一种滑膜肉瘤异种移植小鼠模型的构建方法与流程

本发明涉及肿瘤移植小鼠模型的建立领域，具体涉及一种滑膜肉瘤异种移植小鼠模型的构建方法。

背景技术：

滑膜肉瘤(synovialsarcoma，ss)是一种高度恶性的软组织肉瘤，约占软组织肉瘤的7-10％。由于ss组织起源复杂，没有明确的危险因素，病理形态多变，良恶性分界困难，因此，其诊断、鉴别诊断和分类就成为临床面临的难题。ss常见于20-30岁男性(男/女约为1.2：1)，主要好发于四肢大关节附近，但全身几乎任何部位都可发生，且ss几乎不发生在关节内，也和正常滑膜组织没有关系。原发ss约80％发生在手足部位，20％左右发生在非手足部位如肋骨、心包、肺脏和腹壁。绝大多数ss能转移到肺，腹腔内转移少见。既往研究认为，大范围切除瘤体及周围可切除的组织是治疗ss的首选方法，但其复发率高，故综合治疗成为改善ss预后的重要手段。这为患者及其家庭带来极大的精神伤害，也为社会乃至国家都带来沉重的经济负担，带来更大的社会问题。因为滑膜肉瘤组织异质性的存在，既往基于滑膜肉瘤细胞系的基础研究结果很难在临床滑膜肉瘤患者体内重现，较大程度导致临床滑膜肉瘤诊治水平的滞后。

肿瘤模型是肿瘤研究的重要载体。研究发现，细胞在传代过程中不断适应体外环境，生物学特点与在体肿瘤细胞不符，细胞系异种移植模型与患者本身肿瘤存在较大一致性，而且现有的肿瘤动物模型缺乏免疫系统，模型的缺陷导致抗肿瘤药物临床试验的失败率高。

因此，利用与患者原发肿瘤同质性更好的患者来源的人源性异种移植模型(patient-derivedxenograft，pdx)模型意义深远，其可以深入探讨滑膜肉瘤发病机制，基于pdx研发的成果可在患者体内得到较好的重复，同时可以大量扩增临床患者体内有限的滑膜肉瘤样本，使用异种移植小鼠代替临床患者进行不同组合药物筛选，从而选择最合适的药物，大大提高有效性并降低药物副作用。

人源性肿瘤异种移植(patientderivedxenograft，pdx)模型是一种体内模型，通过将病人的新鲜肿瘤组织处理后直接移植到免疫缺陷小鼠上，依靠小鼠提供的环境生长与逐步传代，能以小鼠为载体大量扩增患者肿瘤组织。pdx模型有如下优点：首先，其相当于一个模型对应一个病人，能很好地反应不同个体间肿瘤的差异性，相较于传统模型更能够反应临床病人的实际情况；其次，pdx模型可以进行传代，并且传代的肿瘤组织能够和初始肿瘤组织在基因拷贝数、基因突变和表达模式等保持高度的一致性，相当于对于病人肿瘤样本进行了扩增，这就为药物筛查和病人患病机制研究提供了很好的条件；再次，pdx培养的肿瘤块，可以冻存起来复苏之后依然能够构建新的pdx模型，相当于构建了不同病人的肿瘤活体库。

现有的技术主要是通过将新鲜滑膜肉瘤组织进行切碎处理或进行细胞匀浆化处理后，在皮下建模。例如本申请人在先申请的发明cn201910462582.8中提供一种滑膜肉瘤细胞系hss-005r及其子代细胞系。其中包括取滑膜肉瘤细胞系中的hss-005r细胞进行皮下单侧接种小鼠，接种1～3周后，肿瘤开始形成并生长，接种后30～50天的小鼠为医药研究用小鼠模型。

技术实现要素：

但匀浆处理后被认为破坏了肿瘤组织本身微环境的特点，不能良好的保持肿瘤与周围间质与患者的一致性。另外，滑膜肉瘤好发于关节附近，皮下建模被认为不能良好模拟肿瘤发生环境。而本发明成功建立了小鼠膝关节内组织块移植方式，较好地保留了肿瘤与周边间质的稳定关系，并成功建立了滑膜肉瘤关节原位建模模型，保留了模型肿瘤生长环境与患者肿瘤的一致性。

因此，本发明提供一种滑膜肉瘤异种移植小鼠模型的构建方法，所述方法包括先采集滑膜肉瘤患者肿瘤组织块，再在无菌条件下将新鲜的患者肿瘤组织块异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种原位移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将采集到的新鲜的患者肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将患者肿瘤组织块植入小鼠的关节囊中，缝合切口，养育小鼠使得其关节囊中肿瘤生长。

在一种具体的实施方式中，先用灭菌的眼科剪纵行剪开小鼠膝关节皮肤，再用显微剪刀或者显微刀片沿髌韧带内侧纵向切口打开关节囊，随后在关节囊中植入滑膜肉瘤组织块。

在一种具体的实施方式中，在关节囊中植入滑膜肉瘤组织块之后，先缝合关节囊，再缝合皮肤切口；所述关节囊为膝关节囊。

在一种具体的实施方式中，所述滑膜肉瘤患者肿瘤组织块的单边长度小于等于3mm，优选小于等于1mm。

在一种具体的实施方式中，原位移植时小鼠的体重为8～20g，优选为12～15g，所述无菌孵育液中还包含抗生素，优选所述无菌孵育液中包含抗生素和dmem培养基或rpmi-1640培养基，更优选所述抗生素包含青霉素和链霉素。

在一种具体的实施方式中，所述免疫缺陷小鼠为nod/scid小鼠。

在一种具体的实施方式中，所述方法还包括采用小动物活体成像仪观察小鼠关节囊中滑膜肉瘤大小，优选还采用小动物活体成像仪观察肿瘤是否转移到小鼠的内脏。

在一种具体的实施方式中，所述方法还包括养育小鼠使得其关节囊中肿瘤生长后解剖小鼠，剥离瘤体得到p0代肿瘤瘤体，取p0代肿瘤瘤体异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内得到p1代肿瘤瘤体，可选地取p1代肿瘤瘤体异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内得到p2代肿瘤瘤体，以此类推传代；优选所述方法还包括将部分p0代肿瘤瘤体程序降温并保存在液氮中，以及可选地包括将部分p1和p2代肿瘤瘤体程序降温并保存在液氮中。

本发明还提供一种滑膜肉瘤异种移植小鼠模型的构建方法，所述方法包括在无菌条件下将新鲜的小鼠模型中的p0代滑膜肉瘤肿瘤组织、p1代滑膜肉瘤肿瘤组织或p2代滑膜肉瘤肿瘤组织异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种原位移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将所述滑膜肉瘤肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将所述滑膜肉瘤肿瘤组织块植入小鼠关节囊中，缝合切口，养育小鼠使得其关节囊中肿瘤生长。

本发明还提供一种如上所述方法得到的小鼠模型在筛选预防或治疗滑膜肉瘤药物中的应用。

本发明还提供一种滑膜肉瘤异种移植小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括先复苏保存在液氮环境中的滑膜肉瘤患者肿瘤组织块，再在无菌条件下将复苏的患者肿瘤组织块异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种原位移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将复苏的患者肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将患者肿瘤组织块植入小鼠的关节囊中，缝合切口，养育小鼠使得其关节囊中肿瘤生长。

在一种具体的实施方式中，所述方法还包括对采集到的滑膜肉瘤患者肿瘤组织块进行程序降温和液氮保存的过程以及快速升温复苏的过程。

在一种具体的实施方式中，所述滑膜肉瘤患者肿瘤组织块保存在含dmso、fbs和neaa的dmem中，三段以上程序降温至液氮温度，并在液氮温度中保存，所述快速升温复苏是指将冻存组织放至36～38℃的恒温水浴中进行复苏。

本发明还提供一种滑膜肉瘤异种移植小鼠模型的构建方法，所述方法包括在无菌条件下将冻存在液氮环境中并复苏的小鼠模型中的p0代滑膜肉瘤肿瘤组织、p1代滑膜肉瘤肿瘤组织或p2代滑膜肉瘤肿瘤组织异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种原位移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将所述滑膜肉瘤肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将所述滑膜肉瘤肿瘤组织块植入小鼠关节囊中，缝合切口，养育小鼠使得其关节囊中肿瘤生长。

本发明至少具有如下有益效果：

本发明成功建立了组织块原位移植方式，较好地保留了肿瘤与周边间质的稳定关系，具体是关节囊原位建模，保留了模型肿瘤生长环境与患者肿瘤的一致性。相比皮下建模，原位建模情况更真实，筛选出来的药物方案能更好地用在患者身上，且原位建模理论上来说比皮下建模会更容易发生肿瘤转移。总的来说，该滑膜肉瘤原位模型的建立与应用有望提高临床滑膜肉瘤治疗的有效性和患者的预后，防止患者致残甚至死亡而带来极大的医疗社会负担，减少治疗费用及政府财政支出。

附图说明

图1为滑膜肉瘤病人照片及滑膜肉瘤pdx小鼠皮下建模照片。

图2为滑膜肉瘤pdx小鼠膝关节囊原位建模照片以及micro-ct检测小鼠原位成瘤情况。

图3为患者滑膜肉瘤与pdx小鼠滑膜肉瘤肿瘤组织he对比图。

图4为患者原发的滑膜肉瘤与pdx小鼠滑膜肉瘤肿瘤的免疫组化对比图。

图5为患者复发的滑膜肉瘤与pdx小鼠滑膜肉瘤肿瘤的免疫组化对比图。

具体实施方式

经医院伦理委员会审核批准，样本收集前患者均签署知情同意书，采集到的组织经过组织病理学检查，经病理确诊的滑膜肉瘤患者肿瘤组织块，保存在无菌生理盐水中，置于冰上。将组织块分为3部分，第1部分无菌条件下直接处理(详见下文)异种移植进免疫缺陷小鼠体内；第2部分置入加入10％dmso(二甲基亚砜)，90％fbs(胎牛血清)和1％neaa(非必需氨基酸)的dmem(一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)中，梯度冷冻至-80度，置入液氮中保存；第3部分放入液氮中速冻，然后置入液氮中保存。其中，第1部分用于建模，第二部分用于复苏和接种，第三部分用于送检做基因检测。

对比例和实施例

对比例为小鼠皮下接种，实施例为小鼠关节腔内原位植入。

皮下接种：选用4周龄nod/scid小鼠(或balb/c裸鼠)10只，nod/scid小鼠即非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致(以免受到一些未知的激素干扰)，体重约12-15g，将新鲜肿瘤组织(或经液氮冻存和复苏后的滑膜肉瘤患者肿瘤组织)浸泡在纯fbs+青霉素和链霉素的无菌孵育液中(青霉素的终浓度为100u/ml，链霉素的终浓度为100u/ml)，用无菌剪刀切成1*1*1mm小块。小鼠麻醉后固定，在右侧近腋下处作皮肤切口，将肿瘤组织块植入皮下(p0)，缝合手术切口。每天观察小鼠肿瘤生长情况。肿瘤生长至长度超过5mm时。每周用游标卡尺测量2次瘤体并记录瘤体长(a)与宽(b)，计算肿瘤体积(v＝a*b²/2)。同时采用小动物活体成像仪观察肿瘤是否转移到小鼠的内脏，待瘤体体积v增长至1500mm³时或42d后解剖动物，剥离瘤体称重，部分瘤块接种传代，其余置入液氮中保存。

关节腔内原位植入：

1.选用4周龄nod/scid小鼠10只，小鼠性别与患者性别保持一致，体重约12-15g。

2.将新鲜无菌的肿瘤组织(或液氮保存并复苏后的肿瘤组织)用无菌剪刀剪切成1*1*1mm小块保存在纯fbs中。

3.小鼠麻醉后，剃净膝关节周围鼠毛并用75％乙醇消毒。

4.固定实验小鼠于手术台上，灭菌的眼科剪纵行剪开小鼠膝关节皮肤约1cm长度，用显微剪刀或者显微刀片沿髌韧带内侧纵向切口打开关节囊。将剪碎的肿瘤组织块植入关节囊内。

5.用8-0的外科缝线缝合关节囊，再用6-0的外科缝线缝合皮肤切口。

6.术后小鼠置于37℃温床上直至复苏，常规可腹腔给予青霉素预防手术后感染。

7.术后小鼠放入笼中饲养，不限制其活动，可以任意取食及饮水。每周观察滑膜肉瘤成瘤情况，每3周采用小动物活体成像仪观察滑膜肉瘤大小及内脏转移情况(肿瘤是否转移到小鼠的内脏)，待瘤体体积增长至1500mm³时或45-60d后解剖膝关节，剥离瘤体称重，部分瘤块接种传代，其余置入液氮中保存。液氮中保存组织块或整个瘤体的过程包括程序降温，具体是4℃、-20℃、-80℃(专用冷冻冰箱)和液氮这几个温度梯度。

滑膜肉瘤原代及传代肿瘤组织复苏接种：取液氮中冻存的p0、p1及p2代滑膜肉瘤肿瘤组织，快速复温至常温，分别接种于10只同性别nod/scid小鼠腋下和关节腔内，方法同前所述。

因病人的滑膜肉瘤组织是很珍贵的研究用材，因此需要对荷瘤小鼠的肿瘤组织进行传代，以便产生更多的实验用荷瘤小鼠。而对肿瘤组织进行冻存复苏则是因为每次建模实验都用不了太大的肿瘤块，下次实验的时候就可以使用留种的即冻存复苏的肿瘤块。肿瘤组织传代p0、p1和p2等，理论上该肿瘤组织不会改变，因而各代的实验效果可视为相同。且原位建模或皮下建模时，只要p0代成瘤成功，则后续p1及p2等传代和复苏是很简单和容易的，会全部成功。

图1为滑膜肉瘤病人照片及滑膜肉瘤pdx小鼠(具体使用的是浑身无毛的balb/cnude鼠)皮下建模照片。其中图a为患者005-pa(其中pa代表患者，005为患者序号)滑膜肉瘤手术前拍摄图像，可见+号出呈现右侧膝关节肿胀。图b、c和d为皮下建模过程。从图c和d可见，种植入患者复发滑膜肉瘤005r-p4(其中r是recurrence，即复发的意思；p4代表pdx模型的第四代；故005r-p4是005患者复发肿瘤pdx模型的第四代)后裸鼠的图像，可见小鼠肿瘤最大直径约1cm，瘤体呈现出膨胀性生长，瘤体有包膜，形态较为规则，解剖小鼠皮下肿瘤，发现其与周围组织的分界较为明显，血运丰富，检查其他脏器，未发现肺脏、骨髓、肝脏等转移；005r-p4小鼠种植后能触摸到皮下肿瘤时间约为21天左右。

图2为滑膜肉瘤pdx小鼠(具体使用的是浑身白毛的nod/scid鼠)膝关节囊原位建模照片(图e和f)以及micro-ct检测小鼠原位成瘤情况(图g)。

图3为患者滑膜肉瘤与pdx小鼠滑膜肉瘤肿瘤组织he对比图。图3a和图3b分别为患者原发及复发滑膜肉瘤的he染色图，可见到梭形细胞与纤维细胞交织排列在一起。图3c和图3d分别为患者原发及复发滑膜肉瘤组织建立的pdx模型he染色图，可见图中梭形细胞与纤维交织细胞排列，组织学特点与患者病理一致。

图4为患者原发的滑膜肉瘤与pdx小鼠滑膜肉瘤肿瘤的免疫组化对比图。从图4中患者原发肿瘤与pdx小鼠免疫组化的对比可见，患者与pdx滑膜肉瘤在bcl-2、cd34、cd99、ck、ema、ki-67、s-100、sma、vim、tle-1染色基本一致。

图5为患者复发的滑膜肉瘤与pdx小鼠滑膜肉瘤肿瘤的免疫组化对比图。从图5可见，接种于小鼠上的肿瘤与其来源的患者复发的滑膜肉瘤的免疫组化基本一致，该肿瘤组织与患者的复发肿瘤具有一致性。

图4和图5中的005-f1pdx是指患者肿瘤组织种植成的第一代pdx模型，f1与p0(患者肿瘤组织初次种植于小鼠后生长得到的肿瘤)代表相同意思。

pdx中的原位建模意义深远，原位建模所得肿瘤与患者原发肿瘤同质性更好，建模成功后可以深入探讨滑膜肉瘤发病机制，基于其研发的成果可在患者体内得到较好的重复，同时可以大量扩增临床患者体内有限的滑膜肉瘤样本，使用异种移植小鼠代替临床患者进行不同组合药物筛选，从而选择最合适的药物，大大提高有效性并降低药物副作用。因此，原位建模与应用可有望提高临床滑膜肉瘤治疗的有效性和患者的预后，防止患者致残甚至死亡而带来极大的医疗社会负担，减少治疗费用及政府财政支出，这些方面都具有重大的现实意义，具有极大的经济效益。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。