对氨基苯甲酸的应用的制作方法

本发明属于生物农业领域，涉及对氨基苯甲酸的应用，尤其涉及对氨基苯甲酸在制备抑制链格孢菌生长的制剂中的应用及采后小番茄黑腐病治疗和防治上的应用。
背景技术：
：小番茄(lycopersiconesculentum)又称圣女果、樱桃番茄等，其维生素含量是普通番茄的1.7倍。其外观玲珑可爱，含糖度很高，口味香甜鲜美，风味独特，在全世界范围内都很受欢迎。在中国，由于气候和病害，小番茄果实在生长和收获后损失显著。链格孢菌(alternariaalternata)是一种真菌，已在380多种植物的寄主种上被记录到引起叶斑病和其他疾病，导致许多植物部位的叶斑、腐烂和枯萎。链格孢菌还可以引起免疫功能低下的人士出现上呼吸道感染和哮喘。采后小番茄是链格孢菌的典型寄主，感染链格孢菌后小番茄表现出黑腐病。目前，市场上没有防治该病的专用药剂。生产上常采用种子消毒、苗床土消毒、在发病初期喷洒14％络氨铜水剂400倍液等化学药剂，或者用50％代森铵水剂1000倍液多次喷洒来对小番茄黑腐病进行控制。这些方法虽然能获得较好的防治效果，但需要的周期长，价格昂贵，且化学药剂的使用导致的农药残留问题和环境污染问题日益突出。因此，开发有效、安全、环保的杀真菌剂，对于防治采后小番茄黑腐病、推进小番茄产业稳定发展，具有重要意义。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供对氨基苯甲酸的应用，使其抑制链格孢菌生长效果显著，同时可用于相关药物的制备中。对氨基苯甲酸(p-aminobenzoicacid,paba)是一种天然芳香族化合物，对氨基苯甲酸分子式为c7h7no2，结构式为如下式所示：本发明经过研究发现，对氨基苯甲酸可抑制名为链格孢菌的植物病原真菌的生长，故提出了对氨基苯甲酸在制备抑制链格孢菌生长的制剂中的应用。根据应用，本发明提供了一种抑制植物中的链格孢菌生长的制剂，该制剂的活性成分为对氨基苯甲酸。作为优选，所述制剂为对氨基苯甲酸溶液。更优选地，所述对氨基苯甲酸溶液的浓度为20mm。本发明将采后小番茄分为预防组和治疗组，预防组采后小番茄分别采用水(作为对照)和10mm对氨基苯甲酸溶液喷洒后接种链格孢菌菌饼，治疗组采后小番茄接种链格孢菌菌饼后分别采用水(作为对照)和10mm对氨基苯甲酸溶液喷洒，24h后观测链格孢菌的生长情况，发现预防组中采用水(对照)喷洒的采后小番茄接种部位病菌生长较严重，受侵害程度大，经paba溶液预防处理的采后小番茄，链格孢菌生长受到显著抑制，黑腐病感染程度减轻；治疗组中采用水(对照)喷洒的采后小番茄接种链格孢菌部位出现小部分白色菌丝，而经10mmpaba治疗处理的采后小番茄，链格孢菌的生长几乎完全被抑制，说明paba可有效抑制链格孢菌的生长，进而可治疗黑腐病。与现有技术相比，本发明将对氨基苯甲酸应用于治疗和/或预防采后小番茄黑腐病的制剂中，通过抑制链格孢菌的胞质分裂的独特方式达到杀菌的目的。本发明无需复杂分子操作，制剂中主要活性物质对氨基苯甲酸为天然来源，可以采用生物法生产，对环境友好。除此之外，本发明提供了一种治疗和/或预防采后小番茄黑腐病的制剂，该制剂为对氨基苯甲酸溶液，浓度为20mm的制剂相对于其他浓度制剂而言，治疗和/或预防效果最佳，且制备方法简单。附图说明图1为实施例1中采用0mm、5mm、10mm、20mm浓度paba溶液制备得到的pda培养基培养得到的链格孢菌菌落直径柱状图；图2为实施例1中在含有浓度为0mm、5mm、10mm、20mm的对氨基苯甲酸溶液的pda培养基上的链格孢菌生长情况图；图3为实施例2中不含对氨基苯甲酸的pda培养基上的链格孢菌的细胞生长过程图；图4为实施例2中对照组待测菌液(图a)和10mmpaba组待测菌液(图b、图c)置于荧光显微镜下的观察结果典例图；图5为实施例2中经浓度为0mm(对照组)、10mm对氨基苯甲酸溶液处理后的链格孢菌中多核细胞占比柱状图；图6为实施例3中预防组与治疗组中对照实验和paba处理实验得到的采后小番茄菌落直径柱状图；图7为实施例3中预防组与治疗组中对照实验和paba处理实验得到的采后小番茄中链格孢菌的生长情况图。具体实施方式本发明公开了对氨基苯甲酸的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明。实施例1：对氨基苯甲酸的抗真菌活性检测pda培养基配方如表1所示。先将马铃薯洗净去皮,再称取200g切成小块，加水煮烂(煮沸20～30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，再加入20g葡萄糖，定容至1l后均分为4份，每份250ml,加入相应质量的对氨基苯甲酸、5g琼脂，115℃灭菌20min后，倒平板，含不同浓度的对氨基苯甲酸的pda培养基平板各3～5块。表1pda培养基配方(1l)试剂质量马铃薯200g葡萄糖20g对氨基苯甲酸xg*琼脂粉20g水定容至1l*x为终浓度为0mm、5mm、10mm、20mm时的对氨基苯甲酸的加入量，分别为0g、0.17g、0.34g、0.68g。菌饼制备：将斜面保存的链格孢菌菌株接种于不含对氨基甲苯酸的pda固体培养基平板中，于28℃恒温培养箱避光培养3天，用直径3mm的打孔器于菌落边缘切取，制备成菌饼备用。将菌饼接种于含不同浓度对氨基甲苯酸的pda培养基平板中心位置(设置3个平行)，于28℃恒温培养箱避光培养，当含0mm对氨基甲苯酸的pda培养基中的菌落边缘接近平板边缘时，测定各平板中的菌落直径，测定结果如图1所示，图1为采用不同浓度paba制备得到的pda培养基培养得到的链格孢菌菌落直径柱状图。根据图1可以发现浓度为20mm的对氨基苯甲酸水溶液制备的pda培养基培养得到的链格孢菌菌落直径最小，说明对氨基苯甲酸水溶液的浓度越高，对链格孢菌的抑制效果越明显。观察链格孢菌在其中一组浓度为0mm、5mm、10mm、20mm的对氨基苯甲酸溶液制备pda培养基上的生长情况，结果如图2所示，图2为在含有浓度为0mm、5mm、10mm、20mm的对氨基苯甲酸溶液的pda培养基上的链格孢菌生长情况图，根据该图可以发现随着对氨基苯甲酸溶液浓度的增加，链格孢菌菌落直径越小，说明抑菌效果越好。实施例2：对氨基苯甲酸阻断链格孢菌胞质分裂。取30块菌饼置于5ml灭菌水中，充分混匀后，分别吸取1ml菌液于两个新管(a管和b管)，a管中加入水(0mmpaba)，b管中加入10mmpaba溶液，再分别加入0.5mlyedp培养液，28℃，200rpm摇床培养24h，分别得到对照组(0mmpaba组)待测菌液和10mmpaba组待测菌液。yedp培养液配方如表2。表2yedp培养液配方(50ml)试剂质量酵母提取物0.15g胰蛋白胨0.5g葡萄糖1g蒸馏水50ml对a管开始200rpm摇床培养的前两个小时进行显微镜观测，得到如图3所示的链格孢菌的细胞生长过程图。根据图3可知，链格孢菌从分生孢子(图3a)开始，经过出芽(图3b左)，发芽管(图3b右)，出现菌丝(图3c)、菌丝大量生长(图3d)四个阶段。图3充分说明，在不受外界抑制的情况下，链格孢菌极少有多核细胞的产生。用20μl移液枪分别吸取对照组待测菌液和10mmpaba组待测菌液，各滴一滴在两块载玻片上，更换枪头后分别滴加一滴dapi(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)。dapi是一种能与dna强力结合的荧光染剂。盖上盖玻片后，置于荧光显微镜下观察，对大量清晰细胞的计数，计算多核细胞占比情况，结果如图5所示。图5为经浓度为0mm(对照组)、10mm对氨基苯甲酸溶液处理后的链格孢菌中多核细胞占比柱状图。根据该图可以发现，相比于对照组(0mm对氨基苯甲酸)，10mm对氨基苯甲酸溶液处理后的链格孢菌中多核细胞占比显著增加，说明对氨基苯甲酸能够阻断链格孢菌的胞质分裂。图4为待测菌液置于荧光显微镜下的观察结果典例。其中，图4中a图为对照组待测菌液置于荧光显微镜下的观察结果典例，图4中b图和c图均为10mmpaba组待测菌液置于荧光显微镜下的观察结果典例。根据图4中a图可知，对照组(0mmpaba)待测菌液中多核细胞非常少。由图4中b图和c图可知，10mmpaba处理得到的待测菌液(10mmpaba组)存在大量的细长细胞显示两个甚至三个核。根据图4可以发现，对照组待测菌液(图4a)中几乎所有细胞核均被隔膜分开，而10mmpaba组待测菌液(图4b和图4c)中细胞隔膜分离速度非常低，由此证明paba抑制链格孢菌胞质分裂。实施例3：对氨基苯甲酸对链格孢菌在采后小番茄上的预防与治疗效果比较分析。预防组：取14个生长状况相似的采后小番茄，均分用于对照实验(7个)和paba处理实验(7个)。对照实验(水喷洒)：将水均匀喷洒至采后小番茄(7个)上，待干燥后用牙签在每个小番茄上扎一个小孔，每个孔上用已消毒的镊子接种菌饼，然后放入托盘，用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，放入28℃培养箱中，24h后测量7个采后小番茄的菌落直径。paba处理实验：将10mm对氨基苯甲酸溶液均匀喷洒至采后小番茄(7个)上，待干燥后用牙签在每个小番茄上扎一个小孔，每个孔上用已消毒的镊子接种菌饼，然后放入托盘，用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，放入28℃培养箱中，24h后测量7个采后小番茄的菌落直径。治疗组：取14个生长状况相似的采后小番茄，均分用于对照实验(7个)和paba处理实验(7个)。对照实验(水喷洒)：用牙签在每个小番茄上扎一个小孔，每个孔上用已消毒的镊子接种菌饼。处理完成后，放入托盘，用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，放入28℃培养箱中，24h后取出将水均匀喷洒至采后小番茄上。干燥后重新用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，放入28℃培养箱中，24h后测量14个采后小番茄的菌落直径。paba处理实验:用牙签在每个小番茄上扎一个小孔，每个孔上用已消毒的镊子接种菌饼。处理完成后，放入托盘，用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，放入28℃培养箱中，24h后取出将10mm对氨基苯甲酸溶液均匀喷洒至采后小番茄上。干燥后重新用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，放入28℃培养箱中，24h后测量14个采后小番茄的菌落直径。图6为预防组与治疗组中对照实验和paba处理实验得到的采后小番茄菌落直径柱状图。从预防组与治疗组中对照实验和paba处理实验得到的采后小番茄中各选择两个拍照，照片如图7所示。图7为预防组与治疗组中对照实验和paba处理实验得到的采后小番茄中链格孢菌的生长情况图。根据图7可知，预防组中，与对照实验(水喷洒)得到的小番茄相比，paba处理实验组采后小番茄接种链格孢菌的部位病菌直径较小，说明paba可有效预防黑腐病；而治疗组中，对照实验组(喷洒水处理)番茄接种链格孢菌部位出现小部分白色菌丝，可见链格孢菌生长旺盛，而经10mmpaba治疗处理后，链格孢菌的生长几乎完全被抑制，可有效防止黑腐病的扩散。可以认为，在感染链格孢菌前喷洒对氨基苯甲酸，能保护采后小番茄免受病菌侵害。对于感染黑腐病的采后小番茄，喷洒对氨基苯甲酸能有效控制病害扩散。本发明的实施例中，单位符号mm为mmol/l，m为mol/l。以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12