本发明属于种子处理及成苗培育
技术领域：
，具体涉及一种甜樱桃早熟品种的种子处理方法及播种当年成苗的方法。
背景技术：
：甜樱桃品种按照成熟期可分为早熟品种、中熟品种、晚熟品种。其中早熟品种由于成熟早、售价高，受到种植者的青睐，培育出具有综合性状优良的早熟甜樱桃品种是育种者的目标。甜樱桃新品种的基本培育程序：利用综合性状优良的品种为父母本，进行杂交，获得杂交种子或自然实生种子；对这些种子进行播种，得到杂交苗或实生苗；然后从中选育更优良的品种；针对早熟甜樱桃新品种选育，以早熟品种做母本，更有利于筛选后代的早熟性状。然而，由于甜樱桃的早熟品种的发育期短，胚发育不成熟，导致以未完全成熟的种子进行常规培育(比如层积处理，低温处理等)后，败育率较高，所得后代极少，严重制约了甜樱桃早熟新品种的培育。cn105284234a公开了一种提高甜樱桃种子发芽率的方法，但该方法仅适用于甜樱桃的中、晚熟品种。为了提高杂交后代的获得率，近年来开展了胚抢救工作的研究。研究表明，胚抢救是解决甜樱桃早熟品种的种子萌发的关键技术。例如，《甜樱桃与中国樱桃杂种的胚抢救及杂种鉴定》公开了针对以甜樱桃为母本，中国樱桃为父本的种间杂交，建立了杂种胚抢救技术体系，并确定最佳萌发与生长培养基。但该方法仅适合少量种子且须在无菌室内进行，程序复杂，培养条件要求严格。而在实际基层培育工作中，为了保证杂交后代的品质，通常需要大量的杂交后代以供选择。但在处理大群体时，胚抢救技术不论在处理能力方面还是操作可行性方面均不适合，存在太过费时、费工，成本高的问题。cn104170557a公开了一种促进中国樱桃种子快速高效萌发成苗的方法，通过对种子进行破壳处理，在湿毛巾(含水量40％)内于0-4℃低温诱导7天，种子萌动后在常温种床上培养3天后发芽率可达75％。但该方法并不适合欧洲甜樱桃。因为中国樱桃的种子发育成熟完全，萌发力相对较强，而欧洲甜樱桃早熟品种的种子发育不完全，萌发力较弱，采用该方法培育后种子萌发率并未显著提高。因此急需一种简单、高效、适用于大群体处理的可提高甜樱桃的早熟品种的种子萌发率的培育技术。技术实现要素：本发明的目的是提供一种针对甜樱桃的早熟品种种子的种子处理方法，该方法简单、高效且适用于大群体处理，可显著提高甜樱桃的早熟品种种子的萌发率及后代的获得率；同时该方法也能显著提高甜樱桃的中、晚熟品种的种子发芽率。所述甜樱桃的种子处理方法包括：采取液体培养方式处理种胚；其中，所述液体培养的条件为：密封条件下，于温度2～6℃培养5～7天；培养液的成分为：不含琼脂的ms培养基，6-ba(6-苄氨基嘌呤)1.0mg/l，iaa(吲哚乙酸)0.2mg/l。种仁萌发率的提高一是靠提高自身发育程度，二是靠抑制内生菌及外源菌的影响程度；但现行培育方式往往难以实现二者兼顾，常常是萌发力的提高伴随着内生菌及外源菌的严重污染，最终导致后代获得率降低。本发明通过采取液体培养方式处理甜樱桃早熟品种的种胚，同时控制液体培养程序及培养液配方，使两者发挥协同作用，既能够提高种胚的萌发力，又有效抑制内生菌及外源菌对种胚萌发的负面影响，从而显著提高甜樱桃早熟品种种胚的萌发率，进而提高杂交或实生后代的获得率，实现当年播种并当年成苗的目标，大大缩短育种周期。此外，本发明所述的方法简单易操作，可同时处理大群体(几十到上百斤种子)，显著提高育种效率，降低育种成本。研究显示，目前每年利用此方法可获得3000-5000株杂交或实生苗。虽然在种仁培育过程中，本领域技术人员通常会对种胚预处理，优化调整培育条件及培养基配方，以期提高种仁的发芽率；但在实际操作中，这种培育方式及培育条件、培养基成分之间以何种作用关系存在才能有效平衡提高种仁萌发力与抑制内生菌及外源菌污染的关系则对于本领域技术人员而言是非常难确定的。本案技术人员通过多年深入研究不断探索，才确定了上述种子处理条件，取得显著的技术效果。优选地，所述培养液还包括白砂糖；进一步优选地，控制所述白砂糖的浓度在20-30g/l之间，既可进一步提高萌发力，又可防止内生菌及外源菌对种胚的负面影响。作为本发明的具体实施方式之一，所述培养液的配方为：不含琼脂的ms培养基，6-ba(6-苄氨基嘌呤)1.0mg/l，iaa(吲哚乙酸)0.2mg/l；白砂糖30g/l，ph5.8～6.0。试验表明，此配方培养基可使种仁的发芽率显著提高且育种过程无污染。优选地，在所述液体培养的过程中更换一次培养液，既防止种仁发霉污染，提高其发芽率，又合理控制培育成本。进一步优选地，在所述液体培养的第2或3天更换培养液，更有助于加速种仁早期发育。为了更好的提高萌发率，所述种胚在液体培养前先浸泡至膨胀。研究发现，对种仁进行充分吸水预处理，再于合适的低温条件下液体培养，可在较短时间获得较高的发芽率，且整个育种过程中污染概率大大降低，无需消毒处理，大大简化培养程序，降低对实验条件和操作者的技术要求。本发明所述的种子处理方法为简便而高效的育种程序，具有更大的实用价值，有利于基层育种推广使用。优选地，所述浸泡的温度为2～6℃。作为本发明的具体实施方式之一，所述种胚通过下述方法获得：去除外种皮的种仁在密封条件下于2～6℃水中浸泡至膨胀，去除内种皮，即得。经过处理后的种仁膨胀，种粒饱满，有利于种子中的营养物质溶解在水里，由子叶或胚乳转运给胚，供给胚的发育。本发明所述的种子可为甜樱桃的实生种子或杂交种子，不限于早熟、中熟或晚熟品种，当然对早熟品种的效果更显著。所述早熟品种包括红灯、早大果、早蜜露、五月红等；所述中熟品种包括玲珑脆、美早等；所述晚熟品种包括拉宾斯、先锋、斯特拉等。作为本发明的具体实施方式之一，所述种子处理方法包括：去除外种皮的种仁在密封条件下于2～6℃水中浸泡至膨胀，去除内种皮，得种胚；将种胚置于培养液中，于2～6℃液体培养5～7天；其中液体培养至第2或3天时更换一次培养液；所述培养液为：不含琼脂的ms培养基，6-ba(6-苄氨基嘌呤)1.0mg/l，iaa(吲哚乙酸)0.2mg/l；白砂糖30g/l，ph5.8～6.0。本发明第二目的是提供一种甜樱桃的早熟品种的种子播种当年成苗的方法。所述方法包括：将上述处理后的种子播种在育苗基质中，覆盖湿蛭石，培养5-7天出芽，其中控制温度为25～28℃，湿度为70～80％；待苗长高于土面2-3cm后降低湿度至50％；待苗长高于土面10-15cm时定植田间长成成苗。本发明直接采用上述处理所得种子进行播种，在常温条件下培养5-7天即可出芽，避免了现有种胚培养后进行继代培养、生根培养和驯化移栽的复杂程序，实现了当年播种并当年成苗的目标，大大缩短甜樱桃早熟品种得育种周期。所述育苗基质包括草炭土、珍珠岩与蛭石；优选地，所述草炭土、珍珠岩与蛭石的质量比为(2-3)：(1-2)：(2-3)，进一步优选地，质量比为2:1:2。优选地，所述湿蛭石的厚度为0.5-0.7cm。与现有技术相比，本发明的有益效果如下：1、本发明能够显著提高甜樱桃的早熟品种种子的萌发率，以及杂交或实生后代的获得率；同时又无需苛刻的无菌操作条件，避免传统胚培养所需的超净工作台和培养室以及对操作人员更高的技术要求，大大提高了工作效率。2、本发明使得甜樱桃的早熟品种的实生种子当年播种、当年成苗的目标得以实现，避免了现行种胚培养后须进行继代培养、生根培养和驯化移栽的复杂程序，大大缩短了育种周期，提高了育种效率，同时为以后利用甜樱桃的早熟品种做母本进行杂交授粉获得杂交种子后代提供了技术保障。传统沙藏种子须第二年播种，且沙藏后的甜樱桃的早熟品种种子的出苗率仅为10％左右；而本发明所述方法可使甜樱桃的早熟品种的出苗率提高到49-52％，且当年播种当年出苗，效率显著。3、本发明所述的种子处理方法同样适用于中晚熟的甜樱桃品种，对提高甜樱桃的育种效率具有十分重要的意义。4、本发明所述的种子处理方法简单易行、效率高、成本低，对研究环境及条件设施要求不严格，适于开展大批量种子处理。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。作为本发明的具体实施方式之一，所述甜樱桃早熟品种的种子处理方法的具体操作步骤如下：(1)选种：3月中、下旬，选择温室自然或杂交授粉得到的甜樱桃早熟品种，采取无病虫害的果实，将甜樱桃果肉与种子剥离，装入干净的容器(烧杯、塑料桶等)，用自来水洗净，去除漂浮在水面上(败育)的种子，倒掉剩余水。(2)种子的预处理：将步骤(1)中沉在水底下的种子取出，用锤子砸破外种皮，取出种仁，将其放在三角瓶中，用蒸馏水冲洗干净，并加入蒸馏水浸泡，水面高于种子，盖上封口膜，置于2～6℃冰箱冷藏1-2天，让种仁充分吸水，判断种仁充分吸水的标准是：种仁吸水膨胀，种粒饱满，种皮无皱褶。倒掉蒸馏水，将浸泡后的种仁从三角瓶中取出，置于铺有干净滤纸的培养皿中，用锋利的手术刀片将内种皮割开，但不要伤及种胚，去除内种皮；(3)种子处理：将去除内种皮的幼胚小心放入干净的三角瓶中，用蒸馏水冲洗干净，倒掉蒸馏水，加入培养液进行培养，液面刚好没过种子，然后给三角瓶盖上封口膜，置于2～6℃冰箱冷藏，3天后换1次培养液，培养5-7天；培养液的配方为：不含琼脂的ms培养基，6-ba(6-苄氨基嘌呤)1.0mg/l、iaa(吲哚乙酸)0.2mg/l、白砂糖30g/l，ph5.8，121℃高压灭菌15分钟后，放凉后置于2～6℃冰箱冷藏备用。作为本发明的具体实施方式之一，所述甜樱桃早熟品种的播种当年成苗的方法，具体步骤如下：将处理好的种子从冰箱中取出，倒掉培养液，用蒸馏水冲洗3次，然后用镊子将其播种在准备好的育苗块或装有育苗基质的育苗盘或营养钵中，上面覆盖0.5cm后的湿蛭石，放入温室或搭建小拱棚，保温保湿5-7天，期间控制温度为25～28℃，湿度为70～80％；育苗基质由草炭土：珍珠岩：蛭石以质量比2:1:2组成；5-7天后，陆续有芽露出土面，待苗长高于土面2-3cm后降低湿度至50％；待苗长高于土面10-15cm时定植田间长成成苗。以下实施例中涉及的甜樱桃早熟品种，‘早大果’和‘早蜜露’定植于河北省农林科学院昌黎果树研究所温室。以下实施例中涉及的符号释义：ms表示ms培养基；iaa为吲哚乙酸(indole-3-aceticacid)；6-ba为6-卞氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine)。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1一种高效的甜樱桃早熟品种实生种子的处理方法及播种当年成苗的方法，具体步骤如下：(1)选种：3月下旬，选择温室刚成熟的自然授粉甜樱桃早熟品种‘早大果’，采取无病虫害的果实，将甜樱桃果肉与种子剥离，装入干净的烧杯，用自来水洗净，去除漂浮在水面上(败育)的种子，倒掉剩余水。(2)种子的预处理：将步骤(1)中沉在水底的种子取出，用锤子砸破外种皮，取出种仁，将其放在三角瓶中，用蒸馏水冲洗干净，并加入蒸馏水浸泡，水面高于种子，盖上封口膜，置于2～6℃冰箱冷藏1天，让种仁充分吸水，判断种仁充分吸水的标准是：种仁吸水膨胀，种粒饱满，种皮无皱褶。倒掉蒸馏水，将浸泡后的种仁从三角瓶中取出，置于铺有干净滤纸的培养皿中，用锋利的手术刀片将内种皮割开，但不伤及种胚，去除内种皮；(3)种子处理：将去除内种皮的种仁小心放入干净的三角瓶中，用蒸馏水冲洗干净，倒掉蒸馏水，加入培养液进行培养，液面刚好没过种子，然后给三角瓶盖上封口膜，置于2～6℃冰箱冷藏，2天换1次培养液，培养6天。培养液的配方为：不含琼脂的ms培养基，ba1.0mg/l、iaa0.2mg/l、白砂糖30g/l，ph5.8，121℃高压灭菌15分钟后，放凉后置于2～6℃冰箱冷藏备用。(4)播种：6天后，将处理好的种子从冰箱中取出，倒掉培养液，用蒸馏水冲洗3次，然后用镊子将其播种在准备好的育苗块中，育苗块事先用自来水浸透，播完后种子上面覆盖0.5cm后的湿蛭石。放入温室培养，保温保湿，温度控制在25～28℃，湿度控制在70～80％。(5)出苗：5-7天后，陆续有芽露出土面；15天后，调查种子萌发率，结果显示：‘早大果’的出苗率为52.0％，白化苗占3.42％；待小苗长出土面2-3cm，降低湿度到50％；待植株长到10-15cm，约5月中下旬将培养成株的实生苗定植田间，10月份长成0.8-1.0m的成苗。次年进入选种圃，进行选种。实施例2一种高效的甜樱桃早熟品种实生种子的处理方法及播种当年成苗的方法，具体步骤如下：(1)选种：4月22日，选择温室刚成熟的自然授粉的甜樱桃早熟品种‘早蜜露’，采取无病虫害的果实，将甜樱桃果肉与种子剥离，装入干净的烧杯，用自来水洗净，去除漂浮在水面上(败育)的种子，倒掉剩余水。‘早蜜露’的审定信息为：原代号‘6-46’，冀s-sv-ca-008-2018，河北省林木品种审定委员会2019.1.9。(2)种子的预处理：将步骤(1)中沉在水底的种子取出，用锤子砸破外种皮，取出种仁，将其放在三角瓶中，用蒸馏水冲洗干净，并加入蒸馏水浸泡，水面高于种子，盖上封口膜，置于2～6℃冰箱冷藏1天，让种仁充分吸水，判断种仁充分吸水的标准是：种仁吸水膨胀，种粒饱满，种皮无皱褶。倒掉蒸馏水，将浸泡后的种仁从三角瓶中取出，置于铺有干净滤纸的培养皿中，用锋利的手术刀片将内种皮割开，但不伤及种胚，去除内种皮；(3)种子处理：将去除内种皮的种仁小心放入干净的三角瓶中，用蒸馏水冲洗干净，倒掉蒸馏水，加入培养液进行培养，液面刚好没过种子，然后给三角瓶盖上封口膜，置于2～6℃冰箱冷藏，2天换1次培养液，培养6天。培养液的配方：不含琼脂的ms培养基，ba1.0mg/l、iaa0.2mg/l、白砂糖30g/l，ph5.8，121℃高压灭菌15分钟后，放凉后置于2～6℃冰箱冷藏备用。(4)播种：6天后，将处理好的种子从冰箱中取出，倒掉培养液，用蒸馏水冲洗3次，然后用镊子将其播种在准备好的育苗块中，育苗块事先用自来水浸透，播完后种子上面覆盖0.5cm后的湿蛭石。放入温室培养，保温保湿，温度控制在25～28℃，湿度控制在70～80％。(5)出苗：5-7天后，陆续有芽露出土面；15天后调查种子萌发率，结果显示：‘早蜜露’的出苗率为48.9％，白化苗占4.17％；待小苗长出土面2-3cm，降低湿度到50％；待植株长到10-15cm，约5月中下旬将培养成株的实生苗定植田间，10月份长成1.0-1.5m的成苗。次年进入选种圃，进行选种。同样地，“红灯”、“五月红”等品种的种仁均可采用上述方法处理。实验结果(1)甜樱桃不同品种的败育率、出苗率调查对田间甜樱桃的不同品种的败育率进行田间调查。同时对甜樱桃的不同品种种子进行沙藏处理(第二年春播种)及本发明所述种子处理方法处理。败育率及不同处理方法的出苗率的结果如表1所示。表1甜樱桃不同品种的败育率、出苗率调查由表1可以看出，甜樱桃的早熟品种的种子败育率很高，红灯、五月红达到50％以上，这给利用甜樱桃的早熟品种做母本进行育种造成一定困难。而沙藏后种子只能在第二年春天进行播种，育种效率低且出苗率低。而本发明所述方法处理后的种子可以在当年播种、当年成苗，且出苗率高，更重要的是育种过程简便，显著提高育种效率。(2)激素处理时间对早蜜露种子萌发率的影响在大量种子处理前，利用早蜜露的种子进行了激素处理时间的筛选。实验表明(见表2)，在液体培养5-8天，均能获得较高的萌发率，处理7天的萌发率最高，达到48.9％。表2激素处理时间对早蜜露种子萌发率的影响品种1d2d3d4d5d6d7d8d早蜜露7.5162828.132.832.048.945.8(3)不同处理对甜樱桃的早熟品种种胚萌发率的影响处理方式1：胚抢救；处理方式2：采用本发明所述方法处理后播种；培养液的配方：不含琼脂的ms培养基，ba1.0mg/l、iaa0.2mg/l、白砂糖30g/l，ph5.8；处理方式3：与处理方式2相似，区别在于培养液为：水+6-ba1.0mg/l+iaa0.2mg/l。表3不同处理方式对甜樱桃早熟品种种胚萌发率(％)的影响由表3可知，未处理直接播种后种胚萌发率几乎为零。而采用处理方式3后播种虽一定程度提高萌发率，但效果一般。而处理方式1(胚抢救)及处理方式2(本发明所述方法)处理后萌发率显著提高。但如前所述，胚抢救处理量小，且操作程序复杂，对操作环境及技术人员要求较高。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12