一种裂盖马鞍菌人工菌种的分离培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种野生食用菌人工菌种的分离培养方法，具体的涉及一种基于裂盖马鞍菌生物学特性、通过对裂盖马鞍菌子实体和基质的原产地采集和收集、子实体的辐照处理和组织分离、菌丝体的平板培养和种瓶培养人工分离培养裂盖马鞍菌人工菌种的方法。
【背景技术】
[0002]裂盖马鞍菌(Helvella leucopus Pers.)俗名巴楚蘑葫、地木耳，属子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌目(Pizizales)、马鞍菌科(Helvellaceae)、马鞍菌属(Helvella),原产于新疆巴楚县原始胡杨林场，是叶尔羌河水、千年胡杨树、干旱少雨的大漠气候条件经大自然融合孕育出的一种绿色珍稀食用菌，素以纯天然、质嫩味美、营养丰富而著称，它不但具有较高的营养价值，还有提高人体免疫力、促进大脑发育、防止脑动脉硬化、促进副肾皮质激素分泌、增强人体应激能力、溶血栓、降血压、降低胆固醇等多种保健作用，市场上干品价格高达每公斤600元仍供不应求。
[0003]裂盖马鞍菌是一种珍稀名贵的野生食用菌，该菌子实体香气浓郁、味道鲜美、质地细腻，其营养价值高于大宗的平菇、香菇及黑木耳等担子菌，与羊肚菌相当。裂盖马鞍菌的子实体含有氨基酸、脂肪酸、矿质元素等成分，经测定:裂盖马鞍菌子实体中含有17种氨基酸，菌盖、菌柄氨基酸含量分别为19.46g/kg和13.14g/kg，必需氨基酸含量为9.26g/kg和
2.41g/kg，必需氨基酸分别占各自氨基酸总量的47.58%和48.78%，油酸、亚油酸、亚麻酸组成的不饱和脂肪酸的含量为8.56%，多糖含量为11.33%。裂盖马鞍菌形态特征独特，菌盖呈黑木耳状，菌盖裂片一般3?5片，暗褐色至黑褐色，表面光滑至粉状，裂瓣边缘卷曲，边缘有的与柄连生，宽2.0?4.0cm。菌柄白色至乳白色，上细下粗，中空，根部主体亦呈圆形，有须根，菌柄长2.0?6.0cm，上部粗1.0?1.5cm，下部粗达1.2?2.8cm，基部膨大处有沟和凹坑。裂盖马鞍菌分布地域广阔，主要沿塔里木盆地北缘塔里木河流域分布，常见于南疆的胡杨林、新疆杨和库尔勒香梨林中地面上或腐殖落叶层，北疆也偶有发现。裂盖马鞍菌主要生长于新疆塔里木盆地天然胡杨林的沙土中，在新疆农田防护林、老苜蓿地中也有生长，是一种土生型食用菌。裂盖马鞍菌生长发育条件苛刻，土壤多为林灌草甸土，有机质含量 1.50%?3.18%，全氮 0.06%?0.07%，全磷 0.12%?0.14%,C/N 16.8 ?18.4，pH7.3?8.6。发生时间一般为每年4月下旬?5月中旬，气温多在15?21°C，春雨降过或经冰山雪水浸润之后裂盖马鞍菌就在塔里木河和叶尔羌河流域广袤的林区地面上以单生、散生或群生方式破土而出，其传播途径主要以耳片在水中弹射孢子的方式逐水传播。不同地域产裂盖马鞍菌子实体内均有细菌、放线菌、真菌三种伴生菌，与产地根系土壤中微生物类群一致，但其数量比土壤中的微生物数量要少。
[0004]近年来，由于对裂盖马鞍菌人为过渡采收加之其生长环境不断恶化等原因其产量逐年下降，而人工驯化和栽培至今尚未获实质性突破，急需深入开展包括人工菌种分离培养、栽培技术革新等应用基础研宄。但国内外对裂盖马鞍菌的研宄甚少，近年来只有国内学者朱铭莪、孟庆玲、胡建伟等对裂盖马鞍菌的营养成分、免疫功能、抗氧化及抗肿瘤活性、孢子萌发及环境适应性进行了初步研宄。因此，为了更好的保护野生裂盖马鞍菌种群及生物遗传多样性和可持续开发利用，急需对裂盖马鞍菌进行区域普查、育种技术及栽培技术的科技攻关。
[0005]本申请的发明人经过近两年深入裂盖马鞍菌发生地对当地物候条件、发生基质、发生方式的野外实地考察结合实验室大量细致的研宄工作，设计了一种基于裂盖马鞍菌生物学特性、通过对裂盖马鞍菌子实体和基质的原产地采集和收集、子实体的辐照处理和组织分离、菌丝体的平板培养和种瓶培养人工分离培养裂盖马鞍菌菌种的方法，实验业已证实该方法是一种简便实用的裂盖马鞍菌人工菌种分离培养方法。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种裂盖马鞍菌人工菌种的分离培养方法，该方法包括裂盖马鞍菌子实体和基质的原产地采集和收集、子实体的辐照处理和组织分离、菌丝体的平板培养和种瓶培养等步骤。优选地，在裂盖马鞍菌人工菌种分离培养的步骤中还包括对裂盖马鞍菌子实体组织分离前进行就地的一次无菌处理和运返实验室的二次无菌处理的步骤，经过上述处理可获得裂盖马鞍菌人工纯菌种。
[0007]鉴于裂盖马鞍菌急需原产地保护和可持续开发的现实需要，以野外采集的裂盖马鞍菌子实体为材料，融合酒精表层和6°Go辐照深层无菌处理的前期步骤，采用组织分离的方法人工分离培养裂盖马鞍菌菌种，可为后续裂盖马鞍菌优良菌种的选育和人工栽培技术的突破提供种质保证。
[0008]其中，野外采集的时机和方式是影响裂盖马鞍菌人工菌种分离培养成功与否的关键因素，因此，野外采集的时间、地点以及采集、保存方式是裂盖马鞍菌人工菌种分离培养首先要解决的问题。基于文献资料报道的每年4月下旬-5月中旬为新疆裂盖马鞍菌的菌丝体扭结、子实体发育成熟适宜采集的季节，结合对裂盖马鞍菌主要发生地南疆叶尔羌流域的巴楚县和塔里木河流域的轮台县的气候、水文、交通等情况的长期跟踪比较，项目组成员利用五一长假期间赶赴巴楚县深入夏河和夏玛勒胡杨林场寻找、观察、采集了大量裂盖马鞍菌子实体及生长基质样本，并通过就地的酒精表层无菌处理及低温保鲜处理后运返实验室，以备后续组织分离培养之用。
[0009]无菌处理的方法是影响裂盖马鞍菌人工菌种分离培养成功与否的决定性因素，因此，采用什么样的灭菌方式直接决定了能否获得裂盖马鞍菌纯菌种并对菌种的种性有一定影响。基于实验室长期对食用菌辐射诱变育种及保鲜的研宄经验，结合裂盖马鞍菌菌柄的中空结构及内外均带有细菌、放线菌及霉菌的双重考虑，常规的高低温、紫外线、化学试剂等理化杀菌方法都不能对裂盖马鞍菌子实体进行有效的杀菌，而6°Go辐照技术不仅具有杀菌快捷、彻底的特点，而且是一种业已被证实在食用菌辐射诱变育种中功效显著的方法，因此，采用6°Go辐照技术既可杀灭杂菌又可对裂盖马鞍菌进行菌种改良，可谓是一举两得。
[0010]营养因子及培养条件是影响裂盖马鞍菌菌丝体生长发育的重要因素，因此，营养及非营养因子的优化实验显得尤为重要。基于裂盖马鞍菌原生地生长基质成分检测实验结果，通过正交优化实验获得了适合裂盖马鞍菌菌丝体生长发育的培养方式、最优化培养基配方。
[0011]该方法已在实验室得到成功实践，结果表明该方法是是一种简便、实用的裂盖马鞍菌人工菌种分离培养方法。
【具体实施方式】
[0012]