抗微生物涂覆组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本公开的主题设及用于涂覆制品的抗微生物涂覆组合物（coating composition),包含；抗微生物肤；结合至所述抗微生物肤的纳米颗粒，其中，组合物适于 结合至制品的表面。所述组合物可W用作医疗器械和实验室表面的涂覆组合物。
【背景技术】
[0002] 由于金属纳米颗粒的独特表面等离子体共振（SPR)性能、稳定性、生物相容性、容 易合成、W及表面功能化，因此已经对它们用于生物传感器、药物递送、抗微生物材料、W及 其他生物医学应用进行了广泛研究1。在关于具有较宽抗微生物谱的抗微生物金属纳米 颗粒制备的文献中可得到数个报导 2'3。该些方法包括包含合成纳米颗粒、表面功能化和 封端抗微生物材料的多个步骤，或合成具有抗微生物性能的纳米颗粒的一锅法（onepot method)3。然而，由于该些纳米材料分布广泛并且不加选择暴露一段时间，因此存在细菌可 W采取针对它们的耐受性的可能性，该引起了全世界公众健康关注。大量研究已经记录了 通过多种机制，针对纳米银和纳米氧化侣的细菌不同菌株的耐受性 4。事实上，该种耐受性 还可W影响细菌针对其他种类抗微生物剂的耐受性4。此外，该些纳米颗粒对人类细胞的毒 性取决于尺寸、形状、功能性、W及剂量，并且没有详细研究由该些颗粒诱导的代谢反应和 免疫反应5。
[0003] 对于开发具有不会触发细菌耐受性和人类细胞毒性的性能的抗微生物纳米颗粒， 存在迫切需要。随后描述的抗微生物肤（AM巧是满足该些标准的一类具有前景的分子，该 是因为它们的作用方式W及它们代表新一代的抗生素。近来，已经将自组装AMP纳米颗粒、 负载在碳水化合物纳米颗粒上的AMP、W及与银纳米颗粒结合的AMP用作有效的抗微生物 剂6。通过蛋白水解降解可W减弱AMP的抗微生物活性，并且因此，已经合成了具有不同链 长的各种AMP类似物，W防止降解7。另一方面，纳米颗粒表面上的肤封端是可替代的方法， W阻止它们蛋白水解降解w'8。已经将具有不同生物学性能的肤用于在合成步骤过程中结 合金纳米颗粒，用于它们潜在的生物学应用9。此外，使用用于合成金属纳米颗粒的选择技 术如瞻菌体、细胞表面、W及酵母展示，已经合成了工程化肤1°。该些肤不仅特异性并且强 烈地结合至一定范围的不同金属、半导体、氧化物、W及生物矿物表面，而且精确地控制从 原子开始矿物化的无机纳米颗粒的形状和尺寸W。然而，关于肤如何控制纳米颗粒的形态 和尺寸的机理，出现了多个问题。如果将更好地理解合成机理，生物学上重要的肤可W用于 合成用在生物催化、成像、健康、W及治疗中的数个应用的先进材料。就我们所知，尚未对使 用AMP合成抗微生物的W及生物相容的金纳米颗粒作出努力。
[0004] 此外，植入物和生物医疗器械相关感染在患者中非常常见，该对医疗和卫生保 健行业造成严峻的挑战。经常实践利用新植入物除去和替换植入物，该确实是膨胀过程 (expansiveproce化re)。形成在植入物表面上的生物膜保护微生物免受常规施用抗生素 和来自人体的免疫反应。除此之外，抗生素暴露较长时间可W促进抗生素抗性表型的发 展，该导致在不存在有效医学治疗下对于控制感染的破坏性影响。使用抗生素（Rai，A.; Prabhune,A. ;Perry,C.C.J.Mater.Chem. 2010, 20, 6789.b)Shukla,A. ;Avadhany,S.N. ;Fang,J.C.Hammond,P.T.Small2010, 21，2392.c)Hanna,H. ;Benjamin,R.; Chatzinikolaou,I. ;Alakech,B. ;Richardson,D. ;Masfield,P. ;Dvorak,T.; Munsell，M.F. ;Darouiche，R. ;Kantarjian,比；Raad,I.J.Clin.Oncol. 2004, 22, 3263. d)Aumsuwan,N. ;McConnell,M.S.Urban,M.W.Biomacromol. 2009，10, 623)、季馈 盐(Lee,S.B. ;Koepsel,民.民.；Morley,S.W. ;Matyjaszewski,K. ;Sun,Y. ;Russell. A.J.Biomacromol. 2004, 5, 877.b)Murata,H. ;Koepsel.民.民.；Matyjaszewski,K.; Russell,A.J.Biomater. 2007, 28, 4870)、苯酷衍生物（Qumg，D. ;Papadakis，S.E. ;Yam，K. LInt.J.FoodSci.Technol. 2003, 38, 165)、氧化尉；（化，G. ;Vary,P.S. ;Lin,C_T.J.Phys. Chem.B2005, 109, 8889.b)Matsunaga，T. ;Tomoda，R. ;Nakajima，T. ;Nakamura，N.; Komine，T.Appl.Environ.Microbiol. 1988, 54. 1330)、臥及重金属如银（Silver,S. FernsMicrobiol.Rev. 2003, 27, 341.b)Atiyeh，B.S. ;Costagliola，M. ;Hayek，S.N.; Dibo,S.A.Burns2007, 33, 139.c)Dowling,D.P. ;Donnelly,K;McConnell,M.L;Eloy,R..; 分1'打过11(1，]\1^化;[11801王(1門111132001，398,602)、臥及锡衍生物（0111过6，1.分口口1.化咨过1101116古. 化em. 2003, 17, 81)已经开发了各种共价涂层和非共价涂层，臥对抗微生物感染，然而，利用 这些涂层臥达到具有较小细胞毒性作用的有效抗微生物表面，存在有限的成功。这些技术 的另一个缺点在于；在频繁使用么后，微生物可能将发展对抗这些涂层的耐受性巧age,K; Wilson,M. ;Parkin，I.P.J.Mater.Chem. 2009, 19, 3819)。因此，对于开发具有宽谱抗微生物 活性（其不仅杀死微生物和阻止生物膜生长而且还对细菌对抗涂层耐受性的发展具有较 小影响）用于生物医学植入物的强劲涂层（robustcoating),存在日益增长的兴趣。
[0005] 如么前所述，抗微生物版（AMP)、非经典药物可替代其他抗微生物药物，这是因为 它们的宽谱抗微生物活性和调节免疫反应的能力臥及对宿主细胞无毒性（(a)0naizi，S.A. ；Leong,S.S.J.Biotechnol.Adv. 2011, 29, 67.b)Costa,F.Carvalho,I.F.Montelaro,R. C. Gomes,P. ;Martins,C.L.ActaBiomaterialia2011，7, 1431.c)Andreu,D. ;Rivas,L. Biopolym. 1998, 47, 4andHilpert,KM. ；Jenssen,H. ;Kindrachuk,J. ;Fjell,C. D. ;Korner,J. ;Winkler,D.F.H. ;Weaver,L.L;Henklein,P. ;Ulrich，A.S. ;Chiang,S. 比Y. ;Farmer,S.W. ;Pante,N. ;Volkmer,R. ;Hancock,R.E.W.Chem.Biol. 2009，16, 58) Reddy，K.V. ;Yedery，R.D. ;Aranha，C.Int.J.Antimicrob.Agents2004, 24, 536.)。AMP 较短（15-50个氨基酸），在性质上是净正电荷具有较大变化的高度阳离子性，并且具有 采用两亲结构的趋向（（a)Onaizi,S.A. ;Leong,S.S.J.Biotechnol.Adv. 2011，29, 67.b) Costa,F.Carvalho,I.F.Montelaro,民.C.Gomes,P. ;Martins,C.L.ActaBiomaterialia 2011，7，1431.c)Andreu，D. ;Rivas，LBiopolym. 1998, 47, 4andHilpert，K;Elliott，M.; Jenssen,H. ;Kindrachuk,J. ;Fjell,C.D. ;Korner,J. ;Winkler,D.F.H. ;Weaver,L. L;Henklein,P. ;Ulrich，A.S. ;Chiang,S.H.Y. ;Farmer,S.W. ;Pante,N. ;Volkmer,民.； Hancock,R.E.W.Chem.Biol. 2009，16, 58andReddy,K.V;Yedery,R.D. ;Aranha,C. Int.J.Antimicrob.Agents2004,24,536;臥及a)Perron，G.G. ;Zasloff，M. ;Bell，G. Proc.Biol.Sci. 2006, 273, 251.b)Van'tHof,W. ;Veerman,E.C;Helmerhost,E.J.; Amerongen，A.V.Biol.Chem.2001，382,597)。近年来，在不同表面上AMP涂层（同时维持 它们的活性）的文献中已经报导了许多策略如物理（一层一层地组装（layerbylayer assembly))((a)Etienne, 0. ;Gasnier,C;Taddei,C;Voegel,J-C;Aunis,D. ;Schaaf,P.Metz-Boutigue,M-H. ;Bolcat〇-Bellemin,A-L;Egles,C.Biomater. 2005, 26, 6704.b) Etienne, 0. ;Picart,C;Taddei,C;Haikel,Y. ;Dimarcq,J.L;Schaaf,P. ;Voegel,J. C;0gier,J.A. ;Egles,C.Antimicrob.AgentsChemother. 2004, 48, 3662)和共 价固定 方争去（（a)Bagheri,M. ;Beyermann,M. ;Dathe,M.A.Antimicrob.Agents Chemotherap. 2009, 53, 1132.b)Haynie,S.L. ;Crum,G.A. ;Doele,B.A.Antimicrob.Agents Qiemotherap. 1995, 39, 301.c)Ferreira,L;Zumbuehl,AJ.Mater.Chem. 2009, 19, 7796)。 已经研究了包括间隔物类型、长度和柔性、臥及AMP的取向和浓度的不同参数对于固定 版活性的影响，臥开发高效、安全、臥及持久的抗微生物植入物和设备（(a)0naizi，S.A.; Leong,S.S.J.Biotechno1.Adv. 2011，29, 67.b)Costa,F.Carvalho,I.F.Montelaro,R. C. Gomes, P. ;Martins, C. L. Acta Biomaterialia 2011, 7, 1431. c) Andreu, D. ;Rivas, L. Biopolym. 1998, 47, 4and Hilpert, K M. ;Jenssen，H. ;Kindrachuk, J. ;Fjell，C. D. ;Korner, J. ;Winkler, D. F. H. ;Weaver, L. L ;Henklein, P. ;Ulrich, A. S. ;Chiang, S. 比Y. ;Farmer，S.W. ;Pante，N. ;Volkmer，R. ;Hancock，R.E.W.Qiem.Biol.2009，16,58and Reddy, K. V ;Yedery, R. D. ;Aranha, C. Int. J. Antimicrob. Agents 2004, 24, 536.，and a) Perron，G.G. ;Zasloff，M. ;Bell，G.Proc. Biol. Sci. 2006, 273, 251. b) Van't Hof, W.; Veerman, E. C ;Helmerhost,E.J. ;Amerongen, A. V. Biol. Chem. 2001，382, 597and a) Bagheri, M. ;Beyermann, M. ;Dathe, M. A. Antimicrob. Agents Chemotherap. 2009, 53, 1132. b) Haynie, S. L. ;Crum, G. A. ;Doele, B. A. Antimicrob. Agents Chemotherap. 1995, 39, 301. c) Ferreira, L；Zumbuehl, A J.Mater. Chem. 2009, 19, 7796and a)Humblot, V； Yala,J-F. ;Thebault,P. ;Boukerma, K ;Hequet, A. ;Berjeaud,J-M. ;Pradier,C-M. Biomater. 2009, 30, 3503. b) Gao, G. ;Yu，K;Kindrachuk，J. ;Brooks，D.E. ;Hancock，R. E. W. ;Kizhakkedathu, J. N. Biomacromol.2011, 12, 3715.c)Gabriel,M. ;Nazmi,K.; Veerman, E. C ;Amerongen, A. V. N. ;Zentner, A. Biocon j. Chem.2006, 17, 548.d) Hi Ipert, K.; Elliott, M.；Jenssen, H. ;Kindrachuk, J. ;Fjell，C. D. ;Korner, J. ;Winkler, D. F.比； Weaver, L. L ;Henklein, P. ;Ulrich，A. S. ;Chiang, S. H. Y. ;Farmer, S. W. ;Pante, N.; Volkmer, R. ;Hancock, R. E. W. Chem. Biol.2009, 16, 58.e) Steven,比D. ;Hotchkiss, J. H. J. Appl. Polym. Sci.2008, 110, 2665.f) Appendini, P.；Hotchkiss, J. H. J. Appl. Polym. Sci.2001，81，609.g) Cho, W. M. ; Joshi, B. P. ;Cho, H. ;Lee, K. H. Bioorg. Med. Chem. Lett.2007, 17, 5772)。就我们所知，除了其中在尉;表面上与聚合物刷（polymer brush)结 合的AMP示出了优异的体内抗微生物活性的一个研究，尚未进行多个研究用来证明在人 类血清存在下固定AMP的抗微生物活性（Gao，G. ;Lange，D. ;Hilpert，K;Kindrachuk，J.; Zou, Y. ;Cheng, J. T. J. ;Kazemzadeh-Narbat，M. ;Yu, K ;Wang,民.；Straus, S. K ;Brooks, D. E. ;Oiew，B.H. ;Hancock，R.E.W. ;Kizhakkeda化u，J.N. Biomater.2011，32, 3899)。
[0006] 本发明的实施方式么一是开发在存在人类血清下，在具有抗微生物活性下在 各种表面上抗微生物版（AM巧强劲涂层（robustcoating)的技术。杀菌版-蜂毒素 (Cecropin-mellitin) (CM)是存在的抗微生物版，其中，选择C端的半脱氨酸臥固定在 金纳米颗粒涂覆的玻璃表面和尉;表面上。CM版是具有15个氨基酸长度、包含来自杀菌 版-A和蜂毒素抗微生物版的序列的杂合抗微生物版。脱胺和硫醇-PEG-胺用于使表面 功能化，W研究两种分子的链长和柔性（flexibility)对系连CM肤的抗微生物活性的影 响。与其他报导方法（化)Gao，G.;化，K;Kin化achuk，J. ;Brooks，D.E. ;Hancock，R.E.W.; Kizhakkedathu,J.N.Biomacromol. 2011, 12, 3715.c)Gabriel,M. ;Nazmi,K;Veerman,E. C；Amerongen,A.V.N. ;Zentner,A.Bioconj.Chem. 2006, 17, 548andGao,G. ；Lange,D.； Hilpert,K；Kindrachuk,J. ；Zou,Y. ；Cheng,J.T.J. ;Kazemzadeh-Narbat,M. ；Yu,K； Wang,R. ；Straus,S.K；Brooks,D.E. ;Chew,B.H. ；Hancock,R.E.W. ；Kizhakkedathu,J. N.Biomater. 2011, 32, 3899andKazemzadeh-Narbat,M. ；Kindrachuk,J. ；Duan,K.； Jenssen,H. ;Hancock,R.E.W. ;Wang,R.Biomater. 2010, 31,9519)相比，将每平方厘米大量 CM肤（1.02mg/cm2)固定在硫醇-PEG-胺功能化的表面上。系连在脱胺功能化表面上的小 量CM肤起抑菌作用，而系连在脱胺或硫醇-阳G-胺功能化表面上的大量起杀菌作用，该由 AFM分析支持。系连在金纳米颗粒涂覆的铁表面上的CM肤在人类血清存在下维持了抗微生 物活性，具有优异的可复用性，持续了五个循环。
【发明内容】
[0007] 所公开的主题设及用于涂覆制品的抗微生物涂覆组合物，包含；抗微生物肤；结 合至所述抗微生物肤的纳米颗粒，其中，组合物适于结合至制品的表面。所述组合物可W用 作医疗器械和实验室表面的涂覆组合物。
[000引本发明主题的一种实施方式设及用于涂覆制品的抗微生物涂覆组合物，包含：抗 微生物肤和结合至所述抗微生物肤的纳米颗粒，其中，组合物适于结合至制品的表面。
[0009] 在描述的抗微生物涂覆组合物的另一实施方式中，纳米颗粒可W是金属纳米颗粒 或由金属层覆盖的纳米颗粒，优选地，所述纳米颗粒具有lO-lOOnm，优选地，15-50nm，更优 选地，20-30皿之间的尺寸。
[0010] 在描述的抗微生物涂覆组合物的另一实施方式中，抗微生物肤可W在C端具有半 脱氨酸，优选地，抗微生物肤模拟物、AMP的小分子模拟物。
[0011] 在描述的抗微生物涂覆组合物的另一实施方式中，抗微生物肤可W选自下组：杀 菌肤-蜂毒素（cecropin-mellitin)、爪赡抗菌肤（magainin)、皮抑菌肤（dermaseptin)、导 管素（cathelicidin)、防卫素（defensin)、蛋白整合素（protegrin)、本领域技术人员将意 识到的其他物质。
[0012] 在描述的抗微生物涂覆组合物的另一实施方式中，组合物可W进一步包含粘合 剂，优选地，分子，更优选地，聚合物，甚至更优选地，可W是聚阳离子或聚阴离子。在一种优 选的实施方式中