较快，15d后3品种的所有烟苗均恢复正常生长；后期（25d)观察显示，部分生理活性 调节物质处理的烟苗生长比较旺盛、生长势优于对照。
[0042] (2)常温恢复生长30、45、60d后烟苗的现蕾情况调查。观察发现：同一品种、不同 生理活性调节物质喷施处理的烟草植株现蕾时间有明显的差异，甜菜碱、脯氨酸、5-氨基乙 酰丙酸、水杨酸和ABA处理植株的现蕾时间均较对照明显"推迟"。
[0043] 2、低温逆境处理烟苗叶片电导率检测
[0044] 相对电导率是反映生物膜系统状况的一个重要生理指标。当植物遭遇逆境胁迫 时，细胞膜遭到破坏、透性增大，细胞内电解质的外渗将导致植物组织浸提液电导率增大， 即膜透性增大程度与植物抗逆性负相关。
[0045] 低温弱光照处理期间第0、2、4、6、8d中午，对14种植物生理活性调节物质处理烟 苗的第4或5叶片的相对电导率进行了检测，以进一步验证其对烟苗低温逆境抗性影响。检 测结果表明：与对照相比，大部分植物生理活性调节物质处理可减轻低温逆境胁迫所导致 的叶片相对电导率的增加，尤以甜菜碱、5-氨基乙酰丙酸、脯氨酸、水杨酸和ABA这5种植物 生理活性调节物质的减轻效果明显，即增强了烟苗的低温逆境抗性。
[0046] 综合评价参试3品种、14种植物生理活性调节物质叶面处理幼苗的低温逆境响应 表现（叶片萎蔫程度、冷害症状、叶片电导率）、常温恢复生长和现蕾表现三方面的情况（表 2)，并考虑其理化特性，这14种植物生理活性调节物质处理中，甜菜碱（BH)、脯氨酸（Pro)、 水杨酸（SA)、5_氨基乙酰丙酸（5-ALA)和脱落酸（ABA)的处理对烟草幼苗低温耐性的增强 作用比较明显，其处理幼苗表现出较强的低温抗性、常温恢复生长良好。据此，将这五种生 理活性调节物质视为烟草抗冷剂的主要候选成分开展进一步的研究。
[0047] 表2 14种生理活性调节物质对烟草品种K326幼苗低温逆境响应影响的综合评价
[0048]
[0049] 注：烟草幼苗低温胁迫反应的评价：
[0050]
[0051] 二、植物生理活性调节物质复合配方的筛选
[0052] 1、实验基本概况：依照前期单一植物生理活性调节物质初步筛选所确认的候选成 分及其浓度，设计生理活性调节物质复合配方组合8个（表3)，叶面喷施处理1日后开始低 温弱光照逆境处理。参试品种为K326和云87,实验材料的育成、人工气候室驯化、低温弱光 照逆境处理条件、观察项目及评价标准与前期实验相同。低温弱光照处理期间，第〇、〇. 5、 l、2、3、5、7d中午，观察、记录各复合配方处理烟苗的低温逆境响应（萎蔫程度、冷害症状）， 第0、l、3、5d午中测定各处理烟苗叶片光合活性，第0、2、4、6、8d午中采集各处理烟草叶片 鲜样、液氮冷冻研碎后，-8〇°C低温冰箱保存供理化分析用，实验结果见表4、5。
[0053] 表3生理活性调节物质8种复合配方组合及其浓度
[0054]
[0055] 注：表中八个组合分别为甜菜碱（B)、水杨酸（S)、ABA(Ab)、5-ALA(A)、脯氨酸（P) 的不同组合配方。
[0056] 2、复合配方调节剂的处理结果及分析（表4)
[0057] 2. 1低温逆境响应
[0058] 综合评价参试品种K326、云烟87、不同复合配方处理烟苗低温逆境处理期间的低 温响应（烟苗的冷害症状、萎蔫程度等），8个复合配方中组合②、③、⑥、⑧处理烟苗的低温 逆境响应明显优于对照。
[0059] 2. 2光合作用活性
[0060] 低温逆境处理期间两参试品种烟苗的光合活性均有所下降（数据略），但复合配 方处理可减轻烟苗光合活性的下降程度，其中复合配方②、③、⑥处理的烟苗其光合活性下 降的幅度较小、其它复合配方处理烟苗的下降幅度较大或与对照相当。
[0061] 2. 3常温生长恢复
[0062] IOd低温处理结束、恢复常温生长条件。常温恢复生长15d后，两品种所有处理的 烟苗均恢复正常生长，其中复合配方②、③、⑥处理的烟苗生长比较旺盛（明显优于对照）。
[0063] 综合分析比较8种植物生理活性调节物质复合配方叶面喷施处理对参试两品种 幼苗低温逆境响应的影响和常温恢复期间的生长状况，复合配方②、③、⑥的综合表现较 优，可作为候选复合配方、对其生理效果作进一步验证筛选。
[0064] 表4生理活性调节物质复合配方对参试品种幼苗低温逆境响应影响的初步评价
[0065]
[0066]
[0067] 另外，从上述8个复合配方的生理效果可以看出，含有脯氨酸（Pro)的组合效果 欠佳；因此，五种候选成分中"剔除"脯氨酸、将甜菜碱（BH)、水杨酸（SA)、脱落酸（ABA)和 5-氨基乙酰丙酸（5-ALA)四种组分作为优选成分用于进一步筛选复合配方。
[0068] 3、四种优选植物生理活性调节物质处理对烟草逆境生理生化指标的影响
[0069] 植物遭遇逆境胁迫时其基本策略是主动调整自身代谢，强化专一的抗性生理代 谢，积累相溶性溶质，如增加可溶性糖、脯氨酸等细胞内源性保护物质含量以及提高抗氧化 系统中酶的活性；同时，通过细胞内相溶性溶质清除活性氧、减轻氧化直接伤害或发挥分子 伴侣的作用来维持蛋白质的结构和功能，保护植物免受伤害。因此，逆境抗性相关的生理生 化指标是评价植物的逆境抗性的重要依据。
[0070] 为对抗冷剂的优选组分作出进一步的筛选确定，对4种优选成分甜菜碱（BH)、水 杨酸（SA)、脱落酸（ABA)和5-氨基乙酰丙酸（5-ALA)叶面处理K326烟苗（材料的育成同 前），在低温弱光照处理第〇、2、4、6、8d中午采样进行生理生化分析检测；检测指标：叶绿 素、丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白质、可溶性糖、抗坏血酸、过氧化氢、氧自由基含量。
[0071] 表5四种生理活性调节物质对K326幼苗逆境生理指标影响的综合评价
[0072]
[0073] 注：与对照相比的变化：显著增加++增加+相当土减少-显著减少一
[0074] 综合评价：优于对照V劣于对照X
[0075] 综合分析评价甜菜碱、水杨酸、脱落酸和5-氨基乙酰丙酸4种生理活性调节物质 的叶面处理对烟草幼苗逆境生理生化指标影响（表5、数据略）表明：这4种植物生理活性 调节物质的处理，可使烟草幼苗中脯氨酸、可溶性蛋白质、可溶性糖等相溶性溶质的含量增 加，降低了MDA和活性氧基团的积累量，减轻了细胞膜质、叶绿素的氧化伤害，均对烟草幼 苗逆境抗性的增强有促进作用（与前期烟草幼苗低温逆境响应的实验结果一致）；本实验 结果进一步确认了这4种植物生理活性调节物质可作为烟草抗冷剂复合配方的优选组分。
[0076] 实施例2
[0077] 将实施例1最后得到的四种优选组分结合其他辅助成分得到新的配方。
[0078] 称（量）取甜菜碱I. 15g、水杨酸5. 0mg、5-氨基乙酰丙酸0? 6g、脱落酸3mg、甘油 201111、吐温20〇'￥661120)0.51111、￥(3 0.5(^、氯化钙0.68和微量元素铁$6)511^、硼（8)511^、 猛（Mn)O. 5mg、锌（Zn) 10mg、钼（Mo)O. 05mg，用于烟草幼苗抗冷型叶面喷施剂的制备。
[0079] 先将组分水杨酸溶于IOml无水乙醇，获得溶液I;
[0080] 将组分甜菜碱、5-氨基乙酰丙酸、甘油、Vc、氯化钙和微量元素加入IL水中，不断 搅拌直至充分溶解获得溶液II;
[0081] 将组分脱落酸溶于IOml无水乙醇，获得溶液III;
[0082] 最后将溶液I、III分别加入到溶液II中、并加入吐温20,不断搅拌使其充分混合均 匀，制得本发明的抗冷型叶面喷施剂。
[0083] 实施例3
[0084] 称取甜菜碱I. 85g、水杨酸10mg、5_氨基乙酰丙酸lg、脱落酸4mg，其余组分、含量 以及配制步骤同实施例2。
[0085] 实施例4
[0086] 称取甜菜碱2. 25g、水杨酸8mg、5_氨基乙酰丙酸0. 8g、脱落酸5mg，其余组分、含量 以及配制步骤同实施例2。
[0087] 为了进一步证明本发明抗冷剂配方的效果，继续进行实施例5~8的试验验证。
[0088] 实施例5 :本发明实施例2制备的抗冷剂处理对烟草幼苗抗性生理生化指标的影 响
[0089] 实验于2013年4~7月、2014年4~7月，在湖南农业大学?中南烟草试验站大 型人工气候室进行。供试品种为K326和云87,实验材料育成同实施例1。选用生长旺盛、 长势基本一致的幼苗移入人工气候室，常温驯化3d(22~23°C、50001x、光照12h);抗冷剂 叶面喷施24h后开始低温逆境处理（8°C，lOOOlx、光照12h)。
[0090] 实验设置：实施例2制备的抗冷剂组（处理组）和清水喷施组（对照组），每组喷 施处理10株（以叶片上下表面湿透为度