一种以蒲公英根段为外植体建立高效再生体系的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种以蒲公英的根段为外植体建立高效再生 体系的方法。
【背景技术】
[0002] 蒲公英（Taraxacum)是菊科（Compositae)蒲公英属（Taraxacum)多年生草本植 物，全属约2000余种，主要产于北半球温带至亚热带地区。我国有70种，1变种，广泛分布 于东北、华北、西北、华中及西南各省区。蒲公英是传统的中药材，具有清热解毒，消肿散结， 利尿通淋之功效，被称为中药八大金刚之一。其化学成分复杂，主要有效成分具有抗氧化作 用(黄酮类物质和抗氧化酶等）、抗菌作用（绿原酸)和抗肿瘤作用（蒲公英留醇)等。此外， 蒲公英作为一种优质的营养保健蔬菜，越来越受到人们的青睐。因其集食用和药用于一身， 人们称之为食疗蔬菜。
[0003] 为了对蒲公英进行遗传转化和有效成分更加深入的研究，快速高效的再生系统是 建立和开展这些工作所需要的基本实验平台，而已有的工作还不系统，再生频率较低。目 前，体外高效再生系统的建立对于蒲公英突变体筛选和遗传转化都是必不可少的前提条 件，因为在农杆菌介导的遗传转化过程中，由于农杆菌的侵染和抗生素的存在，都会使再生 频率降低，因而一个高效的再生体系是转化成功的关键。因此，如何缩短培养时间、提高培 养效率、建立优良的转化系统，获得能够大量积累有效药用成分的突变体以及耐盐突变体 具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明是为了建立蒲公英根段组织培养繁殖体系，主要用于蒲公英高效再生体系 的建立。
[0005] 本发明解决上述问题所采用的技术方案包括如下步骤： ⑴根段诱导成苗：将蒲公英根段接种到MS培养基中，在组培室内培养20~30d得到 无菌试管苗，其MS培养基中含NAA(萘乙酸）0~2. 0mg/L、6-BA(苄基氨基嘌呤）1.0mg/ L、琼脂4~7g/L、蔗糖30~40g/L。⑵健壮植株生根培养：将步骤⑴中得到的健壮植株 置于1/2MS生根培养基中，在组培室内培养10~20天得到带根的完整植株，其中1/2MS生 根培养基中含IAA(H引噪乙酸）0~2. 5mg/L、NAA0~I. 0mg/L，6_BA0~2. 0mg/L、琼 脂4~6g/L、蔗糖30~40g/L。⑶炼苗与移栽：步骤⑵获得带根的完整植株后，在室温下 打开瓶盖，经过炼苗，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到基质中，在基 质中生长20~30d后移栽大田。
[0006] 根据本发明所述方法的进一步特征，所述步骤⑴中，所述培养基为：每升MS基本 培养基中添加NAA0~2. 0mg、6-BA0~1. 0mg、琼脂 4 ~7g、鹿糖 30~40g。
[0007] 根据本发明所述方法的进一步特征，所述步骤⑴中，采用生长20~30天根段为外 植体，直接进行无菌接种。
[0008] 根据本发明所述方法的进一步特征，所述步骤⑵中，所述培养基为：每升1/2MS 生根培养基中含IAA0~2. 5mg、NAA0~I. 0mg，6_BA0~2. 0mg、琼脂4~6g、鹿糖 30~40g〇
[0009] 根据本发明所述方法的进一步特征，所述步骤⑶中，簇生带根的再生苗直接或分 散为带有3~5个植株的丛苗形式进行移栽。
[0010] 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤⑶中，移栽基质采用泥炭土： 珍珠岩为1:1~3:1 (V/V)的混合基质。
[0011] 根据本发明所述方法的进一步特征，所述步骤⑶中，移栽后的培养液为自来水或 者1/4MS培养液。
[0012] 本发明的突出优点和效果： 1、经实验证明，米用MS+0 ~2. 0mg/LNAA+0 ~I. 0mg/L6-BA+30 ~40g/L鹿糖 +4~7g/L琼脂作为蒲公英根段诱导培养基，外植体诱导为丛生芽的发生率达到98. 8%，单 个外植体平均成苗18~36株，组织培养苗生长良好，基本保持原种特性。
[0013] 2、经实验证明，在本发明所述方法中，采用蒲公英根段作为外植体，外植体的成活 率达到99. 7%，诱导率为99. 2%以上，外植体可以直接诱导并分化出多个芽点。
[0014] 3、经实验证明在本发明所述方法中，采用1/2MS+0~2.5mg/LIAA+ 0~LOmg/ LNAA+0~2. 0mg/L6-BA+30~40g/L鹿糖+4~7g/L琼脂作为蒲公英无菌苗的生根 培养基，无菌苗的生根条数为10~21条，根长为3. 0~8. 2cm，生根率可达98. 6%以上，试 管苗长势旺盛，叶片较厚。
[0015] 4、经实验证明，在本发明所述方法中，经炼苗，簇生的组织培养苗可直接或分散移 栽到[泥炭土：珍珠岩=1:1~3:1(V/V)]的混合基质中，3d后丛生苗的成活率达到 97. 1%，且生长旺盛。
[0016] 5、与现有的繁殖技术相比，本发明所述技术方法极显著简化了蒲公英育苗程序， 缩短育苗周期，提高无性繁殖系数，保持原种特性，培养程序简单，达到一次外植体诱导即 获得大量幼苗的效果，是实现蒲公英优质种苗工厂化生产的有效途径。
[0017] 6、本发明所述方法无需专有设备克服外植体的细菌污染对育苗造成的影响，操作 简便。
[0018] 综上所述，本发明以蒲公英无菌根段为材料，研究不同生长调节剂组合配方对蒲 公英根段再生体系建立的影响，通过筛选培养基组分，优化培养条件，简化组织培养技术流 程，探索出建立快速高效的再生体系，缩短了组织培养时间、提高了培养效率、建立了优良 的转化系统，对获得能够大量积累有效药用成分的突变体以及耐盐突变体提供了技术支 撑。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明以蒲公英根为外植体进行组织培养快速繁殖方法的技术路线工序 流程图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】进一步说明。
[0021] 本发明方法的工序包括： ⑴蒲公英无菌试管苗的诱导：取生长健康带根的无菌蒲公英种苗，剪下根段，用灭过菌 的滤纸吸干水分，然后将根段剪成根段，将根段接种到MS培养基中。MS培养基中NAA浓度 为0~2. 0mg/L，6-BA浓度为0~I. 0mg/L，蔗糖和琼脂的浓度分别为30~40g/L和4~ 7g/L。培养20~30d时，每个外植体诱导为丛生芽的发生率达到98. 8%，单个外植体平均成 苗18~36株，组织培养苗生长良好，基本保持原种特性。
[0022] ⑵试管苗丛生芽快速增殖培养：将步骤⑴中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养 基中培养。其中1/2MS生根培养基中IAA浓度为0~2. 5mg/L、NAA浓度为0~I. 0mg/L、 6-BA浓度为0~2.Omg/L、蔗糖和琼脂的浓度分别为30~40g/L和4~6g/L。培养10~ 20d时，根条数为10~21条，根长可达3. 0~8. 2cm，生根率可达8. 6%以上，试管苗生长旺 盛，叶柄粗壮，叶片加厚。
[0023] ⑶健壮植株生根培养：将步骤⑵中获得带根的完整植株，在室温下打开瓶盖，经过 炼苗，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到基质中，在基质中生长20~ 30d后移栽大田。30d后再生苗的成活率达到97. 1%，且生长旺盛。
【主权项】
1. 一种以蒲公英根段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于，包括如下步 骤： ⑴蒲公英的根段诱导成苗：将蒲公英无菌根段接种到MS培养基中，在组培室内培养 20~30d得到无菌试管苗，其中MS培养基中含NAAO~2.Omg/L、6-BAO~I.Omg/L、琼 脂4~7g/L、鹿糖30~40g/L; 纖试管苗生根培养：将步骤⑴中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中，在组培室 内培养10~20d得到带根的完整植株，其中1/2MS生根培养基中含IAA0~2. 5mg/L、NAA 0 ~I. 0mg，6_BA0 ~2. 0mg/L、琼脂 4 ~6g/L、鹿糖 30 ~40g/L; ⑶炼苗与移栽：步骤获得带根的完整植株后，在室温下打开瓶盖，经过炼苗，表面角 质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到基质中，在基质中生长20~30d后移栽大 田。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤⑴中，所述培养基为：每升MS基 本培养基中添加NAA0~2.0mg、6-BA0~L0mg、琼脂4~7g、鹿糖30~40g。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤⑴中，采用生长20~30d无菌 根为外植体，直接进行无菌接种。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤屬中，所述培养基为：每升 1/2MS生根培养基中含IAA0~2. 5mg，NAA0~L0mg，6-BA0~2. 0mg琼脂4. 5g、蔗 糖 30~40g。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤⑶中，簇生的再生苗直接或分 散为带有3~5个植株的丛生苗形式进行移栽。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤⑶中，移栽基质采用泥炭土：珍 珠岩为1:1~3:1 (V/V)的混合基质。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤⑶中，移栽后的培养液为自来 水或者1/4MS培养液。
【专利摘要】本发明涉及一种以药食两用植物蒲公英根段为外植体建立高效再生体系的方法，本发明所述的方法包括如下步骤：⑴将蒲公英根段置于MS培养基中诱导一步成苗；⑵将所述健壮丛生芽或植株置于1/2MS生根培养基中培养得到完整的带根苗；⑶取完整的带根苗进行炼苗后置于基质中生长20~30d后移栽至大田。采用本发明所述方法得到的种苗健壮、成活率高，可在短期内提供大量蒲公英的优质种苗。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105210881
【申请号】CN201510723050
【发明人】朱金霞, 张源沛, 郑国保, 孔德杰, 朱永兴, 吕学莲, 白海波
【申请人】宁夏农林科学院
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月29日