化的玉米茎节转移到共培养培养基中：将侵染后的茎节 在无菌纸上放置5分钟以吸附其表面的水分，然后将玉米茎节垂直放到共培养基上光照 培养，共培养温度为24-26°C，共培养时间为48-72h ;
[0054] (4)将玉米茎节从共培养基中转移到诱导培养基中：将步骤（3)中经过共培养的 玉米茎节垂直接种到诱导培养基上，成苗的光照强度为75001UX，温度为24-26°C，湿度为 80% ；
[0055] (5)将玉米茎节再生苗进行炼苗和室内移栽，包括下列步骤：
[0056] 5. 1选取经诱导形成的健壮玉米幼苗，进行开盖壮苗处理，壮苗时将诱导培养基表 面覆盖5-10ml的无菌水，且每日更换无菌水，炼苗的光照强度为75001UX，炼苗的温度为 24-26°C，开盖炼苗的时间为5-7d ;
[0057] 5. 2将经步骤5. 1开盖炼苗的玉米幼苗取出，洗净琼脂，光照培养室内移栽于按草 炭土：輕石：珍珠岩=3:1:1配制的土壤中，并进行覆膜保湿；
[0058] 5. 3移栽后的2-3天内避免阳光直接照射，4-5天后置光下培养，移栽炼苗的玉米 幼苗的培养温度为24-26 °C ;
[0059] (6)玉米茎节再生苗向田间移栽：将步骤（5)中经室内炼苗的茎节再生苗连同盆 内的土，在避免阳光直接照射的情况下，移栽到田间或温室中，移栽前3天避免浇水，移栽 后每天浇灌1次，每次200ml。
[0060] 步骤（1)所述种子萌发培养基的成分和浓度为：1/2MS大量元素、MS微量元素 、MS 铁盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白（CH)600mg/L、鹿糖（sugar)30g/L、琼脂（agar)6. 5g/L。
[0061] 步骤⑵所述重悬培养基的成分和浓度为：MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、改 良MS有机成分、水解酪蛋白（CH)600mg/L、α-萘乙酸（NAA)0.4mg/L、蔗糖（sugar)30g/L、 乙酰丁香酮（AS) 40mg/L，pH 为 6· 0。
[0062] 步骤⑶所述共培养培养基的成分和浓度为：MS大量元素、MS微量元素、MS铁 盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白（CH)600mg/L、α-萘乙酸（NAA)0.4mg/L、乙酰丁香酮 (AS)40mg/L、鹿糖（sugar)30g/L、琼脂（agar)6.5g/L，pH 为 6.0。
[0063] 步骤⑷和（5)所述诱导培养基的成分和浓度为：MS大量元素、MS微量元素 、MS 铁盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白（CH)500-600mg/L、α-萘乙酸（NAA)0.4mg/L、蔗糖 (sugar) 30g/L、琼脂（agar) 5. 5-6. 5g/L、头孢噻Η亏钠 400mg/L，pH 为 6. 0。
[0064] 所述改良13有机成分和浓度为：￥1311〇11^/1、'\^6111^/1、烟酸111^/1、甘氨酸0.0511^/ L、肌醇 100mg/L、生物素 0· 05mg/L。
[0065] 所涉及的MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐和改良MS有机成分的详细内容如下：
[0066] MS大量元素
[0069] 备注：配制1000ml培养基时，吸取20 X母液50ml。
[0070] MS微量元素
[0072] 备注：配制1000ml培养基时，吸取200 X母液5ml。
[0073] MS 铁盐
[0075] 备注：配制1000ml培养基时，吸取200 X母液5ml。 [0076] 保存于棕色磨口瓶中。
[0077] 改良MS有机成分
[0079] 备注：配制1000ml培养基时，吸取200 X母液5ml。
【主权项】
1. 一种玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法，其特征在于包括下列 步骤： (1) 将玉米自交系成熟种子进行消毒、接种，包括下列步骤： 1.1将玉米自交系成熟种子用70%乙醇和0.1%取(：12依次消毒121^11，无菌水冲洗3-5 次； 1. 2将经步骤1. 1处理后的玉米种子接种到种子萌发培养基中，24-26Γ完全黑暗条件 下萌发； 1. 3待幼苗高度达到lcm-2cm时，置光下生长； (2) 将玉米种子萌发幼苗的茎节进行遗传转化，包括下列步骤： 2. 1当玉米幼苗高度达到3-5cm时，在无菌条件下切取莖节，莖节以上保留0. 5cm，莖节 以下保留0. 5cm，作为遗传转化受体使用，将茎节接种于重悬培养基中准备进行遗传转化； 2. 2制备重悬液，包括下列步骤： 2. 2. 1收集菌体：采用农杆菌菌株EHA105,将经过划线活化、含有目的基因载体的农杆 菌菌液扩摇到l〇ml YEP培养基中，28 °C，180rpm扩摇过夜，再将扩摇过夜的农杆菌菌液扩 摇到40ml YEP培养基中，28°C，180rpm扩摇到0D6。。在0· 8-L 0的范围内，4°C，lOOOOrpm离 心lOmin收集菌体； 2. 2. 2重悬菌液：向步骤2. 2. 1收集的菌体中加入重悬培养基，重悬菌液0D6。。在 0. 6-0. 7的范围内，重悬菌液在两小时内使用； (3) 将经步骤（2)遗传转化的玉米茎节转移到共培养培养基中：将侵染后的茎节在无 菌纸上放置5分钟以吸附其表面的水分，然后将玉米茎节垂直放到共培养基上散光培养， 共培养温度为24-26 °C，共培养时间为48-72h ; (4) 将玉米茎节从共培养基中转移到诱导培养基中：将步骤（3)中经过共培养的玉米 茎节垂直接种到诱导培养基上，成苗的光照强度为75001UX，温度为24-26°C，湿度为80% ; (5) 将玉米茎节再生苗进行炼苗和室内移栽，包括下列步骤： 5. 1选取经诱导形成的健壮玉米幼苗，进行开盖壮苗处理，壮苗时将诱导培养基表 面覆盖5-10ml的无菌水，且每日更换无菌水，炼苗的光照强度为75001UX，炼苗的温度为 24-26°C，开盖炼苗的时间为5-7d ; 5. 2将经步骤5. 1开盖炼苗的玉米幼苗取出，洗净琼脂，光照培养室内移栽于按草炭 土：蛭石：珍珠岩=3:1:1配制的土壤中，并进行覆膜保湿； 5. 3移栽后的2-3天内避免阳光直接照射，4-5天后置光下培养，移栽炼苗的玉米幼苗 的培养温度为24-26 °C ; (6) 玉米茎节再生苗向田间移栽：将步骤（5)中经室内炼苗的茎节再生苗连同盆内的 土，在避免阳光直接照射的情况下，移栽到田间或温室中，移栽前3天避免浇水，移栽后每 天浇灌1次，每次200ml。2. 按权利要求1所述的玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法，其特 征在于步骤（1)所述种子萌发培养基的成分和浓度为：1/2MS大量元素、MS微量元素、MS铁 盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白（CH)600mg/L、鹿糖（sugar)30g/L、琼脂（agar)6.5g/L。3. 按权利要求1所述的玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法，其特 征在于步骤（2)所述重悬培养基的成分和浓度为：MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、改良 MS有机成分、水解酪蛋白（CH)600mg/L、α-萘乙酸（NAA)0.4mg/L、蔗糖（sugar)30g/L、乙 酰丁香酮（AS) 40mg/L，pH 为 6. 0。4. 按权利要求1所述的玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法，其 特征在于步骤（3)所述共培养培养基的成分和浓度为：MS大量元素、MS微量元素、MS铁 盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白（CH)600mg/L、α-萘乙酸（NAA)0.4mg/L、乙酰丁香酮 (AS)40mg/L、鹿糖（sugar)30g/L、琼脂（agar)6.5g/L，pH 为 6.0。5. 按权利要求1所述的玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法，其 特征在于步骤（4)和（5)所述诱导培养基的成分和浓度为：MS大量元素、MS微量元素、MS 铁盐、改良MS有机成分、水解酪蛋白（CH)500-600mg/L、α-萘乙酸（NAA)0.4mg/L、蔗糖 (sugar) 30g/L、琼脂（agar) 5. 5-6. 5g/L、头孢噻Η亏钠 400mg/L，pH 为 6. 0。6. 按权利要求2、3、4、5所述的玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方 法，其特征在于所述改良MS有机成分和浓度为：VBi 10mg/L、VB6 lmg/L、烟酸lmg/L、甘氨酸 0· 05mg/L、肌醇 100mg/L、生物素 0· 05mg/L。
【专利摘要】玉米自交系成熟种子幼苗茎节遗传转化直接成苗的方法属生物工程领域，本发明包括下列步骤：1.将玉米自交系成熟种子进行消毒、接种；2.将玉米种子萌发幼苗茎节进行遗传转化；3.将遗传转化的玉米茎节转移到共培养基中；4.将玉米茎节从共培养基中转移到诱导培养基中；5.将玉米茎节再生苗进行炼苗和室内移栽；6.将玉米茎节再生苗向田间移栽。与传统的玉米体细胞胚胎发生途径相比，本发明通过器官发生途径直接成苗，可在短期内迅速获得大量再生植株，且不受基因类型和季节限制，取材方便，不易污染、成苗率高，为玉米遗传转化产业化研究奠定了坚实基础。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105284626
【申请号】CN201510881184
【发明人】原亚萍, 张曼, 冯逸龙, 吴颖, 韩俊友, 单晓辉, 苏胜忠, 李世鹏, 刘宏魁, 李颖
【申请人】吉林大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年12月4日