专利名称：用天冬氨酸通过酶促的转氨基作用生产l－膦丝菌素的方法
技术领域：
本发明涉及农作物保护剂合成的技术领域，特别是L-2-氨基-4-(羟甲基氧膦基)丁酸(L-膦丝菌素，L-PPT)的合成，该合成是自4-(羟甲基氧膦基)-2-氧代丁酸(HMPB，PPO)，在有天冬氨酸，PPO-特异性天冬氨酸转氨酶(Asp-TA)存在的情况下，通过酶促的转氨基作用进行的。化合物L-PPT，它的盐和某些衍生物是具除草活性的非-蛋白原性氨基酸或其衍生物和盐(DE-A-2717440)。每种化合物的L-形式是生物活性的，而每种化合物的D形式实际上是非活性的(DE-A-2856260)。
先前已经公开了转氨酶由于其高立体选择性和相对较宽的底物特异性，其对于自氨基酸的酮酸前体生产相应氨基酸的手性酶促合成是特别适宜的。然而，转氨酶工业使用的一个缺点是，其大约为1的平衡常数，通常仅能得到所需要产品50％的产率(US-A-4,826,766)。EP-A-0344683和US-A-5,221,737描述了除草剂L-膦丝菌素[(L-同型丙氨酸-4-基(甲基)次膦酸，L-2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸，L-PPT)]，一种非蛋白原性氨基酸的制备，该制备是用来源于大肠杆菌的4-氨基-丁酸2-酮戊二酸转氨酶(GABA转氨酶，EC2.6.1.19)，自相应的酮酸[(2-氧代-4-(羟基)(甲基)膦基)丁酸，PPO)]，通过转氨基作用进行的。定量转化需要很多摩尔量的氨基供体谷氨酸，其使反应产物难于纯化。
此问题的一个解决办法是使用天冬氨酸作为氨基供体，这是因为相应的酮酸草酰乙酸在含水介质中是不稳定的，并自发地脱羧为丙酮酸。反应产物自平衡的除去使得逆反应不能进行，而甚至是使用等摩尔的酮酸和供体氨基酸，也可以进行定量转化。此类型的方法在EP-A-0135846中描述。
然而，还没有记载将此原理应用至L-膦丝菌素的酶促合成，这是因为所述GABA转氨酶不接受天冬氨酸作为氨基供体，且没有任何已知的对L-膦丝菌素和天冬氨酸具有接合特异性的转氨酶。
另外，(EP-A-0249188和EP-A-0477902)已经提出了由PPT特异性转氨酶和谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT，EC2.6.1.1)组成的偶联2-酶系统。在此反应过程中，用于L-PPT合成中的谷氨酸是通过GOT自天冬氨酸再生的。天冬氨酸转氨酶自身对于L-PPT/PPO是没有特异性的。草酰乙酸自发转化成丙酮酸还导致总反应中平衡向L-PPT合成的方向移动。在这种情况下，使用等摩尔PPO和天冬氨酸的定量产品产率明显少于使用等摩尔量谷氨酸的。
此偶联酶方法与受体酮酸PPO相比，可以明显减少底物溶液中存在的多余供体氨基酸，其简化了产品溶液的处理。然而，在偶联反应过程中仍然需要使用谷氨酸，其在与酮戊二酸的平衡中，保留在反应产物中或必须通过复杂的纯化方法将其自结构上非常相似的氨基酸L-PPT中除去。此外，由于不同的动力学参数，使用2种酶的反应过程比使用1种酶的更难于最佳化。
虽然，先前已经公开了天冬氨酸转氨酶如GOT，不转化PPO，人们已经惊奇地发现了一种来源于微生物的天冬氨酸转氨酶，其同样以高特异性将L-PPT/PPO用作为底物。这些酶催化天冬氨酸的α-氨基直接转化为PPO。
因此，本发明涉及一种制备通式(I)的L-2-氨基-4-(羟甲基氧膦基)丁酸(L-膦丝菌素，L-PPT)，其衍生物和/或盐的方法， 该方法是自作为受体的通式(II)的4-(羟甲基氧膦基)-2-氧代丁酸(HMPB，PPO)，其衍生物和/或盐 在有天冬氨酸作为供体的情况下，通过酶促的转氨基反应进行的，转氨基反应是在有一种或多种受体特异性的，特别是PPO特异性的天冬氨酸转氨酶(Asp-TA)存在的情况下进行的，优选在有一种或多种热稳定和/或分离的天冬氨酸转氨酶存在的情况下，更优选在有一种或多种对丙酮酸具有最小底物特异性的的天冬氨酸转氨酶存在的情况下进行，以提供草酰乙酸和通式(I)的化合物，其衍生物或盐，以便减少或基本上避免副产物丙氨酸的形成。
L-PPT的盐通常是与无机和/或有机酸的盐或与无机和/或有机碱的单-和二盐。与酸的盐(酸加成盐)是，例如，与无机酸如盐酸(氢氯化物)或硫酸(硫酸盐)，或与碳酸(碳酸盐，碳酸氢盐)或与有机酸如醋酸(醋酸盐)，甲酸(甲酸盐)，丙酸(丙酸盐)或酒石酸(酒石酸盐)的盐。与碱的盐是，例如，碱金属和碱土金属盐，铵盐，与有机胺如伯，仲或叔胺的盐，和季铵盐。
衍生物包括，例如，在次膦酸基上酯化的L-PPT的酯，例如用C1-C12-烷醇如甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，正，异和仲或叔丁醇和C3-C6-环烷醇如环己醇酯化的。衍生物还包括，选择性地或附带地在羧基上被上述醇酯化的L-PPT的酯。衍生物还可以是L-PPT的羧酰胺和其衍生物，其中，在烷基部分含具有1-4个碳原子的N-烷基或N，N-二烷基酰胺。
PPO的衍生物是，例如，其与无机和/或有机碱的盐，适宜的碱已经在上述与L-PPT相关的内容中描述了。衍生物是，例如，PPO的酯，其是在羧基或次膦酸基或两者之上酯化的。适宜于酯基的醇形式上是适宜于L-PPT酯的醇，优选上述提到的烷基醇。衍生物还可以是PPO的羧酰胺和其在次膦酸基上酯化的衍生物，且适当时可以是相应的N-烷基或N，N-二烷基酰胺。
天冬氨酸优选指定L-天冬氨酸或它的盐，优选碱金属盐。然而，使用L-天冬氨酸和D-天冬氨酸的混合物，例如外消旋的D，L-天冬氨酸，作为天冬氨酸也是可以的。
本发明方法中另一种可能途径是通过物理的，化学的和/或酶促的方法，优选通过酶促催化转化的方法，例如通过乙酰乳酸合成酶(ALS)，丙酮酸脱羧酶，丙酮酸氧化酶，特别是乙酰乳酸合成酶除去存在于反应混合物中的丙酮酸；丙酮酸的转化特别优选在有相对耐热的酶存在的情况下进行。因而所用的酶可以是固定化形式的。
底物(供体和受体)以例如0.5-2∶1(基于L-天冬氨酸PPO)，优选0.75-1.5∶1的摩尔比，特别是大约等摩尔的比例使用。使用L-和D-天冬氨酸(盐)的混合物时，L-天冬氨酸(盐)的摩尔量是决定性的。PPO衍生物必须以与PPO相等的摩尔量使用。底物溶液中谷氨酸的存在不是必需的。某些酶显示了极好的热稳定性。因此，该方法可以在较宽的温度范围内，例如10-95℃，优选40-90℃，特别是60-85℃的温度范围内进行。没有显示特别热稳定性的酶的优选温度范围是20-70℃，特别是30-40℃。
相对较高的温度使得反应速率显著加速，且可以较高的空间/时间产率转化更浓的底物溶液(10％强度)。反应优选在6.5-10，优选7-9，特别是7.5-8.5的pH范围内，在pKa值为7-9的适当缓冲液系统，特别是磷酸盐或三羟甲基氨基甲烷缓冲液中进行。令人惊奇地是，已经详细生化表征的酶对于GABA没有特异性，因而明显不同于先前公开的L-PPT/PPO-特异性转氨酶。
如果可以在转氨基作用过程中避免丙氨酸的形成或使其达到最小，则可以在反应中得到较高的转化速率。为了这个目的，可以使用对丙酮酸没有底物特异性的优化ASP-TA变体。另一种可能性是物理地(例如使用选择性通透膜)和/或化学地或酶促地(例如通过用丙酮酸脱羧酶，丙酮酸氧化酶或草酰乙酸合成酶)自反应混合物除去丙酮酸(见，例如，Taylor et al.，TIBTECH(1998)，vol.16，412-418；Fotheringham et al.，CHIMICA OGGI/chemistry today(1997)，9/10，33-38；WO98/53088)。
自反应溶液中纯化L-PPT产品可以通过已知的和常规的方法，例如用甲基异丁基酮提取，或用阳离子交换色谱，例如用AmberliteIR120(由Sigma制造)等进行。
在下列实施例中进一步说明本发明的方法，并在权利要求中限定本发明。下列实施例不理解为对本发明在这点上的限制。
实施例1.)具有L-PPT特异性天冬氨酸转氨酶活性的土壤微生物的分离培养用10ml pH＝7.0的10mM磷酸钠缓冲液室温提取1g各种土壤样品(腐殖土，壤土，沙土/Schwanheimer Düne，Frankfrut)1小时。自提取物接种下列培养基中的富集培养物5mM葡萄糖5mM琥珀酸10mM 甘油10mM PPO10mM L-天冬氨酸50ml/l 溶液A25ml/l 溶液B溶液A50g/lK2HPO4溶液B2.5g/lMgSO40.5g/l NaCl25ml/l 下述贮存液该贮存液含 1g/lFeSO4×7H2O0.22g/lMnSO4×H2O0.1g/lH3BO30.1g/lNa2MoO4×2H2O0.18g/lZnSO4×7H2O0.16g/lCuSO4×5H2O0.1g/lCoCl2×6H2O1ml/l1NHCl培养物在28℃，200rpm的振荡器上培养3-5天。于所试验土壤样品的其中一种(腐殖土)中富集到能够用L-天冬氨酸作为单一N源生长的微生物。在相同的培养基中进一步几次传代该培养物，然后在相同组成的琼脂培养基上涂板，以得到分离的单克隆菌落。28℃培养3-5天之后，分离总共100个单克隆菌落，然后在液体培养基(见上)中培养。重复琼脂平板上的分离2次，以确保得到纯净的培养物。
在这些选择循环之后，得到能够以L-天冬氨酸作为单一N源的20个菌株。
为了试验PPO/Asp转氨酶的活性，2ml各菌株的培养物按照上述生长。用0.5％甲苯，0.5％乙醇在37℃透化处理400μl的每种培养物30分钟。在50μl的反应混合物中分别混悬细胞沉淀，并在28℃过夜培养，其中该反应混合物是由50mM的PPO，50mM的L-天冬氨酸，50mM的Tris/HCL，pH＝8.0，10μM的磷酸吡哆醛组成的。
为了所形成PPT的定量鉴定，用水1∶5稀释反应上清液，并在纤维素HPTLC平板(Merck)上，用正丁醇∶冰醋酸∶水＝60∶15∶25作为流动相，通过薄层色谱分析其5μl部分。通过茚三酮染色观察氨基酸。使用4种菌株(DSM 13353，DSM 13354，DSM 13355，DSM 13356；所有菌株均已经在“Deutsche Sammlung von Mikoorganismen undZellkulturen GmbH”保藏)可以检测到膦丝菌素的形成。反应产物的对映异构纯度是通过手性HPLC[用青霉胺作为基质(由Phenomenex制造)的分离柱Chirex(D)进行研究](流动相2mM CuSO4，10％甲醇，流速0.5ml/min，UV检测254nm，保留时间L-PPT大约17分钟，D-PPT大约21分钟)测定的。由此在所有4种研究的试验样品中可以检测到L-PPT，而无D-PPT反应产物。
为了通过生物转化制备L-PPT和定量分析反应进展，使1升的各种土壤细菌菌株DSM 13354，DSM 13355，DSM 13356在上页中描述的培养基中28℃培养48小时。通过离心，用10mM的NaCl，10mM磷酸钠，pH＝7.5，洗一次，然后过夜冻干来采集细胞。
为了进行生物转化，在10ml下列底物溶液中混悬200mg干燥生物量的上面鉴定的各土壤细菌菌株100mMPPO200mML-天冬氨酸100mMTris/HCL，pH＝8.01mM 磷酸吡哆醛在200rpm培养振荡器和37℃下培养混合物。在1，2，4，8，24和30小时之后，取出200μl样品，并按照上页描述的，在HPLC中分析。L-PPT和L-天冬氨酸的测量结果在表1中概括。所获得的最大转化率[所产生的L-PPT/底物中的PPO×100]约为59％(DSM 13355)。
表1通过使用土壤分离物进行生物转化的PPO/天冬氨酸转氨基反应的进展
*反应温度37℃2)使用转氨酶制剂的PPO/天冬氨酸转氨基作用的直接检测将总共7种不同的商业上应用的转氨酶用于PPO/天冬氨酸转氨基作用的试验。自微生物获得(热稳定的转氨酶AMN-001-01，-001-02，-001-03，-001-04，-001-05，包含在来源于Diversa CAT# AMN-001(1998)的氨基转移酶试验试剂盒中；谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(GOT)，谷氨酸-丙酮酸转氨酶(GPT)，Sigma)。将酶制剂以5mg/ml蛋白质浓度溶于50mM Tris/HCl缓冲液中，pH＝8.0，然后相对于相同的缓冲液在4℃过夜透析。其目的在于除去可能存在于酶制剂中并可能在转氨基作用中作为中间体载体发挥作用的氨基供体和受体。然后将酶溶液调节至1mg/ml，并与反应缓冲液在50μl混合物中，在具体酶的最佳温度下孵育1小时，该缓冲液是由50mM PPO，50mM L-天冬氨酸，50mM Tris/HCl，pH＝8.0，10μM磷酸吡哆醛组成的。
通过实施例1中描述的手性HPLC和薄层色谱分析酶试验。用2种热稳定的酶，AMN-001-3和AMN-001-4(反应温度80℃)，可以检测到通过转氨基作用自L-天冬氨酸对映体选择性地形成L-PPT。试验的其它酶均未显示任何活性。
3.)热稳定转氨酶AMN-001-03的PPO/天冬氨酸转氨基作用的定量研究因为比活性相对较高，为了更准确的表征L-PPT合成反应，选择使用转氨酶AMN-001-03。将1mg的AMN-001-03转氨酶在80℃与1ml的底物溶液一起孵育，该底物溶液是由40mM PPO，48mM L-天冬氨酸，50mM Tris/HCL，pH＝8.0，0.1mM磷酸吡哆醛组成的。为了分析反应进展，取50μl等分试样24小时，并在-20℃冷冻。在氨基酸分析器(Biotronic LC 5001)中测定PPT和天冬氨酸。结果在表2中表示。在所选择的条件下，L-PPT合成反应在2-4小时之后达到平衡。所用的氨基供体，L-天冬氨酸，在7小时之后被完全地消耗掉了。获得大约75％的转化率[所产生的L-PPT/底物中的PPO×100]。
表3使用部分纯化的热稳定转氨酶AMN-001-03，通过转氨基作用制备L-PTT
*反应温度80℃
权利要求
1.通式(I)的L-2-氨基-4-(羟甲基氧膦基)丁酸(L-膦丝菌素，L-PTT)，其衍生物和/或盐的制备方法， 该方法是自通式(II)的4-(羟甲基氧膦基)-2-氧代丁酸(HMPB，PPO)，其衍生物和/或盐作为受体 在有天冬氨酸作为供体的情况下，通过酶促的转氨基作用进行的，其中的转氨基作用是在有一种或多种受体特异性的天冬氨酸转氨酶(Asp-TA)存在的情况下进行的，以提供草酰乙酸和通式(I)的化合物，其衍生物和/或盐。
2.根据权利要求1的方法，其中天冬氨酸作为供体，与通式(II)化合物，其衍生物和/或盐作为受体的反应，是在有一种或多种热稳定的受体特异性天冬氨酸转氨酶存在的情况下进行的。
3.根据权利要求1-2中一项或几项的方法，其中受体特异性天冬氨酸转氨酶对于丙酮酸具有较低的底物特异性，从而尽可能地避免副产物丙氨酸的形成。
4.根据权利要求1-3中一项或几项的方法，其中存在的丙酮酸通过物理的，化学的和/或酶促的方法，自反应混合物中除去。
5.根据权利要求4的方法，其中丙酮酸的转化在有一种或多种乙酰乳酸合成酶(ALS)存在的情况下进行，以产生乙酰乳酸。
6.根据权利要求4的方法，其中丙酮酸的转化在有丙酮酸脱羧酶存在的情况下进行，以产生乙醛。
7.根据权利要求4的方法，其中丙酮酸的转化在有丙酮酸氧化酶存在的情况下进行，以产生乙酰磷酸。
8.根据权利要求5-7中一项或几项的方法，其中丙酮酸的转化在有热稳定酶存在的情况下进行。
9.根据权利要求1-8中一项或几项的方法，其中转氨酶中一种或多种是固定化形式的。
10.保藏号为DSM 13353的微生物。
11.保藏号为DSM 13354的微生物。
12.保藏号为DSM 13355的微生物。
13.保藏号为DSM 13356的微生物。
全文摘要
本专利申请描述了一种用天冬氨酸作为氨基供体,自相应的酮酸PPO通过转氨基作用酶促手性合成L－膦丝菌素的方法。通过适当的反应工艺,使用大约等摩尔量的氨基供体和氨基受体,可以进行定量转化,由此完全地使用供体氨基酸天冬氨酸。热稳定转氨酶的使用可以确保达到高反应速率和相应的高空间/时间效率。
文档编号C12P1/04GK1349561SQ00806973
公开日2002年5月15日 申请日期2000年3月30日 优先权日1999年4月30日
发明者K·巴特施 申请人:阿温提斯作物科学有限公司