专利名称：氨基甲酰天冬氨酸及其衍生物的合成方法
技术领域：
本发明涉及一种氨基甲酰天冬氨酸及其衍生物的生物合成方法。
氨基甲酰天冬氨酸及其衍生物是用来制备五元和六元杂环化合物的前体，具有重要的应用价值。以往通常是采用天冬氨酸和氰酸钾为原料在碱性条件下合成(J.F.Nyc and H.K.Mitchell,Synthesis of orotic acidfrom aspartic acid。J.Am.Soc.1947,69,1382-1384)，会对环境造成很大危害。
生物酶是一类独特的有机合成催化剂，由于它们所拥有的优点，那些对人类，对环境有害的合成反应或许终将会被酶催化反应代替。当然用酶作为有机合成的催化剂也有其不足的一面。通常在生物酶催化的反应中，每一种酶只能催化一步反应，因而大大限制了生物酶在复杂化合物合成中的应用。而将多种单酶放在同一个催化体系中连续催化几步反应，各种酶之间的相互作用往往会导致整个催化体系的紊乱以及酶的失活或者可能产生各种副产物，最重要的是无法控制这种单酶混合体的催化顺序。如果采用一个具有多种催化活性的多功能复合酶，以上的问题就可以解决。
本发明的目的在于解决上述问题而提出一种以多功能复合酶为生物催化剂，催化反应合成氨基甲酰天冬氨酸及其衍生物的生物合成方法。
本发明的目的可由如下措施实现首先对来自于中华苍鼠肾细胞的BHK-21细胞系细胞进行培养，从收获的细胞中分离纯化出纯的多功能复合酶CAD，然后将其添加到含有氯化铵(或小分子胺)、碳酸氢钠、天冬氨酸等的溶液中，35-39℃反应一定时间后得到含有产物氨基甲酰天冬氨酸或其衍生物的水溶液。
下式是哺乳动物细胞中由多功能复合酶CAD催化完成的嘧啶核苷酸合成中起始的三步反应。多功能复合酶CAD是由一条多肽折叠产生的具有三种独立的酶活性的复合酶，它具有依赖于谷氨酰胺的氨基酰磷酸合成酶(CPSase)，天冬氨酸甲酰胺酶(ATCase)和氨甲酰天冬氨酸脱水酶(DHOase)活性。可从谷氨酰胺开始经过四步合成二氢乳清酸。由于化学热力学平衡不利于形成二氢乳清酸，第三步反应的产物氨甲酰天冬氨酸会发生积累。本发明把经分离纯化得到的多功能复合酶CAD作为有机合成的催化剂，以氯化铵或小分子胺、天冬氨酸和碳酸氢钠作为原料，在含有三磷酸腺苷的同一反应体系中同时催化多步反应，合成出非常有价值的药用前体氨甲酰天冬氨酸及其衍生物。
依赖于谷氨酰胺的氨基酰磷酸合成酶(C) 一种氨甲酰天冬氨酸及其衍生物的合成方法，其特征在于采用多功能复合酶CAD为生物催化剂，以氯化铵或小分子胺、天冬氨酸和碳酸氢钠为反应底物，在反应介质存在下，35-39℃条件反应得到氨甲酰天冬氨酸或其衍生物。
本发明采用的多功能复合酶CAD的浓度为5-20毫克/毫升。
本发明采用的底物天冬氨酸的浓度为15～17.5毫摩尔/升，底物氯化铵(或小分子胺)的浓度为15-87毫摩尔/升，底物碳酸氢钠的浓度为12.7-20毫摩尔/升。反应所需能量由三磷酸腺苷提供，浓度为15-16毫摩尔/升。
本发明采用的反应介质为含有89-100毫摩尔/升的氯化钾、2.5-25毫摩尔/升的氯化镁、2.2％-2.5％的甘油、6.5-7.5％的二甲基亚砜的87-100毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(pH=7.5-8.0)。
本发明采用的反应温度为35-39℃，反应时间为0.5-1.0小时。
本发明有如下特点a 采用酶催化的方法在温和条件下以氯化铵(或小分子胺)、天冬氨酸和碳酸氢钠为底物反应得到氨甲酰天冬氨酸及其衍生物，对环境十分有利。
b 采用多功能复合酶同时催化多步反应，前一反应的产物刚好位于催化后一反应的酶活性位点附近，克服了将多种单酶放在同一个催化体系中连续催化几步反应会导致整个催化体系紊乱和可能产生各种副产物，以及无法控制催化顺序的问题。
c 利用不利于最终产物二氢乳清酸形成的化学热力学平衡，实现了目标产物氨甲酰天冬氨酸及其衍生物的积累。
现进一步通过最佳实施例来阐述发明的实现方式。
实施例1从BHK-21细胞中按文献(P.F.Coleman,D.P.Suttle and G.R.Stark,Purification from Hamster Cell of the Multifunctional Protein ThatInitiates de Novo Synthesis of Pyrimidine Nucleotides.The Journal ofBiological Chemistry.1977,252(18):6379-6385)的方法分离纯化到纯的多功能复合酶CAD，将其添加到1毫升含有下列成分的反应液中使多功能复合酶CAD在该反应液中的浓度为5-20毫克/毫升浓度为15～17.5毫摩尔/升的天冬氨酸，浓度为15-87毫摩尔/升的氯化铵，浓度为12.7-20毫摩尔/升的碳酸氢钠，浓度为15-16毫摩尔/升的三磷酸腺苷，浓度为89-100毫摩尔/升的氯化钾，浓度为2.5-25毫摩尔/升的氯化镁，浓度为2.2％-2.5％的甘油，浓度为6.5-7.5％的二甲基亚砜，浓度为87-100毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(pH=7.5-8.0)。
37℃反应0.5-1.0小时后添加浓度为1摩尔/升的盐酸0.1毫升终止反应，离心后得到含有产物氨甲酰天冬氨酸的水溶液。
实施例2其它同实施例1，仅将反应底物之一的氯化铵改为丁胺，浓度为15-87毫摩尔/升。37℃反应0.5-1.0小时后添加浓度为1摩尔/升的盐酸0.1毫升终止反应，离心后得到含有产物丁基氨甲酰天冬氨酸的水溶液。
实施例3其它同实施例1，仅将反应底物之一的氯化铵改为丙胺，浓度为15-87毫摩尔/升。37℃反应0.5-1.0小时后添加浓度为1摩尔/升的盐酸终止反应，离心后得到含有产物丙基氨甲酰天冬氨酸的水溶液。
权利要求
1．一种氨甲酰天冬氨酸及其衍生物的合成方法，其特征在于采用多功能复合酶CAD为生物催化剂，以氯化铵或小分子胺、天冬氨酸和碳酸氢钠为反应底物，在反应介质存在下，35-39℃条件反应得到氨甲酰天冬氨酸或其衍生物。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于在该反应中使用的天冬氨酸的浓度为15～17.5毫摩尔/升，氯化铵或小分子胺的浓度为15-87毫摩尔/升，碳酸氢钠的浓度为12.7-20毫摩尔/升。
3．如权利要求1所述的方法，其特征在于反应介质为含有浓度为15-16毫摩尔/升的三磷酸腺苷，浓度为89-100毫摩尔/升的氯化钾，浓度为2.5-25毫摩尔/升的氯化镁，浓度为2.2％-2.5％的甘油，浓度为6.5-7.5％的二甲基亚砜，浓度为87-100毫摩尔/升的pH=7.5-8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液。
全文摘要
本发明公开了一种以天冬氨酸、碳酸氢钠、氯化铵(或小分子胺)为原料在温和条件下制备氨基甲酰天冬氨酸及其衍生物的生物合成方法。采用多功能复合酶CAD为催化剂,在同一催化体系当中同时催化多步反应合成氨基甲酰天冬氨酸及其衍生物,克服了将多种单酶放在同一个催化体系中连续催化几步反应会导致整个催化体系紊乱和可能产生各种副产物,以及无法控制催化顺序的问题。利用不利于最终产物二氢乳清酸形成的化学热力学平衡,实现了目标产物氨甲酰天冬氨酸及其衍生物的积累。
文档编号C12P13/00GK1298948SQ0013492
公开日2001年6月13日 申请日期2000年12月10日 优先权日2000年12月10日
发明者辛嘉英, 朱利民, 崔俊儒, 章俭, 李树本 申请人:中国科学院兰州化学物理研究所