蛋白在基因修饰真菌中的表达的制作方法

专利名称：蛋白在基因修饰真菌中的表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过真菌的基因修饰来提高目的蛋白的产量。此外，本发明还涉及新型的基因重组物，含有这些构建物的真菌，其蛋白产量明显地增加。
背景技术：
真菌表达体系在生产目的蛋白中的应用在本领域是众所周知的。例如，真菌表达体系中生产的外源蛋白已应用于生物量的转化、洗涤剂、纤维素酶底物的去皮，以及其他工业酶。其他目的外源蛋白，例如食品添加剂或补充剂、药物化合物、抗体、蛋白试剂等，以及工业用蛋白都可用真菌表达体系生产。
很多微生物产生水解纤维素的酶，包括腐木菌木霉属(Trichoderma)，复合细菌嗜热单孢属(Thermomonospora)，杆菌属(Bacillus)，和纤维单孢属(Cellulomonas)；链霉菌属(Streptomyces)，以及真菌腐质霉属(Humicola)、曲霉属(Aspergillus)和镰刀霉属(Fusarium)。这些微生物所产生的酶是蛋白混合物，并以三种作用方式参与纤维素向葡萄糖的转化，例如葡聚糖内切酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)，和β-葡萄糖苷酶。EG和CBH酶总称为“纤维素酶”。EG酶在随机位置切断纤维素聚合物，直至可被CBH酶作用。举例来说，木霉株产生至少四种不同的EG酶，已知为EGI、EGII、EGIII和EGV。CBH酶连续将纤维二糖分子从纤维素聚合物的末端释放出来。纤维二糖是水溶性的β-1，4-连接的葡萄糖二聚体。木霉中有两种主要的CBH酶，CBHI和CBHII。β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。木霉产生一种葡萄糖苷酶。
上述β-葡萄糖苷酶催化的纤维素水解的最后一步是重要的一步，因为葡萄糖容易通过各种酵母发酵为乙醇，而纤维二糖不能发酵为乙醇。水解结束后残留的纤维二糖表示损失的乙醇产量。更重要的是，纤维二糖是CBH和EG酶的很强的抑制剂。纤维二糖浓度仅为3.3g/L时，即可使木霉CBH和EG酶的水解速度降低50％。由于水解速度的降低，必须加入更多的纤维素酶，这样反过来又影响了整个工艺的经济性。因此，生产乙醇时，水解过程中的纤维二糖的蓄积是很不希望出现的。
因为木霉和其他产生纤维素酶的微生物只产生很少的β-葡萄糖苷酶，所以在酶催化的水解过程中纤维二糖的积蓄成为主要问题。β-葡萄糖苷酶占木霉产生的总蛋白的1％以下。低水平的β-葡萄糖苷酶量导致缺乏将纤维二糖水解为葡萄糖的能力，并且在水解过程中，纤维二糖的积蓄量可达到10～20g/L。这种高水平的纤维二糖使纤维素酶的需要量比含有适当量的β-葡萄糖苷酶时增加了10倍。
现已提出了几种方法来克服纤维素酶中β-葡萄糖苷酶的不足。
一种途径是用产生少量纤维素的微生物来生产β-葡萄糖苷酶，并将这种外源的β-葡萄糖苷酶加入纤维素酶中，提高其水解能力。产生这种β-葡萄糖苷酶的微生物中最成功的是黑曲霉(Aspergillusniger)和海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)。来源于这些微生物的β-葡萄糖苷酶市售品如Novo Nordisk生产的Novozym188，但是，作为乙醇生产过程的商业化生物质，所需量的成本太高。
克服β-葡萄糖苷酶不足的第二种途径是纤维素的水解与葡萄糖的酵母发酵同时进行，即所谓的同时糖化和发酵(SSF)方法。在SSF系统中，葡萄糖的发酵可将其本身从溶液中除去。葡萄糖是强的β-葡萄糖苷酶的抑制剂，因此，SSF的目的是增加β-葡萄糖苷酶的效率。然而，SSF系统尚未实现商业化，因为纤维素酶要求的温度条件为50℃，对此来说，酵母的作用温度28℃太低了；采用折衷温度37℃则效率很低，且容易造成微生物污染。
克服β-葡萄糖苷酶不足的第三种途径是采用基因工程的方法使该酶过表达，并增加木霉的β-葡萄糖苷酶的产量。这种方法已被Barnett、Berka和Fowler采用，例如“Trichoderma reesi胞外β-葡萄糖苷酶基因的克隆和扩增纤维质底物糖化方法的检验或改良评估”Bio/Technology，Vol.9，1991.6，p.562-567，在此称为“Barrett等”；以及Fowler、Barnett和Shoemaker的WO92/10581“Trichoderma reeseiβ-葡萄糖苷酶基因的克隆和扩增，以及纤维素的改良糖化方法”，在此称为“Fowler等”。
Barnett等和Fowler等都描述了将多拷贝的β-葡萄糖苷酶基因导入Trichoderma reesei(以下，也可略作T.reesei)株P40中。两个研究小组均构建了质粒pSASβ-glu，该质粒为含有T.reesei基因组β-葡萄糖苷酶基因和amd S标记筛选的转化载体。amd S基因来源于构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，并编码乙酰胺酶，它可使转化细胞在以乙酰胺为唯一氮源的培养基上生长。T.reesei不具有与amd S基因等同的功能，因此不能利用乙酰胺作为氮源。该转化细胞含有10-15个β-葡萄糖苷酶基因的拷贝，其产生的β-葡萄糖苷酶比未转化的细胞高出5.5倍。
Barnett等和Fowler等所获得的β-葡萄糖苷酶产量的提高并不能缓解其在纤维素水解中的不足。天然木霉株的β-葡萄糖苷酶产量，举例来说，必须增加至少10倍才能满足纤维素水解的需要。
在木霉中过表达蛋白时，一种策略是将目的基因直接与cbh1启动子或cbh1分泌信号连接。因为CBH1是木霉在纤维素酶的诱导条件下产量最丰富的蛋白，所以认为cbh1启动子和分泌信号在指导蛋白的转录和分泌中是非常有效的，该蛋白由基因重组物中位于上述启动子和分泌信号之后的基因编码。这种策略已成功地应用于过表达木霉和其他微生物蛋白(“在Trichoderma reesei中表达Trichoderma harzianum内切壳聚糖酶以及该内切壳聚糖酶的改良生产方法”Margolles-Clark，Hayes，Harman and Penttila，Appl.Environ.Microbiol.62(6)2145-2151，1996；“Trichoderma reesei和Hormoconis resinae葡糖淀粉酶P(gamP)基因的转化异源葡糖淀粉酶在Trichoderma reesei中的生产”Joutsjouki，Torkkeli and Nevalainen，1993，Curr.Genet.24223-228；“Trichoderma reesei中高频一步基因置换1.葡聚糖内切酶I的过剩生产”Karhunen，Mantyla，Nevalainen and Suominen，1993，Mol.Gen.Genet.241515-522)。
另一个用真菌表达系统生产的工业酶的例子是木聚糖酶。某些商业上最重要的木聚糖酶属于木聚糖酶家族11。如果某种木聚糖酶具有家族11共有的氨基酸，包括两个作为必要的催化残基的谷基酸残基，则可将这种木聚糖酶属于家族11。按Trichoderma reesei的木聚糖酶II编号，这些残基为86位和177位氨基酸。木聚糖酶家族11共有的氨基酸记载于Wakarchuck，et al，Protein Science 3467-475(1994)。
药学上重要的外源蛋白的表达，例如对胰岛素(Goeddel D.V.etal.，1979，Proc.Nat.Acad.Sci.76 106-110)和凝血因子Xa(Smith D.B.1988，Gene 6731-40)用细菌表达体系的表达已有报道。与此类似，U.S.4,751,180公开了在酵母中表达外源蛋白，其中包括胰岛素和IgF-2。
已有报道用丝状真菌Trichoderma reesei生产外源的牛凝乳酶原(Harkki A.et al.，1989，Bio/Technol.7596-603)，其基因重组物包括cbh1(纤维二糖水解酶I基因)调控区和终止子、cbh1或凝乳酶信号序列，以及也可包括cbh1的间插区。Margolles-Clark E等(1996，App Environ Microbiol.，622152-2155)公开了用Trichoderma reesei的cbl1启动子来表达T.haraianum的内切壳多糖酶。同样，目的蛋白例如凝乳酶也已用丝状真菌构巢曲霉和泡盛曲霉(A.awamori)生产，其所用的基因重组物包括glaA(葡糖糖化酶)基因的调控区和分泌信号、glaA或凝乳酶的信号序列，以及葡糖糖化酶(EP 215,594)的间插区。在后面的两钟情况中，蛋白产物在宿主中的转录不是外源蛋白生产的限制因素。但是，分泌到宿主体外的蛋白产物量低，从而造成胞外蛋白的收率很低。
在试图增加丝状真菌表达体系生产的外源蛋白在胞外的蓄蓄积量方面，Lawlis(1997，US 5,679,543)公开了采用多组分的融合多肽来增加目的蛋白的分泌和在胞外的蓄积。该基因重组物是编码包括4个部分的融合蛋白的复合物，4个部分包括信号肽、分泌多肽或其部分(载体蛋白)、可断裂的接头多肽以及所需表达的目的多肽。蛋白分泌水平的提高归结于将glaA信号序列与全长糖化酶(载体蛋白)的融合，或是与其他在宿主内分泌的蛋白融合，融合产物然后进一步与可断裂的接头以及目的蛋白(凝乳酶)融合。已发现在真菌构巢曲霉中进行表达时，这种基因重组物增加了融合多肽的分泌。
虽然在US 5,679,543中提到采用该4组分的融合蛋白可增加分泌水平，但这种表达载体的生产是复杂的。这种表达体系要求采用6部分的基因重组物，由此基因重组物来表达含有4-部分蛋白产物、表达蛋白和各种载体蛋白的复合物。此外，因为表达蛋白中包含了载体蛋白，所以目的表达产物中约有50％不能回收，同时，目的蛋白的表达后处理和纯化还导致了成本增加。为了回收最终的目的蛋白产物，还需要进行重要的分泌后加工，其中包括接头的去除和培养基的酸化。
在本领域需要有一种简单的系统，该系统能使目的蛋白在宿主细胞中高水平地表达和分泌。该系统中所用的基因重组物中优选包含较少的组成部分，以便于制备嵌合结构。而且，采用这种基因重组物时表达和分泌水平必须要高，同时还优选在回收目的蛋白时不需要或少需要下游操作。
本发明的目的是克服现有技术的缺点。
结合本发明的主要权利要求、从属权利要求的特征，以及由这些特征引申出的本发明的实施方案，则可达到上述目的。
发明的概述本发明涉及通过真菌的基因修饰来提高目的蛋白的产量。此外，本发明还涉及新型的基因重组物，含有这些结构的真菌，其蛋白产量和分泌量都明显地增加。本发明的基因重组物可在真菌表达体系中增强目的蛋白的生产。
能达到上述目的的基因重组物中包含以下DNA序列。该DNA序列包括一个以上的调控元件，以及与该调控元件相连并受该调控元件调控的编码木聚糖酶分泌信号以及目的蛋白的核苷酸序列，此外还可含有编码间插区的核苷酸序列。
本发明涉及的核苷酸序列包括调控区，以及与该调控区相连并受该调控区调控的木聚糖酶分泌序列和目的基因，其中，该调控区或目的基因中至少有一方与木聚糖酶蛋白的生产是非正常关联。本发明的一个实施方案是针对于上述定义的核苷酸序列，其中的调控区选自cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、xln1和xln2。
本发明也涉及上所定义的核苷酸序列，其中的目的基因选自编码某种蛋白的基因，这种蛋白可用于医药、营养品、工业产品、动物饲料、食品添加剂或酶。优选该目的基因编码某种酶，这种酶选自β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解酶、蛋白酶、果胶酶和过氧化物酶。
以上所定义的本发明的核苷酸序列，还可进一步包含间插序列。
本发明也涉及包含以上定义的核苷酸序列的载体，以及含有该载体的转化丝状真菌。本发明还涉及含有上述定义的核苷酸序列的丝状真菌。优选的转化丝状真菌选自木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、镰刀霉属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、葡萄孢属(Botrytis)、疣孢霉属(Mycogone)、轮枝孢属(Verticillium)、链霉属(Streptomyces)、毛盘孢属(Colletotrichum)、链孢霉属(Neurospora)、灰侧耳菌属(Pleurotus)、青霉属(Penicilium)、头孢属(Cephalosporium)、漆斑菌属(Myrothecium)、丝葚霉属(Papulospora)、绵霉属(Achlya)、柄孢壳属(Podospora)、内座壳属(Endothia)、毛霉属(Mucor)、旋孢腔菌属(Cochilobbolus)、Tolypocladium、梨孢霉属(Pyricularia)、青霉属(Penicillum)、毁丝霉属(Myceliophthora)、耙菌属(Irpex)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、帚霉属(Scorpulariopsis)、毛壳霉属(Chaetomium)、粘帚霉属(Gilocladium)、头孢霉属(Cephalosporin)、支顶孢属(Acremonium)。
本发明包含在丝状真菌中生产目的蛋白的方法。该方法包括用一种核酸序列转化丝状真菌，该核酸序列包括调控区，与该调控区相连并受该调控区调控的木聚糖酶分泌序列以及目的基因，其中，该调控区或目的基因中至少有一方与木聚糖酶蛋白的生产是非正常关联，以及其中的木聚糖酶分泌序列与该丝状真菌是异源或同源；培养该丝状真菌，并促使该丝状真菌生产目的蛋白。此外，本方法还涉及目的蛋白的纯化。
本发明的目的在于，提供在丝状真菌中生产目的蛋白的方法。该方法包括，用一种核酸序列转化丝状真菌，该核酸序列包括调控区，与该调控区相连并受该调控区调控的木聚糖酶分泌信号、间插序列和目的基因，其中，该调控区或目的基因中至少有一方与木聚糖酶的生产是非正常关联，以及其中的木聚糖酶分泌序列与该丝状真菌是异源或同源；培养该丝状真菌，并促使该真菌生产目的蛋白。本方法还涉及目的蛋白的纯化。此外，可以除去目的蛋白中由间插序列编码的氨基酸序列。
本发明还涉及由上述方法生产的蛋白。
按照本发明的方法，采用木聚糖酶分泌信号使一些目的蛋白的表达和分泌水平高于采用现有技术中所用的分泌信号，例如cbh1分泌信号。因为木聚糖酶在木霉所产的总蛋白中所占的比例比CBH1小得多(分别为5％和60％)，人们可能预计cbh1的分泌信号会更有效，然而，情况不是如此。而且，木聚糖酶分泌信号在数种宿主的表达体系中提高了蛋白的产量。
本发明的概述不必描述本发明所有的必需特征，但将所述特征的再组合后也可体现本发明的一些特点。
由以下详述的优选实施方案及附图会对本发明的其他方面更为了解，其优点也会更为明显。
附图的简单说明


图1载体pCBG1-TV的限制性酶图谱，以及CBH1分泌信号/成熟β-葡萄糖苷酶接合点的氨基酸序列(参见实施例5)。
图2载体pXBG1-TV的限制性酶图谱，以及木聚糖酶II分泌信号/成熟β-葡萄糖苷酶接合点的氨基酸序列(参见实施例6)。
图3载体pC/XBG(Xbal)-TV限制性酶图谱，以及木聚糖酶II分泌信号/成熟β-葡萄糖苷酶接合点的氨基酸序列(参见实施例7)。
图4由T.reesei株RutC30和M2C38分离的基因组DNA的Southern印迹结果，所用探针为含有M2C38木聚糖酶启动子和分泌信号的、标记的DNA片段。
图5由T.reesei株RutC30和M2C38分离的基因组DNA的Southern印迹结果，所用探针为含有M2C38的成熟β-葡萄糖苷酶编码区的、标记的DNA片段。
图6eg2表达载体pEG2-TV(图6a)和pC/XREG2-TV(图6b)的示意图，如实施例23所述，该载体包含xln2分泌信号。
图7实施例27所述的man1表达载体pCMAN-TV(图7a)的示意图，图7b表示pXMAN-TV的示意图；图7c表示pC/XMAN-TV(图7c)的示意图，两者均含有xln2分泌信号。后两种载体描述于实施例28中。
图8含有eg2的表达载体的示意图，该eg2由Humicol ainsolens获得。图8a表示pChHE2-TV；图8b表示pC/XhHE2-TV，含有xln2分泌信号，两者均在实施例30中有所描述。
图9漆酶I(lcc1)表达载体的示意图。图9a表示pCL1-TV；图9b表示pC/XL1-TV，含有xln2分泌信号，两者均在实施例32中有所描述。
图10实施例34所述的含有木聚糖酶的表达载体(pC/XHTX4-TV)的示意图。
优选实施方案的详细说明本发明涉及通过真菌的基因修饰来提高目的蛋白的产量。此外，本发明涉及新型的基因重组物，含有该结构的真菌，其蛋白产量显著增加。
以下仅以举例的方式描述优选的实施方案，而不限制本发明所必需的特征的组合。
本发明中所描述的真菌基因修饰是用新型基因重组物表达目的基因。该目的基因编码在宿主内高水平表达的目的蛋白，并进而将其从该宿主中释放出来。优选的表达宿主为丝状真菌。丝状真菌的特征是营养菌丝体，营养菌丝体的细胞壁含有复杂的多糖，包括壳多糖和纤维素。营养体生长通常通过菌丝的伸长而进行。可用于本发明的丝状真菌包括木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、镰刀霉属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、葡萄孢属(Botrytis)、疣孢霉属(Mycogone)、轮枝孢属(Verticillium)、链霉属(Streptomyces)、毛盘孢属(Colletotrichum)、链孢霉属(Neurospora)、灰侧耳菌属(Pleurotus)、青霉属(Penicillum)、头孢属(Cephalosporium)、漆斑菌属(Myrothecium)、丝葚霉属(Papulospora)、绵霉属(Achlya)、柄孢壳属(Podospora)、内座壳属(Endothia)、毛霉属(Mucor)、旋孢腔菌属(Cochilobbolus)、Tolypocladium、梨孢霉属(Pyricularia)、青霉属(Penicillum)、毁丝霉属(Myceliophthora)、耙菌属(Irpex)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、帚霉属(Scorpulariopsis)、毛壳霉属(Chaetomium)、粘帚霉属(Gilocladium)、头孢霉属(Cephalosporin)、支顶孢属(Acremonium)，但不限于这些。
丝状真菌的转化方法在本领域是已知的(例如EP 870,835；U.S.5,863,783；Camels T.et al.Curr.Genet.，1991，20309-314；Lorito etal.，1993，Curr.Genet.24349-356；Goldman et al.，1990，Curr.Genet.17169-174；Penttila et al.，1987，Gene 6155-164；Yelton et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811470-1474；Bajar et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888202-8212；“链霉菌的基因操作实验手册”Hopwood et al.，1985，The John Innes Foundation，Norwich，UK；所有上述文献在此均作为参考引入)。
本发明的基因重组物通常包含调控区，与该调控区相连并受该调控区调控的分泌信号和目的基因，以及包含其他需要加入的元件，例如终止子序列，筛选标记等。如果需要，在分泌信号和目的基因之间可插入间插序列。调控区
“调控区”或“调控元件”通常是指基因上游的一部分核酸，这部分核酸通常由DNA组成，但也并非总是如此。调控元件包括启动子元件、基本(核心)启动子元件、可被外部刺激物诱导的元件、启动子活性介导元件，例如负调控元件或转录增强子。此处所用的调控元件也包括转录活性调控元件，例如调整基因表达的调控元件，这其中包括翻译和转录增强子、翻译和转录阻遏子、上游激活序列和mRNA不稳定效应物。后面的几种元件可位于靠近编码区的位置。本发明的上下文中，术语“调控元件”或“调控区”通常是指结构基因的编码序列上游(5′)的DNA序列，该序列通过提供被RNA聚合酶和/或其他转录起始所需的因子识别的某一特定位置，对编码区的表达进行调整，但并非总是如此。但是，其他核酸序列，例如位于3′端的序列，但不仅限于此，也可能对目的编码区的表达起调控作用。为RNA聚合酶或其他转录因子提供识别部位并保证转录在某一特定位置起始的调控元件的例子是启动子元件。启动子元件包括负责转录起始的基本启动子元件，以及修饰基因表达的其他调控元件(如以上所列出的)。
本发明所用的调控元件包括发育调控的、可诱导的和组成型调控元件。发育调控或对受其调控的基因的差异表达进行调控的调控元件，在宿主的发育期间的特定时间内是活化的。可诱导的调控元件受诱导剂诱导时，能直接或间接地激活一种以上DNA序列或基因的转录。诱导剂不存在时，DNA序列或基因不能转录。通常，与可诱导的调控元件特异结合以激活转录的蛋白因子是以失活的形式而存在，然后直接或间接被诱导剂转换为激活的状态。诱导剂可以是化学试剂，例如蛋白、代谢物或其他化学试剂。组成型的调控元件在宿主体内以连续的方式指导基因的表达。
现已克隆了很多合适的调控元件，并对其特性作了鉴定，如本文所述，这些元件可用来驱动目的基因在真菌宿主中的表达。例如，不受任何形式的限制，现已克隆了几种基因及其关联的调控区。T.reesei的EGIII(Saloheimo M et a.，1988，Gene 6311-21)，木聚糖酶xln2(Saarelainen et al.，Mol.Gen.Genet.241497-503，1993)。其他用于目的外源基因表达的调控区在本领域也是已知的。例如，不受任何方式的限制，组成型启动子pgk(磷酸甘油酸激酶；Vanhanen et al.，Gene 106129-133，1991)；T.reesei的组成型启动子pki(Carmen LM et al.，1999，phytopathol.892554-261)；米黑毛霉(Mucor miehei)的羧基蛋白酶的调控区(U.S.5,679,543)；曲酶的gla A(淀粉葡萄糖苷酶)(Cullen D.et al.，1987，Bio/Technol.5713-719)、gpd(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)(Deane et al.，1999，Enzyme and Microbial Tech.Vol.24，pp.419-424；Pentilla et al.，1987，Gene Vol.61，pp.155-164)；构巢曲霉的tpiA(McKinight，G.L.et al.，1986，Cell 46143-147)；曲霉的alcA(Lockington，P.A.，et al.，1986，Gene 33137-149)、米曲霉的amy(α-淀粉酶)(Christensen T.et al.，1988，Bio/Technol.61419-1422)；T.reesei的Trl(Camels et al.，1991，Gurr Gent.Vol.20，pp.309-314)、T.reesei的cbh1(Harkki，A.et al.，1989，Bio/Technol.7596-603)；黑曲霉(Aspergillus niger)糖化酶的调控区(Nunberg J.H.et al.，1984，Mol.Cell.Bio.42306-2315；Boel E.et al.，1984，EMBO J.，31581-1585)；构巢曲霉的trpC(Yelton M.et al.，1984，Proc.Nat.Acad.Sci.811470-1474)、构巢曲霉的xln1或xln2(Torronen et al.，1992，Bio/Technol.101461-1465)或amdS(Hynes M.J.，et al.，1983 Mol.Cell.Genet.19937-45)。外源调控元件的应用在U.S.5,863,783中已有描述，包括xlnA、肌醇六磷酸酶、ATP合成酶亚基9(oliC)、tpi(磷酸丙糖异构酶)、adh(乙醇脱氢酶)、amy、glaA、乳糖酶和gpd。
对基因重组物中调控元件的选择并不限制本发明的实际应用。但是，优选的调控元件为cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、xln1和xln2。T.reesei cbh1的DNA序列已存储在基因库中，登记号为D86235。
本领域的技术人员懂得，可通过置换、取代、附加或缺失一个或一个以上核苷酸对天然的调控元件进行修饰，而不改变其功能。本发明的实践包含这种对启动子的改变，但不会受其约束。分泌信号“分泌信号”亦可称为“分泌序列”，用于促使宿主产生的目的蛋白定位在胞外。如本文所述，优选的分泌信号是来源于木聚糖酶的木聚糖酶分泌信号。木聚糖酶分泌信号是编码木聚糖酶分泌信号肽的DNA序列。木聚糖酶分泌信号肽(或分泌肽)是存在于编码的木聚糖酶氨基末端的肽序列，该序列随后在将成熟的木聚糖酶运出宿主细胞期间被除去。该分泌信号可包含肽原、前肽或两者。
在一个优选的实施方案中，木聚糖酶分泌信号包含11家族木聚糖酶基因的木聚糖酶分泌信号。在更优选的实施方案中，11家族木聚糖酶基因是木霉的木聚糖酶基因。在进一步优选的实施方案中，木聚糖酶分泌信号包含木霉木聚糖酶I(xln1)基因或木聚糖酶II(xln2)基因的木聚糖酶分泌信号。木霉xln1和xln2分泌信号的DNA序列分别见“T.reesei的两种主要木聚糖酶酶和基因特性的鉴定”的图3和2中(Torronen，Mach，Messner，Gonzalez，Kalkkinen，Harkki，and Kubicek，Bio/Technology 101461-1465，1992)(发表的图例中，基因鉴定结果是颠倒的)。
本领域的技术人员懂得，通过置换、取代、附加或缺失天然分泌信号中的一个或更多个核酸，可对其进行修饰而不改变其功能。本发明的实践包括这种对木聚糖酶分泌信号的改变，而又不受这种改变的约束。间插区在信号序列和目的基因之间的间插区，可以插入其他的核苷酸序列。插入这些序列的目的有很多，例如为了增加前导肽的长度，使目的基因易于插入基因重组物中，提高目的蛋白的表达水平，增加目的蛋白从宿主输出的量(例如U.S.5,679,543)，或有助于目的蛋白的纯化，例如用亲合色谱或其他本领域中为大家所熟知的方法。前导序列的长度可以不同，由几个氨基酸至该宿主分泌蛋白的氨基酸序列。此外，该前导序列也可编码一些氨基酸，这些氨基酸有助于通过可断裂的接头分离目的蛋白。如果间插区含有影响目的蛋白活性的前导肽，含有用于蛋白纯化的亲合标记，或者如果该前导肽过长，则需要采用可断裂的接头。这种可断裂的接头在本领域是为大家所熟知的，例如可被溴化氰切断的氨基酸，但不限于蛋氨酸；或者是已知可被蛋白酶切断的氨基酸，例如可被胰蛋白酶、胶原酶、梭菌蛋白酶、酵母的KEX2蛋白酶、Xa因子、枯草蛋白酶(例如Martson F.A.O.1986，Biol.Chem J.2401-12)切断的氨基酸，但不仅限于这些蛋白酶。但是，本发明的基因重组物也可不含有这种间插序列。
如
图1-3和6-9所示，实施例5-7、23、27、28、30和32中所述的基因重组物中含有附加9个的碱基对的DNA序列；前3个编码T.reesei木聚糖酶II基因分泌信号之后的谷氨酰胺残基，其余6个碱基对为插入和/或修饰的单一限制性内切酶位点，用于连接木聚糖酶分泌信号和编码目的蛋白的核苷酸序列。这些DNA序列使木聚糖酶分泌信号肽和目的蛋白之间产生附加的氨基酸。相应于该基因重组物编码的木聚糖酶分泌信号或用于连接木聚糖酶分泌信号序列与目的基因的限制性酶切位点，这些DNA序列可以是天然的或合成的，并编码成熟木聚糖酶中一个或更多个氨基酸。如上所述，间插序列也可包含编码被蛋白酶识别的氨基酸序列或前导序列。本发明的实践包括在木聚糖分泌信号与成熟β-葡萄糖苷酶编码区之间存在附加的DNA序列，但并不仅限于此。目的基因“目的基因”是指在转化宿主中表达的任何基因。目的基因包含编码目的蛋白的核酸序列。目的蛋白可以包括有药学活性的蛋白，例如生长因子、生长调控剂、抗体、抗原、可用于免疫或疫苗接种等的抗原衍生物、白细胞介素、胰岛素，G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSF或它们的组合物，干扰素α、干扰素β、干扰素τ等干扰素，凝血因子如因子VIII、因子IX、tPA或它们的组合物，但不限于此。目的基因也可编码工业酶，例如用于纸浆和纸、纺织品改良，或乙醇生产的酶。目的基因也可编码蛋白添加剂、营养品，或用于动物饲料、食物，或饲料和食品两者的加值产品。这类蛋白的例子包括酶、蛋白酶、氧化酶、肌醇六磷酸酶、壳多糖酶、甘露聚糖酶、漆酶、转化酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解酶、果胶酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、过氧化物酶等，但不限于此。目的蛋白的类似物也可用本发明的嵌合基因重组物表达。这些类似物的特征通常是其氨基酸序列有改变，例如插入、缺失、或其他变异如等位变异等。
本发明进一步的目的是含有目的DNA的嵌合基因重组物，该目的DNA与本发明的调控元件和分泌序列连接并受调控元件的调控。按照本发明，任何目的基因都可采用并进行操作，以使该目的蛋白得到表达。其他元件本发明的基因重组物中，在紧接着编码目的蛋白的核苷酸序列下游可含有转录终止子。如本领域技术人员所知，任何合适的转录终止子都可采用。本发明的实践对所用转录终止子没有限制。转录终止子的例子不受任何限制，可以是任何目的基因下游的终止子。本领域的技术人员很容易获得合适的终止子，至少可从上述鉴定的基因获得(参见“调控区”)。
对实施例5-7、23、27、28、30、32和34中所述的终止子并没有任何限制，这些终止子由位于木霉cbh2基因终止密码子3′端的1.9kb的DNA构成。T.reesei cbh2转录终止子的前553个碱基对的DNA序列已公开，该序列紧接TAA终止密码子的下游(或3′端)(参见“T.reesei纤维二糖水解酶II的核苷酸序列及推测的一级结构”的图2，Chen，Gritzali and Stafford，Bio/Technology 5274-278，1987)。此外，也可使用其他终止子序列，例如实施例23、27和28(图6a和7a-c)所述的cbh1、xln2的终止子序列，但也不限于此。
本发明的基因重组物中含有筛选标记，该标记可位于同一质粒载体中基因重组物的上游或下游(例如，在该结构的5′端或3′端)，或位于与该基因重组物不同的质粒载体中并共转化。筛选标记的选择对本领域的技术人员来说是熟知的，筛选标记包括能给予转化细胞利用不是此微生物正常代谢产生的代谢物的能力(例如，编码乙酰胺酶的构巢曲酶amd S基因，它能使转化细胞具有在乙酰胺为唯一氮源的培养基上生长的能力)的基因(合成或天然的)，或者是使转化细胞具有抗生素抗性的基因(例如，编码潮霉素β-磷酸转移酶的大肠杆菌hph基因，它能使转化细胞具有潮霉素抗性)。如果宿主菌缺少与筛选标记相应的功能基因，那么该基因就可用作标记。这类标记的例子包括trp、pyr4、pyrG、argB、leu等，相应的宿主菌应没有与此筛选标记相应的功能基因，即，trp、pyr、arg、leu等。实施例5-7、27和28中所述的用于基因重组物中的筛选标记是木霉磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子表达的大肠杆菌hph基因。在实施例23、30和32中(图6b、8a、8b、9a和9b)记载了pyr4的应用。
大肠杆菌hph基因的DNA序列可参见文献“质粒编码的潮霉素B抗性潮霉素B磷酸转移酶基因的序列及其在大肠杆菌和啤酒酵母中的表达”的图4(Gritz and Davies，Gene 25179-188，1983)T.reesei的pgk启动子的DNA序列可参见文献“Trichoderma reesei的3-磷酸甘油酸激酶的编码基因(pgk1)的启动子结构和表达”的图2(Vanhanen，Saloheimo，Ilmen，Knowles and Penttila，Gene 106129-133 1991)。
因此，本发明的基因重组物包含调控区，以及与该调控区相连并受该调控区调控的木聚糖酶分泌序列和目的基因。其中，该调控区或目的基因中至少有一方与木聚糖酶蛋白的生产是非正常关联。
迄今为止所描述的本发明的一个实施方案中包括β-葡萄糖苷酶基因重组物。本发明的实践不受制备该重组物的方法所约束，该方法包括标准的分子生物学技术，例如用碱裂解法从大肠杆菌中分离质粒DNA，用限制性内切酶消化质粒DNA，用琼脂糖凝胶电泳分离和回收DNA片段，用T4 DNA连接酶连接DNA片段，通过聚合酶链反应或加入寡核苷酸接头在DNA片段末端插入单一的限制性酶切位点，以及用T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段补平DNA片段末端，但不限于此。
实施例1-7描述了制备上述基因重组物的步骤。
本发明还公开了以下基因重组物(表达载体)的制备方法。例如T.reesei和H.insolens的葡聚糖内切酶II、eg2(实施例4和30)、甘露聚糖酶、man1(实施例27和28)、漆酶、lcc1(实施例34)和木聚糖酶(实施例38)。实施例25，29，31和33中描述了这些目的蛋白中的几种在T.reesei中的表达。在实施例38中描述了目的蛋白在Humicola insolens中的表达。
在本发明的另一个实施方案中，在真菌宿主中导入编码β-葡萄糖苷酶、葡聚糖内切酶II、甘露聚糖酶、漆酶或木聚糖酶的基因重组物并进行表达，进而制成基因修饰的微生物。相对于未转化的微生物宿主，或者与含有表达基因固有内源分泌信号的转化宿主比较，上述基因修饰的微生物提高了目的蛋白的生产水平。对所有检测的目的蛋白和所有检测的宿主来说，含有木聚糖酶分泌信号的嵌合基因重组物都能增加从宿主分离出来的目的蛋白量。例如，不受限制条件来考虑，相对于未转化的微生物宿主来说，可看到β-葡萄糖苷酶提高的水平优选为至少约10倍，更优选为至少约40倍，最优选为至少约120倍。用其他目的蛋白也可观察到表达水平的提高(分别参见实施例25、29、33和38的葡聚糖内切酶II、甘露聚糖酶、漆酶和木聚糖酶)。
本发明中包括将含有目的基因的基因重组物导入本领域技术人员熟知的微生物宿主的任何方法，这些方法包括用氯化钙处理细菌细胞或真菌原生质体，使其细胞膜变得脆弱；加入聚乙二醇使细胞膜融合；用电穿孔法使细胞膜去极化；土壤杆菌介导的转化；用粒子枪等通过微粒轰击，使DNA穿过细胞壁和膜等；但不限于此。丝状真菌的转化方法已有文献报道(如EP 870,835；U.S.5,863,783；Camels T.et al.，Curr Genet.，1991，20309-314；这些文献都在此作为参考引入)。
实施例9、20和35描述了用粒子枪将β-葡萄糖苷酶基因重组物导入木霉或Humicola insolens孢子中的方法。
与未转化的微生物宿主相比，β-葡萄糖苷酶的产量增加了10倍以上，这比天然变异的菌株高出很多并表明产量得到了显著增加，并且在商业上具有重要的意义。采用这种方法，β-葡萄糖苷酶增加的程度可高达136倍，并能达到1000倍以上。如实施例11所述，测量β-葡萄糖苷酶产量增加程度的方法时使培养物生长，并测定β-葡萄糖苷酶的活性。
本领域的技术人员知道，酶混合物的β-葡萄糖苷酶比活性(IU/mg蛋白)可通过降低酶混合物中的纤维素酶和其他蛋白的量来提高。通过物理和机械方法将酶混合物分离，或通过基因重组方法使纤维素酶或其他基因缺失，则可达到上述目的。用微生物实际生产β-葡萄糖苷酶的过程中，这种方法效果很小或是无效。但是根据需要，本发明的实践中可包括这些步骤。
实施例25、29和33描述了采用本发明的嵌合基因重组物过表达葡聚糖内切酶II、甘露聚糖酶和漆酶。在所有情况下都观察到目的蛋白生产水平的提高，该提高的范围为3-10倍或更多，并且活性超过未转化的宿主。实施例30和31描述了H.insolens葡聚糖内切酶II在T.reesei中的生产，同样也获得葡聚糖内切酶II生产水平提高的结果。
实施例34-38描述了T.reesei木聚糖酶的生产，以及其在H.insolens中的表达。这些实施例表明，非天然的启动子和分泌信号在异源丝状真菌中是有活性的，同时也表明这些元件促进了在异源宿主内有活性的目的基因的表达。在这些实施例中，目的基因可从木霉获得，并能编码木聚糖酶，该目的基因与同样来源于木霉的木聚糖酶分泌信号融合。此融合核酸序列受同样也是来源于木霉的cbh1启动子的调控。最终的重组物用来转化腐质霉属H.insolens。对目的基因在转化的和未转化H.insolens中的活性进行了测定(参见实施例38)，结果表明来源于木霉的cbh1启动子和木聚糖酶分泌信号在H.insolens中具有活性。此外，与未转化宿主表达的内源活性相比，转化宿主产生的活性增加了2-2.5倍。该实验结果表明，来源于一种丝状真菌的非天然启动子和分泌信号在另一种丝状真菌中是有活性的。
因此，本发明的目的是用任一丝状真菌表达目的基因，并生产目的蛋白。例如，不受任何方式的限制来考虑，宿主可选自木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、镰刀霉属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、链霉属(Streptomyces)、毛盘孢属(Colletotrichum)、链孢霉属(Neurospora)、灰侧耳菌属(Pleurotus)、青霉属(Penicillum)、头孢属(Cephalosporium)、绵霉属(Achlya)、柄孢壳属(Podospora)、内座壳属(Endothia)、毛霉属(Mucor)、旋孢腔菌属(Cochilobbolus)、Tolypocladium、梨孢霉属(Pyricularia)。适合宿主的选择取决于所要生产的目的蛋白。将DNA重组物导入木霉中的方法有文献报道(“Biolistic Transformation of Trichoderma harzianum and Gliocladiumvirens using plasmid and genomic DNA”Lorito，Hayes，Dipietro andHarman，Curr.Genet.24349-356 1993；“用高压电脉冲法转化Trichoderma harsianum”Goldman，VanMontagu and Herrera-Estrella，Curr.Genet.17169-174 1990；“纤维素分解真菌Trichoderma reesei的通用转化系统”Penttila，Nevalainen，Ratto，Salminen and Knowles，Gene6155-164 1987)，以及对DNA重组物导入曲霉(“用trpC质粒转化构巢曲霉”Yelton，Hamer and Timberlake，Proc.Natl.Acad.Sci.USA811470-1474 1984)、镰刀霉(“可被磷酸化转换因子介导的植物信号诱导的真菌角质酶及其鉴定”Bajar，Podila and Kolattukudy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888202-8212 1991)、Tolypocladium(Camels T.et al.，Curr.Genet.，1991，20309-314)的方法也均有报道。此外，EP 870,835公开了用土壤杆菌介导的基因转移法转化各种丝状真菌的方法，这些丝状真菌包括曲霉、毛盘孢、镰刀霉、链孢霉、灰侧耳菌和木霉。
在优选的实施方案中，微生物宿主为木霉。在更优选的实施方案中，微生物宿主为木霉属的Trichoderma reesei。
上述这些发表的转化方法中所用的基因重组物，与实施例5-7、23、27、28、30、32和34中所描述的基因重组物类似，其类似点在于它们都含有调控区，与调控区相连并受其调控的蛋白编码区(该编码区可编码可筛选标记)，以及转录终止子。在大多数情况下，该基因重组物与可筛选标记基因相连。
在优选的实施方案中，木聚糖酶的分泌信号是微生物宿主天然的木聚糖酶分泌信号，而基因修饰的微生物是由此微生物宿主产生的(即，木聚糖酶分泌信号来源的微生物宿主，与产生所说的基因修饰的微生物的微生物宿主是同一类型)。但是，如本文所述，任何木聚糖酶分泌信号都可使用。
用本发明的方法和基因重组物产生的目的蛋白可以使用由宿主得到的粗提取物，或可用本领域熟知的方法将此目的蛋白部分或完全纯化，所用的方法包括离心、盐和pH沉淀、尺寸排阻、离子交换、亲合层析等。采用含有亲合标记的前导肽，然后用合适的亲合基质分离标记的目的蛋白，可以提高目的蛋白的纯化水平。这种亲合标记及其相应的亲合基质，在本领域也是为大家所熟知的。而且，间插序列编码的前导肽可以在目的蛋白的加工之前、加工期间或加工之后，与该目的蛋白分开。
以上的描述不会以任何方式来限制本发明的范围，此外，所讨论的特征组合对阐明本发明可能不是绝对必需的。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。这些实施例仅是用于说明本发明，而不以任何方式来限制本发明的范围。
实施例实施例1描述了从木霉属Trichoderma reesei株RutC30、M2C38、BTR48中分离基因组DNA，以及这些菌株的基因修饰衍生物。实施例2-7描述了基因组DNA文库的构建，各种基因的克隆，以及来源于Trichoderma reesei株M2C38的几种基因重组物。实施例9和11-15描述了β-葡萄糖苷酶基因重组物在Trichoderma reesei株M2C38、BTR48和RutC30中的转化和表达。
Trichoderma reesei株M2C38和BTR48是Iogen公司有产权的菌株，并由Trichoderma reesei RutC30(ATCC 56765，“纤维素酶高产的T.reesei突变株的筛选分离”Montenecourt and Eveleigh，Adv.Chem.Ser.1979，181289-301)衍生而来，该菌株本身又来源于Trichoderma reeseiQm6A(ATCC 13631，“碳源和金属对绿色木霉的纤维素酶的影响效应”Mandels and Reese，1957，J.Bacterial.73269-278)。
在实施例1及随后的实施例中，限制性内切酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶和大肠杆菌DNA聚合酶1的Klenow片段购自Gibco/BRL、New England Biolabs、Boehringer Mannheim或Pharmacia，并按生产商推荐的方法使用。具有校对活性的Pwo聚合酶(BoehringerMannheim)按照生产商所提供的方案，用于所有的聚合酶链反应中(PCR)。潮霉素B购自CalBiochem。
噬菌体文库在载体λ-DASH(Stratagene，Inc)中构建，其构建方法如下。基因组DNA(3μg)用2、1、0.5和0.2单位/μg的BamHI在37℃下消化1小时，以产生9-23kb大小的片段。每份消化反应所得的DNA用1倍体积Tris饱和的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，随后用10μl 3M醋酸钠(pH5.2)和250μl 95％的乙醇(-20℃)沉淀。通过微量离心沉淀消化的DNA，用0.5ml冷的70％乙醇淋洗，空气干燥后重新悬浮于灭菌去离子水中。通过琼脂糖凝胶电泳(0.8％琼脂糖，电泳液为含1mM EDTA的0.04M Tris-醋酸盐)进行9-23kb大小DNA片段的富集。将消化的DNA(0.4μg)与1μg用BamHI(Stratagene)预先消化的λ-DASH臂连接，连接反应物中含有2单位T4 DNA连接酶和1mM ATP，总体积为5μl，在4℃下反应过夜。用GigapackII Goldpackaging extracts(Stratagene)并按照生产商的方案，将连接混合物包装入噬菌体颗粒中。用大肠杆菌宿主菌株XL1-Blue MRA(P2)评估该文库的规模，测得共含有3×105个独立的克隆。
32P标记的探针制备方法如下。从富含Hind III、BamH1或EcoRI片段的库中，用PCR法分别扩增bgl1、cbh1和cbh2编码区的短片段(0.7-1.5kb)，标记反应物中含有10-50ng靶DNA、0.2mM的d(GCT)TP、0.5μM dATP，20-40μCiα-32P-dATP、10pmol寡核苷酸引物以及0.5单位Tag聚合酶，反应总体积为20μl。该扩增反应共进行6个循环(95℃2分钟；56℃1.5分钟；70℃5分钟)。加入0.5ml 10％(w/v)的三氯乙酸和0.5mg酵母tRNA使扩增的32P-标记的DNA沉淀。然后通过微量离心收集DNA沉淀，用1ml 70％乙醇洗两次，经空气干燥后重新悬浮于含1mM EDTA、pH7.5的1M Tris中。
将固定了重组pUC119质粒的尼龙膜放入加热密封的袋中60-65℃下预杂交1小时，预杂交液含1M NaCl、1％SDS、50mM Tris(pH7.5)、1mM EDTA，并含有100μg/ml变性并切断的鲑鱼精子DNA。杂交反应在加热密封的袋中用同样的缓冲液进行，缓冲液中含有50μg/ml变性并切断的鲑鱼精子DNA和5×106-5×107cpm变性的bgl1、cbh1或cbh2探针，反应在60-65℃进行16-20小时。膜用1M NaCl、0.5％SDS在60℃洗15分钟，共洗一次；用0.3M NaCl、0.5％SDS在60℃洗15分钟，共洗两次；然后再用0.03M NaCl、0.5％SDS在55℃洗15分钟，共洗一次。将膜再放入热密封的袋内，并暴露于Kodak RP X光片，在-70℃下放置16-48小时。按生产商的方案使该X光片显影。挑取给出强或弱信号的菌落，并在添加70μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中培养。用碱裂解法(Sambrook等，pp.1.25-1.28)从这些培养物中分离质粒DNA，再用限制性内切酶消化、Southern杂交(Sambrook等，pp.9.38-9.44)和PCR分析(Sambrook等，pp.14.18-14.19)进行分析。
用1.0kb bgl1探针与pUC119-Hind III文库(实施例2)进行菌落转移杂交，以鉴定携带bgl1基因的克隆，bgl1探针采用寡核苷酸引物制备，该引物设计成可扩增已知bgl1序列中碱基对462-1403的片段(Barrett等)。分离出的bgl1克隆pJEN200中含有的6.0kb的Hind III片段，该片段相当于启动子、结构基因和终止子序列。用0.7kb的cbh1探针与pUC119-BamH1文库进行菌落转移杂交，以鉴定携带cbh1基因的克隆，cbh1探针用寡核苷酸引物制备，该引物设计成可扩增已知发表的cbh1序列中碱基对597-1361的片段(“Trichoderma reesei菌株L27的外切纤维二糖水解酶1的分子克隆”Shoemaker，Schweikart，Ladner，Gelfand，Kwok，Myambo and Innis，Bio/Technology 1691-696，1983；以下称为Shoemaker等)。分离出的cbh1克隆pCOR132中含有5.7kb的BamHI片段，该片段相当于启动子(4.7kb)和1kb的cbh1结构基因。在上述结果的基础上，将包含Cbh1启动子(2.1kb)和cbh1编码区的5′端(0.4kb)的2.5kb EcoRI片段亚克隆到pUC119中，构建pCB152。用1.5kb的cbh2探针与pUC119-EcoRI文库进行菌落转移杂交，以鉴定携带cbh2基因的克隆，cbh2探针用寡核苷酸引物制备，该引物设计成可扩增已知cbh2序列中碱基对580-2114片段(“Trichoderma reesei纤维二糖水解酶的核苷酸序列以及推测的一级结构”Chen，Gritzali and Stafford，Bio/Technology 5274-278，1987；以下称为Chen等)。分离出的cbh2克隆pZUK 600含有4.8kb的EcoRI片段，该片段相当于启动子(600bp)、结构基因(2.3kb)和终止子(1.9kb)。实例例4T.reesei M2C38 cbh1终止子，木聚糖酶II(xln2)基因，磷酸甘油酸激酶(pgk p)的克隆地高辛-11-dUTP标记的探针制备过程为，PCR扩增cbh1、xln2和pgk基因的编码区，引物是用DIG标记和检测试剂盒(BoehringerMannheim)并按照生产商的方案标记的随机引物。含有cbh1、xln2和pgk基因的基因组克隆通过λ-DASH文库的噬菌斑转移杂交来鉴定。对于每个目的基因，将1×104个克隆转移至Nytran(Schleicher andSchull)尼龙膜上。膜上有噬菌斑的一面在用0.5M NaOH、1M NaCl饱和的印迹纸(VWR238)覆盖，放置5分钟，使噬菌体颗粒裂解并使噬菌体DNA变性；然后将此膜上有噬菌斑的一面在用1.5MTris(pH7.5)、1M NaCl饱和的印迹纸(VWR238)覆盖，放置5分钟，使膜中和。将该膜在空气中干燥30分钟后，在80℃烘烤2小时，使DNA固定在膜上。将膜放入加热密封的袋中，65℃预杂交2小时，预杂交液为6×SSPE、5×Denhardt′s、1％SDS，再加入100μg/ml变性并切断的鲑鱼精子DNA。然后再将此膜放入加热密封的袋中杂交，杂交液与预杂交液的相同，但含有50μg/ml的变性并切断的鲑鱼精子DNA和0.5μg地高辛-dUTP标记的探针，在65℃反应过夜。杂交后的膜用2×SSPE、0.1％SDS，室温下洗两次，每次15分钟；用0.2×SSPE、0.1％SDS，65℃洗两次，每次15分钟；以及用2×SSPE洗一次，洗15分钟。阳性的杂交克隆按照生产商的方案，通过与抗-地高辛/碱性磷酸酶抗体偶联物的反应来鉴定，显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯和4-氮蓝四唑氯(Boehringer Mannbeim)。用地高辛dUTP标记的探针进行第二轮的筛选，进一步将阳性的杂交克隆纯化。单个克隆的分离以及噬菌体DNA的纯化按Sambrook等(1989)pp.2.118-2.121中所述的方法进行，但其中的CsCl梯度离心步骤用1倍体积的酚∶氯仿∶异戍醇(25∶24∶1)和1倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提步骤所替代。用0.1倍体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积冷的95％乙醇沉淀DNA，用0.5ml冷的70％乙醇洗涤沉淀的噬菌体DNA，空气干燥后重悬于50μl含1mM EDTA、pH8.0的10mM Tris中。用限制性内切酶消化该纯化的噬菌体DNA，以及用Southern印迹杂交(Sambrook等，pp.9.38-9.44)鉴定含有目的基因的限制性片段。该Southern印迹杂交过程中，采用与筛选λ-DASH文库相同的地高辛-dUTP标记的探针。采用与转移噬菌斑时同样的方法，将膜杂交并使阳性杂交片段显影。一旦由每个λ-DASH克隆鉴定出所需的限制性片段，则重复上述限制性内切酶消化步骤。酶切的片段在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离，电泳液为TAE，并将所需的条带切下。用Sephaglas BandPrep试剂盒(Pharmacia)并按照生产商的方案，将DNA从凝胶切片上洗脱下来。
用cbh1探针与λ-DASH文库(实施例2)进行菌落转移杂交，以鉴定携带cbh1基因的克隆，该cbh1探针含有已知的cbh1序列(Shoemaker等)中碱基对45-2220的片段。用限制性内切酶消化由λ-DASH cbh1克隆纯化的噬菌体DNA，分离出含有cbh1编码区的3′端(0.5kb)和cbh1终止子(1.3kb)的1.8kb的BamHI片段。将此片段亚克隆到大肠杆菌质粒载体pUC 119的BamHI位点，制备质粒pCB1Ta。用xln2探针与λ-DASH文库(实施例2)进行菌落转移杂交，以鉴定携带xln2基因的克隆，该xln2探针含有已知的xln2序列(“Trichoderma reesei木聚糖内切酶II(pI9)基因xln2的克隆、序列分析和表达增强”Saarelainen，Paloheimo，Fagerstrom，Suominen andNevalainen，Mol.Gen.Genet.241497-503，1993；以下称为Saarelainen等)中碱基对100-783的片段。用限制性内切酶消化由λ-DASH xln2克隆纯化的噬菌体DNA，分离出含有xln2基因的启动子(2.3kb)、编码区(0.8kb)和终止子(2.6kb)的5.7kb KpnI片段。将此片段亚克隆到pUC119的KpnI位点，制备质粒pXYN2K-2。用pgk1探针与λ-DASH文库(实施例2)进行菌落转移杂交，以鉴定携带pgk基因的克隆，该pgk1探针含有已知的pgk序列(“丝状真菌Trichoderma reesei3-磷酸甘油酸激酶基因(pgk)的分离和鉴定”Vanhanen，Penttila，Lehtovaara and Knowles，Curr.Genet.15181-186，1989)中碱基对4-1586的片段。用限制性内切酶消化由λ-DASH pgk克隆纯化的噬菌体DNA，分离出含有pgk基因的启动子(2.9kb)、编码区(1.6kb)和终止子(0.5kb)的5.0kb EcoRI片段。将此片段亚克隆到pUC119的EcoRI位点，制备质粒pGK5.0。
用Pwo聚合酶，以pJEN200为模板，PCR扩增含有bgl1编码区并减去β-葡萄糖苷酶分泌信号(碱基对474-2679)的DNA片段。扩增所用的引物与发表的bgl1序列同源，并可在编码的β-葡萄糖苷酶32位缬氨酸5′端导入SphI位点或在bgl1终止密码子的3′端导入KpnI位点。用SphI和KpnI消化此扩增的片段，并插入用SphI和KpnI消化的pCB219N中，制备pBgstrf。为了制备pCB219N，以pZUK600为模板，扩增出cbh2终止子片段。所用的一个引物与发表的cbh2基因3′端非翻译区的碱基对2226-2242(Chen等，1987)同源，并在5′端导入Kph1位点；所用的另一引物为PUC正向引物(Cat，NO.1224，NewEngland Biolabs)，该引物与pZUK600中cbh2 3′端的EcoRI位点的下游配对。将此扩增的片段在构建的KpnI和EcoRI位点进行消化，然后插入pUC119的相应位点，制备pCB219。再将EcoRI-Not1接头(Cat.NO.35310-010，Gibco/BRL)插入pCB219的单一EcoRI位点，制备pCB219N。由pCB152，用cbh1特异引物(发表的cbh1序列中的碱基对249-286，Shoemaker等，1983)和PUC正向引物(Cat.No.1224，New England Biolabs)扩增含有cbh1启动子和分泌信号的片段。cbh1特异引物可在编码的CBH1第19位丝氨酸3′端导入SphI位点，pUC正向引物与pCB152中cbh1 5′端EcoRI位点的上游配对。然后用SphI和EcoRI消化上述包括cbh1启动子和分泌信号PCR产物，并将其插入pBR322L(pBR322的衍生物，其中SphI和Sal1位点间的区域被SphI-NotI-SalI接头所替代)的相应位点中，制备pBR322LCS。为了构建表达序列盒，从pBgstrf中分离出包含bgl1编码区和cbh2终止子的4.1kb的SphI/NotI片段，并插入用SphI和NotI消化的pBR322LCS中。在接合cbh1分泌信号与成熟β-葡萄糖苷酶时，为了保持其阅读框的正确性，将所得质粒pCBGstrf在单一SphI位点线性化，并用T4DNA聚合酶将SphI位点补平。然后将所得质粒pCBG1进一步修饰，即加入XhoI接头(Cat.No.1073，New England Biolabs)使cbh2终止子3′端的唯一NotI位点转换为唯一XhoI位点。最终的质粒pCBG1-Xho即为表达序列盒质粒。
由质粒pVU1005，用Pwo聚合酶扩增用作T.reesei筛选标记的大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶基因(hph)(“用作植物细胞筛选标记的嵌合潮霉素抗性基因”Van den Wizen，Townsend，Lee and Bedbrook，Plant Mol.Biol，5299-302，1989)。所用的引物设计成在hph的编码区(发表的hph序列中碱基对211-1236；“质粒编码的潮霉素B抗性潮霉素B磷酸转移酶基因的序列及其在大肠杆菌和啤酒酵母中的表达”Gritz and Davies，Gene 25179-188，1983)的5′端和3′端分别引入SphI和KpnI位点。用SphI和KpnI消化所得的PCR产物，并将消化产物插入pUC119多接头区的相应位点。所产生的质粒pHPT100用作起始质粒以构建筛选序列盒。将两个新的接头区引入此质粒，以便于克隆启动子和终止子片段。其中，HindIII-XbaI-XhoI-SphI接头插入HindIII和SphI位点之间，以及KpnI-NotI-SacI接头插入仍保留在pHPT100中的pUC119多接头的KpnI和SacI位点之间。所产生的结构指定为pHPT102。用于扩增pgk启动子(“T.reesei 3-磷酸甘油酸激酶基因(pgk1)的启动子结构和表达”Vanhanen，Saloheimo，Ilmen，Knowles and Penttila，Gene 106129-133，1991)的引物设计成在启动子的-970位和+1位分别引入XhoI位点和SphI位点。这些位点随后用来将pgk启动子插入pHPT102的XhoI和SphI位点，以制备pHPT115。由pCB1Ta，用Pwo聚合酶扩增1.3kb的cbh1终止子片段，所用的一个引物与cbh1的3′端非翻译区(发表的cbh1序列中碱基对1864-1899)配对，该非翻译区在碱基对1877-1882含有KpnI位点，所用的另一引物为PUC反向引物(Cat.No.18432-013，Gibco/BRL)，该引物与pCB1Ta中cbh1终止子3′端EcoRI位点的下游配对。用KpnI消化cbh1终止子的PCR产物，并将此消化产物插入pHPT115的唯一KpnI位点，制备筛选序列盒质粒pHPT136。
为了获得转化载体，由pCBG1-Xho分离出5.6kb XbaI/XhoI片段的表达序列盒，并将其插入pHPT136的筛选序列盒上游的唯一XbaI/XhoI位点。最终的转化载体pCBG1-TV如
图1所示，以环状质粒的形式，如以下实施例9所述，通过微粒轰击导入T.reesei M2C38中。
由基因组bgl1克隆pJEN200，用Pwo聚合酶和引物扩增出β-葡萄糖苷酶编码区(碱基对474-2680)，以便在发表的bgl1序列(Barrett，等)中碱基对474的正上游插入XbaI位点，以及在碱基对2680的正下游插入KpnI位点。将平端的pCR产物插入PUC118的SmaI位点，制备的质粒指定为pBGm.s。由于XbaI位点是构建在成熟β-葡萄糖苷酶的起始32位缬氨酸的正上游，所以克隆的片段不包括β-葡萄糖苷酶的分泌信号。用XbaI和KpnI消化质粒pBGm.s，分离出含有bgl1编码区并减去分泌信号的2.2kb片段，将此片段插入质粒pCB219N(在以上实施例5中描述)中cbh2终止子上游的XbaI和KphI位点，制备质粒pBG2X。由基因组xln2亚克隆pXYN2K-2，用Pwo聚合酶，并采用xln2特异的引物和pUC反向引物(Cat.No.18432-013，Gibco/BRL)扩增2.3kb含有xln2基因(碱基对-2150至+99，其中+1表示ATG起始密码子)的启动子和分泌信号的片段。xln2特异的引物含有已知的xln2序列(Saarelainen等)中碱基对103正下游的NheI位点，pUC反向引物与xln2基因5′端KpnI位点的上游配对。用EcoRI(作为pUC119多接头的一部分由pXYN2K-2i扩增而来)和NheI消化xln2 PCR产物，并将其产物插入质粒pBR322L(在以上实施例5中描述)中，制备pBR322LXN。然后用Klenow将pBR322LXN的EcoRI位点补平，再加入SpeI接头(Cat.No.1086，New Englanol Biolabs)，制备pBR322SpXN。用XabI和NotI酶切pBG2X质粒，分离出含有bgl1编码区以及随后的cbh2终止子的4.2kb片段。将此片段插入用NheI和NotI酶切的质粒pBR322SpXN中(NheI和XbaI有相匹配的凸末端)。该克隆中木聚糖酶分泌信号直接与成熟β-葡萄糖苷酶融合，制成完整的表达序列盒pXBG-2。
将以上实施例5中所述的筛选序列盒质粒pHPT136中的cbh1终止子，用含有xln2转录终止子的2.6kb KpnI片段取代。用Pwo聚合酶和引物由基因组亚克隆pXYN2K-2扩增xln2终止子，所用的一个引物可引入发表的xln2序列(Saarelainen等)中碱基对780正下游的KpnI位点，另一引物为PUC正向引物(Cat.No.18431-015，Gibco/BRL)，该引物与pXYN2K-2中xln2基因3′端的下游配对。用KpnI消化xln2终止子的PCR产物，并与含有pUC119中pgk启动的hph基因的pHPT136的5.1kb KpnI片段连接，制成筛选序列盒质粒pHPT136X。
转化载体的构建包括在筛选序列盒的pgk启动子正上游插入表达序列盒。用NotI消化表达序列盒质粒pXBG2，用Klenow将末端补平，然后用SpeI消化。筛选序列盒pHPT136X用同样的方式制备，先用XhoI消化，随后通过充填反应产生平末端，然后用XbaI消化。将pXBG2的6.5kb SpeI/平端NotI片段与pHPT136X的XbaI/平端XhoI片段(Spel和Xbal有相匹配的凸出末端)连接，进行上述两片段进行平端一粘端连接。最终的转化载体pXBG-TV如图2所描述，在其唯一的NotI位点线性化，然后如以下实施例9所述，通过微粒轰击转化T.reeseiM2C38。
实施本实施例的目的是检测cbh1启动子和xln2分泌信号对bgl表达的联合影响。用含有cbh1启动子的质粒pBR322LCS(实施例5)作为模板，PCR扩增含有cbh1启动子中碱基对-1399至-204的1.2kb HindIII片段，以便在碱基对-1393至-1388插入唯一的XbaI位点。此修饰的cbh1启动子片段用Hind III消化后，用来取代pXBG1(实施例6)中xln2启动子碱基对-1400至-121的片段，制成新的表达序列盒质粒pC/XBG1。用NotI消化pC/XBG1，随后用Klenow片段将NotI位点补平，再用SpeI消化，分离出6.4kb的表达序列盒。然后通过平端/粘端连接，将此片段插入已用XhoI消化的pHPT136X中hph筛选序列盒的上游，并用Klenow将此XhoI补平后，再用XbaI消化。如图3所示，最终的转化载体pC/XBG(XbaI)-TV(保藏编号209613，保藏日期1998年2月3日，保藏单位是美国标准生物材料保藏所(American TypeCulture Collection)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 USA)，将此转化载体中在cbh1启动子5′端和xln2终止子3′端的单一XbaI和NotI位点线性化，然后如以下实施例9所述，通过微粒轰击转化T.reeseiM2C38。
孢子出现后，进行第二次筛选，以分离单个转化子。用接种环收集孢子并重悬于无菌水中。然后将此悬浮物通过塞有玻璃微纤维的无菌注射器过滤，使孢子滤过，而留下不需要的菌丝体。测定悬浮物中孢子的浓度，然后进行稀释，将稀释物在添加0.75％Oxgall(Difco)和潮霉素B(40单位/ml)的PDA平板上涂板，每个平板得到20-50个孢子。Oxgall起到菌落限制剂的作用，从而在这些第二次筛选平板上分离出单个菌落。2-3天后可观察到分离出来的菌落。
表1亲本和重组T.reesei株中的bgl1拷贝数

实施例11在液体培养物中生产β-葡萄糖苷酶本实施例描述木霉株生产的β-葡萄糖苷酶酶量的测定方法将单个木霉菌落转移到PDA平板上，用于繁殖各自的培养物。为了使摇瓶的接种均匀，要求菌落形成孢子，摇瓶接种后用于测定其培养物产生的β-葡萄糖苷酶和纤维素酶的能力。培养基的组成如下所示。组分 g/L(NH4)2SO46.35KH2PO44.00MgSO4·7H2O 2.02CaCl2·2H2O 0.53CSL(玉米浆) 6.25CaCO310.00碳源**5-10微量元素*1ml/L*微量元素溶液含有5g/l FeSO4·7H2O；1.6g/l MnSO4·H2O；1.4g/l ZnSO4·7H2O。**5g/l葡萄糖加10g/l Solka floc(采用cbh1或其他纤维素酶启动子时)、10g/l木聚糖(采用xln2启动子时)或其他与指导β-葡萄糖苷酶表达的启动子相匹配的碳源。碳源可配制成pH2-7的水溶液，分装后灭菌，然后加入到主培养基中。
液体的体积为每个1升的瓶中加入150ml，起始pH为5.5，每个瓶子都在121℃高压灭菌30分钟，然后接种。
对未转化的(天然的)和转化的细胞，按实施例9所述，从PDA平板分离孢子，每个摇瓶接种1-2×106个孢子。该摇瓶在28℃、以200rpm的速度振摇6天。通过GF/A玻璃微纤维过滤器(Whatman)过滤收集含分泌蛋白的滤液。用Bio-Rad Protein Assay(Cat.No.500-0001)，以木霉纤维素酶为标准，确定蛋白的浓度。β-葡萄糖苷酶活性按实施例16所述进行测定。
筛选产β-葡萄糖苷酶能力(IU/mg)比未转化的宿主菌至少高10倍以上的转化子，该产酶能力的测定方法是将培养物滤液的β-葡萄糖苷酶活性IU/ml除以该培养物滤液的蛋白浓度(mg/ml)。实施例12由T.reesei株RutC30、RC-300、和RC-302用Solka floc碳源生产β-葡萄糖苷酶基于前面所述的用cbh1启动子和分泌信号在木霉中使蛋白过表达的成功结果，将成熟β-葡萄糖苷酶编码区置于基因重组物中cbh1启动子和分泌信号的下游，该基因重组物如
图1所示，并在实施例5中描述(pCBG1-TV)。通过微粒轰击，将载体引入T.reesei RutC30中(实施例9)，所产生的转化子RC-300能产生高出亲本株7倍多的β-葡萄糖苷酶活性(表2)。此7倍增加量是由于转化载体的一个拷贝掺入了宿主的染色体中(实施例10，表1)。β-葡萄糖苷酶活性较大的提高是由于某一基因结构的1个拷贝，在此基因结构中β-葡萄糖苷酶是用cbh1启动子和分泌信号进行表达，这种策略优于Barnett等和Fowler等所采用的策略。在Barnett等和Fowler等所采用的方法中，基因结构的10-15个拷贝仅使β-葡萄糖苷酶的活性增加了5倍，在该基因结构中β-葡萄糖苷酶用其本身的启动子和分泌信号进行表达。但是，β-葡萄糖苷酶活性增加7倍，仍不足以缓解纤维素水解过程中β-葡萄糖苷酶的不足。
通过微粒轰击，将基因重组物导入未转化的T.reesei株RutC30(实施例9)，该基因重组物来自编码与T.reesei木聚糖酶II分泌信号相连的成熟β-葡萄糖苷酶的pC/XBG(XbaI)。
未转化的T.reesei株RutC30及由此宿主产生的转化株RC-302按实施例11的步骤，以10g/L Solka floc和5g/L葡萄糖为碳源进行培养。结果如表2所示。
未转化株产生的每mg蛋白中β-葡萄糖苷酶活性为0.14IU。
含有CBH1启动子和木聚糖酶II分泌信号的转化子RC-302产生的β-葡萄糖苷酶活性约为19IU/mg。这比未转化株提高了约136倍，这对于纤维素-乙醇生产来说是很重要的。
含有CBH1启动子和木聚糖酶II分泌信号的转化子RC-302产生的β-葡萄糖苷酶活性比含有CBH1启动子和CBH1分泌信号的最佳RC300转化子高出19倍。
表2150ml摇瓶培养物中T.reesei株RutC30、RC-300和RC-302的β-葡萄糖苷酶产量

实施例13由M2C38和RM4-302株用Solka floc碳源生产β-葡萄糖苷酶将载体pCBG1-TV通过微粒轰击导入T.reesei M2C38中(实施例9)，上述载体中β-葡萄糖苷酶依靠CBH1启动子和分泌信号来表达(
图1和实施例5)。所得转化子RM4-300产生的β-葡萄糖苷酶活性约为亲本株的7-12倍(表3)。
通过微粒轰击，将基因重组物导入未转化的T.reesei株M2C38(实施例9)，该基因重组物来源于编码与T.reesei木聚糖酶II分泌信号相连的成熟T.reesei β-葡萄糖苷酶的载体pC/XBG(XbaI)-TV。
未转化的M2C38株和由此宿主转化的转化株RM4-302，以10g/LSolka floc和5g/L葡萄糖为碳源，按实施例11的步骤进行培养。结果如表3所示。
未转化株产生的每mg蛋白中β-葡萄糖苷酶活性为0.35IU。
含有CBH1启动子和木聚糖酶II分泌信号的转化子RM4-302产生的β-葡萄糖苷酶活性约为14.1IU/mg。这比未转化株提高了约40倍，这对纤维素-乙醇生产来说有很重要的意义。
含有CBH1启动子和木聚糖酶II分泌信号的转化子RM4-302所产生的β-葡萄糖苷酶活性约为含有CBH1启动子和CBH1分泌信号的转化子的3倍。该差别是很重要的，说明采用CBH1启动子和分泌信号时不能产生足够的β-葡萄糖苷酶，以完全抑制水解过程中纤维二糖的产生。
表3150ml摇瓶培养物中T.reesei株M2C28、RM4-300和RM4-302的β-葡萄糖苷酶产量

实施例14用T.reesei株M2C38和RM4-301由木聚糖碳源生产β-葡萄糖苷酶通过微粒轰击，将基因重组物转导入未转化的T.reesei株M2C38(实施例9)，该基因重组物来源于编码与木聚糖酶启动子和分泌信号相连的成熟T.reesei β-葡萄糖苷酶的载体pXBG1-TV。
未转化的M2C38株和由此宿主转化的转化株RM4-301，以5g/L葡萄糖和10g/L木聚糖为碳源，按实施例11的步骤培养。结果如表4所示。
未转化株产生的每mg蛋白中β-葡萄糖苷酶活性为0.16IU。含有木聚糖酶II启动子和木聚糖酶II分泌信号的转化子RM4-301产生的β-葡萄糖苷酶活性约为20.4IU/mg。此结果比未转化的菌株提高了约127倍，这对纤维素-乙醇生产来说是非常有意义的。
表4用木聚糖为碳源，150ml摇瓶培养基物中T.reesei株M2C38和RM4-301的β-葡萄糖苷酶产量

实施例15用Solka floc碳源，由BTR-48和RB48-301株生产β-葡萄糖苷酶通过微粒轰击，将基因重组物导入未转化的T.reesei株BTR48，该基因重组来源于编码与木聚糖酶启动子和分泌信号相连的成熟T.reeseiβ-葡萄糖苷酶的载体pXBG1-TV。
未转化的BTR-48株和由该宿主转化的转化株RB48-301，以5g/L葡萄糖和10g/L Solka floc为碳源，按实施例11的步骤进行培养。结果如表5所示。
未转化株产生的每mg蛋白中β-葡萄糖苷活性为0.16IU酶。含有木聚糖酶II启动子和木聚糖酶II分泌信号的转化子RB48-301产生的β-葡萄糖苷酶活性约为21.9IU/mg。此结果比未转化株提高了约136倍，这对纤维素-乙醇生产来说是非常有意义的。
表5用Solka floc为碳源，150ml摇瓶培养基中T.reesei株BTR48和RB48-301的β-葡萄糖苷酶产量

实施例16酶混合物中的β-葡萄糖苷酶活性的测定按照Ghose的方法(“纤维素酶活性的测定”Pure and Appl.Chem.，59257-268，1987)，测定β-葡萄糖苷酶活性。活性测定步骤为用50mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.8)将酶样品稀释成若干个浓度，系列系稀释样品的体积均为0.5ml。合适的稀释倍数范围是将样品的估计活性稀释3～24倍。例如，10U/ml的样品的稀释比为1∶30-1∶240。无论所用的稀释倍数是多少，每支酶标管内均装入0.5ml的柠檬酸缓冲液样品。底物为15mM(5.13g/L)的纤维二糖。将稀释的酶贮存液和底物分别在50℃预热5分钟，然后在装有酶的每支管中加入一份0.5ml的底物。试管在50℃温育30分钟。然后将各试管浸入沸水浴中5分钟，以终止反应。将试管旋转混合，在YSI葡萄糖分析仪上测定每份酶样品管中的糖量，此时需要考虑到由酶产生的少量背景。
1个单位β-葡萄糖苷酶活性的定义为每分钟产生的葡萄糖微摩尔数。由每种稀释度所得的平均值按公式1计算活性，该稀释度条件下产生0.15-1.5mg/ml的葡萄糖。
A＝C×G×D (1)其中，A＝β-葡萄糖苷酶活性(U/ml)(或微摩尔葡萄糖/ml/分钟)C＝16.7微摩尔/mg/分钟G＝产生的葡萄糖(mg/ml)D＝酶的稀释度(无单位)实施例17纤维素水解本实施例的目的是确认转化木霉产生的β-葡萄糖苷酶对纤维素水解的促进效果用于此研究的酶为Iogen Cellulase，此酶为Iogen公司生产的纤维素酶市售品；以及按实施例11的方法，30L发酵罐内培养RM4-302的产物，所用的培养基浓度为实施例11中所列出的两倍。通过Amicon10,000MWCO膜超滤浓缩，使酶浓度提高，并校正至与Iogen Cellulase相同的纤维素酶活性。这两种酶的活性如表6所示。
表6用于纤维素水解研究的酶的活性

用于本研究中的纤维素是预处理的燕麦壳，按照Foody等的(“用于纤维素转化为燃料乙醇的改进预处理工艺”U.S.5,916,780)实施例6的步骤制备。
将0.5g预处理的燕麦壳纤维素样品加入到装有49.5g的0.05mol柠檬酸钠缓冲液(pH 4.8)的25ml烧瓶中。
将酶加入到摇瓶中，每g纤维素的相应加入量为10FPU。最终的β-葡萄糖苷酶剂量列于表6中。
加入两种酶的摇瓶都以250rpm振荡，并保持在50℃共24小时。此时，取样并过滤除去不溶的纤维素，然后用标准Dionex脉冲-电流HPLC糖类分析法分析葡萄糖和纤维二糖的浓度。结果列于表7中。
Iogen Cellulase是常用的木霉纤维素酶，但该酶仅将45％的纤维素转化为葡萄糖。在乙醇生产中如此低的程度是不可接受的。纤维二糖的蓄积也很严重，占纤维素的13％。
β-葡萄糖苷酶含量提高的纤维素酶对纤维素水解得较好，可将近84％的纤维素转换为葡萄糖。其优良表现的原因是由于β-葡萄糖苷酶的含量丰富，导致纤维二糖的蓄积几乎可忽略。
表7高含量的β-葡萄糖苷酶增加了纤维素的水解

实施例18RutC30和M2C38株中T.reesei xln2和bgl1基因的比较用六种不同的限制性内切酶消化M2C38和RutC30的DNA，这些内切酶酶切成熟β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶分泌信号(实施例8)编码区的内部和外部，然后对此消化的DNA进行Southern印迹分析，以确定该两种菌株间是否存在多态性。如图4和图5所示，用编码成熟β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶II启动子以及分泌信号的M2C38片段制备的标记探针杂交时，可发现相同的条带，表明了该两种菌株间的这些区域不存在多态性，而有高度的DNA序列同源性。
对于制备实施例5-7中所述的基因重组物时所必需的M2C38DNA序列来说，鉴定和克隆这些序列所用的探针和引物都是基于已发表的几种不同T.reesei株的各种基因DNA序列制备的，这些菌株包括QM9414(pgk，Vanhanen等，1989；以及cbh2，Chen等)、QM9419衍生株VTT-D79125(xln2，Saarelaihen等)和L27(cbh1，Shoemaker等)，以及RL-P37株的衍生株P40(bgl1，Barnett等)。所有这些菌株，类似于M2C38，都来源于QM6a株(“T.reesei染色体和基因的电泳核型分析纤维素酶和木聚糖酶基因的图谱”Carter，Allison，Reyand Dunn-Coleman，Molecular Microbiology 62167-2174，1992)。
RutC30由QM6a衍生而来，并且是M2C38的先祖。发明者确信实施例2-4所述的方法，即用于制备实施例5-7所述β-葡萄糖苷酶表达载体的基因序列的分离方法，同样能用于分离M2C38和RutC30的相同基因序列。根据上述的菌株谱系和Southern印迹信息，发明者还高度地确信由RutC30 DNA制备的基因重组物与由M2C38 DNA制备的基因重组物将含有相同的DNA片段，该DNA片段为编码成熟β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶II分泌信号的序列。由于由M2C38 DNA制备的基因结构(实施例5-7)提高了β-葡萄糖苷酶在M2C38和RutC30中的表达(实施例12-14)，本发明者也确信由RutC30 DNA制备的基因重组物将会在RutC30和M2C38中使β-葡萄糖苷酶活性有同样水平的提高。
实施例19描述了T.reesei株M2C38和BTR213营养缺陷型pyr4的分离。实施例20和21描述了目的酶(内源和外源的)通过基因重组物在T.reesei株M2C38和BTR213中的转化和表达。实施例22、26和32分别描述了T.reesei eg2和man1基因的克隆。
实施例23、27、28、30和32描述了用于在T.reesei中表达目的酶的基因重组物的构建。实施例25、29、31和33描述了基因重组物在T.reesei株M2C38和BTR 213中的转化和表达。
为了筛选这些突变体，将T.reesei的孢子在含有1.2g/ml FOA、2mg/ml尿苷的固体最小培养基上涂平板。最小培养基的组成如下10g/L的葡萄糖、10g/L KH2PO4、6g/L(NH4)2SO4、1g/L MgSO4·7H2O、3g/L柠檬酸三钠·2H2O、5mg/L FeSO4·7H2O、1.6mg/L MnSO4·H2O、1.4mg/LZnSO4·7H2O、2mg/ml CaCl2·2H2O、pH5.5。在3-4天内出现自发的FOA抗性菌落。进一步筛选，鉴定其生长需要尿苷的突变体。鉴定明确含有缺失pyr4基因的突变体的方法是用质粒pNCP4hph转化，该质粒含有潮霉素抗性基因和粗糙链孢霉pyr4基因。此载体的构建方法如下，从pFB6中分离出3.2kb的BglII片段(“通过在大肠杆菌中的表达，粗糙链孢霉乳清酸核苷-5′-一磷酸羧化酶结构基因的克隆”Buxton，F.P.and Radford，A.，Mol.Gen.Genet.190403-405，1983)，然后将其克隆到pHPT136(上述实施例5)的唯一BamHI位点，制备载体pNCP4hph。通过微粒轰击法，用pNCP4hph转化孢子，并在含潮霉素的Potato Dextrose琼脂培养基上筛选。随后用缺乏尿苷的培养基培养抗潮霉素的转化子，鉴定出其缺失的pyr4基因被粗糙链孢霉的pyr4基因互补的转化子。
用含有大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶(hph)基因作为筛选标记的载体进行转化时，在Potato Dextrose琼脂培养基(PDA)平板上涂布1×106个孢子。轰击后的平板在28℃温育。轰击后4小时，将添加80U/ml潮霉素B的筛选PDA培养基覆盖在平板上，对孢子进行初选。轰击平板在28℃温育，生长3-6天后，用无菌牙签挑取单个转化子，分别放在含40U/ml潮霉素B的各PDA平板上，并在28℃温育3-6天。
用含有粗糙链孢霉pyr4基因作为筛选标记的载体进行转化时，用1×106个孢子在最小培养基上制备平板(实施例19)。轰击的平板在28℃温育。生长3-6天后，用无菌牙签挑取单个的转化子，分别放在各最小培养基平板上，并在28℃温育3-6天。
每个1升的摇瓶中加入150ml体积的液体，超始pH为5.5，每个摇瓶在接种前均在121℃高压灭菌30分钟。
用接种环从平板上收集天然的和转化的细胞的孢子，并重新悬浮于无菌水中。然后将此悬浮液通过塞入玻璃微纤维的无菌注射器过滤。这样可使孢子通过，而留下不需要的菌丝体。测定该悬浮液中孢子的浓度后，每个摇瓶接种1-2×106个孢子。将此摇瓶在28℃的温度、200rpm振荡培养6天。通过GF/A玻璃微纤维过滤器(Whatman)过滤，收集含有分泌蛋白的滤液。以木霉纤维素酶为标准，用Bio-Rad ProteinAssay(Cat.No.500-0001)测定蛋白的浓度。
用eg2亚克隆pEG2gen为模板，用Pwo聚合酶(Boehringer)和引物扩增编码葡聚糖内切酶II蛋白连同其本身分泌信号(碱基对bp262-1692)的DNA序列，该引物设计成可在碱基对260-265引入SphI位点，以及在碱基对1692的终止密码子正下游引入KpnI位点。将扩增的PCR产物以平端片段插入pUC119的SmaI位点，制备质粒pEG2-6，并测定其序列。对于可使该eg2基因通过cbh1启动子而表达的表达序列盒来说，在其构建之前，先用Pwo聚合酶和引物，由cbh1基因组亚克隆pCB152(上述实施例3)扩增含有cbh1启动子的2.2kb片段，其中一个引物与pUC119多接头的EcoRI位点的上游配对，另一反向引物设计成可在cbh1的起始密码子引入SphI位点(发表的cbh1序列的碱基对209-214；“T.reesei L27株外切纤维二糖水解酶1的分子克隆”Shoemaker，Schweikart，Ladner，Gelfand，Kwok，Myambo andInnis，Bio/Technology 1691-696，1983；以下称为Shoemakar等)。用EcoRI和SphI消化此扩增的片段，并插入pBR322L(上述实施例5)中，制备质粒pBRC1pro，pBR322L是在pBR322原有的位点SphI和SalI间插入合成的SphI-NotI-SalI接头而衍生出来的质粒。由pEG2-6分离出含eg2基因的1.4kb SphI/KpnI片段，并插入质粒pCB219N(上述实施例5)中cbh2转录终止子上游唯一的SphI和KpnI位点之间。然后用SphI/NotI消化，分离出含eg2基因和cbh2转录终止子的3.3kb片段，并将其插入pBRC1pro中cbh1启动子正下游的SphI和NotI位点之间。所得表达序列盒质粒pCEG2含有与cbh1启动子和cbh2终止子序列连接的eg2基因(编码成熟的分泌葡聚糖内切酶II及其本身的分泌信号)。对此质粒作进一步的修饰，在唯一的NotI位点进行消化，用Klenow补平并加入XhoI接头(Cat.No.1073，New England Biolabs)，从而在cbh2终止子的3′端插入了单一XhoI位点，由此制成新的表达序列盒质粒pEG2-Xho。为了构建最终的转化载体pEG2-TV(图6a)，pCEG2-Xho在cbh2终止子的3′端单一XhoI位点进行酶切，然后在cbh1启动子中碱基对-1392的单一XbaI位点进行酶切，以分离出包含在cbh1启动子调控下的eg2基因的5.6kb表达序列盒。然后将此片段插入pHPT136(上述实施例5)中hph筛选序列盒的上游，该pHPT136已在单一XhoI和XbaI位点预先酶切过。在转化T.reesei M2C38株之前，用XbaI和NotI消化转化载体pEG2-TV，用琼脂糖凝胶电泳分离片段，纯化含有eg2基因结构的大条带。
为了构建与xln2分泌信号连接并受cbh1启动子调控的成熟葡聚糖内切酶II表达序列盒，用Pwo聚合酶和引物，以及用基因组亚克隆pEG2gen为模板扩增发表的eg2序列(Saloheimo等)中碱基对331-1692片段，所用的引物设计成可在碱基对331的正上游引入唯一的NheI位点，以及可在碱基对1692的正下游引入唯一的KpnI位点。将产生的平末端片段插入pUC119的SmaI位点，制备质粒pE1，并测定eg2基因的序列。用NheI/KpnI消化pE1，分离出1.3kb编码成熟葡聚糖内切酶II的片段(不含分泌信号)，将此片段插入质粒pCB219N-HB中cbh2终止子的上游，制备pCB219N-E1。pCB219N-HB是由pCB219N(上述实施例5)衍生的质粒，在pCB219N中原有的pCB219 cbh2终止子片段上游的HindIII和BamI位点间插入合成的HindIII-SphI-NheI-BamHI接头，即产生pCB219N-HB。用NheI/NotI消化pCB219N-E1，分离出含有eg2编码区和cbh2终止子序列的3.2kb片段，将此片段插入质粒pBR322LXN(上述实施例6)中xln2启动子和分泌信号正下游的NheI和NotI位点之间，制成pXE2。将pXE2中包含xln2启动子中碱基对-1400至-121的1.3kb HindIII片段用修饰的1.2kb HindIII片段替换，后者含有cbh1启动子中碱基对-1399至-204的片段，但在-1393至-1388有一个新的XbaI位点，该片段是用含有cbh1启动子的质粒pBR322LCS为模板，通过PCR扩增而制备的。由所得质粒pC/XRE2-Xba，分离出包含修饰的cbh1启动子、xln2分泌信号、eg2编码区和cbh2终止子的接近4.9kb的XbaI/NotI片段，并用来取代PCE2中包含cbh1启动子和分泌信号、eg2编码区和cbh2终止子的XbaI/NotI片段，从而制备表达序列盒质粒pC/XRE2。注意到pCE2的cbh1启动子中XbaI位点是位于碱基对-1497至-1492的内源位点。因此，在表达序列盒质粒pC/XRE2中，由于pCE2中天然cbh1启动子的内源XbaI位点与pC/XE2-Xba中修饰的cbh1启动子的构建XbaI位点的融合，丢失了cbh1启动子的碱基对-1496至-1393的片段。为了构建最终的转化载体pC/XRE2-TV(图6b)，由pCE2和pC/XRE2，通过EcoRI消化(该酶在cbh1启动子的5′端和cbh2终止子的3′端酶切)分离出eg2表达序列盒。然后将这些片段插入粗糙链孢霉pyr4筛选序列盒质粒pNCBg1的唯一EcoRI位点。pNCBg1的构建方法是，将取自pFB6的、含有粗糙链孢霉pyr4基因的启动子、编码区和终止子的3.2kb BglII片段插入pUC19多接头的BamHI位点。选择插入的方向，使包含eg2表达序列盒和粗糙链孢霉pyr4筛选序列盒的完整基因重组物通过XbaI消化能够由pUC序列分离出。在转化T.reesei株BTR213之前，用XbaI消化转化载体pC/XRE2-TV，用琼脂糖凝胶电泳分离消化的片段，并纯化含有eg2基因结构的大条带。
表8亲本株和重组木霉属T.reesei株中eg2的拷贝数

实施例25由天然和转化T.reesei株生产葡聚糖内切酶II通过微粒轰击，将基因重组物导入T.reesei株BTR213或其pyr4营养缺陷型(实施例20)，该基因重组物来源于载体pE2-TV和pC/XRE2-TV，并编码与eg2或xln2分泌信号连接并受cbh1启动子调控的葡聚糖内切酶II。用10g/L Solka floc和5g/l葡萄糖作为碳源，按照实施例21的步骤培养天然的BTR213株和所得转化株。测定酶样品的葡聚糖内切酶活性葡聚糖内切酶活性通过测量羧甲基纤维素(CMC)底物释放的还原糖来确定。用50mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.8)将酶样品稀释成若干个浓度，系列稀释样品的体积均为0.5ml。合适的稀释度范围是将样品的估计活性稀释2-20倍。例如，1000U/ml的样品的稀释比为1∶2000～1∶20,000。无论所用的稀释度是多少，每支酶标管中柠檬酸缓冲液样品的体积均为0.5ml。底物是用50mM柠檬酸盐缓冲液(pH4.8)制备的1％CMC溶液。稀释的酶贮存液和底物分别在50℃预热5分钟，然后将0.5ml等份的底物加入到装有酶的各管中。将试管在50℃温育30分钟。加入3ml DNS试剂(1％二硝基水杨酸、1％氢氧化钠、0.2％酚、0.05％偏亚硫酸氢钠的水溶液)，并将试管浸入沸水中10分钟，以终止反应。煮沸结束后，每支管内中加入1ml 40％的酒石酸钾钠水溶液。然后将管子旋转振荡。冷却、并测定由底物释放并与DNS试剂反应的可溶性还原糖量。测定的方法是测量其在550nm的吸光度，并与标准曲线对照，该标准曲线由含有0.18-0.5mg/ml葡萄糖(还原糖)的50mM柠檬酸盐缓冲液(pH4.8)制作。培养物的活性用以下方法进行计算。即，在同样条件下，比较产生0.5mg/ml还原糖所需的培养物滤液ml数与释放0.5mg/ml还原糖所需的已知活性的对照葡聚糖内切酶溶液ml数。
按实施例21所述，收集培养物滤液，并分析其葡聚糖内切酶活性。结果如表9所示。
表9150ml摇瓶培养物中T.reesei株BTR213、201-2A、843-2和845-2的葡聚糖内切酶产量

未转化株每mg蛋白葡的聚糖内切酶活性为9.9IU。含2个拷贝cbh1启动子和eg2分泌信号的转化子210-2A产生2倍以上的葡聚糖内切酶或活性接近22IU/mg，而含有cbh1启动子和xln2分泌信号的转化子843-2和845-2的葡聚糖内切酶活性为29-35IU/mg，这是天然菌株的3.3倍以上，或是含eg2分泌信号的转化子的1.3-1.6倍。
用man1λDASH克隆为模板，用Pwo聚合酶(Boehringer)和引物扩增编码分泌甘露聚糖酶蛋白(碱基对88-1443)的DNA序列。所用的引物设计成可在碱基对88-93引入NheI位点，以及在碱基对1443的终止密码子正下游引入KpnI位点。所得PCR产物以平末端片段的形式插入到pUC118的SmaI位点，以制成质粒pManGNK，对该序列进行测序。用NheI和KpnI消化pManGNK，分离出man1片段，然后将此片段插入已用NheI和KpnI消化过的表达序列盒质粒pBR322LEC中，制成表达序列盒质粒pLECMAN。pBR322LCS含有2.3kb片段的包含启动子和分泌信号的T.reesei cbh1基因(上述实施例5)，由pBR322LCS构建pBR322LEC的方法如下用SphI消化pBR322LCS，使其线性化，并用T4 DNA聚合酶(Gibco/BRL)使其末端成为平末端，然后连接NheI接头；用NheI消化后，用T4 DNA连接酶使该质粒重新环化，从而产生质粒pBR322LCN。用NheI/NotI消化pCB219N-HB(上述实施例22)，分离出含有T.reesei cbh2基因转录终止子，以及终止子的5′和3′端的唯一KpnI和NotI位点的1.9kb NheI/NotI片段，然后将此片段插入pBR322LCN中唯一NheI和NotI位点间，以获得pBR322LEC。为了获得最终的转化载体pCMAN-TV(图7a)，用NotI消化pLECMAN中cbh2终止子3′端的唯一NotI位点，用Klenow补平，然后在碱基对-1392的cbh1启动子唯一XbaI位点消化，以分离出含有在cbh1启动子和分泌信号调控下的man1基因的5.6kb表达序列盒。然后将此片段插入pHPT136(上述实施例5)中hph筛选序列盒的上游，pHPT136的唯一XhoI位点已预先消化过并已用Klenow补齐，随后已将邻近的唯一XbaI位点消化。在转化T.reesei株M2C38之前，先用XbaI和NotI消化pCMAN-TV，用琼脂糖凝胶电泳分离消化片段，然后纯化含有man1基因结构的大条带。
用NheI/NotI消化pBR322LEC(上述实施例27)，分离出包含man1编码区和cbh2转录终止子的3.3kb NheI/NotI片段，然后将此片段插入质粒pBR322SpXN(上述实施例6)中T.reesei xln2启动子和分泌信号序列的下游，产生表达序列盒质粒pXMAN。用Hind III消化pBR322LCS(上述实施例5)，分离出包含T.reesei cbh1启动子的碱基对-1399至-204的1.2kb Hind III片段，用此片段替换pXMAN中包含xln2启动子的碱基对-1400至-121的1.3kb HindIII片段，得到表达序列盒质粒pC/XMAN。为了获得最终的转化载体pXMAN-TV(图7b)和pC/XMAN-TV(图7c)，分别消化pXMAN和pC/XMAN中cbh2终止子3′末端的唯一NotI位点，用Klenow补平，然后在cbh1启动子的碱基对-1392的唯一XbaI位点消化，以分离出含有受xln2启动子和分泌信号或cbh1启动子和xln2分泌信号调控的man1基因的5.6kb表达序列盒。然后将这些片段分别插入pHPT136X(上述实施例6)中hph筛选序列盒的上游，该pHPT 136X的唯一XhoI位点已预先消化过并已用Klenow补平后，随后已将邻近的XbaI位点消化。在转化T.reesei株M2C38之前，用NotI消化转化载体pXMAN-TV和pC/XMAN-TV，使其线性化。
按实施例21所述收集培养物滤液，并按上述方法分析甘露聚糖酶的活性。结果如表10所示。
表10150ml摇瓶培养物中T.reesei株M2C38、5D和82D的甘露聚糖酶产量

未转化株的每mg蛋白甘露聚糖酶活性为3.58IU。含有cbh1启动子和分泌信号的转化子5D产生1.9倍以上甘露聚糖酶或酶活性为6.72IU/mg，而含有cbh1启动子和xln2分泌信号的转化子82D甘露聚糖酶活性为16.22IU/mg，这是天然株的4.5倍以上，或是含cbh1分泌信号的转化子的2.4倍以上。
通过微粒轰击，将载体pXMAX-TV的基因重组物导入T.reesei株M2C38(实施例20)，该基因重组物编码与xln2分泌信号连接并受xln2启动子调控的成熟甘露聚糖酶。以10g/l木聚糖和5g/l葡萄糖为碳源，按实施例21的步骤培养天然株M2C38和由其产生的转化株。
按实施例21所述收集培养物滤液，并按上述方法分析其甘露聚糖酶活性。结果如表11所示。
表11150ml摇瓶培养物中T.reesei株M2C38和17D的甘露聚糖酶产量

以木聚糖为碳源时，未转化株每mg蛋白的甘露聚糖酶活性为0.3IU。含有xln2启动子和分泌信号的转化子17D产生9.4倍以上的甘露聚糖酶，或酶活性为2.81IU/mg。
为了克隆成熟葡聚糖内切酶II基因(cmc3)的编码区，用前面所述的方法(实施例8)，从H.insolens株ATCC 22080生物质中分离出H.insolens的基因组DNA，该生物质是在含24g/l玉米浆、24g/l葡萄糖和0.5g/l CaCO3、pH5.5的培养基中，37℃培养48小时后所得的(如在“清洁剂纤维素酶”中所述，Barbegaard，Jensen and Holm，U.S.Pat.No.4,435,307，1984)。然后用Pwo聚合酶和引物，用此H.insolens基因组DNA作为模板扩增成熟葡聚糖内切酶II的编码区。所用的引物设计成可在H.insolens cmc3序列(Gene Bank登记号X76046)中碱基对64的正上游以及碱基对1182的正下游分别引入唯一的NheI和KpnI位点。扩增的片段用NheI和KpnI消化，并用来替换表达序列盒质粒pCMAN(实施例26)中的man1基因，该质粒pCMAN已预先用NheI和KpnI消化。在所得cmc3表达序列盒质粒pChHE2中，cmc3序列的表达将由cbh1启动子和分泌信号驱动。为了构建cmc3基因与xln2分泌信号连接的表达序列盒pC/XhHE2，用经NheI和KpnI消化的cmc3PCR产物替换表达序列盒质粒pCE2(上述实施例22)中的eg2基因，质粒pCE2预先用NheI和KpnI消化。
为了得到转化载体pChHE2-TV(图8a)和pC/XhHE2-TV(图8b)，通过EcoRI消化pChHE2和pC/XHE2(该酶在cbh1启动子的5′端和cbh2终止子的3′端酶切)，分离出cmc3表达序列盒。然后将这些片段分别插入粗糙链孢霉pyr4筛选序列盒质粒pNCBgl(上述实施例23)中唯一的EcoRI位点。选择插入的方向，使包含cmc3表达序列盒和粗糙链孢霉pyr4筛选序列盒的完整基因重组物通过XbaI的消化从pUC序列中分离出。在转化T.reesei株M2C38之前，用XbaI消化转化载体pChHE2-TV和pC/XhHE2-TV，用琼脂糖凝胶电泳分离消化的片段，并纯化含有cmc3基因结构的大条带。
按实施例21所述收集培养物的滤液，并按上述方法分析高pH葡聚糖内切酶的活性。结果如表12所示。
表1214升发酵物中T.reesei株M2C38、984A和998A的高pH葡聚糖内切酶产量

未转化株每mg蛋白的高pH葡聚糖内切酶活性为0IU。含有cbh1启动子和分泌信号的转化子984A的高pH葡聚糖内切酶活性为0.097IU/mg，而含有cbh1启动子和xln2分泌信号的转化子998A的高pH葡聚糖内切酶活性为0.195IU/mg，该活性为含有cbh1分泌信号的转化子的2倍以上。
T.versicolor漆酶I基因(lcc1)的cDNA克隆由Edgar Ong等人在噬菌粒载体pBK-CMV中获得(“水解木质素的担子菌Trametesversicolor的两种漆酶互补DNA的克隆和序列分析”Ong，Pollock andSmith，Gene 196113-119，1997；以下称为Ong等)。用Pwo聚合酶和引物扩增去除了天然分泌信号的成熟漆酶编码区，该引物设计成可在发表的lcc1序列(Ong等)的碱基对250的正上游和碱基对1750的终止密码子正下游分别引入唯一XbaI位点和唯一XhoI位点。该扩增序列以平端片段的形式插入pBR322的唯一EcoRI位点，制成质粒pBRLcc1，并对该lcc1片段的序列进行测定。为了获得lcc1表达序列盒质粒pCL1和pC/XL1，用KpnI消化cmc3表达序列盒质粒pChHE2和pC/XhHE2，并用T4 DNA聚合酶使其切口变成平末端，随后连接XhoI接头(Cat.No.1073，New England Biolabs)，即可在两个质粒的cbh2转录终止子的5′端插入唯一的XhoI位点，从而制成修饰的cmc3表达序列盒质粒pChHE2-Xho和pC/XhHE2-Xho。用XbaI/XhoI消化pBRLcc1，即可分离出1.5kb片段的lcc1基因，该片段用来替换表达序列盒质粒pChHE2-Xho和pC/XhHE2-Xho中的cmc3基因，pChHE2-Xho质粒和pC/XhHE2-Xho质粒已预先用NheI/XhoI消化(NheI和XbaI有相匹配的凸出末端)。所得lcc1表达序列盒质粒含有与cbh1(在pCL1中)或xln2(pC/XL1)分泌信号连接并受cbh1启动子调控的lcc1基因。为了获得最终的转化载体pCL1-TV(图9a)和pC/XL1-TV(图9b)，用EcoRI消化pCL1和pC/XL1，分离出lcc1表达序列盒，并将其插入pyr4筛选序列盒质粒pNCBg1(上述实施例23)的唯一EcoRI位点。选择插入的方向，使包含lcc1表达序列盒和粗糙链孢霉pyr4筛选序列盒的完整基因重组物在用XbaI消化时能从pVC序列分离。在转化T.reesei株BTR213aux28之前，用XbaI消化转化载体pCL1-TV和pC/XL1-TV，用琼脂糖凝胶电泳分离消化的片段，并纯化包含lcc1基因结构的大条带。
以10g/l Solka floc和5g/l葡萄糖为碳源，按实施例21的步骤培养天然株BTR213及由其产生的转化株。酶样品的漆酶活性测定通过ABTS在30℃的氧化来测定漆酶的活性。试验混合物中含有0.5mM ABTS、0.1M醋酸钠(pH5.0)以及适量的酶。通过测定其在420nm(ε420＝3.6×104M-1Cm-1)吸光度的增加来检测ABTS的氧化。1单位的漆酶活性定义为每分钟氧化1微摩尔ABTS所需的酶量。
按实施例21所述收集培养物滤液，并按上述方法分析漆酶的活性。结果表明，与未转化的宿主(BTR213)相比或与用包含cbh1调控区和分泌信号的载体转化的T.reesei相比，含有木聚糖酶分泌信号(pC/XL1-TV)的转化子，其漆酶的产量有提高。实施例34-38描述了修饰的嗜热木霉木聚糖酶用T.reesei cbh1启动子和xln2分泌信号在Humicola insolens中的表达。
组分 g/L(NH4)2SO46.35KH2PO44.00MgSO4·7H2O 2.02CaCl2·2H2O 0.53CSL6.25CaCO310.00碳源**5-200微量元素*1ml/L*微量元素溶液中含有5g/l FeSO4·7H2O；1.6g/l MnSO4·H2O；1.4g/l ZnSO4·7H2O。**葡萄糖、Solka floc碳源可配制成pH2-7的水溶液，分装后灭菌，然后在培养开始前加入到主培养基中，或在发酵过程中加入。
每个1升摇瓶中加入的液体体积为150ml，起始pH为5.5，每个摇瓶在接种前在121℃高压灭菌30分钟。
按前面所述(实施例9)，从YPSS琼脂平板分别分离出天然的和转化的细胞的孢子，每个摇瓶接种1-2×106个孢子。然后将摇瓶置于37℃，以200rpm的转速振荡培养3天。通过GF/A玻璃微纤维过滤器(Whatman)过滤，收集含分泌蛋白的滤液。用Bio-Rad protein Assay(Cat.No.500-0001)测定蛋白的浓度。
表14150ml摇瓶培养物中H.insolens 22082和22082-5A株的修饰嗜热T.reesei木聚糖酶产量

未转化株每mg蛋白在50℃时的木聚糖酶活性为15.9IU，以及每mg蛋白在65℃时的木聚糖酶活性为10.55IU。转化子22082-5A在50℃时的木聚糖酶活性为29.8IU/mg，以及在65℃时的木聚糖酶活性为24.99IU/mg。由此结果可以看出，65℃时转化株的木聚糖酶活性为未转化株的2.4倍。
这些结果表明T.reesei cbh1启动子和xln2分泌信号对目的基因在外源宿主中的表达，以及目的蛋白在外源宿主中的分泌是有效的。
所有引用的文献都在此作为参考引入。
尽管本发明描述了有关目前认为是优选的实施方案，但本发明不受限于所公开的实施方案。相反，本发明力求覆盖包括在附属的权利要求的精神和范围之内的各种修改和等同的方案。以下的权利要求的范围给出了最宽范围的说明，以致于可包含所有此类的修改和等同的配方以及用途。
权利要求
1.一种核苷酸序列，它包括调控区、与调控区相连并受调控区调控的木聚糖酶分泌序列和目的基因，其中，该调控区或目的基因中至少有一方与木聚糖酶蛋白的生产是非正常关联。
2.权利要求1所述的核苷酸序列，其中，调控区选自cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、xln1以及xln2。
3.权利要求1所述的核苷酸序列，其中，目的基因编码的蛋白可用于医药、营养品、工业品、动物饲料、食品添加剂以及酶。
4.权利要求1所述的核苷酸序列，它进一步包含终止子序列。
5.权利要求1所述的核苷酸序列，它进一步包含标记基因。
6.权利要求1所述的核苷酸序列，它进一步包含间插序列。
7.一种载体，它包含权利要求1所述的分离核苷酸序列。
8.一种转化丝状真菌，它包含权利要求7所述的载体。
9.一种转化丝状真菌，它包含权利要求1所述的核苷酸序列。
10.权利要求9所述的转化丝状真菌，其中，丝状真菌选自木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、镰刀霉属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、疣孢霉属(Mycogone)、轮枝孢属(Verticillium)、链霉属(Streptomyces)、毛盘孢属(Colletotrichum)、链孢霉属(Neurospora)、葡萄孢属(Botrytis)、灰侧耳菌属(Pleurotus)、青霉属(Penicillum)、头孢属(Cephalosporium)、漆斑菌属(Myrothecium)、丝葚霉属(Papulospora)、绵霉属(Achlya)、柄孢壳属(Podospora)、内座壳属(Endothia)、毛霉属(Mucor)、旋孢腔菌属(Cochilobbolus)、Tolypocladium、梨孢霉属(Pyricularia)、青霉属(Penicillum)、毁丝霉属(Myceliophthora)、耙菌属(Irpex)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、帚霉属(Scorpulariopsis)、毛壳霉属(Chaetomium)、粘帚霉属(Gilocladium)、头孢霉属(Cephalosporin)、支顶孢属(Acremonium)。
11.权利要求10所述的转化丝状真菌，其中，丝状真菌为木霉。
12.权利要求10所述的转化的丝状真菌，其中，丝状真菌是腐质霉。
13.一种在丝状真菌中生产目的蛋白的方法，该方法包括以下步骤(i)用核酸序列转化丝状真菌，该核酸序列包括调控区、与调控区相连并受调控区调控的木聚糖酶分泌序列和目的基因，其中，该调控区或目的基因中至少有一方与木聚糖酶蛋白的生产是非正常关联；(ii)培养该丝状真菌；以及(iii)促使该真菌生产目的蛋白。
14.一种在丝状真菌中生产目的蛋白的方法，该方法包括以下步骤(i)用权利要求6所述的核酸序列转化丝状真菌；(ii)培养该丝状真菌；以及(iii)促使该真菌生产目的蛋白。
15.权利要求13所述的方法，其中，转化步骤中的木聚糖酶分泌序列相对于该丝状真菌而言是异源的。
16.权利要求13所述的方法，其中，转化步骤中的木聚糖酶分泌序列相对于该丝状真菌而言是同源的。
17.权利要求14所述的方法，其中，转化步骤中的木聚糖酶分泌序列相对于该丝状真菌而言是异源的。
18.权利要求14所述的方法，其中，转化步骤中的木聚糖酶分泌序列相对于该丝状真菌而言是同源的。
19.权利要求13所述的方法，其中，促使该真菌生产的步骤进一步包括目的蛋白的纯化过程。
20.权利要求14所述的方法，其中，促使该真菌生产的步骤进一步包括目的蛋白的纯化过程。
21.权利要求14所述的方法，其中，促使该真菌生产目的蛋白的步骤进一步包括由目的蛋白中除去间插序列编码的氨基酸序列的过程。
22.一种蛋白，它由权利要求14所述的方法生产。
23.一种蛋白，它由权利要求20所述的方法生产。
24.权利要求3所述的核苷酸序列，其中，蛋白选自β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解酶、果胶酶、蛋白酶以及过氧化物酶。
25.一种载体，它包含权利要求24所述的分离核苷酸序列。
26.一种转化丝状真菌，它包含权利要求25所述的载体。
27.一种转化丝状真菌，它包含权利要求24所述的核苷酸序列。
28.一种在丝状真菌中生产目的蛋白的方法，其中，目的蛋白选自β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解酶、果胶酶、蛋白酶和过氧化物酶，目的蛋白的生产方法则包括以下步骤(i)用权利要求25所述的载体转化丝状真菌；(ii)培养该丝状真菌；以及(iii)促使该真菌生产目的蛋白。
29.一种在丝状真菌中生产目的蛋白的方法，其中，目的蛋白选自β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解酶、果胶酶、蛋白酶和过氧化物酶，目的蛋白的生产方法则包括以下步骤(i)用权利要求24所述的核酸序列转化丝状真菌；(ii)培养该丝状真菌；以及(iii)促使该真菌生产目的蛋白。
30.一种生产目的蛋白的表达体系，该体系包括含有某种核苷酸序列的丝状真菌，该核酸序列包含调控区、与调控区相连并受调控区调控的木聚糖酶分泌序列和编码目的蛋白的目的基因，其中，该调控区或目的基因中至少有一方与木聚糖酶蛋白的生产是非正常关联。
全文摘要
本发明涉及提高真菌宿主的目的蛋白的产量。本发明公开了包含调控区、与调控区相连并受调控区调控的木聚糖酶分泌序列和目的基因的核苷酸序列。该目的基因编码的蛋白可用于医药、营养品、工业品、动物饲料、食品添加剂以及酶。优选该目的基因编码纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解酶、果胶酶、蛋白酶或过氧化物酶。本发明还涉及含有这些核酸序列的载体和宿主,也涉及生产目的蛋白的方法。
文档编号C12N15/80GK1390260SQ00815509
公开日2003年1月8日 申请日期2000年9月1日 优先权日1999年9月9日
发明者T·C·怀特, S·麦胡格, C·D·辛德勒 申请人:伊奥根生物产品公司