专利名称：Tcf效应元件的制作方法
背景技术：
本发明涉及T细胞因子(TCF)-效应元件，基因和该TCF效应元件或核酸构建体在分析方面的用途，该核酸构建体包含TCF-效应元件和治疗基因。
TCF是高速泳动族(HMG)DNA结合蛋白内的一组转录因子(Love等，Nature，376，791-795，1995)。该家族包括TCF-1，TCF-3和TCF-4，其在van der Wetering等(EMBO J.，10，123-132，1991)，EP-A-0 939 122和Korinek等(Science，275，1784-1787，1997)中有所描述。表明TCF-4参与和Wnt/Wing1ess信号有关的肿瘤发生。认为TCF和LEF-1(淋巴样增强因子-1)通过与β-连环蛋白相互作用介导对Wnt信号的核应答。认为Wnt信号和其他增加β-连环蛋白稳定性的细胞事件可通过LEF-1和TCF蛋白与β-连环蛋白相连而导致基因的转录活化。当不存在Wnt信号时，LEF-1/TCF蛋白与Groucho和CBP(CREB结合蛋白)相连从而阻遏转录。
当不存在Wnt信号时，发现β-连环蛋白有两种不同的多蛋白复合体。定位于质膜的一种复合体和肌动蛋白细胞骨架与钙粘着蛋白(钙依赖性粘连分子)偶联，而另一种复合体(包含腺瘤样肠息肉病蛋白(APC)，轴蛋白(axin)和糖原合成酶激酶3β(GSK3β))靶向β-连环蛋白用于降解。Wnt信号拮抗APC-axin-GSK3β复合体，导致游离胞质β-连环蛋白库增加。这种游离胞质β-连环蛋白可转移到细胞核中，在其中该蛋白结合LEF-1/TCF因子并激活Wnt靶基因。Eastman等人讨论了LEF-1/TCF转录因子通过Wnt和其他信号的调节(Current Opin.Cell Biology，11，233-240，1999)。
APC基因是一种肿瘤抑制基因，其在多数结肠癌中是不具有活性的。APC的突变被认为是引起游离β-连环蛋白累积的原因，其接着结合TCF，引发基因的转录活化增加，所述基因包括对于细胞增殖重要的基因(如细胞周期蛋白D1(Tetsu等，Nature 398，422-426，1999和Shtutman等，PNAS USA，96，5522-5527，1999)及c-myc基因(He等，Science，281，1509-1512，1998))。He等(同上)说明了APC参与肿瘤发展。
已知TCF识别并结合具有核苷酸序列CTTTGNN的TCF结合元件，其中N表示A或T(van der Wetering等，同上)。
Korinek等(Science，275，1784-1787，1997)，Morin等(Science，275，1787-1790，1997)，EP-A-0939122和WO98/41631构建了TCF报道基因并作了说明。据说该TCF报道基因包含三个TCF结合元件，其上游或者是一个驱动荧光素酶基因表达的最小的c-Fos启动子，或者是一个驱动氯霉素乙酰基转移酶表达的最小的疱疹病毒胸苷激酶启动子。He等(同上)公开了包含四个插入pBV-Luc中的TCF结合元件的TCF报道基因构建体。
对于和Wnt信号途径的去调节相关的癌症需要有效的治疗。这些癌症包括多数结肠癌，约30％的黑素瘤和一些乳腺癌，前列腺癌和肝细胞癌。
也需要这样一种TCF效应元件，当其与可表达基因相连时，可导致表达水平和特异性的增加。
发明概述一种核酸构建体，其包括含有至少一个TCF结合元件的TCF效应元件，所述TCF结合元件具有序列CTTTGNN，其中N是A或T；启动子；和与所述TCF效应元件可操作连接的可表达治疗性基因，其中所述TCF效应元件使可操作连接的治疗性基因能够诱导性表达。
本文所用术语“诱导表达”是指利用TCF效应元件所获得的表达水平当一个或多个TCF/β连环蛋白异二聚体与一个或多个TCF结合元件相结合时被诱导(即增加)。优选表达水平至少增加了15倍，更优选至少25倍，而最优选至少30倍。
本文所用术语“可操作连接”是指一种顺式连接，其中基因表达受到TCF效应元件的控制。
可表达基因当与TCF效应元件可操作连接时，包含基因表达所必须的元件，如剪切接受序列，内部核糖体进入部位序列(IRES)和转录终止位点。这些元件是本领域公知的。
通过使用本发明核酸构建体发现，可操作连接的治疗性基因只有在TCF/β连环蛋白异二聚体存在并且可激活转录时其表达才能被诱导。由于因Wnt信号途径的去调节而导致癌变的细胞含有能激活转录的TCF/β连环蛋白异二聚体，因此该治疗性基因的表达可被诱导。相应的，本发明的核酸构建体作为肿瘤选择性启动子。
本发明的核酸构建体表现出高度选择性的表达，当不存在TCF/β连环蛋白异二聚体，或者不存在功能上等价的转录活化因子时，其不诱导可操作连接的基因比背景水平更高的表达。
治疗性基因可以是任何在表达时产生治疗效果的基因。优选的治疗性基因包括编码毒素蛋白的基因，如植物蓖麻毒素蛋白和白喉毒素蛋白，以及激活酶的前体药物，如激活CB1954的硝基还原酶、激活5-氟胞嘧啶的胞嘧啶脱氨酶、激活环磷酰胺和对乙酰氨基酚的细胞色素P-450以及激活更昔洛韦(ganciclovir)的胸苷激酶。优选治疗性基因编码硝基还原酶。在EP-A-0638123和Watanabe等(NAR，18，1059，1990)中描述了合适的硝基还原酶。其他优选的治疗性基因包括编码免疫调节剂的基因，如IL-2、IL-12、GMCSF、B7-1和B7-2共同刺激分子；编码肿瘤抑制因子的基因，如RB、p53、和p16；编码编程性细胞死亡基因的基因，如Bax、FasL和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶)。
启动子可以是任何使可操作连接的基因的表达达到期望水平的启动子。合适的启动子包括SV40启动子、EIB启动子和c-Fos启动子。优选启动子是E1B启动子的基本TATA框。
优选TCF效应元件包含至少三个或更优选至少五个TCF结合元件。发现通过使用至少三个更优选至少五个TCF结合元件，与包含更少结合元件的TCF效应元件相比，基因表达水平有意想不到地增加。表达水平增加对于制备有效治疗量的编码产物是有益的。
优选TCF效应元件包含5到15个TCF结合元件，更优选包含5到10个TCF结合元件，最优选包含5个TCF结合元件。
所述TCF结合元件优选由3到20个核苷酸彼此相互隔开，更优选由3到14个，最优选由10到12个核苷酸彼此相互隔开。
进一步优选TCF结合元件之间彼此隔开，使其以DNA双螺旋为中心呈辐射状相等分布，特别当该启动子是EIB启动子时。
优选与启动子最近的TCF结合元件和该启动子的TATA框的距离在140到10个核苷酸之间。进一步优选与启动子最近的TCF结合元件和该启动子的TATA框的距离在100到10个核苷酸之间，更优选50到10个核苷酸之间，最优选在30到15个核苷酸之间。
一个优选实施方案中，TCF结合元件之间彼此间隔3或4个核苷酸，并且与启动子最近的TCF结合元件和该启动子的TATA框的距离为25个核苷酸。
TCF结合元件优选具有核苷酸序列CTTTGAT。
TCF结合元件可处于启动子的任一方向，即5’到3’或3’到5’。
本发明还提供一种在此定名为5merTCF-E1BTATA的核酸构建体，示于图6中并且在以下的材料与方法章节中说明。
本发明还提供了TCF效应元件，其包含至少五个TCF结合元件和启动子序列，其中该TCF效应元件当与可表达基因可操作相连时，能诱导该可操作连接的基因的表达。
包含至少五个TCF-结合元件的TCF效应元件可用于使任何可操作连接的基因诱导性表达，如报道基因或治疗性基因。合适的报道基因包括荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶和氯霉素乙酰基转移酶。
发现包含至少五个TCF-结合元件的TCF效应元件与包含少于5个TCF结合元件的TCF效应元件相比，其导致可操作连接的基因表达水平提高(即增加)。
TCF结合元件和包含至少5个TCF结合元件的TCF效应元件的启动子定义如上。
本发明还提供了TCF报道基因构建体，其包含具有至少5个与报道基因可操作相连的TCF结合元件的TCF效应元件。
本发明还提供了本发明TCF报道基因构建体在鉴定治疗癌症的候选药物的方法中的用途，所述癌症与Wnt信号途径的去调节相关，该方法包含以下步骤将该TCF报道基因构建体与待测化合物在该报道基因转录的条件下接触；和检测该报道基因的转录；其中抑制该报道基因转录的待测化合物就是治疗癌症的侯选药物。
优选将TCF报道基因构建体接触的步骤是在具有Wnt信号途径去调节的细胞裂解液存在下进行的。
本发明还提供了包含本发明核酸构建体的载体，或包含具有至少5个与可表达基因可操作连接的本发明TCF结合元件的TCF效应元件的载体。
载体可以是任何可将DNA转移入细胞的载体。优选载体是整合型载体或附加型载体。
优选的整合载体包括重组反转录病毒载体。重组反转录病毒载体将包括至少一部分能感染靶细胞的反转录病毒基因组的DNA。术语“感染”用来指病毒将遗传物质转移到宿主或靶细胞的这一过程。优选地，本发明的载体构建中所用的反转录病毒也是复制缺陷型的，导致病毒在靶细胞中的复制作用丧失。在这些情况下，复制缺陷型病毒可通过传统技术利用辅助病毒进行包装。通常，任何满足上述感染性和功能基因可转移性标准的反转录病毒都可用于实施本发明。
合适的反转录病毒载体包括但不限于pLJ、pZip、pWe和pEM，是本领域技术人员所熟知的。用于复制缺陷型反转录病毒合适的包装病毒系包括，如ΨCrip，ΨCre，Ψ2和ΨAm。
其他用于本发明的载体包括腺病毒、腺伴随病毒、SV40病毒、痘苗病毒、HSV和痘病毒载体。优选载体是腺病毒。腺病毒载体是为本领域技术人员所熟知的，并被用于向多种细胞类型传递基因，包括呼吸道上皮细胞、骨骼肌、肝、脑和皮肤(Hitt，MM，Addison CL和Graham，FL(1997)Human adenovirus vectors for gene transfer intomammalian cells.Advances in Pharmacology，40137-206；和AndersonWF(1998)Human gene therapy.Nature，392(6679 Suppl)25-30)。
进一步优选的载体是腺伴随病毒(AAV)载体。AAV载体是本领域技术人员所熟知的，并且被用于稳定地转导人T-淋巴细胞、成纤维细胞、鼻息肉、骨骼肌、脑、类红细胞和造血干细胞以进行基因治疗(Philip等，1994，Mol.Cell.Biol.，14，2411-2418；Russell等，1994，PNAS USA，91，8915-8919；Flotte等，1993，PNAS USA，90，10613-10617；Walsh等，1994，PNAS USA，89，7257-726l；Miller等，1994，PNAS USA，91，10183-10187；Emerson，1996，Blood，87，3082-3088)。国际专利申请WO 91/18088描述特异的基于AAV的载体。
优选的附加型载体包括瞬时非复制性附加型载体和具有衍生自病毒如EBV、人乳空病毒(BK)和BPV-1复制起点功能的自我复制的附加型载体。这些整合型和附加型载体是本领域技术人员所熟知的，并且在本领域技术人员熟知的文献中均有详尽的描述。合适附加型载体尤其见于WO 98/07876。
哺乳动物人工染色体也可用做本发明的载体。哺乳动物人工染色体的使用详见Calos(1996，TIG，12，463-466)。
一个优选实施方案中，本发明的载体是质粒。该质粒可以是非复制、非整合质粒。
本文所用术语“质粒”是指编码可表达基因的任何核酸，并且包括线性或环状核酸，和双链或单链核酸。核酸可以是DNA或RNA，并可能包含经修饰的核苷酸或核糖核苷酸，也可能通过如甲基化或引入保护基因或帽结构或尾结构而被化学修饰。
非复制、非整合质粒是核酸，当其转染入宿主细胞后不复制并且不特异性地整合于宿主细胞基因组中(即不以高频整合并且不在特异性位点整合)。
复制质粒可通过标准分析方法加以鉴定，包括Ustav等(EMBOJ.，10，449-457，1991)的标准复制分析。
本发明也提供了经本发明载体转染的宿主细胞。该宿主细胞可以是任何哺乳动物细胞。优选的宿主细胞是啮齿动物或哺乳动物细胞。
已知许多技术可用于本发明中，将本文所述载体传递到细胞中，包括使用核酸缩合剂、电穿孔、与石棉复合、聚凝胺(polybrene)、纤维素、葡聚糖、脂质体、阳离子脂质体、脂多胺类、聚鸟氨酸、颗粒轰击和直接显微注射(由Kucheriapati和Skoultchi综述，Crit.Rev.Biochem.16349-379(1984)；Keown等，Methods Enzymol.185527(1990))。
本发明的载体可通过病毒或非病毒的传递方式非特异或特异地传递到宿主细胞内(即到宿主细胞中指定的亚组)。优选的病毒起源的传递方式包括将产生病毒颗粒的包装细胞系作为本发明载体的转染受体，其中病毒包装信号是经工程改造的，如腺病毒、疱疹病毒和乳空病毒的包装信号。优选的基于非病毒的基因传递方式和方法也可用于本发明，包括直接注射裸露的核酸，核酸缩合肽和非肽类阳离子脂质体以及囊化在脂质体中。
已有将载体直接传递到组织的描述，并获得了短期的基因表达。现有技术清楚地说明了将载体直接传递于肌肉(Wolff等，Science，247，1465-1468，1990)、甲状腺(Sykes等，Human Gene Ther.，5，837-844，1994)、黑素瘤(Vile等，Cancer Res.，53，962-967，1993)、皮肤(Hengge等，Nature Genet，10，161-166，1995)、肝(Hickman，Human Gene Therapy，5，1477-1483，1994)、以及在暴露于呼吸道上皮后(Meyer等，GeneTherapy，2，450-460.，1995)的情况。
来源于病毒包膜蛋白氨基酸序列的各种肽与聚赖氨酸DNA复合体共同施用时，可用于基因转移(Plank等，J.Biol.，Chem.，26912918-12924(1994))；Trubetskoy等，Bioconjugate Chem.，3323-327(1992)；WO 91/17773；WO 92/19287和Mack等，Am.J.Med.Sci.307138-143(1994)，这暗示聚赖氨酸偶联物与阳离子脂共缩合能导致基因转移的效率增加。国际专利申请WO 95/02698公开了使用病毒组分来增加阳离子脂基因转移的效率。
可用于本发明的核酸缩合剂包括精胺、精胺衍生物、组蛋白、阳离子肽、阳离子非肽如聚乙烯亚胺(PEI)和聚赖氨酸。“精胺衍生物”是指精胺的类似物和衍生物，包括如国际专利申请WO 93/18759(1993年9月30日公布)中所公开的化合物。
二硫键被用来连接传递载体的肽组分(Cotten等，Meth.Enzymol.217618-644(1992)；也参见Trubetskoy等(同上))。
DNA构建体传递到细胞所使用的传递载体是本领域所公知的，包括特异于细胞表面受体的DNA/聚阳离子复合体，如在Wu和Wu，J.Biol.Chem.26314621(1988)；Wilson等，J.Biol.Chem.267963-967(1992)以及美国专利5166320中所述。
本发明载体的传递考虑采用核酸缩合肽。核酸缩合肽对于缩合载体并将该载体传递到细胞中是特别有用的，在国际专利申请WO96/41606中有所说明。可在用于传递本发明载体的肽上连接功能基团，如WO 96/41606所述。这些功能基团可包括靶向特定细胞类型的配体，如单克隆抗体、胰岛素、运铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白或糖。因此该配体可能以非特异性方式靶向细胞，或者以限定于细胞类型的特异性方式靶向细胞。
功能基团也可包含脂如棕榈酰、油酰或硬脂酰；中性疏水聚合物如聚乙二醇(PEG)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；基因融合肽如流感病毒的HA肽；重组酶或整合酶。功能基团也可包含胞内运输蛋白如核定位序列(NLS)、内体逃逸信号如膜破坏性肽，或将蛋白直接定向细胞质的信号。
本发明也提供了治疗用途的本发明核酸构建体、载体或宿主细胞。
优选地，核酸构建体、载体或宿主细胞用于治疗癌症。
本发明还提供了本发明核酸构建体、载体或宿主细胞在制备治疗癌症的组合物中的用途。
本发明还提供了治疗方法，其包含给需要这种治疗的患者施用有效量的本发明核酸构建体、载体或宿主细胞。优选患者患有癌症。
优选地，所述癌症是任何与Wnt信号途径的负调节相关的癌症，如结肠癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌和肝细胞癌。
本发明还提供了药物组合物，其包含与可药用受体相组合的本发明核酸构建体、载体或宿主细胞。
本发明的药物组合物可包含本发明核酸构建体、载体或宿主细胞，如需要，与可药用载体或稀释剂混合，用于治疗疾病。
本发明的核酸构建体、载体或宿主细胞或者药物组合物的施用途径包括全身、肌内、皮下、皮内、静脉内、喷雾、口服(固态或液态形式)、局部、眼内、作为栓剂，腹膜内和/或鞘内和局部直接注射。
当然，确切剂量需要临床医师根据不同患者来测定，反过来，剂量又根据由治疗性基因所表达蛋白的确切性质以及治疗所靶向的组织类型来控制。
剂量还应基于疾病指征和给药途径来测定。
根据本发明被传递用于有效治疗的核酸构建体或载体的量优选在50ng到1000μg载体DNA/千克体重范围之间；更优选在约1-1001μg载体DNA/千克体重范围内。
根据本发明，尽管优选将核酸构建体、载体或宿主细胞以体内细胞摄入的方式给哺乳动物施用，但也可利用体外方法，其中细胞从动物体取出，用核酸构建体或载体转导，然后重新植入该动物体。例如，肝脏可通过体外方法进行评估，即从动物体取出肝细胞，体外转导所述肝细胞，再将经转导的肝细胞植入动物体(如，由Chowdhury等，Science 2541802-1805，1991所述的兔和由Wilson，Hum Gene Ther.3179-222，1992中所述的人)。这些方法也可用于向循环或淋巴系统中各种细胞群如红细胞、T细胞、B细胞和造血干细胞进行有效传递。
本发明还提供了给细胞传递本发明的核酸构建体的组合物，或给细胞传递与可表达基因可操作连接的包含至少五个本发明TCF结合元件的TCF效应元件的组合物。
附图简述
图1表示Tcf应答荧光素酶报道基因构建体“5merTCF-SV40-Luc”(CTL501)对HeLa、HepG2和SW480细胞瞬时转染的结果(图la)。数字表示Tcf位点之间碱基对的数目。5merTCF-SV40反义链核苷酸序列示于图1c。下划线和斜体的序列是活性Tcf位点。只有下划线的序列是突变的Tcf位点。黑体的序列是BglII、NheI和KpnI的识别位点。细胞用等摩尔量(各约1μg)的Tcf-应答和对照荧光素酶报道基因构建体转染，如图1b所示。“SV40P”只包含SV40启动子；“SV40e/p”包含SV40启动子和增强子；“CMV”包含巨细胞病毒启动子/增强子。数据以倍数活性表示，以SV40启动子的活性设定为1。显示了两次单独转染的平均值和标准差(SD)。结果代表了三次独立的实验。
图2表示CTL102或CTL501感染的HeLa、HepG2和SW480细胞所表达的硝基还原酶(NTR)的量。细胞以显示的感染复数(moi，pfu/细胞)感染了CT1102，其以CMV启动子/增强子表达NTR，或感染了c1(CTL501)，其包含从左到右方向的5merTCF-SV40-NTR盒，或感染了c13，其包含相同的表达盒，但方向从右向左。两天后制备细胞质提取物，通过ELISA(参见材料和方法一节)分析NTR的表达。感染重复两次。显示了代表性实验的平均NTR表达水平。
图3显示了裸鼠中CTL501/CB1954抗HepG2异体移植肿瘤的抗肿瘤功效。用约1010病毒颗粒一次性注射截面积大小范围为20-80mm2的六个肿瘤组。在材料和方法章节中说明了前体药物施用和肿瘤检测。
图4总结了单次注射CTL501或CTL102(在20μl 5％蔗糖、25mMTris-HCl，pH7.4中含有1.5x1010颗粒)后，对裸鼠皮下SW480异体移植物的NTR免疫染色的结果。在48小时后切除肿瘤，如材料和方法章节所述监控NTR的表达。显示了各分裂肿瘤来自3个连续切片的NTR阳性细胞的平均百分比。
图5显示在全身施用和前体药物处理后，CTL501和CTL102的体内毒性比较。裸鼠用指定数量的病毒颗粒静脉(尾部静脉)注射。48小时后，将CB1954以20mg/kg体重的剂量连续5天以腹膜内给药。附图表示在监控期(第1-15天)内各动物组(各组4只动物)的最大平均体重下降(％)以及在15天后各测试组中存活动物的百分比。
图6显示HeLa和SW480细胞用Tcf应答荧光素酶报道基因构建体5merTCF-E1BTATA-Luc(CTL502)瞬时转染的结果(图6a)。E1BTATA反义链的核苷酸序列显示于图6c。下划线和斜体的序列是E1B TATA框。黑体的序列是HindIII、BglII、NheI和KpnI的识别位点。细胞用等摩尔量(各约1μg)的几种荧光素酶报道基因构建体转染，如图6b所示。pGL3basic包含无启动子的luc cDNA；“E1B”包含在luc cDNA上游的Ad5 E1BTATA框，图1a显示了5merTcf-SV40(CTL501)。数据以倍数活性表示，以pGL3basic的活性设定为1。显示了两次重复转染的平均值和标准差(SD)。结果代表了三次独立的实验。
图7以示意形式显示了本文中所述的在实验中评价的5个Tcf结合元件的四种不同排列方式。显示了各构建体在结合位点之间的碱基对的数目，以及基于这种假设，即10.4bp相应于双螺旋结构的完整一圈，显示了这些位点沿DNA双螺旋的二维排列。
图8显示了用指定的Tcf应答荧光素酶报道基因构建体对SW480细胞的瞬时转染结果。TcfA、TcfB和TcfC或者与最小的腺病毒E1BTATA框组合或者与SV40基本启动子组合(参见图7关于TcfA，TcfB和TcfC的说明)。图6以比例显示了E1B、5merTcf-SV40(CTL501)、5merTcf-E1BTATA(CTL502)和CMV报道基因质粒。用等摩尔量(各约0.5μg)的各种荧光素酶报道基因构建体转染细胞。数据分别以5merTcf-E1BTATA(CTL502)(a)或5merTcf-SV40(CTL501)(b)的活性百分比表示。显示了三次重复转染的平均值和标准差(SD)。结果代表了三次独立的实验。
图9显示了利用Tcf-E1BTATA荧光素酶报道基因构建体与不同数量和不同排列的Tcf结合位点对SW480细胞瞬时转染的结果。图9a显示了Tcf位点的数量和其之间的间隔。图9c显示了Tcf-E1BTATA构建体反义链的核苷酸序列。下划线和斜体的序列是活性Tcf位点。黑体的序列是BglII、NheI和KpnI的识别位点。4merTcf-E1BTATA构建体中BglII的位点是缺陷的。细胞用0.5μg的各荧光素酶报道基因构建体转染。数据以5merTcf-E1BTATA(CTL502)活性的百分比表示(图9b)。显示了三次重复转染的平均值和标准差(SD)。结果代表了三次独立的实验。
图10表示用Tcf-E1BTATA-luc构建体对SW480细胞的瞬时转染结果，所述Tcf-E1BTATA-luc构建体在近端Tcf位点和TATA框之间的间隔各有不同(25-499bp)。在图7中有关于TcfC元件结构的说明。图10a显示用于本分析的TcfC-E1BTATA报道基因构建体的结构。“d”表示从近端Tcf结合位点的最后一个核苷酸到TATA序列第一个T之间的碱基对。88bp和447bp间隔片段是从人β-珠蛋白内含子II中经PCR获得。细胞用0.5μg的各荧光素酶报道基因构建体转染。数据以TcfC-E1BTATA d＝25构建体(b)活性的百分比表示。显示了三次重复转染的平均值和标准差(SD)。结果代表了三次独立的实验。图10c中显示了当d＝25时，TcfC-E1BTATA反义链的核苷酸序列。下划线和斜体的序列是活性Tcf位点。黑体序列是E1B TATA框，以及SmaI和KpnI的识别位点。
图11显示了通过ELISA检测CTL102、CTL501和CTL502感染的HeLa细胞和SW480细胞中表达的NTR的量。细胞以各种感染复数(moi)(1、5、20、100、500和1500pfu/细胞)感染。两天后制备细胞质提取物，并通过ELISA(材料和方法章节)分析NTR。显示了重复两次的感染的平均值。
图12显示了在用CTL102和CTL501静脉注射(i.v.)后，针对重组腺病毒的NTR在正常小鼠肝中表达水平的比较。小鼠用指定量的CTL102或CTL501进行尾部静脉注射，48小时后处死小鼠，如材料和方法章节中肿瘤切片所述对NTR进行肝的染色。
图13显示了CTL501/CB1954和CTL102/CB1954在结肠癌异体移植模型中抗肿瘤功效水平的比较。截面积在20-80mm2的SW480肿瘤组(n＝5)用单剂量(109或1010颗粒)的CTL102或CTL501注射。如材料和方法章节所述进行前体药物处理和肿瘤检测。
图14显示了CTL503/CB1954和CTL102/CB1954在结肠癌异体移植模型中抗肿瘤功效水平的比较。截面积在20-80mm2的SW480肿瘤组(n＝5)用单剂量(1010颗粒)的CTL102或CTL503注射。如材料和方法章节所述进行前体药物处理和肿瘤检测。
图15显示CTP1和CTP3在正常人上皮细胞、皮成纤维细胞和肝细胞中的表达水平极低。如材料和方法章节中所述，细胞感染了Ad.CMV-nLacZ、Ad.CTP1-nLacZ和Ad.CTP3-nLacZ，48小时后分析。对于图15a和b中显示的数据，从以指定MOI(pfu/细胞)感染的细胞中制备提取物，用Galacto-Light分析系统进行β-半乳糖苷酶分析，方法如供应商所示。误差棒代表标准差。各情况显示了一个代表性实验。图15c中，细胞以1000pfu/细胞的MOI感染，通过X-Gal染色识别表达β-半乳糖苷酶的细胞。只有感染了Ad.CMV-nLacZ的成纤维细胞才表达可检测的酶。图15d显示所有三种病毒都指导感染的SW480结肠癌细胞表达高水平的β-半乳糖苷酶。
图16显示腺病毒辅助细胞系(PerC6和293)中，在复制条件下，CTP1和CTP3以极低水平表达。用100MOI感染PerC6和293细胞，30小时后收集。然后制备细胞提取物，如材料和方法章节分析β-半乳糖苷酶。误差棒代表标准差。显示代表性实验。图16a为对数标度，图16b为线性标度。
图17显示了CTP1和CTP3在继发性结肠癌组织中高水平表达，但在附着的肝组织中并非如此。将新鲜切离的继发性结肠癌(肝)与附着的肝边缘组织的2-3mm3区段与指定的病毒温育，固定48小时后染色并根据材料和方法中所述检测β-半乳糖苷酶的表达。“T”指肿瘤组织，“L”指附着的肝组织。
图18表示在原发性结肠癌样品中CTP1和CTP3高水平表达，与β-连环蛋白的高水平、非膜化的表达相关联。
用指定的病毒转导2-3mm3区段的新鲜切离的原发性结肠癌，根据材料和方法章节所述染色并检测β-半乳糖苷酶的表达。
发明详述本发明通过使用以下实施例进行详细阐述。这些实施例仅仅是说明而非看作是限制。实施例材料和方法细胞培养从ATCC获得HepG2(人肝癌；突变的β-连环蛋白)、SW480(人结肠癌，突变的APC)和HeLa(人子宫颈癌)细胞系，按照供应商的建议维持这些细胞系。PER.C6(人胚胎成视网膜细胞系)细胞获自IntroGene，(Fallaux等，Human Gene Ther.，91909-1917，1998)并且培养于添加了10％FCS、2mM MgCl2和抗生素(150μg/ml青霉素和250μg/ml链霉素)的DMEM培养基中。
初级人皮成纤维细胞从来自健康志愿者的穿孔活体样品中分离，并按上述方法维持。从Pomocell(Heidelberg，Germany)获得HUVEC细胞，维持于添加了营养混合物的内皮细胞生长培养基(EndothelialGrowth Medium plus Supplement Mix)(Pomocell)。初级肝细胞维持于添加了抗生素、谷氨酰胺、胰岛素和氢化可的松的Williams培养基中。质粒构建为了克隆pGL3pro/5merTcf-SV40(CTL501)，通过将两对部分互补的寡核苷酸1和2，以及3和4退火，产生两个部分双链的片段。
寡核苷酸1PCT AGC AAG CTT ACT AGT CCT TTG ATC AAGAGT CCT ACC TTT GAT CTC TAA ATG CAC CTT TGA TC寡核苷酸2PAC TGA ATT CCT TGA TCA AAG GTG CAT TTAGAG ATC AAA GGT AGG ACT CTT GAT CAA AGG ACT AGT AAGCTT G寡核苷酸3PAA GGA ATT CAG TCC TTT GAT CAA GAG TCCTAC CTT TGA TCT CTA AAT GCA CCT TTG ATC A寡核苷酸4PGA TCT GAT CAA AGG TGC ATT TAG AGA TCAAAG GTA GGA CTC TTG ATC AAA GG(其中P示磷酸修饰)
这些片段各包含三个TCF结合位点(共有序列CCTTTGATC)。将这两个双链片段连接起来，产生包含六个TCF结合位点的片段(约130bp)，通过NheI和BglII位点将其克隆到经NheI/BglII消化过的pGL3启动子质粒(pGL3pro；Promega)，产生pGL3pro/5merTcf-SV40克隆10。但是测序表明，多数3’TCF结合位点都包含一个G核苷酸的缺失，产生一个无活性的位点(CCTTTATC)(参见图1c)。
为了从Clontech质粒pG5CAT中获得84bp的pGL3basic/5merTcf-E1BTATA(CTL502)，利用包含BglII和HindIII的突出端的寡核苷酸进行PCR，对跨越腺病毒E1BTATA框(TATATAAT)上游第21bp和下游55bp的区域进行扩增。然后将包含Ad5 E1B启动子的16bp(GGGTATATAATGCGCC)的片段克隆到经BglII/HindIII消化后的pGL3basic，产生pGL3basic/E1BTATA克隆2(参见图6c)。然后用NheI/BglII消化pGL3basic/5merTcf-SV40(CTL501)克隆10，从中切割出5-mer TCF位点；再将该位点克隆到经NheI/BglII消化过的pGL3basic/E1BTATA克隆2中，产生pGL3basic/5merTcf-E1BTATA克隆1，测序证实其是所需要的构建体。
为了产生pGL3pro/Tcf-SV40克隆4、pGL3pro/TcfB-SV40克隆31、pGL3pro/TcfC-SV40克隆3、pGL3basic/TcfA-E1BTATA克隆28、pGL3basic/TcfB-E1BTATA克隆10和pGL3basic/TcfC-E1BTATA克隆1，将各包含5个活性TCF结合位点(CCTTTGATC)和一个故意突变位点(CCTTTATC，为其一致性)的寡核苷酸5、7和9分别与其各自的反义寡核苷酸6、8和10退火。
寡核苷酸5CTA GCA AGC TTA CTA GTC CTT TGA TCA AGAGTT TCC TAC CTT TGA TCT CTA AAT TGC ACC TTT GAT CAAGGA ATT CAG TCC TTT GAT CAA GAG TAA CCT ACC TTT GATCTC TAA ATG CAC CTT TAT CA
寡核苷酸6GAT CTG ATA AAG GTG CAT TTA GAG ATC AAAGGT AGG TTA CTC TTG ATC AAA GGA CTG AAT TCC TTG ATCAAA GGT GCA ATT TAG AGA TCA AAG GTA GGA AAC TCT TGATCA AAG GAC TAG TAA GCT TG寡核苷酸7CTA GCA AGC TTA CTA GTC CTT TGA TCA AGCTAC CTT TGA TCT CTA GCA CCT TTG ATC AAG AGT CCT TTGATC AAG CCT ACC TTT GAT CTC TAA ATG CAC CTT TAT CA寡核苷酸8GAT CTG ATA AAG GTG CAT TTA GAG ATC AAAGGT AGG CTT GAT CAA AGG ACT CTT GAT CAA AGG TGC TAGAGA TCA AAG GTA GCT TGA TCA AAG GAC TAG TAA GCT TG寡核苷酸9CTA GCA AGC TTA CTA GTC CTT TGA TCA ATACCT TTG ATC TCA CCT TTG ATC AAG TCC TTT GAT CAT ACCTTT GAT CTC TAA ATG CAC CTT TAT CA寡核苷酸10GAT CTG ATA AAG GTG CAT TTA GAG ATC AAAGGT ATG ATC AAA GGA CTT GAT CAA AGG TGA GAT CAA AGGTAT TGA TCA AAG GAC TAG TAA GCT TG以上六个寡核苷酸都经5’磷酸修饰。
将所获得的包含NheI/BglII突出端的片段克隆到经NheI/BglII消化过的pGL3启动子或经NheI/BglII消化过的pGL3basic/E1BTATA克隆2中，以产生上述构建体。通过测序证实该序列为预期序列。
将构建体pGL3basic/2merTcf-E1BTATA克隆9、pGL3basic/3merTcf-E1BTATA克隆2、pGL3basic/3merTcf-E1BTATA克隆13、pGL3basic/4merTcf-E1BTATA克隆15和pGL3basic/4merTcf-E1BTATA克隆34以同样方法克隆，但最可能由于退火中产生了环状结构，并且在转化大肠杆菌后这些环状结构被切除，因此这些构建体有一个或多个Tcf位点缺失。对于TCF位点之间的间隔并证实这些构建体的序列，可参见图9a和c。
pGL3basic/88-E1BTATA克隆8和pGL3basic/TcfC-88-E1BTATA克隆2(至TATA框的距离d＝140)的构建是用BglII突出端将从人β-珠蛋白基因内含子II中经PCR扩增的88bp片段(5’寡聚引物GAAGATCTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAG，3’寡聚引物GAAGATCTGCAATCATTCGTCTGTTTCCC)分别克隆到经BglII消化过的pGL3basic/ElBTATA克隆2或经BglII消化过的pGL3basic/TcfC-ElBTATA克隆1。pGL3basic/447-E1BTATA克隆l和pGL3basic/TcfC-447-ElBTATA克隆6(至TATA框的距离d＝499)的克隆是用BglII突出端将从人β-珠蛋白基因内含子II中经PCR扩增的447bp片段(5’寡聚引物GAAGATCTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAG，3’寡聚引物GAAGATCTGATTTGGTCAATATGTGTACAC)插入到经BglII消化过的pGL3basic/E1BTATA克隆2或经BglII消化过的pGL3basic/TcfC-E1BTATA克隆1。这些序列都经测序证实。
为了获得pGL3basic/TcfC-25-E1BTATA克隆6(至TATA框的距离d＝25)，将pGL3basic/TcfC-E1BTATA克隆1用HindIII/BglII消化切割出TcfC片段，然后用绿豆核酸酶(NEB)对其进行平端化。将该平端化的片段克隆到经XbaI部分消化、绿豆核酸酶平端化的pGL3basic/E1BTATA克隆2，产生中间构建体pGL3basic/TcfC-25-E1BTATA克隆19。由于在克隆19中，质粒载体因未知原因在其骨架上紧邻启动子上游的地方发生了改变，因此我们不得不将TcfC-25-E1BTATA启动子片段重新克隆到pGL3basic中。因此，用SpeI/HindIII消化pGL3basic/TcfC-25-E1BTATA克隆19，获得的TcfC-25-E1BTATA启动子片段用Klenow酶平端化。最后，将平端化的TcfC-25-E1BTATA启动子片段克隆到经HindIII消化并经Klenow平端化的pGL3basic中，产生具有正确质粒骨架的pGL3basic/TcfC-25-E1BTATA克隆6(d＝25)。由于平端易于发生错误，进行了序列测定(参见图10c)。瞬时转染和荧光素酶分析在转染前一天，将HepG2、SW480和HeLA分别以每6孔2.5x105、1.5x105和6.0x104的细胞密度接种。第二天，在HBS(10mM HepespH7.4，150mM NaCl；Sigma)中制备CL22肽(KKKKKKGGFLGFWRGENGRKTRSAYERMCNILKGK(见于国际专利申请WO 98/35984))和质粒DNA的混合物(2∶1比率，μg∶μg)，终体积为100μl，室温温育30-45分钟，然后加入0.9ml“RAC”溶液(含0.1％人白蛋白(BPL，UK)、120μM氯奎(Sigma)的RPMI培养基(Sigma))。细胞用PBS润洗一次后，将转染溶液加入其中，温育4-5小时后，以2ml新鲜的完全培养基替换。两天后，用PBS润洗细胞一次，然后在200μl裂解缓冲液(10mM磷酸钠pH7.8、8mMMgCl2、1mM EDTA pH8.0、1％ Triton X-100和15％甘油)中室温温育10分钟。离心后，取上清的部分和荧光酶分析缓冲液(含0.1mM荧光素和0.44mM ATP的裂解缓冲液)进行荧光酶活性分析，使用荧光计数仪(Lumat LB 9501，Berthold，Germany)。根据各样品(BCA，Pierce)的蛋白含量对活性正态化作图。表达NTR的复制缺陷型腺病毒的构建用于构建重组腺病毒c1/CTL501、c13和CTL502即分别是pPS1128/5merTcf-SV40(克隆1和13)和pPS1128/5merTcf-E1BTATA(克隆10)的转移载体是通过两步构建的。首先，将来自pGL3pro/5merTcf-SV40克隆10的5merTcf-SV40启动子和来自pGL3basic/5merTcf-E1BTATA克隆1的5merTcf-E1BTATA启动子以HindIII片段克隆到经HindIII消化的pTX0374中，导致用各自的Tcf启动子替代CMV增强子/启动子，分别产生“pTX0374/5mer Tcf-SV40克隆8”和“pTX0374/5merTcf-E1BTATA克隆1”。pTX0374包含用于转录稳定的人β-珠蛋白内含子II，以及用于终止的补体2基因多聚A信号的CMV-NTR-IVSII-p(A)(NTR从基因组DNA中扩增的大肠杆菌B/r硝基还原酶基因)表达盒，以质粒pBluescript KS+作为骨架。第二步，将来自pTX0374/5mer Tcf-SV40克隆8和pTX0374/5merTcf-E1BTATA克隆1的完整的表达盒重新克隆到经SpeI消化的pPS1128中，产生“pPS1128/5mer Tcf-SV40克隆1和13(克隆1在E1中从左到右方向；克隆13在E1中从右到左方向)”和“pPS1128/5merTcf-E1BTATA克隆10(在E1中从左到右方向)”。pPS1128由伯明翰大学CRC癌症研究所的P.Searle博士惠赠。pPS1128包含腺病毒从左边ITR到核苷酸第359(nt359)以及从核苷酸第3525(nt3525)到10589的序列，因此是E1缺失载体。
用于制备CTL102的转移载体pTX0375的构建是将pTX0374中跨越整个表达盒(CMV-NTR-IVSII-p(A))的SpeI片段克隆到经SpeI消化的pPS1128中，并鉴定克隆包含从左到右方向表达盒。
腺病毒“骨架”载体pPS1160的构建是用PacI对pPS1128进行线性化，再与包含XbaI位点的PacI-相容性接合体(寡聚引物15’-TACATCTAGATAAT-3’；寡聚引物25’-TTATCTAGATGTA-3’)连接，再用XbaI消化并释放出包含Ad5序列3524-10589的约7kb的XbaI片段。然后再将其克隆到经XbaI线性化的pPS1022中(Peter Searle博士)，该质粒基于pUC18，包含Ad5从核苷酸第10589(nt10589)到右边ITR的序列，但缺少核苷酸第28592(nt28592)到30470(E3区)。
重组病毒CTL501、CTL502和CTL102通过在Per.C6细胞中的同源重组而构建。其分别与pPS1128/5mer Tcf-SV40(克隆1或13)、pPS1128/5merTcf-E1BTATA(克隆10)或pTX0375和pPS1160的等摩尔混合物共转染90％汇合度的Per.C6细胞。约7天后收集重组病毒，方法是通过在感染培养基(DMEM，1％FCS，2mM MgCl2)中的三次冻-融循环。重复感染/收集循环使得病毒大量生长，然后通过标准的CsCl密度离心纯化，在过量的储存缓冲液(10mM Tris pH7.4、140mM NaCl、5mM KCl、0.6mM Na2HPO4、0.9mM CaCl2、0.5mM MgCl2和5％的蔗糖)中透析，最后用液氮迅速冷冻，并储存于-80℃。用BCA蛋白分析试剂(Pierce)测定颗粒浓度。感染效价或者基于100个病毒颗粒中有1个是感染性的这一假设进行估计，或者是对限定的内部病毒标准在有限稀释的标准方法中进行测定。通过限制性酶切和用病毒DNA作为模板(上至起始NTR阅读框的启动子区域都得以测序)对腺病毒DNA进行鉴定。
pTX0374的构建是通过将包含融合有大肠杆菌ntr基因的CMV启动子的1.6kb BglII-BamHI片段克隆到pSW107中。pSW107的构建是将与包含人补体C2基因的polyA添加和转录终止信号的一段240bpHincII-BamHI片段相偶联的917bp人β-珠蛋白基因(外显子2的BamHI位点到外显子3的EcoRI位点)克隆到pBluescript(Stratagene)。通过将来自pTX0374的2.5kb SpeI片段克隆到经SpeI消化的pPS1128中构建pTX0375。该质粒以两步构建。首先，将pPS971(Weedon等，Int.J.Cancer，待出版)左边的EcoRI位点转变为SwaI位点以创建pPS115。第二，将pPS115的350bp SpeI-AflII片段用接头替换，该接头是通过将以下两个寡核苷酸退火制备的5’-CTAGTATCGATTGTTAATTAAGGGCGTGGCC-3’和5’-TTAAGGCCACGCCCTTAATTAACAATCGATA-3’。
pPS1022是通过将右边的EcoRI位点转变为SwaI位点而从pPS972中构建的。
本领域技术人员可理解，构建本发明的Tcf效应元件可使用任何合适的载体。具体地，应理解构建本发明的Tcf效应元件可使用任何合适的基于腺病毒的载体。腺病毒DNA的制备病毒DNA从约1011的CsCl条带的病毒颗粒中制备，方法是将其与含100μg/ml蛋白酶K的20mM Tris-HCl pH7.5、5mM EDTA pH8.0和0.1％SDS在37℃温育3-4小时。然后用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提该粗制DNA制剂两次，单独用氯仿抽提一次，然后用1/10体积的3.0M乙酸钠和2倍体积的100％乙醇在干冰/乙醇浴中沉淀10分钟。离心(室温下13000rpm，10分钟)之后，用乙醇润洗获得的DNA沉淀，空气干燥并重悬于水中。限制性酶切消化以分析病毒DNA。CTL50l和CTL502的启动子区域通过DNA测序进行分析(SeqlabGmbH，Germany)。对经病毒转导的细胞表达的NTR分析(ELISA)每6孔细胞培养平板中1-1.5x104细胞的转导是通过与感染培养基(含1％FCS的DMEM)中的病毒37℃、5％CO2下温育90分钟，接着在完全培养基中温育2天。然后通过低渗裂解制备细胞质提取物。但在用冰冷低渗裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5)在冰上裂解45分钟之前，细胞用PBS润洗。13000rpm离心提取物2分钟，以使其澄清。用50μl提取物重复三次包被96孔平板(NuncImmuno Plate MaxisorpAssay Plates)过夜。孔用PBS/0.5％Tween20润洗三次，然后与羊抗-NTR多克隆抗体(与PBS/0.5％Tween20以1∶2000稀释的100μl溶液)在室温下温育30分钟。通过用PBS/0.5％Tween20润洗三次去除过量的初级抗血清后，抽提物用驴抗-羊HRP偶联物(与PBS/0.5％Tween20以1∶5000稀释的100μl溶液)室温下温育30分钟。用PBS润洗三次之后，孔用lml TMB(1mg/ml DMSO；Sigma)、9ml 0.05M的柠檬酸磷酸缓冲液(Sigma)和2μl 30％(v/v)H2O2制备的混合液100μl温育。室温下将孔温育15分钟，用25μl 2M H2SO4终止反应。用96孔平板读取仪(Labsystems Multiscan MS)读取OD 450nm值。病毒注射的异体移植物的NTR免疫染色用20μl CTL102或CTL501注射SW480肿瘤，48小时后无痛处死，并切除。然后在4℃将肿瘤用4％的福尔马林/PBS固定20-24小时，接着用石蜡(Citadel 2000)包埋。切出3-4μm的石蜡切片，收集于APES处理的载玻片上。切片去蜡、重新水合并在PBS/0.01％Tween20中润洗(5分钟)两次，然后在室温下浸没于0.25％的H2O2/PBS中30分钟。随后将切片在PBS/0.01％Tween20中润洗(5分钟)三次，然后在室温用冰冷0.1％Triton-X100透化5分钟，接着在PBS/0.01％Tween20中润洗两次，每次5分钟。然后将切片用5％溶于PBS中的正常兔血清室温下封闭60分钟，接着与多克隆的羊抗-NTR(与PBS以1∶2000倍稀释)室温下温育60分钟。过量的初级抗体通过用PBS/0.01％Tween20润洗(5分钟)三次去除，然后与生物素化的抗-羊IgG/链亲和素-HRP溶液(Vectastain ABC试剂盒，VectorLaboratories，PK-6106，与PBS以1∶200倍稀释)室温下温育30分钟。
切片用PBS/0.01％Tween20润洗三次，每次5分钟，然后与新鲜制备的AEC试剂(Vectastain，Vector Laboratories)温育。10分钟后用水润洗从而终止反应，最后将切片封固在水样的浸片剂中。通过计数标准化面积内阳性染色细胞的数目分析染色情况。在裸鼠中产生皮下肿瘤异体移植物肿瘤异体移植物的产生是通过在雄性Bal/c nu/nu小鼠(6-8周龄，Harlan UK)的一侧胁腹皮下注射100μl指数生长期的培养的肿瘤细胞悬液，其经润洗并悬浮在无菌盐溶液中。细胞生存力至少为90％。对于HepG2使用5x106细胞接种量。对于SW480，用略低的2x106个细胞。注射后，将小鼠保持在无菌环境中，定期检测是否出现肿瘤异体移植物。CTL102和CTL501的肿瘤内注射使用配有固定的27号针头的U-100胰岛素注射器(TERUMO，Leuven，Belgium)将20μl病毒悬液或仅载体(含5％蔗糖的25mMTris-HCl，pH7.4)直接通过皮肤注射到肿瘤内。为了避免病毒泄漏，以连续缓慢的方式注射，并且在注射结束后15秒内保持针头的插入状态不变。CB1954的处理方案和肿瘤大小的检测通过腹膜内注射施用新鲜溶解于DMSO并以1∶5用NSS稀释的CB1954。小鼠连续5天接受每日一次的注射，剂量为20mg/千克体重。用载体单独处理的小鼠注射入20％DMSO/盐溶液(5.0μl/千克体重)。用游标卡尺在两个垂直方向(长和宽)通过皮肤测量肿瘤直径，并以表面积(长×宽＝mm2)表示，从而检测肿瘤的生长。为了避免不必要的痛苦，当肿瘤达到140mm2时，进行强制性处死。也记录动物的体重下降和行为变化(痛苦症状)。给裸鼠静脉注射施用CTL501/CTL102和CB1954使用配有固定27号针头的注射器对裸鼠的尾部静脉施用100μl的病毒悬浮液。48小时后，按上述方法施用CB1954。监控小鼠并每日称重。为了预防对动物不必要的痛苦，如果小鼠体重下降超过20％，或产生严重的痛苦症状则执行无痛处死。新鲜切除的结肠瘤样品的体外转导新鲜切除的肿瘤组织在无菌条件下用包含10％FCS、150μg/ml青霉素、250μg/ml链霉素、10μg/ml四环素、100μg/ml氨羟丁卡那霉素A、150μg/ml氯霉素和100μg/ml庆大霉素的20ml Earl’s MEM充分润洗(历时至少15分钟)，4℃于包含10％FCS的培养基中储存过夜。在去除了脂肪、杂质和可疑的坏死组织后，制备2-3mm3样品并单个放置于96孔平板的孔中。样品(重复四次)在CO2培养箱中温育于包含1x1010病毒颗粒的150μl无血清培养基中，或温育于不含病毒颗粒的培养基中4小时。然后用包含10％FCS的EMEM替换培养基，样品进一步温育44小时以使基因表达发生。用2％的低聚甲醛/PBS将肿瘤样品4℃固定2小时并用PBS润洗，在X-gal染色液中37℃温育过夜后，观察β-半乳糖苷酶的表达。β-连环蛋白的免疫组织化学染色用兔多克隆抗血清(Santa Cruz Biotechnology Inc)和载体AEC试剂盒对石蜡包埋的切片进行β-连环蛋白的染色。CTL503、Ad.CTP1-nLacZ和Ad.CTP3.nLacZ的构建CTL503的转移载体的构建是将TCFCd＝25-E1BTATA启动子以NTR基因上游HindIII片段克隆到经HindIII-消化的pTX0374，从而从后者中排除了CMV启动子。这种新的表达盒以SpeI片段克隆到pPS1128中，以产生pPS1128/TCFCd＝25-E1BTATA。
Ad.CTP1-nLacZ的转移载体的构建是将表达盒以XbaI片段克隆到经XmaI/SpeI消化并平端化的pTX0374，所述表达盒包含与鼠鱼精蛋白多聚腺苷酸信号融合的靶向核的LacZ基因。CTP1启动子以HindIII片段克隆到nLacZ基因的上游。然后CTP1-nLacZ表达盒从左向右的方向，以平端化的SpeI/NotI片段克隆到经SpeI消化后又平端化的pPS1128，从而产生pPS1128/CTP1-nLacZ。
为了构建Ad.CTP3-nLacZ的转移载体，首先将CTP3启动子以平端化的SpeI/HindIII片段克隆到经HindIII消化并平端化的pTX0374中，用CTP3替换CMV启动子。这种克隆再生了HindIII位点。第二步，用HindIII/PacI消化获得的质粒，然后平端化以释放NTR基因和IVSII内含子/多聚腺苷酸信号。将nLacZ-多聚腺苷酸盒(参见有关CTP1-nLacZ构建的详细说明)以平端的XbaI片段克隆到CTP3的下游。最后，将该完整的表达盒从左向右的方向以平端化的SpeI/NotI片段克隆到pPS1128衍生物(pTX0398)的PmeI位点，其中唯一的SpeI位点被PmeI位点所替换，产生pTX0398/CTP3-nLacZ。
病毒在PerC6细胞中通过上述转移载体和pPS1160的同源重组所拯救，如上所述(表达NTR的复制缺陷型腺病毒的构建)。对细胞的X-gal染色组织学细胞用PBS润洗后，用PBS中的0.05％戊二醛在室温下固定10分钟。进一步用PBS润洗后，将细胞与以下溶液在37℃温育。X-gal溶液DMF中400μl 500mM K4Fe(CN)6、400μl 500mM K3Fe(CN)6、100μl2mM MgCl2、250μl 40mg/ml X-Gal和8.85ml PBS。β-半乳糖苷酶表达的定量β-半乳糖苷酶的表达通过Galacto-Light系统(Tropix Inc，AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)的方法进行图示的定量测定。实施例实施例15merTcf-SV40-荧光素酶构建体在对β-连环蛋白活性去调节的肿瘤细胞系中特异性活化为了评估β-连环蛋白/Tcf结合元件指导基因在对β-连环蛋白活性去调节的肿瘤细胞系中高水平特异性表达的能力，我们构建了包含人工启动子的荧光素酶报道基因质粒，其在基本SV40启动子的上游包含5个Tcf位点。HeLa细胞中(β-连环蛋白未被去调节)，5merTcf-SV40与仅有SV40启动子的活性无差别。相反，在对β-连环蛋白去调节的细胞系中，5merTcf-SV40启动子的表达活性约是CMV增强子/启动子(SW480细胞)活性的80％，甚至比CMV(HepG2)的活性高。5merTcf-SV40的诱导率是18(HepG2)和44.2(SW480)。这些数据表明Tcf位点只在核β-连环蛋白存在时才具有活性。一些实验中，HeLa细胞中5merTcf-SV40启动子的活性甚至比仅有SV40的活性更低(资料未发表)。这与如果β-连环蛋白不存在，产生β-连环蛋白/Tcf异二聚体时，Tcf因子通常阻遏转录，如通过与转录辅助因子CBP(cAMP结合蛋白)相互作用的事实相一致。实施例2复制缺陷型腺病毒载体中保留了5merTcf-SV40人工启动子的活性和特异性为了评价5merTcf-SV40启动子驱动治疗性基因在肿瘤中高水平选择性表达的能力，所述肿瘤包含具有对β-连环蛋白去调节的细胞，如结肠来源的肿瘤，我们构建了复制缺陷型腺病毒载体，其在5merTcf-SV40启动子控制之下表达大肠杆菌B硝基还原酶基因(NTR)。NTR基因编码可将前体药物CB1954转化为高效DNA交联剂的酶，该交联剂可杀死处于分裂状态和不处于分裂状态的细胞。克隆1(CTL501)和13包含指定方向的表达盒(图2a)。CTL102中，CMV增强子/启动子调节NTR的表达。制备CsCl条带的病毒，以指定的感染复数感染HeLa、HepG2和SW480细胞(图2b)。在这种情况下，如图所示，发现从左到右方向的克隆1提供略高的表达特异性，因此其变成采用的标准方向(CTL501)。正如预期，CTL102在所有三种均不依赖其β-连环蛋白状态的细胞系中表达NTR。相反，CTL501只在HepG2和SW480细胞中具有高活性。即使以5倍高的感染复数，NTR在HeLa细胞中的表达也几乎难以检测。而克隆13在HepG2和SW480细胞中活性与CTL501相同，在HeLa细胞中也有表达，尽管与前者相比表达水平相对较低。实施例3Tcf应答性腺病毒CTL501在体内表现抗肿瘤活性已确认在体内CTL501在允许细胞中可高水平表达NTR，我们检测了用病毒对HepG2异体移植物的肿瘤内注射是否可导致足量的酶表达，从而使该肿瘤对CB1954敏感，并且引起可测定的抗肿瘤效果，包括肿瘤退化。实验中，5例肿瘤中的4例发生显著退化(图3)。56天后，4个有反应的肿瘤中有两个可被列为完全退化，而两只动物具有静息状态的极小的肿瘤。仅用载体注射并用CB1954处理的肿瘤如预期那样增大。有趣的是，仅注射了病毒的肿瘤，其生长明显减缓。我们将这种多变的反应归结为肿瘤内注射技术所固有的差异性。实施例4NTR在CTL501注射的SW480异体移植物中高水平表达因已表明CTL501在体外SW480结肠癌细胞中具有高活性，我们测定了是否能通过对裸鼠皮下SW480异体移植物进行肿瘤内注射而获得NTR的高水平表达。用CTL102或者用CTL501注射四例肿瘤，48小时后，无痛处死小鼠，切取肿瘤、固定、切片并针对NTR的表达进行免疫染色。结果显示在图4中。这些提供进一步的证据，即CTL501表达NTR的水平至少相当于CTL102。我们将这种NTR阳性细胞百分比的显著变化归结为肿瘤内注射技术本身固有的差异。实施例5全身性施用腺病毒，然后用CB1954处理CTL501比CTL102(CMV-NTR)的毒性更低以上我们显示了CTL501的肿瘤内注射导致高水平的NTR表达。与这种将治疗性基因特异性地传递到肿瘤细胞的方法相伴随的是病毒传播的危险，尤其是通过血流向肝脏的传播。基于以上显示的体外特异性的数据，我们预测尽管用CTL102对裸鼠的静脉内注射将导致NTR在肝中高水平表达，从而CB1954有显著的毒性，但CTL501的注射相对而言可较好地被耐受，因为其导致NTR在肝中的表达水平极低或不在肝中表达。图5显示的结果支持这一预测。剂量为10E9颗粒的CTL501+CB1954处理几乎不产生毒性，而比该剂量低10倍的CTL102产生100％的存活。我们认为CTL501在正常细胞中，尤其在肝中不表达或表达极低水平的NTR。实施例6构建基于Tcf的改进的启动子，其在缺少β-连环蛋白活性的细胞中完全无活性在一些应用中希望增加这种基于5merTcf的人工启动子的特异性，以便进一步例如控制治疗性腺病毒的复制。因此，我们检测了上述5merTcf元件和腺病毒(Ad5)E1B基因TATA框的组合(5merTcf-E1BTATA-Luc(CTL502)，图6a)。如上所述。在瞬时转染的HeLa和SW480细胞中，5merTcf-SV40启动子在SW480中的活性比CMV高，但由于SV40启动子的本底活性，其在HeLa细胞中表现背景活性。相反，5merTcf-E1BTATA-Luc构建体尽管在SW480中活性较低(是5merTcf-SV40活性的60％)，但其在HeLa细胞(没有对β-连环蛋白去调节)中完全无活性。以另一种方式表达，SV40最小启动子用E1BTATA元件替换，导致SW480中的可诱导性比HeLa中的有所增加，从5merTcf-SV40的约30-60倍增加到5merTcf-E1BTATA的约600-2000倍，即有20倍的增加。实施例75merTcf-SV40和5merTcf-E1BTATA启动子构建体的活性依赖于Tcf位点的相对位置为了测定改变这些位点沿DNA双螺旋的排列是否影响基于5merTcf的启动子的活性，我们构建了“TcfA”、“TcfB”和“TcfC”(图7)与SV40最小启动子或者E1BTATA的组合，并将其活性与各自来源的基于5merTcf的启动子，即+SV40或+E1BTATA进行了比较。在瞬时转染的SW480细胞中，含有TcfC-E1BTATA启动子元件表现最高水平的报道基因的表达(图8a)。而E1BTATA-TcfB的组合表现最低水平的报道基因表达，其约为TcfC-E1BTATA的一半。对于SV40的组合观察到表达差异较小(图8b)。此外，与E1BTATA中获得的结果显著不同的是，TcfC-SV40是其中活性最低的，而TcfB-SV40是活性最高的。这些结果暗示，Tcf位点的最佳间隔依赖于和该Tcf元件组合的基本启动子。图9对于Tcf位点的间隔在测定β-连环蛋白去调节的细胞中表达水平的关键作用提供了进一步的证据。这表明用包含少于5个Tcf位点(2、3和4个)的Tcf-E1BTATA-Luc构建体对SW480瞬时转染的结果。随着这些位点的增加，表达通常也增加，而该结果也表明，有合适间隔的3个位点可产生比交替排列的4个位点更高水平的基因表达。
与起初基于5merTcf的启动子相比，以上所述的所有构建体在HeLa细胞中背景表达水平都无增加，即，Tcf位点间隔的改变不会导致丧失我们前述精巧的特异性。实施例85merTcfC-E1BTATA启动子元件的活性通过Tcf结合位点和E1BTATA框之间的距离测定我们还检测了改变Tcf结合位点与TATA框之间的距离对表达的影响(图10)。构建了四种基于TcfC-E1BTATA的构建体，并对其进行比较(图10a，并参见材料和方法章节)。如图10b所示，在Tcf至TATA的间隔和转染的SW480细胞中荧光素酶表达水平之间发现存在反向关系。尽管缩短间隔可进一步提高表达，但可能25bp是其最小间隔。正如下所预料，这种起始复合物和Tcf/β-连环蛋白可能对其各自的结合位点接近产生空间阻碍。在此检测的新构建体保留了初始5merTcf-E1BTATA人工启动子的特异性(资料未发表)。实施例9复制缺陷型腺病毒中也保留5merTcf-E1BTATA启动子的活性和特异性为了确认5merTcf-E1BTATA(CTL502)启动子在腺病毒背景中是否仍保留其活性和特异性，我们用CTL102、CTL501和CTL502感染了HeLa和SW480细胞，并通过ELISA分析了NTR的表达(图11)。正如预期那样，CTL102在HeLa和SW480中都是高活性的。与上述瞬时转染实验一致，CTL501和CTL502在SW480中活性高，但在HeLa中只有极弱的活性。此外，HeLa细胞中CTL502的活性明显小于CTL501的活性。CTL501在高感染复数(1500pfu/细胞)时表达易于检测的NTR，而用CTL502则不能检测出。由此，β-连环蛋白/Tcf效应元件与腺病毒(Ad5)E1BTATA框的组合可提供极高水平的肿瘤选择性，其可能适合于表达编码强治疗剂的基因，所述治疗剂即使在低水平也可显著破坏非癌性细胞。实施例10CTL501和CTL102对正常小鼠的静脉注射CTL501注射在肝中不表达以上(实施例5)我们显示对正常小鼠全身性施用(尾部静脉注射)CTL501，然后再用CB1954处理，有很好的耐受性。相反，剂量低10倍的CTL102(CMV.NTR)/CB1954与CB1954的组合注射，在所有实验中都是致死的。根据这一结果，我们认为CTL501中驱动NTR基因的β-连环蛋白/Tcf应答启动子在病毒感染的正常鼠组织主要是肝中是无活性或者活性很弱。为了对此提供直接的证据，用CTL501或CTL102注射小鼠，在注射后48小时通过免疫染色测定肝中的表达。图12中，我们显示了对NTR表达染色的代表性的肝切片。CTL501的注射产生不连续低水平的NTR表达，而剂量低10倍的CTL102在多数细胞中都产生高水平的表达。我们解释了这一结果以及实施例5所述的结果，表明β-连环蛋白/Tcf4复合物在正常鼠肝细胞的细胞核中不存在，或仅以极低水平存在，其水平不足以激活启动子。这些数据极不可能反映鼠β-连环蛋白/Tcf-4没有活化启动子的能力，因为(i)该Wnt途径从蝇类开始就是进化上高度保守的，并且(ii)由Wnt信号(cdx)活化的至少一个鼠基因的启动子包含Tcf结合位点，该位点满足我们在构建该启动子时使用的共有序列的人Tcf-4结合位点(Lickert等(2000)Development 1273805-3813)。实施例11CTL501/CB1954在结肠癌异体移植模型中的抗肿瘤功效我们在上述实施例3中显示用单剂量的CTL501对HepG2(肝癌)异体移植物的肿瘤内(i.t.)注射使β-连环蛋白-去调节的肿瘤模型对于前体药物CB1954非常敏感，在多数情况下导致肿瘤退化。我们在此显示CTL501/CB1954治疗在β-连环蛋白-去调节的结肠癌异体移植模型(SW480)中非常有效。分别用109和1010颗粒的CTL501注射两组大小随机选取的肿瘤，开始48小时后将CB1954施用给宿主小鼠。为了能够与从CMV启动子表达的NTR所获得的功效相比，用同等剂量的CTL102注射两组其他的肿瘤组。如图13所示，CTL501和CTL102注射产生相似水平的抗肿瘤功效。未注射病毒的对照肿瘤(注射了载体和全身性CB1954处理)生长旺盛。实施例12CTL503/CB1954在结肠癌异体移植模型中的抗肿瘤功效在以上(实施例6-8)我们显示构建对β-连环蛋白/Tcf-4依赖性增加的β-连环蛋白/Tcf-4应答性启动子(并因此提高对β-连环蛋白去调节的肿瘤的特异性)是可能的，方法是通过用Ad5 E1B TATA替换SV40最小启动子片段，和通过改变Tcf结合位点之间以及E1BTATA和邻近启动子的Tcf-4结合位点之间的间隔。构建了包含驱动NTR的修饰启动子的重组病毒(“CTL503”)，以测定瞬时转染实验中在允许细胞中观察到的高水平表达是否在腺病毒骨架的背景中仍然存在。图14显示了CTL503对SW480异体移植物的肿瘤内注射以及随后施用CB1954所产生的抗肿瘤反应，在程度上与CTL102+CB1954处理所产生的相似。因此这些体内功效数据提供了强有力的证据，即由瞬时转染实验所检测到的CTP3肿瘤特异性得到了增加，其在有去调节的β-连环蛋白/Tcf-4的肿瘤细胞中保留有高水平的活性。实施例13β-连环蛋白/Tcf-依赖性启动子在培养的初级人肝细胞、皮成纤维细胞和内皮细胞中以极低水平表达以上我们显示了上述启动子在保留正常β-连环蛋白调节的肿瘤细胞系中以极低水平表达。据此我们推论这些启动子在正常人细胞中表达无活性/弱活性，即与我们使用的肿瘤细胞相对比的模型正常细胞。为了对此提供直接证据，我们测定了这些启动子中的两种在一组培养的初级人细胞(肝细胞、内皮细胞和皮成纤维细胞)中的活性。为了便于这些以及随后涉及培养的原发人组织的实验(参见以下实施例15和16)，我们构建了在上述两个启动子“Ad.CTP1-nLacZ”和“Ad.CTP3-nLacZ”控制之下表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒(为清楚目的，我们使用了这些启动子的系统命名法CTL501中存在的初始启动子被重命名为“CTP1”；CTL503中存在的最佳启动子重命名为“CTP3”)。
图15显示CMV启动子在所有三种受测细胞类型中表达强烈，而CTP1和CTP3在这些细胞中以极低水平指导β-半乳糖苷酶的表达。但所有三种启动子在SW480结肠癌细胞中都具有高活性(图15d)。实施例14CTP1和CTP3在293和PerC6辅助细胞系内E1-缺失的腺病毒生长过程中以极低水平指导转基因表达试图生长E1-缺失病毒通常是不成功的，所述病毒编码由在表达E1的Ad辅助细胞中具有活性的启动子所驱动的细胞毒性基因，因为该毒性基因产物的表达使细胞不能有效地支持病毒的生长。
为了测定CTP1和CTP3启动子在病毒产生中的表达水平，我们用Ad.CMV-nLacZ、Ad.CTP1-nLacZ和Ad.CTP3-nLacZ病毒感染293和PerC6细胞，并测定感染30小时后LacZ的表达水平。
图16中我们显示了在两种Ad辅助细胞系中由CTP1和CTP3驱动的LacZ的表达水平均显著低于由CMV启动子驱动的水平。但是，如在所有其他的非允许细胞系中观察的那样，CTP3明显比CTP1的活性低(约低10倍)。这两种启动子在PerC6中的活性比在293细胞中的活性约高3倍。这些数据提示这两种细胞系特别是293细胞能支持第一代腺病毒载体的有效复制，所述腺病毒载体编码处于CTP3启动子控制之下的毒性转基因。实施例15CTP1和CTP3启动子在新鲜切离的转移性结肠癌组织中活性高但在相关的肝组织中无活性已建立的肿瘤细胞系是研究癌症中基因表达方式有用的模型系统。然而这些细胞系是从原发性癌中克隆的，所述原发性癌是遗传多样性以及遗传不稳定性细胞的多克隆群体。它们也通常被连续培养一段长的时期，从而提供了更广的细胞选择范围，所述细胞良好地适合体外培养但不真正代表其来源的癌。由于这些原因，我们测定了CTP1和CTP3在原发性和继发性结肠癌的新鲜外植样品中的活性。制备样品，并用Ad.CMV-nLacZ、Ad.CTP1-nLacZ和Ad.CTP3-nLacZ病毒感染，如材料和方法章节中所述进行核β-半乳糖苷酶表达的分析。使用Ad.CMV-nLacZ测定各样品的生存力和对于腺病毒感染的易感性，并对比CMV和CTP1/3启动子的相对活性。图17显示从肝中分离的继发性癌所获得的结果。对于各病毒的处理，将带有附着肝部分的肿瘤在病毒悬液中温育。如同在所有其他肿瘤样品中观察的那样，该组织不含内源的β-半乳糖苷酶活性(模拟品感染的样品不被X-gal染色)。与Ad.CMV-nLacZ温育导致对肿瘤和附着肝的浓染色。通过用Ad.CTP1-nLacZ和Ad.CTP3-nLacZ病毒感染等价样品提供了明显的肿瘤特异性在两种情况下，肝和肿瘤组织暴露产生的表达水平与CMV产生的相同，但局限在肿瘤组织内。在此，所有受测的5例结肠癌转移物对于高水平的CTP1和CTP3的表达都是许可的。在10例原发肿瘤中，发现3例对于启动子活性是弱许可或非许可的。应注意，产生继发性肿瘤的原发肿瘤在各中情况下都是许可的。实施例16高水平CTP介导的表达与β-连环蛋白高水平非膜性表达相关在实施例15中我们说明了CTP1和CTP3可在继发性结肠癌组织中提供高水平的基因表达，尽管也同时将转基因导入邻近的健康肝组织中。目前所述启动子在所有继发性CRC沉积中都有活性，但在10例原发性CRC沉积中有3例观察到低水平表达，或未观察到可检测的表达。分析这些对β-连环蛋白非许可的肿瘤表明，在蛋白的整体细胞水平和亚细胞分布之间存在相互关系。图18显示代表性的许可和非许可肿瘤样品的结果。通过对β-连环蛋白的染色表明肿瘤A(非许可)分化度相对较高，主要限制于细胞外周中，这和其与E-钙粘着蛋白相关是一致的。相反，肿瘤B(许可)的分化度较低，具有显著高的细胞质/核β-连环蛋白的染色。这一结果进一步证明CTP启动子对于β-连环蛋白去调节的依赖性。这与结肠肿瘤发生的简单模型相冲突，该模型中导致对β-连环蛋白/Tcf应答的基因组成型活化的β-连环蛋白去调节是首发事件。这一结果的实际应用是，其可为肿瘤患者提供预选择的基础，所述肿瘤对于CTP启动子是许可的，并由此通过基因治疗方法是潜在可治疗的，其中治疗性基因是处于CTP启动子的控制之下。
权利要求
1.一种核酸构建体，其包括含有至少一个TCF结合元件的TCF效应元件，所述TCF结合元件具有序列CTTTGNN，其中N是A或T；启动子；和与所述TCF效应元件可操作连接的可表达治疗性基因，其中所述TCF效应元件使可操作连接的治疗性基因能够诱导性表达。
2.权利要求1的核酸构建体，其中所述治疗性基因编码毒素蛋白或前体药物活化酶。
3.权利要求1或2的核酸构建体，其中所述治疗性基因编码可活化CB1954的硝基还原酶。
4.上述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述启动子选自SV40启动子、E1B启动子和c-Fos启动子。
5.权利要求4的核酸构建体，其中所述启动子是E1B启动子。
6.上述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述TCF效应元件包含5-15个TCF结合元件。
7.上述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述TCF效应元件包含5-10个TCF结合元件。
8.上述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述TCF效应元件包含5个TCF结合元件。
9.上述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述TCF结合元件彼此之间通过3到20个核苷酸隔开。
10.上述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述TCF结合元件彼此之间通过3到12个核苷酸隔开。
11.上述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述TCF结合元件彼此之间通过10到12个核苷酸隔开。
12.上述权利要求中任一项的核酸构建体，其中与所述启动子最邻近的TCF结合元件和该启动子的TATA框之间有140到10个核苷酸的间隔。
13.上述权利要求中任一项的核酸构建体，其中与所述启动子最邻近的TCF结合元件和该启动子的TATA框之间有100到10个核苷酸的间隔。
14.上述权利要求中任一项的核酸构建体，其中与所述启动子最邻近的TCF结合元件和该启动子的TATA框之间有50到10个核苷酸的间隔。
15.上述权利要求中任一项的核酸构建体，其中与所述启动子最邻近的TCF结合元件和该启动子的TATA框之间有30到15个核苷酸的间隔。
16.权利要求1-10或12-15中任一项的核酸构建体，其中所述TCF结合元件彼此之间通过3或4个核苷酸隔开，以及其中与所述启动子最邻近的TCF结合元件与该启动子的TATA框相距25个核苷酸。
17.上述权利要求中任一项的核酸构建体，其中所述TCF结合元件具有核苷酸序列CTTTGAT。
18.一种TCF效应元件，其包含至少五个TCF结合元件；和启动子序列，其中所述TCF效应元件当与可表达基因可操作连接时，可使该可操作连接的基因诱导性表达。
19.一种TCF报道基因构建体，其包含与报道基因可操作连接的权利要求17的TCF效应元件。
20.权利要求18的TCF报道基因构建体在鉴定治疗癌症的侯选药物的方法中的用途，所述癌症是与Wnt信号途径的去调节相关，该方法包含以下步骤将所述TCF报道基因构建体与待测化合物在该报道基因转录的条件下接触；和检测该报道基因的转录；其中抑制该报道基因转录的待测化合物就是治疗癌症的侯选药物。
21.一种载体，其包含权利要求1到16中任一项的核酸构建体或与可表达基因可操作连接的权利要求17的TCF效应元件。
22.用权利要求20的载体转染的宿主细胞。
23.权利要求1-16中任一项的核酸构建体、权利要求20的载体或权利要求21的宿主细胞在治疗中的用途。
24.权利要求1-16中任一项的核酸构建体、权利要求20的载体或权利要求21的宿主细胞在制备用于治疗癌症的组合物方面的用途。
25.一种治疗方法，其包含给需要这种治疗患者施用有效量的权利要求1-16中任一项的核酸构建体、权利要求20的载体或权利要求21的宿主细胞。
26.一种药物组合物，其包含权利要求1-16中任一项的核酸构建体、权利要求20的载体或权利要求21的宿主细胞与一种可药用受体的组合。
27.一种组合物，其将权利要求1-16中任一项的核酸构建体或权利要求18的TCF效应元件传递于细胞。
全文摘要
本发明公开了DNA元件和构建体，其用于在具有突变的β－连环蛋白/APC途径的肿瘤中获得肿瘤选择性的基因表达。具体地，本发明说明了这些构建体在结肠癌细胞中表达编码治疗性蛋白的基因中的用途。这些构建体包含与启动子可操作连接的多个重复的TCF结合元件。采用这种构建体，转化前体药物的酶如硝基还原酶可在特异的肿瘤细胞中得到表达。当其与合适的前体药物如CB1954全身性施用相偶联时，可表现出对这种肿瘤细胞的选择性杀灭。
文档编号C12N5/08GK1418224SQ0180593
公开日2003年5月14日 申请日期2001年3月1日 优先权日2000年3月2日
发明者劳伦斯·斯特林·扬, 卡伊·斯蒂芬·利平斯基, 克里斯托弗·约翰·赖顿 申请人:Ml实验室公开有限公司