用重组棒状杆菌生产乙醇的方法

专利名称：用重组棒状杆菌生产乙醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种乙醇生产方法。具体地说，本发明涉及一种使用葡萄糖等糖类作为原料的乙醇生产方法；更具体地说，涉及一种以高生产率高效率生产乙醇的方法，包含使用一种由含有一个能表达丙酮酸脱羧酶(以下称之为PDC)活性的基因且如果希望还含有一个能表达醇脱氢酶(以下称之为ADH)活性的基因的DNA在允许该表达的调节序列下转型的棒状杆菌(coryneform bacterium)，和使葡萄糖等糖类的一种原料在这种杆菌没有实质性增殖的乙醇生产条件下发酵来生产乙醇，然后将其收集。
背景技术：
迄今为止，乙醇一直是通过经由来自化石资源例如煤和石油的乙烯的化学合成或者来自生物量资源例如植物的糖类用一种微生物例如酵母或细菌的发酵来制备的。在这些方法中，使用一种可再生生物量资源通过发酵生产乙醇的方法，从能源或环境问题的观点来看，已经受到注意。
通过惯常大规模工业发酵生产乙醇的方法是一种使来自各种生物量资源的淀粉或糖类发酵的方法，即一种基于可饮用乙醇的酿造的技术。然而，使用一种酵母作为发酵微生物导致缓慢的乙醇生产速度，也导致由于需要曝气而造成的困难例如复杂的发酵控制，尽管该发酵是在厌氧条件下进行的。
众所周知的是使用一种属于发酵单胞菌(Zymomonas)的菌株作为发酵微生物(日本专利公报No.H7-59187)。
公认的是，使用发酵单胞菌的发酵方法，与使用酵母的发酵方法相比，导致乙醇生产速度提高。已经有人提出了通过各种微生物种的生物技术改性来提高乙醇生产效率(日本专利公报No.H5-502366、No.H6-504436、和No.H6-505875)。
在以上技术中，已经把来自可移动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的两个基因，即一个为PDC活性编码的基因(能催化糖酵解途径中的丙酮酸转化成乙醛)和另一个为ADH活性编码的基因(能催化乙醛转化成乙醇)，在允许其表达的调节序列下插入宿主(肠细菌，例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)或菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthe))中。因此，使用这样的转化体实现了高生产率的乙醇发酵。
按照以上提到的技术，乙醇生产率的提高归因于这些转化体在发酵罐中的高增长和高细胞密度。这样一些涉及细胞增长的发酵有很多低效性，包括由于使用糖材料作为所述微生物生长用能量供给源造成的糖材料向乙醇转化的低效率，在直至该微生物到达稳定生长期的这段时间内乙醇生产速低，以及由于该微生物伴随其细胞生长的密度变化而造成的发酵罐控制复杂化。
另一个技术问题是当使用大肠埃希氏杆菌作为宿主细胞时有毒物质的分离。大肠埃希氏杆菌容易发生溶菌作用，导致有毒胞内蛋白对发酵产品的可能沾污。
从这种观点来看，要转型的宿主微生物的改善是理想的。
本发明要解决的问题本发明提供一种使用生物量资源作为糖类原材料的乙醇生产新方法，其中实施了以高生产率高效率生产乙醇的更好优异技术，且其中解决了上述先有技术中指出的各种问题。
解决问题的手段本发明者等人为了解决以上提到的问题已经进行了长期研究，而且已经发现，通过使用一种用一个能表达PDC活性的基因和希望时一个能表达ADH活性的基因在允许该表达的调节序列下转型的棒状杆菌，然后在该转型的棒状杆菌没有实质性增殖的乙醇生产条件下进行发酵，就能实现高生产率的乙醇高效率生产，从而完成了本发明。
本发明的特征之一在于要转型的宿主菌是一种棒状杆菌，还在于乙醇是在该转型棒状杆菌没有实质性增殖的条件下制备的。
本发明的实施方案本发明中可以使用来自各种微生的、能表达ADH活性的基因和能表达PDC活性的基因。尽管这些基因中每一种都可以从不同微生物衍生，但较好能使用可移动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。
具体地说，可以使用已经克隆和测序的下列基因。
能表达ADH活性的基因源可移动发酵单胞菌
ADH I基因(保藏号M32100)(J.Bacteriol.vol.172，2491-2492(1990))；ADH II基因(保藏号X17065，M15394)(J.Bacteriol.vol.169，2591-2597(1987))。
源酿酒酵母ADH 1基因(J.Biol.Chem.vol.257，3018-3025(1982))；ADH 2基因(J.Biol.Chem.vol.258，2674-2682(1983))；ADH 3基因(Nature，vol.387，90-93(1997))；ADH 4基因(保藏号X05992)(Mol.Gen.Genet.vol.209，374-381(1987))；ADH 5基因(EMBO J.vol.13，5795-5809(1994))。
源中华根瘤菌属(Sinorhizobium meliloti)ADH基团(Biochim.Biophys.Acta vol.1384，197-203(1998))。
源伤寒沙门氏菌ADH基因(J.Bacteriol.vol.181(17)，5317-5329(1999))。
源结核分支杆菌ADH基因(Nature，vol.393，537-544(1998))。
源大肠埃希氏杆菌ADH基因(DNA Res，vol.3，137-155(1996))。
能表达PDC活性的基因源可移动发酵单胞菌PDC基因(J.Bacteriol.vol.170，3310-3313(1988))。
源酿酒酵母PDC1(保藏号X77316)(Nucleic Acids Res.vol.14，893-63-8977(1986))；PDC6(保藏号X66843，X55905)(J.Bacteriol.vol.173，7963-7969(1991))；PDC5(保藏号X15668)；PDC2(保藏号X65608)(Mol.Gen.Genet.vol 241，657-666(1993))。
源枯草杆菌pdhA基因/pdhB基因(保藏号AF 012285)(J.Bacteriol.vol.172，5052-5063(1990))。
源铁氧化硫杆菌pdhA基因/pdhB基因(保藏号U 81808)(Microbiology，vol.142，2543-2548(1996))。
对于这两种基因来说，为了表达其活性，有必要处在一种调节序列之下，尽管不一定要求它们处在一种共同的调节序列之下。它们可以处在各自独立的调节序列之下，而且在一些情况下处在不同的质粒上并且在一条染色体上的不同部位。
本文中使用的“在一种调节序列下”系指一个意向基因可以通过诸如与启动子、诱导物、操纵基因、核糖体结合部位、转录终止区等的协同作用而自动复制。
按照本发明转型的宿主微生物是一种棒状杆菌。该棒状杆菌是一种革兰氏阳性菌，而且不同于以上提到的先有技术中作为宿主菌使用的革兰氏阴性菌例如大肠埃希氏杆菌。值得注意的是，美国专利5,482,846和美国专利5,916,787公开了一种由一个能表达ADH活性和PDC活性的基因使革兰氏阳性菌转型的方法。然而，其中所使用的革兰氏阳性菌是芽胞杆菌属、乳杆菌属、原纤维菌(Fibribacter)、瘤胃球菌属、足球菌属、噬细胞菌属、纤维单胞菌属、拟杆菌属、梭状芽胞杆菌属、枯草杆菌、和多粘芽胞杆菌，但没有考虑到棒状杆菌可以用来作为要转型的宿主细胞。
本发明的主要特征之一是，选择原来没有从丙酮酸生产乙醇的功能的棒状杆菌作为要转型的宿主。按照本发明转型的棒状杆菌的使用，使我们能在没有观察到实质性细胞生长的条件下制备乙醇，这与通过用按照以上提到的先有技术转型的酵母、发酵单胞菌属或肠细菌例如大肠埃希氏杆菌发酵生产乙醇的通常方法成鲜明对照。
因此，通过在无细胞生长的情况下生产乙醇，克服了由于如上所述细胞生长而产生的很多技术问题。这具有作为一种实用工业生产技术的显著价值。本发明者等已经发现，这样一种技术可以通过使用一种棒状杆菌来实现。
棒状杆菌生长的实质性抑制可以通过使该好氧菌遭遇到厌氧条件或限制其基本营养要求生物素来实现(J.Industrial Microbiol.vol.5，289-294(1990))。此外，调节生长的基因的功能的生物技术调控也会是一种有效手段。
尽管厌氧条件下的乙醇发酵已经实现，但该技术强调或伴随着细胞生长。反之，本发明是十分不同的，达到了本发明意在抑制棒状杆菌在乙醇反应容器中的实质性生长的程度。
以上提到的先有技术披露厌氧条件和好氧条件两者都导致转化体和乙醇生产率的等效增长，这在技术思想或内容上不同于本发明。
本发明的一个基本要素是在一种允许表达的调节序列之下向一种棒状细菌中引入一种含有一个能表达PDC活性的基因和需要时一个能表达ADH活性的基因的DNA。
在本方法中，引入一个能表达PDC活性的基因是基本的，而引入一个能表达ADH活性的基因并不是基本的。这是由于人们通常认为棒状杆菌没有能表达上述各自酶的基因中任意一种，但就ADH而言它是不确定的。因此，无法否认的是，某些棒状杆菌具有能表达ADH酶活性的基因。在这种情况下，只使用一种能表达PDC酶活性的基因作为要引入的基因，基本上就够了。
然而，较好将两种基因都引入，以便即使用来作为宿主的棒状杆菌原来具有产生ADH的能力也能进行更高的转型。
作为用能表达PDC活性的基因和希望时能表达ADH活性的基因转型的棒状杆菌的类型，没有任何限制，只要它是能在通常好氧条件下生长的棒状杆菌即可。其实例是棒状杆菌属、短杆菌(Brevibacterium)、关节杆菌(Arthrobacter)、分支杆菌属、和细球菌属。更具体地说，棒状杆菌的实例是Corynebacterium glutamicumATCC 13032、ATCC 13058、ATCC 13059、ATCC 13060、ATCC 13232、ATCC 13286、ATCC 13287、ATCC 13655、ATCC 13745、ATCC 13746、ATCC 13761、ATCC 14020和ATCC 31831。短杆菌的实例是乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)MJ-233(FERM BP-1497)和MJ-233AB-41(FERM BP-1498)，产氨棒杆菌(Brevibacterium ammoniagen)ATCC 6872。关节杆菌的实例是球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)ATCC 8010、ATCC 4336、ATCC 21056、ATCC 31250、ATCC 31738和ATCC 35698。
作为一种转型，有使具有两种基因的宿主菌的染色体重组的方法，或使用一种重组质粒的方法，其中，两种基因都已经结合到一种能在宿主菌中自动复制的质粒中。
用于这样的目的的质粒载体可以是棒状杆菌中含有一种有自动复制功能的基因的质粒载体。作为具体例，可以列举pAM330(Agric.Biol.Chem.vol.48，2901-2903(1984)和Nucleic Acids Symp Ser.vol.16，265-267(1985))(来自乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)225)，pHM 1519(Agric.Biol.Chem.vol.48，2901-2903(1984)(来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13058)，pCRY30(Appl.Environ.Microbiol.vol.57，759-764(1991))，pEK 0、pEC 5、pEKEx 1(Gene vol.102，93-98(1991))，和pCG4(J.Bacteriol.vol.159，306-311(1984))(来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium gluatmicum)T250)。
本发明中用于棒状杆菌转型的质粒的构建，例如，在一种来自所使用的可移动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的基因的情况下，可以通过使一种调节序列例如一个适当启动子和终止区分别连接含有完整ADH基因的Dral-Dral 1.4kb基因片段(J.Bacteriol.vol.169，2591-2597(1987))和含有完整PDC基因的Dral-Dral 1.8kb(J.Bacteriol.vol.169，949-954(1987))，然后将其插在以上列举的质粒载体中任何一种的一个适当限制部位上这样来进行。
以上所述重组质粒中表达ADH基因和PDC基因的启动子的一个实例是但不限于棒状杆菌原来携带的启动子。它可以是任何一种具有启动ADH基因和PDC基因转录的功能的碱基序列。在一种调节序列之下置于ADH基因和PDC基因下游的终止区的一个实例是但不限于棒状杆菌原来携带的终止区。它可以是，例如，任何一种具有终止ADH基因和PDC基因转录的功能的碱基序列，例如来自大肠埃希氏杆菌(E.coli)的色氨酸操纵子的终止区。
在本发明中，在一种含有诸如意向基因的质粒载体引入该棒状杆菌中之前进行的棒状杆菌培养可以在通常的好氧条件下进行。可以使用通常微生物培养用的培养基作为培养基。例如，向含有天然营养素例如肉膏、酵母膏、胨等的一般培养基中，必要时添加无机盐例如硫酸铵、磷酸钾、硫酸镁的溶液。
在上述培养后引入一种含有意向基因的质粒载体的方法包括但不限于电极化和CaCl2法，只要这样的方法能把一种基因引入一种棒状杆菌中即可。在其一种实施方案中，例如，可以使用一种已知的电脉冲法(Agric.Biol.Chem.vol.54，443-447(1990)，Res.Microbiol.vol.144，181-185(1993))。
就该意向基因向一种染色体中引入而言，也有类似方法可供利用，例如，DNA sequence vol.3，303-310(1993)中所述的那种技术就可以利用。
转型棒状杆菌的选择方法采用抗生素抗性，从而将一种有所述抗性编码的基因引入一种含有该意向基因的质粒载体或染色体中，然后把转型的棒状杆菌涂到一块含有适当浓度的所述抗生素的板上。作为其一种实施方案，有诸如(Agric.Biol.Chem.vol.54，443-447(1990)，Res.Microbiol.vol.144，181-185(1993)中所述的方法可供利用。
基本上，为了将一种好氧棒状杆菌用于本发明的乙醇制备方法，必须先在通常的好氧条件下培养大量转型棒状杆菌。本培养可以按照一种类似于转型前棒状杆菌的培养的方式进行。
在好氧条件下培养的本发明的转型棒状杆菌用离心分离法、膜过滤法收获，或进行化学处理(例如用角叉藻聚糖制动)，以期用于随后的乙醇生产反应。
对于该乙醇生产反应来说，较好使用一种含有适当无机盐或缓冲剂的水溶液。向该水溶液中添加作为乙醇生产用原料的糖类，例如葡萄糖。
该乙醇生产反应是在实质上抑制了转型好气棒状杆菌的生长的条件下进行的。可以采用如上所述的各种方法来实质上抑制其生长，而且把该转型的好气棒状杆菌置于厌氧条件下就足够了。乙醇生产反应体系可以是间歇反应也可以是连续反应，而且从达到高生产率的观点来看，较好是连续的。在本发明方法中连续反应体系的使用没有导致该棒状杆菌的实质上生长，因而其运转控制比伴随着细胞生长的惯常方法的运转控制更容易。
用来作为乙醇生产原料的糖类较好包括但不限于导致迅速产生乙醇的葡萄糖。
本文中使用的“厌氧条件”系指导致水溶液中溶解氧浓度下降的任何条件，先决条件是应当允许有痕量溶解氧，只要实质上抑制了该转型棒状杆菌的生长即可。这个条件是通过诸如在一个密封容器中进行该反应而不曝气或者边进行反应边供给一种惰性气体例如氮气来实现的。乙醇生产的温度通常是15℃～45℃、较好是25℃～37℃。把反应期间的pH调整到5～9、较好7～8的范围内。用于本发明乙醇生产的棒状杆菌可以以非常高的浓度例如1g/l～1500g/l使用，因为它在该反应期间是实质上不生长的。
在本发明的乙醇生产中，该细胞在该反应期间是实质上不生长的，而且原料糖类并没有作为生长营养源消耗掉。此外，不需要诱导期例如指数生长期来提供高密度细菌培养物，这意味着从反应初期阶段起就以高密度(高浓度)细胞进行乙醇生产是可能的，从而能实现高生产率、高效率乙醇生产。
把按照如上所述方法制备的乙醇从反应物中分离出来，必要时加以精制，用来作为燃料乙醇或化学工业原料。
以下实施例详细说明本发明，但不应视为对本发明范围的限制。
实施例实施例1来自Zymomonas mobilis ATCC 29191的含有ADH基因和PDC基因片段的DNA的克隆(A)Zymomonas mobilis ATCC 29191中总DNA的提取向1升生长培养基〔组成20g葡萄糖，5g酵母膏，和1000ml蒸馏水〕中接种一铂接种环Zymomonas mobilis。然后，将其在30℃厌氧培养直至指数生长期晚期，将其收获。
所得到的菌细胞以10mg/ml的浓度悬浮于15ml含有10mg/ml溶菌酶、10mM NaCl、20mM Tris缓冲剂(pH8.0)和1mMEDTA·2Na(每种成分的浓度均为最终浓度)的溶液中。然后，以最终浓度为100μg/ml添加蛋白酶K、在37℃加热1小时。此外，添加硫酸十二烷酯钠(SDS)至最终浓度为0.5％，在50℃保暖6小时以导致溶菌作用。向这种溶菌化溶液中添加等量苯酚/氯仿溶液，在室温下缓缓摇荡10分钟，然后使该总体积离心分离(5,000×g，20分钟，10～12℃)，以分离出一部分上清液。向此上清液中添加乙酸钠，使之达到0.3M的浓度，然后缓缓添加两倍体积的乙醇。存在于水层与乙醇层之间的DNA用玻璃棒取出、用70％乙醇洗涤、然后风干。向所得到的DNA中添加5ml 10mM Tris缓冲剂(pH 7.5)-1mM EDTA·2Na的溶液，在4℃静置过夜，接着用于随后的实验。
(B)来自Zymomonas mobilis的含有ADH基因和PDC基因的DNA片段的克隆用实施例1(A)中制备的染色体DNA作为模板，进行PCR。为了在该PCR中克隆ADH基因和PDC基因，利用“394 DNA/RNAsynthesizer”(Applied Biosystems公司)合成下列每一对引物并使用之。
ADH基因扩增引物(a-1)5′-tct cga gct ctg tag ggt gag gtt ata gct-3′(SEQ 1D NO1)(b-1)5′-ctc tgg tac ctc aag aca gga cgg aaa acc-3′(SEQ 1D NO2)引物(a-1)含有Sac1限制部位，而引物(b-1)含有Kpn1限制部位。
PDC基因扩增引物(a-2)5′-tct cga att ctt gaa tat atg gag taa gca-3′(SEQ 1D NO3)(b-2)5′-tct cga gct caa act aga gga gct tgt taa-3′(SEQ 1D NO4)引物(a-2)含有EcoR1限制部位，而引物(b-2)含有Sac1限制部位。
实际上，PCR是在下列条件下用“DNA热循环者”(Perkin ElmerCetus公司)和Taq DNA聚合酶/TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo公司)作为反应试剂进行的。
反应物(10×)PCR缓冲剂10μl1.25mM dNTP混合物 16μl模板DNA(DNA含量小于1μM) 10μl以上所述两种引物*)(最终浓度0.25μM)各1μl
重组Taq DNA聚合酶 0.5μl无菌水 61.5μl*)当扩增ADH基因时使用引物(a-1)和(b-1)的组合，而当扩增PDC基因时使用引物(a-2)和(b-2)的组合。
将以上成分混合，并使该反应物100μl遭遇PCR。
PCR循环变性过程 94℃60秒退火过程 52℃60秒延伸过程 72℃120秒由以上过程组成的一个循环重复30个循环。
使如上所述制备的反应物10μl遭遇0.8％琼脂糖凝胶的电泳，用约1.2kb DNA片段检测ADH基因，而用1.7kb DNA片段检测PDC基因。
实施例2用来自Zymomonas mobilis的ADH基因和PDC基因制备重组棒状杆菌(A)穿梭载体的构建含有乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869(Yamaguchi，R.et al.，Agric.Biol.Chem.50，2771-2778(1986)，日本专利公报No.S58-67679)固有的质粒pAM 330的ORF1(rep)的约3.0kb HindIII-Hpal DNA片段5μl和用限制酶HindIII裂解的质粒pHSG398(Takara Shuzo公司)2μl混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲剂和1单位T4 DNA连接酶各成分，用无菌蒸馏水配成10μl，在15℃反应3小时，使之结合。
利用这样得到的质粒混合物和氯化钙法〔Journal of MolecularBiology，53，159(1970)〕，使Escherichia coli JM 109(Takara Shuzo公司)转型，并涂到含有氯霉素50mg的培养基(10g胰胨、5g酵母膏、5g NaCl、和16g琼脂溶解于1升蒸馏水中)上。
在该培养基上生长的一个菌株以通常方式在一种液体培养基中培养，从该培养基中提取质粒DNA，用一种限制酶使该质粒裂解，以确认所插入的片段。作为结果，除质粒pHSG 398的2.2kb DNA片段外，还确认了约3.0kb插入的DNA片段。
这种大肠埃希氏杆菌-棒状杆菌穿梭载体简称为pKP1。
(B)tac启动子与ADH基因和PDC基因的连接在实施例1(B)中扩增的、含有来自Zymomonas mobilis的ADH基因的约1.2kb DNA片段5μl，和含有tac启动子的质粒pTrc 99A(Pharmacia公司)2μl，分别用限制酶Sac1和Kpn1进行裂解，这些限制酶是通过在70℃处理10分钟而失活的，然后将两者合并，向其中添加由1μl T4 DNA连接酶10×缓冲剂和1单位T4 DNA连接酶组成的各成分，用无菌蒸馏水配成10μl，在15℃反应3小时，使之结合。用这作为连接溶液A。
类似地，在实施例1(B)中扩增的、含有来自Zymomonas mobilis的PDC基因的约1.7kb DNA片段5μl，和含有tac启动子的质粒pTrc99A(Pharmacia公司)2μl，分别用限制酶EcoR1和Sac1进行裂解，这些限制酶是通过在70℃处理10分钟而失活的，然后将两者合并，向其中添加由1μl T4 DNA连接酶10×缓冲剂和1单位T4 DNA连接酶组成的各成分，用无菌蒸馏水配成10μl，在15℃反应3小时，使之连接。用这作为连接溶液B。
通过使用两种连接溶液A和B中的每一种和氯化钙法〔Journal ofMolecular Biology，53，159(1970)〕，分别使Escherichia coli JM109(Takara Shuzo公司)转型并涂到含有氨苄青霉素50mg的培养基(10g胰胨、5g酵母膏、5g NaCl、和16g琼脂溶解于1升蒸馏水中)上。
在该培养基上生长的菌株每一个都在一种液体培养基中培养，从该培养基中提取质粒DNA，该质粒分别以连接溶液A用限制酶(Sac1，Kpn1)和连接溶液B用限制酶(EcoR1，Sac1)进行裂解，确认了所插入的片段。作为结果，除来自质粒pTrc 99A的约4.2kb DNA片段外，还确认了ADH基因(连接溶液A)的长度1.2kb的插入DNA片段和PDC基因(连接溶液B)的长度1.7kb的插入片段。
含有ADH基因的质粒简称为pTrc 99A-ADH，而含有PDC基因的质粒简称为pTrc 99A-PDC。
然后，为了通过使用以质粒pTrc 99A-ADH和质粒pTrc 99A-PDC作为模板的PCR法来制备其中ADH基因与tac启动子连接的DNA片段和其中PDC基因与tac启动子连接的DNA片段，利用“394 DNA/RNAsynthesizer”(Applied Biosystems公司)合成了下列每一对引物。
(a-3)5′-ctc tag atc tcc gac atc ata acg gtt ctg-3′(SEQ 1D NO5)(b-3)5′-ctt ctc tca tcc gcc aaa ca-3′(SEQ 1D NO6)此外，引物(a-3)还含有BgIII限制部位。
实际上，PCR是在下列条件下用“DNA热循环者”(Perkin ElmerCetus公司)和Taq DNA聚合酶/TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo公司)作为反应试剂进行的。
反应物(10×)PCR缓冲剂 10μl1.25mM dNTP混合物 16μl模板DNA*)(DNA含量小于1μM) 10μl以上所述引物(a-3)和(b-3)(最终浓度0.25μM) 各1μl重组Taq DNA聚合酶 0.5μl无菌水 61.5μl*)当扩增其中ADH基因与tac启动子连接的DNA片段时使用质粒pTrc 99A-ADH作为模板DNA，而当扩增其中PDC基因与tac启动子连接的DNA片段时使用质粒pTrc 99A-PDC作为模板DNA。
将以上成分混合，并使该反应物100μl遭遇PCR。
PCR循环变性过程 94℃ 60秒退火过程 52℃ 60秒延伸过程 72℃ 120秒由以上过程组成的一个循环重复30个循环。
使如上所述制备的反应物10μl遭遇到在0.8％琼脂糖凝胶上的电泳，用约1.4kb DNA片段检测连接tac启动子的ADH基因，用约1.9kbDNA片段检测连接tac启动子的PDC基因。
(C)其中ADH基因与tac启动子连接的DNA片段和其中PDC基因与tac启动子连接的DNA片段向穿梭载体中的插入在以上实施例2(B)中确认了其扩增产物的、其中PDC基因与tac启动子连接的约1.9kb DNA片段的反应物5μl，用限制酶BgIII和BamHI进行完全裂解，而在以上实施例2(A)中制备的质粒pKP1 2μl分别用限制酶BamHI进行完全裂解。通过在70℃处理10分钟使该限制酶失活之后，将两者合并，向其中添加由1μl T4 DNA连接酶10×缓冲剂和1单位T4 DNA连接酶组成的各成分，用无菌蒸馏水配成10μl，在15℃反应3小时，使之结合。
利用所得到的质粒混合物和氯化钙法〔Journal of MolecularBiology，53，159(1970)〕，使Escherichia coli JM 109(Takara Shuzo公司)转型，并涂布到含有氯霉素50mg的培养基(10g胰胨、5g酵母膏、5g NaCl、和16g琼脂溶解于1升蒸馏水中)上。
在这种培养基上生长的一个菌株用一种液体培养基培养，从该培养基中提取质粒DNA，该质粒用限制酶进行裂解，确认了所插入的片段。作为结果，除来自以上实施例2(A)中制备的质粒pKP1的约5.2kbDNA片段外，还确认了长度约1.9kb的一个插入的DNA片段。这种质粒简称为pKP1-PDC。这种质粒只有一个BamHI限制部位。
确认了其扩增产物的、其中ADH基因与tac启动子连接的约1.4kbDNA片段的反应物5μl用限制酶BgIII和BamHI进行完全裂解，而以上质粒pKP1-PDC 2μl分别用限制酶BamHI进行完全裂解。通过在70℃处理10分钟使该限制酶失活之后，将两者合并，向其中添加由1μlT4 DNA连接酶10×缓冲剂和1单位T4 DNA连接酶组成的各成分，用无菌蒸馏水配成10μl，在15℃反应3小时，使之结合。
利用所得到的质粒混合物和氯化钙法〔Journal of MolecularBiology，53，159(1970)〕，使Escherichia coli JM 109(Takara Shuzo公司)转型，并涂布到含有氯霉素50mg的培养基(10g胰胨、5g酵母膏、5g NaCl、和16g琼脂溶解于1升蒸馏水中)上。
在这种培养基上生长的一个菌株用一种液体培养基培养，从该培养基中提取质粒DNA，该质粒用限制酶进行裂解，确认了所插入的片段。作为结果，除来自以上实施例2(A)中制备的质粒pKP1的约7.1kbDNA片段外，还确认了长度约1.4kb的所插入DNA片段。
这种质粒称为pKP1-ADH(SEQ ID No7)。
(D)棒状杆菌的转型该质粒利用电脉冲法(Y.Kurusu，et al.，Agric.Biol.Chem.54443-447。1990和A.A.Vertes，et al.，Res.Microbiol.144181-185，1993)引入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032中。这样得到的一种转化体，即谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)pKP1-PDC-ADH/13032，于2000年6月6日交由国立生物科学与人类技术研究所(National Institute of Bioscience和Human Technology(1-3 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan))保藏(保藏号FERM P-17887)，然后于2001年5月31日转移到《布达佩斯条约》下设国际保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(International Patent Organism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science和Technology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan.保藏号No.FERM BP-7621)。
实施例3用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032转化体(谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)pKP1-PDC-ADH/13032)的乙醇生产由尿素40g，(NH4)2SO4140g，KH2PO45.0g，K2HPO45.0g，MgSO4·7H2O5.0g，FeSO4·7H2O200mg，MnSO4·nH2O200mg，D-生物素2000μg，硫胺素盐酸盐1000μg，酵母膏10g，酪蛋白氨基酸10g和蒸馏水10l(pH6.6)组成的一种培养基以500ml一份倾入2升锥形瓶中，在120℃灭菌15分钟，向其中添加无菌的50％葡萄糖水溶液40ml。向该培养基中接种通过引入上述pKP1-PDC-ADH质粒(pKP1-PDC-ADH/13032) 而转型的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株，并在33℃、在搅拌下培养24小时(好氧培养)。培养完成后，将其离心分离(8000g，20分钟)，以收获菌细胞。所得到菌细胞的总体积遭遇下列反应。
由(NH4)2SO423g，KH2PO40.5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O20mg，MnSO4·nH2O20mg，D-生物素200μg，硫胺素盐酸盐100μg，碳酸钠20g，蒸馏水1000ml组成的反应物500ml倾入1升广口发酵罐中，添加上述菌细胞和50％葡萄糖溶液120ml，在密封条件下(厌氧反应)、在缓慢搅拌下(200rpm)于30℃反应。2小时和4小时后，将代表性反应物离心分离(8000rpm，15分钟，4℃)，然后，这样得到的每一种上清液都进行气相色谱分析，分别表明以3.79和6.96(g乙醇/升)的浓度产生乙醇。
这些结果列于以下表1中。
表1

实施例4使用乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869转化体(pKP1-PDC-ADH/13869)的乙醇生产按照实施例2(C)的方法制备的质粒pKP1-PDC-ADH，以类似于实施例2(D)的方法那样的方式，引入乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)ATCC 13869中。所得到的转化体，即乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)pKP1-PDC-ADH/13869，于2000年6月6日交由国立生物科学与人类技术研究所(National Institute ofBioscience和Human Technology(1-3 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan))保藏(保藏号FERM P-17888)，然后于2001年5月31日转移到《布达佩斯条约》下设国际保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced IndustrialScience和Technology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan.保藏号No.FERMBP-7622)。
按照与实施例3的方法类似的方式，将所得到的棒状杆菌转化体进行好氧培养，并遭遇一种厌氧生产乙醇的反应。4小时后，反应器中乙醇的浓度是4.21(g乙醇/升)。因此，平均乙醇生产速度是1.05(g乙醇/升/小时)。
发明效果按照本发明，在厌氧条件下用ADH基因和PDC基团转型的好氧棒状杆菌的反应使得能以高产率高效率地生产乙醇。
正文中自由列出的碱基序列清单SEQ ID No1
ADH基因扩增用引物。
SEQ ID No2ADH基因扩增用引物。
SEQ ID No3PDC基因扩增用引物。
SEQ ID No4PDC基因扩增用引物。
SEQ ID No5与tac启动子连接的ADH基因扩增用引物。
SEQ ID No6与tac启动子连接的PDC基因扩增用引物。
SEQ ID No7具有与tac启动子连接的PDC基因和与tac启动子连接的ADH基因的大肠埃希氏杆菌/棒状杆菌穿梭载体。
序列表<110>地球环境产业技术研究机构<120>用重组棒状杆菌生产乙醇的方法<130>662562<150>PCT/JP01/04935<151>2001-06-12<150>JP 181625/2000<151>2000-06-16<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<223>扩增ADH基因的引物<400>tctcgagctc tgtagggtga ggttatagct 30<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<223>扩增ADH基因的引物<400>ctctggtacc tcaagacagg acggaaaacc 30<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<223>扩增PDC基因的引物<400>tctcgaattc ttgaatatat ggagtaagca 30<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<223>扩增PDC基因的引物<400>tctcgagctc aaactagagg agcttgttaa 30<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<223>扩增与tac启动子连接的ADH基因的引物<400>ctctagatct ccgacatcat aacggttctg 30<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>扩增与tac启动子连接的PDC基因的引物<400>cttctctcat ccgccaaaca 20<210>7<211>8500<212>DNA<213>人工序列<223>大肠杆菌(E.coli)/具有与tac启动子连接的PDC基因和与tac启动子连接的ADH基因的棒状杆菌穿梭载体<400>aagcttactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact 60taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac 120cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgagcttctt ccgcttcctc 180gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 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1080gatcggcacg taagaggttc caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta 1140ttttttgagt tatcgagatt ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa aaaaatcact 1200ggatatacca ccgttgatat atcccaatgg catcgtaaag aacattttga ggcatttcag 1260tcagttgctc aatgtaccta taaccagacc gttcagctgg atattacggc ctttttaaag 1320accgtaaaga aaaataagca caagttttat ccggccttta ttcacattct tgcccgcctg 1380atgaatgctc atccggaatt tcgtatggca atgaaagacg gtgagctggt gatatgggat 1440agtgttcacc cttgttacac cgttttccat gagcaaactg aaacgttttc atcgctctgg 1500agtgaatacc acgacgattt ccggcagttt ctacacatat attcgcaaga tgtggcgtgt 1560tacggtgaaa acctggccta tttccctaaa gggtttattg agaatatgtt tttcgtctca 1620gccaatccct gggtgagttt caccagtttt gatttaaacg tggccaatat ggacaacttc 1680ttcgcccccg ttttcaccat gggcaaatat tatacgcaag gcgacaaggt gctgatgccg 1740ctggcgattc aggttcatca tgccgtctgt gatggcttcc atgtcggcag aatgcttaat 1800gaattacaac agtactgcga tgagtggcag ggcggggcgt aattttttta aggcagttat 1860tggtgccctt aaacgcctgg tgctacgcct gaataagtga taataagcgg atgaatggca 1920gaaattcagc 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ccggaagaag ctccggctaa aatcgatcac gtgattaaaa 2820ctgctctcgc gaagaagaag ccggtttatc tcgaaatcgc ttgcaacatt gcttccatgc 2880cctgcgccgc tcctggaccg gcaagtgcat tgttcaatga cgaagccagc gacgaagcat 2940ccttgaatgc agcggttgac gaaaccctga aattcatcgc caaccgcgac aaagttgccg 3000tcctcgtcgg cagcaagctg cgcgctgctg gtgctgaaga agctgctgtt aaattcaccg 3060acgctttggg cggtgcagtg gctactatgg ctgctgccaa gagcttcttc ccagaagaaa 3120atccgcatta cattggtacc tcatggggcg aagtcagcta tccgggcgtt gaaaagacga 3180tgaaagaagc cgatgcggtt atcgctctgg ctcctgtctt caacgactac tccaccactg 3240gttggacgga tatccctgat cctaagaaac tggttctcgc tgaaccgcgt tctgtcgttg 3300tcagacgcat tcgcttcccc agcgttcatc tgaaagacta tctgacccgt ttggctcaga 3360aagtttccaa gaaaaccggt tctttggact tcttcaaatc cctcaatgca ggtgaactga 3420agaaagccgc tccggctgat ccgagtgctc cgttggtcaa cgcagaaatc gcccgtcagg 3480tcgaagctct tctgaccccg aacacgacgg ttattgctga aaccggtgac tcttggttca 3540atgctcagcg catgaagctc ccgaacggtg ctcgcgttga atatgaaatg cagtggggtc 3600acattggttg gtccgttcct gccgccttcg gttatgccgt cggtgctccg gaacgtcgca 3660acatcctcat ggttggtgat ggttccttcc agctgacggc tcaggaagtt gctcagatgg 3720ttcgcctgaa actgccggtt atcatcttct tgatcaataa ctatggttac accatcgaag 3780ttatgatcca tgatggtccg tacaacaaca tcaagaactg ggattatgcc ggtctgatgg 3840aagtgttcaa cggtaacggt ggttatgaca gcggtgctgc taaaggcctg aaggctaaaa 3900ccggtggcga actggcagaa gctatcaagg ttgctctggc aaacaccgac ggcccaaccc 3960tgatcgaatg cttcatcggt cgtgaagact gcactgaaga attggtcaaa tggggtaagc 4020gcgttgctgc cgccaacagc cgtaagcctg ttaacaagct cctctagttt gagctcggta 4080cccggggatc tccgacatca taacggttct ggcaaatatt ctgaaatgag ctgttgacaa 4140ttaatcatcc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa 4200acagaccatg gaattcgagc tctgtagggt gaggttatag ctatggcttc ttcaactttt 4260tatattcctt tcgtcaacga aatgggcgaa ggttcgcttg aaaaagcaat caaggatctt 4320aacggcagcg gctttaaaaa tgcgctgatc gtttctgatg ctttcatgaa caaatccggt 4380gttgtgaagc aggttgctga cctgttgaaa gcacagggta ttaattctgc tgtttatgat 4440ggcgttatgc cgaacccgac tgttaccgca gttctggaag 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权利要求
1.一种乙醇生产方法，使用一种由含有一个能表达丙酮酸脱羧酶活性的基因和希望时一个能表达醇脱氢酶活性的基因的DNA在允许该表达的调节序列下转型的棒状杆菌，其特征在于乙醇是在该转型棒状杆菌没有实质性增殖的条件下制备的。
2.一种用于权利要求1中提出的方法以使一种棒状杆菌转型的表达载体，该棒状杆菌在一种允许该表达的调节序列下插入了一种含有一个能表达丙酮酸脱羧酶活性的基因和希望时一个能表达醇脱氢酶活性的基因的DNA。
3.权利要求2中提出的表达载体，其中，该载体是质粒pKP1-PDC-ADH。
4.用权利要求2或3中提出的表达载体转型的棒状杆菌。
5.权利要求4中提出的棒状杆菌，其中，该杆菌是谷氨酸棒杆菌pKP1-PDC-ADH/13032。
6.权利要求4中提出的棒状杆菌，其中，该杆菌是乳发酵短杆菌pKP1-PDC-ADH/13869。
全文摘要
使用一种由含有一个能表达丙酮酸脱羧酶活性的基因且如果希望还含有一个能表达醇脱氢酶活性的基因的DNA在允许该表达的调节序列下转型的棒状杆菌，在这种杆菌没有实质性增殖的乙醇生产条件下，以高生产率高效率生产乙醇的方法。
文档编号C12N1/21GK1436240SQ01811146
公开日2003年8月13日 申请日期2001年6月12日 优先权日2000年6月16日
发明者汤川英明 申请人:财团法人地球环境产业技术研究机构