幽门螺旋杆菌粘附抑制剂的制作方法

专利名称：幽门螺旋杆菌粘附抑制剂的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及能够从胃中消除与消化性溃疡的发展有关的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的幽门螺旋杆菌粘附抑制剂，制备其的方法，和预防或治疗与幽门螺旋杆菌相关的消化性疾病的含这个抑制剂的药物组合物和食品。
现有技术幽门螺旋杆菌是一类螺旋形革兰氏阴性杆菌，在其一个末端具有几根鞭毛并寄居在人胃粘膜。在1983年，来自澳大利亚的Marshall，B.J.和Warren，J.R.报道了从胃炎和胃溃疡患者取样的胃活检样品可高效率地检测到这个细菌。从那时开始，很多报道连续关注这个细菌。例如流行病学研究结果报道了这个细菌引起胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡，并与如胃癌等疾病相关。
因此，目前认为幽门螺旋杆菌的根除对消化性溃疡的永久治愈是必须的。采用抗生素和胃酸分泌抑制剂的组合治疗已经广泛用作如下述的根除治疗。
一旦幽门螺旋杆菌定居到胃粘膜，它就持续寄居在胃部不被消除，尽管对感染有有力的免疫反应(即抗体效价高)。因此，在给药停止后大约一月内，患者的情况返回到治疗前(即感染状态)，除非依靠抗生素疗法完全根除幽门螺旋杆菌。由于盐酸使胃中pH水平保持很低，所以很多抗生素失效。因此，有力抑制胃酸分泌的质子泵抑制剂用于与灭菌剂(抗生素)组合来根除幽门螺旋杆菌。目前，利用三种类型试剂如阿莫西林、克拉霉素和兰索拉唑的组合治疗是日本根除幽门螺旋杆菌的标准治疗。然而，长期给予抗生素可能引起很严重的问题，如耐药菌株数量增加以及副作用。
目前，使用口服疫苗的免疫治疗方法可利用作为解决由给予抗生素根除细菌引起的副作用或耐药菌株增加的问题的方法。然而，由于实验的复杂条件，旨在建立新的预防或治疗方法的研究基本上没有发生进展。而且，给予疫苗的原理目的是预防。因此，它对已经感染幽门螺旋杆菌的患者无效。
通常，细菌首先需要粘附、繁殖和定居到宿主细胞以建立细菌感染。细菌对宿主细胞的粘附需要粘附素与宿主细胞表面的受体结合。JP10-287585(1998)公开了幽门螺旋杆菌粘附的机制。也就是，尚未阐明的粘附素是由该细菌产生的尿素酶，来自鸡蛋的抗这种尿素酶的抗体抑制胃中幽门螺旋杆菌的增生。
JP3,255,161公开了去除牛奶脂肪得到的来自乳清的粘蛋白和来自牛奶的酪蛋白可抑制消化道中幽门螺旋杆菌的定居。
然而，仍未知各种糖和蛋白褐变反应(browning reaction)的产物是否能够抑制幽门螺旋杆菌粘附素-尿素酶与胃粘膜的粘附。
发明概述本发明的一个目的是提供非常安全的可有效抑制与消化性溃疡发展有关的幽门螺旋杆菌与胃粘膜的粘附的幽门螺旋杆菌粘附抑制剂，其中这种粘附抑制剂不涉及如由常规抗生素的使用引起的副作用或耐药菌株增加的问题。
本发明检测了可抑制尿素酶粘附胃粘膜的各种物质。结果，它们发现糖和蛋白褐变反应的产物能够有效抑制作为粘附素的尿素酶与胃粘膜的粘附。这导致本发明的完成。
更特别地，本发明涉及幽门螺旋杆菌粘附抑制剂，其包括作为活性成分的糖和蛋白褐变反应的产物。本发明可以采用任何可口服摄取蛋白和任何可口服摄取还原糖。
本发明也涉及制备幽门螺旋杆菌粘附抑制剂的方法，包括在水溶液中使糖和蛋白经历褐变反应的步骤。
而且，本发明涉及制备幽门螺旋杆菌粘附抑制剂的方法，包括在水溶液中使含糖和蛋白的食品经历褐变反应的步骤。在本发明中，实施褐变反应直到糖-蛋白混合物的5％水溶液在405nm的吸光度变为至少0.01。食品不特别限定，只要它们含有糖和蛋白。其优选的实例包括生牛奶、奶粉(全奶粉)、脱脂奶粉、乳清和脱水奶(浓缩奶)。
本发明涉及幽门螺旋杆菌粘附抑制剂，包含糖和蛋白褐变反应的产物和胃酸分泌抑制剂。本发明也涉及幽门螺旋杆菌粘附抑制剂，包含糖和蛋白褐变反应的产物和能够根除幽门螺旋杆菌的其它物质。此外，本发明涉及幽门螺旋杆菌粘附抑制剂，包含糖和蛋白褐变反应的产物，胃酸分泌抑制剂和能够根除幽门螺旋杆菌的其它物质。在本发明中，术语“能够根除”是指如下作用如粘附抑制、抑制或预防增殖，和幽门螺旋杆菌体内和/或体外灭菌。
本发明也涉及预防或治疗与幽门螺旋杆菌相关的疾病的药物组合物，它包含上述幽门螺旋杆菌粘附抑制剂。此外，本发明涉及预防或改善与幽门螺旋杆菌相关的疾病的食品，它包含上述幽门螺旋杆菌粘附抑制剂。
发明详述下面将详细描述本发明。
本发明的幽门螺旋杆菌粘附抑制剂的活性成分是糖和蛋白褐变反应的产物，也就是，氨基-羰基反应的产物。可以通过在水溶液中将各种糖和各种蛋白混合和加热该化合物实施褐变反应。
在本发明中，可以使用任何可口服摄取蛋白。其实例包括但不限于来源于小麦、大麦、稻米、玉米、大豆、红豆等植物蛋白，和来源于奶、蛋、鱼、肉或等动物蛋白。其具体实例包括牛奶中含有的酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白或乳铁蛋白；小麦中含有的麦谷蛋白或白蛋白；玉米中含有的玉米蛋白；蛋中含有的卵白蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白或溶酶菌；和鱼和肉中含有的肌球蛋白或肌动蛋白。使用前可以根据常规技术纯化这些蛋白，或商业化蛋白可以无需加工使用。这些蛋白可以单独或两种或更多组合使用。可供选择地，含有这种蛋白的食物，例如含牛奶来源的蛋白的生牛奶、奶粉、脱脂奶粉、乳清或浓缩奶可以用作蛋白混合物。
用于制备褐变反应的产物的糖的实例包括各种还原糖如D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-核糖和乳糖。可以使用这些糖的纯化产物。然而当使用脱脂奶粉或乳清时，可以不另外添加牛奶来源的蛋白实施褐变反应，因为这些物质已经含有如上提及的蛋白。
糖与蛋白的质量比可以是任何水平。通常，它在1∶100和10∶1之间，并优选1∶9-1∶1。
在本发明中，可以通过如上提及在水溶液中将糖和蛋白混合来制备褐变反应的产物。可供选择地，含有糖和蛋白的食品，优选含有上面提及的量的糖和蛋白的食品，如生牛奶、奶粉、脱脂奶粉、乳清或浓缩奶，可在水溶液中在那种状态下加热，并且允许发生褐变反应得到褐变反应的产物。
脱脂奶粉含有各种牛奶蛋白，多数是酪蛋白，和糖如乳糖。通过用常规技术离心生牛奶而分离和除去脂肪和雾化所得脱脂奶可以获得脱脂奶粉。可供选择地，也可以使用商业化的脱脂奶粉。
通过从脱脂奶除去酪蛋白制备乳清，它含有糖如乳糖和乳清蛋白如β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白或乳铁蛋白。在本发明中，可以根据常规技术从牛奶中制备乳清，或商业化乳清(如浓缩物或粉剂)可以不加工使用。
在本发明中，优选在中性或碱性水溶液中实施褐变反应。可以使用各种碱性水溶液，其实例是氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠(小苏打)、碳酸钠和磷酸二钠的碱性水溶液。添加的碱浓度不特别限定。例如，可以使用0.05N至0.5N氢氧化钠。水溶液的量不特别限定，只要该溶液可均匀悬浮为糖-蛋白混合物或含糖和蛋白的食品。例如，该溶液的体积可以是混合物或食品体积的1至100倍，优选5至20倍。
实施褐变反应直到糖-蛋白混合物的5％水溶液在405nm的吸光度变为至少0.01，优选至少0.1。在405nm的吸光度至少0.01意味着褐变反应在进行。通过例如使用微板读器检测100μl 5％水溶液来确定吸光度。
当在中性水溶液中实施褐变反应时，优选反应温度至少100℃，并特别优选至少120℃。反应时间通常至少20分钟，并优选为30分钟-10小时。当在碱性水溶液中实施褐变反应时，优选反应温度室温-100℃，特别优选40℃-90℃。反应时间通常为1小时-20小时，优选为2小时-8小时。
褐变反应的产物可以不进一步加工而摄入。可供选择地，它可以接受普通技术，例如，超滤或离子交换树脂来除去未反应的糖和脱盐。通过用来选择性沉淀蛋白的常规技术，如等电沉淀、盐析或有机溶剂沉淀来沉淀褐变反应的产物。为了促进将其制备成药物组合物或添加到食品，优选用普通技术，如冷冻干燥或喷雾干燥使褐变反应的产物脱水。当在中性水溶液中实施褐变反应时，可以使该产物脱水而不进一步加工。优选，除去未反应的糖和脱盐、随后用上述技术脱水米雾化产物。当在碱性水溶液中实施褐变反应时，可以用酸(无机和/或有机酸)中和该溶液。中和后，可以使该溶液脱水而不进一步加工。可供选择地，从溶液中除去未反应的糖，可以用上述技术使溶液脱盐，随后脱水。可接着雾化产物。
本发明的褐变反应的产物优先结合幽门螺旋杆菌粘附素-尿素酶，由此抑制其与胃粘膜上受体的结合。本发明的褐变反应的产物具有根除幽门螺旋杆菌的极好能力，并且因此可以有效预防或改善与幽门螺旋杆菌相关的疾病，如消化性溃疡。而且，起始原料如糖和蛋白是食品或由食品或食品材料得到的可口服摄入的物质，在烹饪食品的加工中不断发生褐变反应。因此，本发明的褐变反应产物非常安全且不引起副作用。如果含有本发明褐变反应的产物的幽门螺旋杆菌粘附抑制剂引入药物组合物或食品，那么它们可以预防或改善与幽门螺旋杆菌相关的疾病。
可以根据制备药物的常规技术，通过产物单独或与载体或赋形剂(如填充剂或粘合剂)适当组合配制包含本发明褐变反应的产物的粘附抑制剂。可以根据需要其它添加剂或物质，例如，抗酸剂(如碳酸氢钠、碳酸镁、碳酸钙沉淀或水滑石(hydrotalcite))，胃粘膜保护剂(如合成硅酸铝、sucralfate或叶绿酸铜钠)，或消化酶(如生物淀粉酶或脂肪酶)。口服给予本发明的粘附抑制剂，剂量通常是每个成人每天0.01g至10.0g的范围(在干燥基础上)的褐变反应的产物，优选0.5g至5.0g的范围。
通过与胃酸分泌抑制剂组合使用可以增强包含本发明褐变反应的产物的粘附抑制剂的作用。可以使用的胃酸分泌抑制剂的实例包括但不限于H2阻断剂，如法莫替丁、尼扎替丁、罗沙替丁、雷尼替丁和西咪替丁，和质子泵抑制剂，如奥美拉唑、兰索拉唑和rabeprazole钠。酸还原剂的剂量根据使用的试剂类型变化。剂量通常每个成人每天10mg至50mg的范围，优选20mg至30mg的范围。
当与能够根除幽门螺旋杆菌的其它物质组合使用时，可以进一步增强本发明的粘附抑制剂根除幽门螺旋杆菌的作用。这种其它物质的实例包括能够结合幽门螺旋杆菌粘附素-尿素酶的各种抗生素、多酚、抗幽门螺旋杆菌的抗体，和多糖或糖蛋白。此外，本发明的粘附抑制剂可以与胃病的治疗剂组合，如铋剂，或杀寄生虫剂如甲硝基羟乙唑。
多酚的实例包括儿茶素、棓儿茶酸、棓儿茶酸棓酸盐、表儿茶素、表儿茶素棓酸盐、表棓儿茶酸、表棓儿茶酸棓酸盐、游离茶黄素、茶黄素单棓酸盐、茶黄素棓酸盐、白藜芦醇、原花色素、槲皮素、花色素苷、1-异硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷(sulforaphane)和异黄酮。本发明的粘附抑制剂也可以含有这种多酚。本发明的粘附抑制剂可以引入含有这种多酚的茶、食品物质如可可或水果，或其提取物。
抗幽门螺旋杆菌的抗体的实例包括抗整个细胞的抗体和抗细胞表面分子的抗体。从可利用性和增强根除的观点来看，优选来自鸡蛋的抗细胞表面分子的抗体，尤其是来自鸡蛋的抗与幽门螺旋杆菌粘附相关的尿素酶和鞭毛的抗体(JP 10-28758A(1998))。
能够结合幽门螺旋杆菌尿素酶的糖蛋白的实例包括得自哺乳动物消化道的粘蛋白、得自乳清的粘蛋白、得自鸡蛋白蛋白的粘蛋白，和这些粘蛋白组成的糖蛋白。
能够结合上述尿素酶的多糖的实例包括葡聚糖硫酸盐(Antimicrobiol Agents and Chemotherapy，44卷，9期，2492-2497页，2000)和岩藻聚糖(Gastroenteroligy，119卷，358-367页，2000)。抑制上述尿素酶活性的物质的实例是蜂胶提取物。报道了依靠超临界提取法获得的蜂胶特别有效(Medical Nutrition，2003年1月1日发行)。
抗生素的实例包括青霉素、头孢烯、大环内酯、neuquinoron和四环素抗生素。特别优选阿莫西林和克拉霉素。抗生素剂量根据使用的试剂类型变化。它们通常是每个成人每天100mg至5000mg的范围，并优选500mg至3000mg的范围。
当引入食品时，含有本发明褐变反应的产物的粘附抑制剂可以更容易地被摄入。待引入食品的本发明的褐变反应的产物的量通常是大约0.5％至10％质量，并优选1.0％至3.0％质量。这种食品如健康食品和功能食品形式的实例包括各种药物组合物如细粒、片剂、颗粒、胶囊和流体；液体食物如汤、汁、茶饮料、牛奶饮料、可可和果冻样饮料；半固体食品如布丁和酸奶；面包；点心；面条如Udon；点心如甜点、巧克力、糖果，和大米饼；和涂味品如日本furikake、黄油和果酱。优选食品包括含能够根除幽门螺旋杆菌的大量多酚、多糖或糖蛋白的物质。其具体实例包括包含含多酚的水果、茶或可可的汁、茶饮料、可可或巧克力，和包含多糖或糖蛋白的牛奶饮料和发酵牛奶饮料。
具体健康食品的褐变反应的产物的形式不特别限定，尽管优选那些可不断摄入的，如点心、干汤和饮料。而且，它们也可以制备成用于病人的食品，如低钠食品、低热量食品或低蛋白食品，或医学上使用的食品，例如汤、饮料或流体食物的形式。
此外，食品可以含有各种各种食品添加剂，如各种营养素、维生素、矿物质、食物纤维、多不饱和脂肪酸、稳定剂如分散剂或乳剂，甜味剂，矫味成分或加香剂。液体食物可以制备成这种形式。可供选择地，它们可以首先制备成粉剂或糊剂和接着溶解于给定量的水流体中。
发明的优选实施方案下面参考下列实施例，更详细地描述本发明，尽管本发明的技术范围不限于此。
实施例实施例1碱性水溶液中酪蛋白和乳糖的褐变反应如下表所示量的乳糖和酪蛋白添加到50ml试管中的10ml 0.2NNaOH水溶液中，并用混合器振荡试管直到形成均匀悬液。试管在水浴中，50℃温育4小时以促进褐变反应。0.2N HCl添加到溶液中直到pH 7.0。冷冻干燥所中和的溶液得到褐色粉末。
表1实例 乳糖酪蛋白1-1 100mg 900mg1-2 300mg 700mg1-3 400mg 600mg1-2 500mg 500mg实施例2水溶液中酪蛋白酸钠和乳糖的褐变反应乳糖(400mg)和酪蛋白酸钠(600mg)添加到50ml试管中的10ml蒸馏水中，并用混合器振荡试管以溶解这些物质。在高压锅中，120℃实施褐变反应20分钟。随后，冷冻干燥溶液得到褐色粉末。
实施例3β-乳球蛋白和和乳糖的褐变反应乳糖(400mg)和β-乳球蛋白(60mg)添加到15ml试管中的1.0ml0.2N NaOH溶液中，并用混合器振荡溶解。试管在50℃水浴中温育4小时以促进褐变反应。0.2N HCl添加到溶液中直到pH 7.0。使用Sephadex G-25(Amersham Pharmacia)通过凝胶过滤使中和溶液脱盐，接着冷冻干燥得到褐色粉末。
实施例4α-乳白蛋白和和乳糖的褐变反应乳糖(400mg)和α-乳白蛋白(60mg)添加到15ml试管中的1.0ml0.2N NaOH溶液中，并用混合器振荡溶解。试管在50℃水浴中温育4小时以促进褐变反应。以与实施例3相同的方式中和该溶液并脱盐，接着冷冻干燥得到褐色粉末。
实施例5脱脂奶粉的褐变反应奶粉(1.0g，Kyoupuro E-22，Kyodo Milk Industry Co.，Ltd.)添加到10ml 0.2N NaOH溶液中。搅拌混合物直到形成均匀悬液。该悬液在50℃水浴中温育4小时进行褐变反应。以与实施例3相同的方式中和该溶液，接着冷冻干燥得到褐色粉末。
实施例6乳清的褐变反应乳清(1.0g，Simplesse 100，CP Kelco)添加到10ml 0.2N NaOH溶液中。搅拌混合物直到形成均匀悬液。该悬液在50℃水浴中温育4小时进行褐变反应。以与实施例3相同的方式中和该溶液，接着冷冻干燥得到褐色粉末。
实施例7酪蛋白酸钠和葡萄糖的褐变反应葡萄糖(4g)和酪蛋白酸钠(6g)添加到100ml蒸馏水中，并搅拌混合物直到固体物质溶解。在高压锅中实施褐变反应，反应温度和反应时间如下表所示。使用Sephadex G-25(Amersham Pharmacia)通过凝胶过滤除去低分子量部分后，冷冻干燥残留物得到褐色粉末。
表2实例 反应温度 反应时间7-1 110℃ 30分钟7-2 120℃ 10分钟7-3 120℃ 40分钟实施例8使用碳酸氢钠的酪蛋白酸钠和乳糖的褐变反应酪蛋白酸钠(60mg)、乳糖(40mg)和碳酸氢钠(42mg)添加到1.5ml微试管中的1ml蒸馏水中并搅拌溶解。在热部件上，90℃实施褐变反应5小时。使用Sephadex G-25(Amersham Pharmacia)通过凝胶过滤使该溶液脱盐，接着冷冻干燥得到褐色粉末。
实施例9大豆蛋白的褐变反应乳糖(400mg)和大豆蛋白粉末(600mg，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)添加到50ml试管中的10.0ml 0.2N NaOH溶液中，并用混合器振荡悬浮。悬液在40℃水浴中温育5小时以促进褐变反应。0.6N HCl添加到溶液中直到pH 7.0。冷冻干燥中和溶液得到褐色粉末。
实施例10乳清白蛋白的褐变反应乳糖(400mg)和乳清白蛋白(600mg，Nisshin Pharma Inc.)添加到50ml试管中的10.0ml 0.2N NaOH溶液中，并用混合器振荡溶解。生成物在40℃水浴中温育5小时以促进褐变反应。以与实施例9相同的方式中和该溶液并冷冻干燥得到褐色粉末。
实施例11卵白蛋白的褐变反应乳糖(400mg)和卵白蛋白(600mg，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd..)添加到50ml试管中的10.0ml 0.2N NaOH溶液中，并用混合器振荡溶解。生成物在40℃水浴中温育5小时以促进褐变反应。以与实施例9相同的方式中和该溶液并冷冻干燥得到褐色粉末。
实施例12玉米蛋白和乳糖的褐变反应乳糖(400mg)和玉米蛋白(600mg，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd..)添加到50ml试管中的10.0ml 0.2N NaOH溶液中，并用混合器振荡溶解。溶液在40℃水浴中温育5小时以促进褐变反应。以与实施例9相同的方式中和该溶液并冷冻干燥得到褐色粉末。
实施例13使用磷酸二钠的酪蛋白和木糖的褐变反应木糖(40mg)和酪蛋白(60mg)添加到Eppendorf管中含0.1mol/l磷酸氢二钠的1.0ml水溶液中，并用混合器振荡悬浮。悬液在85℃热部件中温育2小时促进褐变反应。使用Sephadex G-25(AmershamPharmacia)通过凝胶过滤除去低分子量部分后，冷冻干燥残留物得到褐色粉末。
测试实施例1褐变反应进行的测定根据在405nm的吸光度来估计褐变反应的进行。
实施例1至13制备的褐变反应的产物(每种50mg)溶于1ml蒸馏水中。该溶液在10000×g下离心15分钟，向96孔板(NuncImmunoplate；Order number442404)的每孔分配每种上清100μl。使用微板读器(Versa Max，Molecular Device)，采用在650nm的吸光度作为参照波长，测定在405nm的吸光度。如表3所示，实施例制备的所有褐变反应的产物显示出0.1或更高的吸光度。这表明所有实施例中褐变反应都在充分进行。
表3
测试实施例2抑制幽门螺旋杆菌粘附的活性的测定下列体外实验估计实施例1至13的褐变反应的产物抑制幽门螺旋杆菌粘附素-尿素酶与胃粘膜的粘附的作用。幽门螺旋杆菌通过幽门螺旋杆菌粘附素-尿素酶与胃粘膜粘蛋白的特异性结合定居到宿主胃。因此，较低浓度的能够抑制幽门螺旋杆菌尿素酶和胃粘蛋白之间粘附的产物具有抑制幽门螺旋杆菌粘附的更强活性。
(材料和方法)
以下列方式制备测试中使用的尿素酶和猪胃粘蛋白。
(1)尿素酶的制备幽门螺旋杆菌#130菌株(得自Tokai university，School ofMedicine，Laboratory of Infectious Disease)在Brucella肉汤培养基中的培养溶液(3.5×108CFU/ml)在12000×g下离心20分钟。沉淀溶于纯化水中并用旋涡混合器混合该溶液60秒。再次离心该溶液，获得含尿素酶的提取物的上清。如下述实施纯化。
上面提及的提取物施加到用缓冲液(20mM磷酸盐(pH 6.8)，1mM EDTA，1mM 2-巯基乙醇和10％PEG-300)平衡的DEAE-Sephacel柱上，接着以0.5ml/分的流速吸收到凝胶。用0至0.5MKCl浓度梯度实施洗脱。监测每个分分的尿素酶活性。混合和浓缩具有尿素酶活性峰的级分。随后，浓缩物施加到用缓冲液(20mM磷酸盐(pH 6.8)和150mM NaCl)平衡的Sephacryl S-300柱上，然后洗脱。检测每个级分的尿素酶活性，并混合尿素酶活性峰，用SDS-PAGE分析。结果表明目的级分包含尿素酶A(32kDa)或尿素酶B(60kDa)蛋白。分装尿素酶并在使用前保存在-80℃。
(2)猪胃粘蛋白的制备杀死健康猪(大约2月龄)，取出它的胃，用含0.1M磷酸盐、0.15MNaCl、5mM N-乙基马来酰亚胺(NEM)、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和1mM EDTA的PBS(pH 7.4)洗涤胃的内部。切开胃，剥离粘膜，剥离的粘膜悬于上面提及的缓冲液中。使用Polytron匀浆器在冰冷下匀浆悬液。匀浆在15000×g下离心，在25000×g下再次离心这上清。回收上清，用蒸馏水透析，接着冷冻干燥得到粗纯化的胃粘蛋白。随后，脱水和粗纯化的胃粘蛋白溶于PBS(pH 6.8，含6M盐酸胍和蛋白酶抑制剂(5mM NEM、1mm PMSF和1mM EDTA))，该溶液放置于氯化铯密度梯度(1.5g/ml)上，随后在34000×g下离心48小时。用杂交硝酸纤维素膜并使用高碘酸Schiff试剂染色检测到含唾液酸的部分。混合已显色的部分并再次接受氯化铯密度梯度离心。混合染色部分并冷冻干燥。随后，使用0.1M硫酸盐缓冲液(含0.1M NaCl，pH 6.8)平衡的Sepharose CL-4B柱实施凝胶过滤，接着分部收集。混合含高蛋白水平的PAS阳性级分并用PBS(pH 6.8)透析，获得纯化的猪胃粘蛋白。生成物使用前保存在-80℃(纯化的猪胃粘蛋白)。SDS-PAGE结果发现纯化的猪胃粘蛋白由66kD糖蛋白组成。
根据常规技术生物素化纯化的猪胃粘蛋白，接着用于试验。
(3)幽门螺旋杆菌尿素酶粘附的抑制测试向96孔微板的每孔中分配含5μg/ml幽门螺旋杆菌尿素酶的0.05M碳酸钠缓冲液，每孔50μl的量，微板保存在4℃过夜以使孔吸附尿素酶。每孔用150μl含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)(pH7.0)洗涤三次，接着向其中添加150μl含3％牛血清白蛋白的PBS(pH7.0)。微板在37℃温育1小时进行封闭。除去溶液后，用150μl含0.05％Tween-20的PBS(pH7.0)洗涤孔三次。
含2.5μg/ml的生物素化猪胃粘蛋白的含0.05％Tween-20的PBS(50μl，pH4.0)和给定量的测试样品分配到每孔中，微板在37℃温育1小时以允许生物素化的猪粘蛋白吸附尿素酶。从孔中除去溶液，孔用150μl含0.05％Tween-20的PBS(pH4.0)洗涤三次。此后，微板在65℃温育10分钟固定其上的蛋白。孔用150μl含0.05％Tween-20的PBS(pH7.0)洗涤三次后，向其中添加50μl含过氧化物酶标记的链霉抗生物素的含0.05％Tween-20的PBS(pH7.0)，生成物在室温温育1小时。孔用150μl含0.05％Tween-20的PBS(pH4.0)洗涤五次，向每孔中添加含O-邻苯二胺二盐酸和H2O2的底物溶液(pH 4.5)，每孔每种50μl进行过氧化物酶反应。室温下进行反应5分钟，添加50μl 2N硫酸终止反应。在490nm测定每孔的吸光度。
基于下面的等式计算抑制粘附的活性。
抑制粘附的活性(％)＝[1-(含样品的孔的吸光度/不含样品的孔的吸光度)]×100(4)结果测定100μg/ml的实施例1至13的褐变反应的产物抑制粘附的活性。发现所有产物有效抑制幽门螺旋杆菌尿素酶和猪粘蛋白之间的粘附。结果示于表4。
表4褐变反应的产物抑制粘附的活性
测试实施例3根除幽门螺旋杆菌的体内实验(方法)用对幽门螺旋杆菌感染非常敏感的NSHr/ICR无毛小鼠(theInstitute of Animal Reproduction；登记号IAR-NHI-9710，ATCC#72024)(Clin.Diagn.Lab.Immunol.5，578-582页，1998)作为实验动物。用NSP335菌株(1×109CFU/小鼠)口服接种小鼠并饲养1周。此后，实施例5或实施例8的褐变反应的产物与饲料混合，饲料混合物供应给小鼠10周。每组的小鼠数量是6。10周后杀死每组的小鼠，取出它们的胃，取出其中的内容物。接着使用匀浆器制备悬液。采用该悬液作为检测幽门螺旋杆菌的样品。
检测幽门螺旋杆菌的培养基(Poa Media，分离幽门螺旋杆菌的培养基，Eiken Chemical Co.，Ltd.)接种悬液，用气裹方法(gas packmethod)在37℃培养所得培养基3天，计算菌落的数量，因而检测幽门螺旋杆菌。用不含褐变反应的产物的饲料喂养的组确定为对照，采用对照组平均菌落数量为100估计作用。结果示于下表5。
表5根除幽门螺旋杆菌的作用
从上面结果明显看出，给予本发明褐变反应的产物导致小鼠胃中幽门螺旋杆菌的量明显降低。而且，给予实施例5和实施例8的褐变反应的产物组的一些小鼠中没有检测到幽门螺旋杆菌。这表明本发明的褐变反应的产物具有根除幽门螺旋杆菌的极好作用。
测试实施例4根除幽门螺旋杆菌的体内实验测试了本发明褐变反应的产物、胃酸分泌抑制剂和能够根除幽门螺旋杆菌的各种物质的组合作用。
以与测试实施例3相同的方式，用实施例5的褐变反应的产物(0.25％饲料混合物)、法莫替丁(0.01％饲料混合物)、来自鸡蛋的抗幽门螺旋杆菌尿素酶抗体(0.25％饲料混合物)、来源于牛奶乳清的粘蛋白(0.25％饲料混合物)、酪蛋白酸钠(0.25％饲料混合物)、儿茶素(0.25％饲料混合物)、岩藻聚糖(0.25％饲料混合物)、奥美拉唑(0.01％饲料混合物)、克拉霉素(0.1％饲料混合物)、阿莫西林(0.1％饲料混合物)、硫酸葡聚糖(0.25％饲料混合物)、蜂胶提取物(0.25％饲料混合物)或超临界流体提取物蜂胶(0.25％饲料混合物)中之一喂养感染幽门螺旋杆菌的小鼠。可供选择地，用褐变反应的产物与任何上面提及物质组合喂养它们。10周后检测小鼠胃中的幽门螺旋杆菌。结果，与单独给予本发明的褐变反应的产物得到的相比较，单独给予任何上面的物质产生的根除率增加。结果示于表6。
表6
下文给出含本发明褐变反应的产物的药物组合物的实施例和含本发明褐变反应的产物的食品。
实施例14干汤以如下述方式，制备具有下列组成的干汤。
肉提取物、洋葱提取物、胡萝卜糊、sea tangle提取物、盐和鲜味剂混合，接着使用搅拌器搅拌。加入乳化剂，搅拌生成物。随后，加入褐变反应的产物和很好打匀的鸡蛋，接着混合。最后，添加调味剂(spice)，并搅拌混合。冷冻干燥生成物得到干汤。
本发明褐变反应的产物 23鸡蛋 26肉提取物 5洋葱提取物 17胡萝卜糊 21sea tangle提取物 1乳化剂 1盐 2调味剂(红辣椒) 2鲜味剂(如氨基酸) 2总量 100(质量％)实施例15细粒用湿制粒技术制备具有下列成分的细粒。
本发明褐变反应的产物 45乳糖(赋形剂) 35玉米淀粉 15聚乙烯吡咯烷酮PVP(K-30) 5总量 100(质量％)
实施例16医学流体食物制备具有下列成分的医学流体食物(200ml/袋)。
矿物质、磷酸钠和磷酸钾添加到少量水中，并搅拌混合物。向其中添加褐变反应的产物、麦芽糖糊精、酪蛋白酸钠和乳化剂、牛奶蛋白和少量水，所得混合物加热至大约50℃，随后搅拌。上面提及的物质悬浮后，溶液冷却至室温，添加菜籽油、维生素、调味剂、稳定剂和剩余的水得到含褐变反应的产物的医学流体食物。
本发明褐变反应的产物 3.6麦芽糖糊精38.0酪蛋白酸钠13.0菜籽油12.0维生素1.0矿物质1.5乳化剂0.2牛奶蛋白 10.3磷酸钠1.8磷酸钾1.2调味剂0.5稳定剂(carragheenan) 1.5水余量总量 100(重量％)实施例17片剂用常规湿压缩技术获得片剂。
本发明褐变反应的产物 40.0D-甘露糖醇20.0
乳糖 20.0晶体纤维素10.0羟丙基纤维素 5.0柠檬酸5.0总量 100(质量％)实施例18茶饮料以下述方式，制备具有下列成分的茶饮料(绿茶和乌龙茶)。
使3g绿茶在100ml水中85℃浸泡5分钟来制备绿茶提取物。或者，使4g乌龙茶在100ml水中95℃浸泡5分钟来制备乌龙茶提取物。绿茶提取物或乌龙茶提取物与其五倍体积的褐变反应的产物混合，并搅拌混合物。褐变反应的产物变悬浮后，添加剩余茶提取物得到含褐变反应的产物的茶饮料。
本发明褐变反应的产物 1绿茶提取物99总量 100(质量％)实施例19可可饮料制备具有下列组分的可可饮料。
可可(Morinaga Milk Industry Co.，Ltd.)添加到褐变反应的产物中，并搅拌混合物。向其中添加褐变反应的产物的五倍体积的热水(大约80℃)，随后搅拌为悬液。获得悬液后，添加剩余的热水和奶得到可可饮料。
本发明褐变反应的产物 5可可 5牛奶 20水70
总量 100(质量％)实施例20咖啡饮料制备具有下列组成的咖啡饮料。
在100ml水中，95℃提取咖啡沉渣(6g)1分钟来制备咖啡提取物。添加褐变反应的产物体积的五倍的咖啡提取物和糖，混合物搅拌为悬液。添加剩余咖啡提取物和牛奶得到含褐变反应的产物的咖啡饮料。
本发明褐变反应的产物 2糖 1牛奶 30咖啡提取物 67总量 100(质量％)实施例21香蕉奶昔(milk shake)制备具有下列组成的香蕉奶昔。
褐变反应的产物、牛奶和香蕉放置于家庭混合器中制成悬液。最后，添加维生素C得到含褐变反应的产物的香蕉奶昔。
本发明褐变反应的产物 2维生素C 0.5牛奶 40香蕉 57.5总量 100(质量％)实施例22Furikake制备具有下列组成的Furikake。
本发明褐变反应的产物 40调味干燥狐鲣片(bonito flakes)25调味白芝麻 20调味海藻 10维生素E 5总量 100(质量％)实施例23发酵牛奶饮料含乳酸菌的发酵牛奶(25g，Yakult)添加5g本发明的褐变反应的产物，接着在其中悬浮。悬浮后，添加70g含乳酸菌的发酵牛奶得到含褐变反应的产物的发酵牛奶饮料。
实施例24牛奶饮料牛奶(25g)添加5g本发明的褐变反应的产物进行悬浮。获得悬液后，添加70g牛奶得到含褐变反应的产物的牛奶饮料。
工业实用性本发明提供了具有根除幽门螺旋杆菌的很好活性的幽门螺旋杆菌粘附抑制剂，它非常安全，并且没有副作用。不象常规抗生素，本发明的粘附抑制剂可特异性根除胃中幽门螺旋杆菌，没有耐药菌株数量增加的问题。因此，本发明的幽门螺旋杆菌粘附抑制剂和含其的药物组合物和食品可有效预防和改善与幽门螺旋杆菌相关的疾病，如消化性溃疡。
权利要求
1.幽门螺旋杆菌粘附抑制剂，其包含作为活性成分的糖和蛋白的褐变反应的产物。
2.根据权利要求1的幽门螺旋杆菌粘附抑制剂，其中所述的蛋白是选自来源于小麦、大麦、稻米、玉米、大豆或红豆的植物蛋白，和来源于奶、蛋、鱼或肉的动物蛋白组成的组的至少一个成员。
3.根据权利要求1或2的幽门螺旋杆菌粘附抑制剂，其中所述的糖是选自D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-核糖和乳糖组成的组的至少一个成员。
4.制备幽门螺旋杆菌粘附抑制剂的方法，包括在水溶液中使糖和蛋白经历褐变反应的步骤。
5.制备幽门螺旋杆菌粘附抑制剂的方法，包括在水溶液中使含糖和蛋白的食品经历褐变反应的步骤。
6.根据权利要求4或5的方法，其中所述的蛋白是选自来源于小麦、大麦、稻米、玉米、大豆或红豆的植物蛋白和来源于奶、蛋、鱼或肉的动物蛋白组成的组的至少一个成员。
7.根据权利要求4或5的方法，其中所述的糖是选自D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-核糖和乳糖组成的组的至少一个成员。
8.根据权利要求5的方法，其中所述的食品是生牛奶、奶粉、脱脂奶粉、乳清或浓缩奶。
9.根据权利要求4至8任一项的方法，其中实施褐变反应直到5％水溶液在405nm的吸光度变为至少0.01。
10.幽门螺旋杆菌粘附抑制剂，其包含糖和蛋白的褐变反应的产物和胃酸分泌抑制剂。
11.幽门螺旋杆菌粘附抑制剂，其包含糖和蛋白的褐变反应的产物和能够根除幽门螺旋杆菌的其它物质。
12.根据权利要求11的粘附抑制剂，其中所述的物质是选自能够结合幽门螺旋杆菌粘附素-尿素酶的多酚、抗生素、抗幽门螺旋杆菌的抗体和多糖或糖蛋白组成的组的至少一个成员。
13.预防或治疗与幽门螺旋杆菌相关的疾病的药物组合物，包含根据权利要求1至3和权利要求10至12任一项的幽门螺旋杆菌粘附抑制剂。
14.预防或改善与幽门螺旋杆菌相关的疾病的食品，包含根据权利要求1至3和权利要求10至12任一项的幽门螺旋杆菌粘附抑制剂。
全文摘要
本发明涉及能够从胃中根除与消化性溃疡发病相关的幽门螺旋杆菌的幽门螺旋杆菌粘附抑制剂，制备其的方法，和包含这种幽门螺旋杆菌粘附抑制剂的预防或治疗与幽门螺旋杆菌相关的疾病的药物和食品。本发明的幽门螺旋杆菌粘附抑制剂具有根除幽门螺旋杆菌的极好活性并且非常安全。因此，包含其的药物组合物和食品可非常有效治疗或预防上面提及的疾病。
文档编号A23C9/152GK1638787SQ0380443
公开日2005年7月13日 申请日期2003年1月27日 优先权日2002年1月28日
发明者平本茂, 森下由朗, 木村修武, 儿玉义胜 申请人:日清药业股份有限公司, 株式会社源