专利名称：作为心血管病的标志和治疗靶的il1rl－1的制作方法
技术领域：
本发明涉及诊断和治疗心血管疾病的方法和组合物。更特别地，本发明涉及可用于治疗心血管疾病的分离的分子，所述心血管疾病包括心脏肥大，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭。
背景技术：
在发达国家中，尽管在心血管疾病的治疗上已经取得了很大进展，但是心血管疾病仍然是疾病和死亡的最常见的原因。因此，心血管疾病如心肌梗塞和中风的预防和治疗已经成为主要为公共健康服务的一个重要领域。目前已经认识到了几个心血管疾病发病的危险因素，并且已经在临床上广泛用于发现高危患者。这种筛选检查包括评估总的和HDL胆固醇水平。但是，许多明显是低度到中度危险的患者也会发生心血管疾病，而辨别这类患者的能力还非常有限。而且，累积数据表明在不同的患者人群中，对具有患心血管疾病危险的患者和已患有心血管疾病的患者进行的预防性和治疗性治疗的有益效果的程度也有所不同。然而，目前还缺乏用于确定某种治疗效果较好还是效果较差的诊断性检测数据。
发明简述本发明提供了用于诊断和治疗心血管疾病的方法和组合物。更特别地，本发明识别了基因，当心脏细胞受到机械诱导而变形的时候该基因在细胞中受到正调控。基于这个发现，本发明的分子可用于治疗心血管(包括血管)疾病，包括心脏肥大，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭。
除此之外，还提供了使用这些分子诊断任何上述心血管(血管)疾病的方法。
还进一步提供了用于制备治疗上述疾病的治疗剂的组合物。
因此本发明在几个方面包括了多肽，编码这些多肽的分离核酸，上述分子的功能性修饰物和变体，上述分子的有用片段，以及相关的治疗方法和诊断方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种诊断由核酸分子的异常表达及其表达产物的异常(或上述分子的独特片段的异常)表征的疾病的方法。该方法包括使来自患者的生物样品与试剂接触，所述试剂特异地与所述核酸分子，其表达产物，或者其表达产物的片段结合，检测所结合试剂的量，由此确定所述核酸分子的表达或者其表达产物是否有异常，表达有异常即诊断为疾病，其中所述核酸分子为白介素1受体样1(IL1RL-1，也称为T1/ST2，ST2，和Fit-1，SEQ ID NO1和2是可溶形式，SEQ ID NO3和4是膜结合形式)。术语IL1RL-1，T1/ST2，ST2和Fit-1在本说明书中可以互换使用。在一些实施方案中，所述疾病是选自下组的心血管疾病心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭。在一个实施方案中，所述疾病是心脏肥大。在另一个实施方案中，所述疾病是心力衰竭。在特定的实施方案中，生物样品包括生物活组织切片样品，以及生物流体例如血液/血清。
根据本发明的另一个方面，提供了确定患者的心血管疾病阶段(例如退化，发展或者发作)的方法，其中所述阶段由核酸分子的异常表达及其表达产物的异常(或上述分子的特定片段的异常)表征。所述方法包括监控患者样品的选自下组的参数(i)IL1RL-1核酸分子(或其独特片段)，(ii)由IL1RL-1核酸编码的多肽，(iii)由该多肽衍生的肽(或其独特片段)，以及(iv)可选择性结合所述多肽或肽(或其独特片段)的抗体，这些参数可以确定患者的所述心血管疾病(例如退化，发展或者发作)所处的阶段。在一些实施方案中，所述样品是任何前述实施方案中所述的生物流体或是组织。在特定的实施方案中，监控的步骤包括使所述样品与一种选自下组的可检测到的试剂接触(a)可在严谨条件下与(i)所述核酸分子选择性杂交的分离的核酸分子，(b)可选择性地与(ii)所述多肽，或者(iii)所述的肽结合的抗体，以及(c)可选择性地与(iv)的抗体结合的多肽或肽。所述抗体，多肽，肽，或核酸都可以用可检测到的标记例如放射性标记或酶进行标记。在另一个实施方案中，所述方法包括监控(检测)样品中的肽。在另一个实施方案中，对样品的监控持续一段时间。
根据本发明的一个方面，提供了一种试剂盒。所述试剂盒包括容器，其中含有可以选择性地与任何上述IL1RL-1分离核酸，或其表达产物结合的试剂，以及对照，用于与所述试剂与任意上述分离核酸或其表达产物的结合的测量值进行比较。在一些实施方案中，用于与测量值进行比较的对照具有预先确定的值。在特定的实施方案中，对照包括任意上述分离核酸的表达产物的表位。
根据本发明的一个方面，提供了一种治疗心血管疾病的方法。所述方法包括给需要这种治疗的患者施用有效量的可治疗心血管疾病的IL1RL-1分子。在特定的实施方案中，所述心血管疾病选自心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭。在一些实施方案中，所述方法进一步包括同时给予选自下组的制剂抗炎制剂，抗血栓形成制剂，抗血小板制剂，纤维蛋白溶解剂，降脂剂，直接凝血酶抑制剂，糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂，能与细胞粘附分子结合并能抑制白细胞与这些分子接触的能力的制剂，钙通道阻断剂，β-肾上腺素受体阻断剂，环氧合酶-2抑制剂，或者血管紧张素系统抑制剂。
根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗心脏肥大的方法。所述方法包括给需要这种治疗的患者施用有效量的可治疗患者的心脏肥大的制剂以增加IL1RL-1核酸分子或者其表达产物的表达。
根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗患者以减少患者发生心血管疾病的危险性的方法。所述方法包括给IL1RL-1分子表达水平异常的患者施用有效量的能减少心血管疾病危险性，或者降低患者在未来发生心血管疾病的危险性的制剂，其中所述制剂是抗炎制剂，抗血栓形成制剂，抗血小板制剂，纤维蛋白溶解剂，降脂剂，直接凝血酶抑制剂，糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂，能与细胞粘附分子结合并能抑制白细胞与这些分子接触的能力的制剂，钙通道阻断剂，β-肾上腺素受体阻断剂，环氧合酶-2抑制剂，或者血管紧张素系统抑制剂。在特定的实施方案中，所述患者没有需要用所述制剂治疗的其它症状。
根据本发明的一个方面，提供了一种鉴定可用于治疗心血管疾病的候选试剂的方法。所述方法包括在不存在候选试剂的条件下测定心脏细胞或组织中IL1RL-1分子的表达，其中所述心脏细胞或组织中IL1RL-1分子的为第一种表达量，使所述心脏细胞或组织与候选试剂接触，测定所述IL1RL-1分子表达的检测量，其中在存在候选试剂的条件下表达的检测量与第一种表达量相比有所降低，表明该候选试剂可用于治疗心血管疾病。在重要的实施方案中，IL1RL-1分子是任一个SEQ ID NO1-4所述的分子。在特定的实施方案中，所述心血管疾病选自心脏肥大(例如非适应性肥大)，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭。
根据本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物。所述药物组合物包括一种试剂，所述试剂包括制药有效量的可治疗心血管疾病的IL1RL-1分离核酸分子(SEQ ID NO1或3)，或其表达产物(例如SEQ ID NO2或4)，以及药学可接受的载体。在特定的实施方案中，所述心血管疾病选自心脏肥大，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭。
根据本发明的再一方面，还提供了制备用于治疗心血管疾病的药物的方法。所述药物优选包括有效量的至少一种上述分子或组合物。
根据本发明的另一个方面，提供了固相核酸分子阵列。所述阵列基本由一组核酸分子，其表达产物，或其片段(核酸片段或者多肽分子片段)组成，其中至少一种IL1RL-1分子(包括其表达产物，或其片段)固定于固相底物之上。在一些实施方案中，固相阵列进一步包括至少一种对照核酸分子。
在特定的实施方案中，所述固相底物包括选自下组的物质玻璃，硅，硅酸铝，硅酸硼，金属氧化物例如氧化铝和氧化镍，各种粘土，硝化纤维素，和尼龙。优选所述底物是玻璃。在一些实施方案中，所述核酸分子通过共价结合固定于固体底物之上。
根据本发明的另一个方面，提供了评价患者在用能减少心血管疾病危险性的试剂进行的治疗中获益的可能性的方法。在重要的实施方案中，所述试剂选自抗炎制剂，抗血栓形成制剂，抗血小板制剂，纤维蛋白溶解剂，降脂剂，直接凝血酶抑制剂，糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂，能与细胞粘附分子结合并能抑制白细胞与这些分子接触的能力的制剂，钙通道阻断剂，β-肾上腺素受体阻断剂，环氧合酶-2抑制剂，或者血管紧张素系统抑制剂。所述方法包括获得患者的IL1RL-1分子水平，将所述IL1RL-1分子水平与心血管疾病诊断特异性的预定值相比较。所述IL1RL-1分子水平与预定值的比较可以表明患者是否通过用所述试剂进行的治疗而获益。在特定的实施方案中，心血管疾病诊断特异性的预定值是多个预定标记物水平范围，所述的比较步骤包括确定所述患者的水平落在哪个预定标记物水平范围中。所述心血管疾病可以是选自心脏肥大，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭中的疾病。
本发明的另一个方面提供了一种预测心血管疾病结果的方法。所述方法包括获得患者的IL1RL-1分子水平，将所述IL1RL-1分子水平与心血管疾病的预测结果特异性的预定值相比较。所述IL1RL-1分子水平与预定值的比较可以表明患者是会具有好的/正的结果还是会具有坏的/负的结果。在一些实施方案中高水平的IL1RL-1分子可能表示负的结果，而低水平可能表示正的结果。在特定的实施方案中，心血管疾病的预测结果特异性的预定值是多个预定标记物水平范围，所述的比较步骤包括确定所述患者的水平落在哪个预定标记物水平范围中。所述心血管疾病可以是选自心脏肥大，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭中的疾病。
IL1RL-1分子的任何序列都可以用于本发明的任何方面和任何实施方案中。例如，除了如SEQ ID NO1和3所述的核苷酸序列之外，还包括如SEQ ID NO5和7所述的核苷酸序列。除了包括如SEQ ID NO2和4所述的预测氨基酸序列之外，还包括如SEQ ID NO6和8所述的预测氨基酸序列。
本发明的这些方面和其他方面将通过发明详述来进一步详细描述。
序列简述SEQ ID NO1是人IL1RL1(可溶的)cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO2是人IL1RL1(可溶的)cDNA(SEQ ID NO1)的翻译产物的预测氨基酸序列。
SEQ ID NO3是人IL1RL1(膜结合的)cDNA的核苷酸序列SEQ ID NO4是人IL1RL1(膜结合的)(SEQ ID NO3)的翻译产物的预测氨基酸序列。
SEQ ID NO5是鼠Fit-1S cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO6是鼠Fit-1S cDNA(SEQ ID NO5)的翻译产物的预测氨基酸序列。
SEQ ID NO7是鼠Fit-1M cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO8是鼠Fit-1M cDNA(SEQ ID NO7)的翻译产物的预测氨基酸序列。
附图简述
图1是Northern Blot结果，显示了经过一段时间以后8％周期性机械应变对于培养的心肌细胞中Fit-1的表达的影响。
图2是Northern Blot结果，显示了经过一段时间以后，8％周期性机械应变，血管紧张素受体的阻断，血管紧张素II，IL-1b，和佛波酯对于培养的心肌细胞中IL1RL-1的表达的影响。
图3是Northern Blot结果，显示了经过一段时间以后，8％周期性机械应变，过氧化氢，和TIRON对于培养的心肌细胞中IL1RL-1的表达的影响。
图4是Northern Blot结果，显示了经过一段时间以后，在心肌细胞发生8％周期性机械应变的过程中，放线菌素D和环己亚胺对于IL1RL-1表达的诱导的影响。
图5是Northern Blot结果，显示了经过一段时间以后，8％周期性机械力单独，或与IL-1b一起，以及在没有机械应变的条件下的佛波酯，对于IL1RL-1的表达的影响。
图6是Northern Blot结果，显示了经过一段时间以后，8％周期性机械应变对于培养的心肌细胞中空泡型ATP酶的表达的影响。
图7显示了本发明的试剂盒的外形特征。
图8显示了心肌细胞中机械应变对T2/ST2的mRNA诱导的早期(左)和晚期(右)阶段。3小时达到最大诱导量，维持9小时，然后经15小时下降。顶部组为T1/ST2 RNA；底部组为溴化乙锭。无应变为没有机械应变。
图9显示了通过机械应变(8％)，白介素-1(10ng/ml)和佛波酯(PMA，200nM)在1小时和3小时对T1/ST2的mRNA的诱导。PMA＞机械应变＞IL-1。顶部组为T1/ST2 mRNA，底部组为溴化乙锭。
图10显示了T1/ST2可能是在心肌细胞中IL1/IL-受体信号传导中由NF-kB的激活诱导的一种基因。IL-1和机械应变在用对照腺病毒感染的条件下诱导T1/ST2 mRNA(左)。在被IB腺病毒感染的条件下(右)会降低NF-B DNA的结合活性，IL-1对T1/ST2的诱导被阻断。机械应变对T1/ST2的诱导被IB腺病毒感染部分阻断，表明机械应变还通过另一种途径诱导T1/ST2。顶部组为T1/ST2 mRNA，底部组为溴化乙锭。
图11显示了小鼠心肌梗塞后TI/ST2蛋白的表达，在梗塞后1天和3天进行免疫组化分析。40倍放大。
图12以图解方式显示了人患者心肌梗塞后体循环中的ST2蛋白水平；a.在心肌梗塞后1天与14天和90天相比ST2蛋白显著增加；b.线性回归分析证明了在心肌梗塞后1天循环ST2蛋白和肌酸激酶之间有显著的正相关关系(p＜0.001)。Log ST2＝0.454(log CK)-1.07；c.心肌梗塞后1天循环ST2蛋白水平和和射血分数的四分位值分析。较低的射血分数伴随着较高的ST2蛋白。
图13显示了在随访的30天内，ST2基准水平的升高表示较高的死亡率。(对数秩，p＝0.0009)。
发明详述本发明涉及多个基因的发现，当心脏细胞受到机械诱导发生应变变形的时候所述基因在细胞中受到正调控。由于这个发现，本发明的分子可以用于治疗心血管疾病，包括心脏肥大，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和/或心力衰竭。
除此之外，还提供了使用这些分子诊断任何上述心血管疾病的方法。
进一步，还提供了用于制备治疗上述疾病的治疗剂的组合物。
这里所述的“正调控”是指提高基因和/或它所编码的多肽的表达。“提高表达”是指提高本发明的任何一种核酸(IL1RL-1，SEQ ID NO1，3)的复制、转录、和/或翻译(即达到可检测的水平)，这些过程的任何一种受到正调控都会导致该基因(核酸)编码的多肽的浓度/量的增加。相反地，这里所述的“负调控”或“降低表达”是指降低基因和/或它所编码的蛋白的表达。基因表达的正调控或负调控可以直接根据分别检测所述基因的mRNA水平，或所述基因编码的多肽的蛋白表达水平的升高或降低确定，检测可以用所属领域已知的任何适当的方法，例如分别用核酸杂交或抗体检测方法，并与对照相比较。
这里所说的“心脏细胞”是指心肌细胞。
这里所说的“分子”包括“核酸”和“多肽”两者。
这里所说的“表达”指核酸和/或多肽表达。
这里所说的“患者”指哺乳动物或非人的哺乳动物。在所有的实施方案中，人核酸，多肽，以及人患者都是优选的。用人分子和其它文献所述的鼠分子得到的结果预示着用其它同源序列也可以得到这样的结果。
通常，同源序列和等位基因与本发明的人序列具有至少80％的核苷酸相同性和/或至少85％的氨基酸相同性。进一步，同源序列和等位基因可以与人序列分别具有至少90％，95％，或甚至99％的核苷酸相同性和/或至少95％，98％，或者甚至99％的氨基酸相同性。同源性可以用NCBI(Bethesda，Maryland)提供的各种公开软件计算。实例包括Altschul SF等的启发式算法(JMol Biol，1990，215403-410)，也称为BLAST。可以用公共软件(EMBL，Heidelberg，Germany)和商业软件(例如OxfordMolecular Group/Genetics Computer Group，Madison，WI，Accelrys，Inc.，San Diego，CA的Mac Vector序列分析软件)进行Pairwiseand ClustalW对准排列(BLOSUM30矩阵设置)。本发明还包括上述核酸的Watson-Crick互补序列。
在筛选相关基因，例如本文所述的序列的同源序列和等位基因的时候，可以在严谨条件下进行Southern blot，并使用探针。这里所说的术语“严谨条件”是指所属领域所熟悉的参数。对于核酸来说，严谨杂交条件通常是指条件为低离子强度，温度低于DNA杂交复合物的熔解温度(Tm)(通常是比杂交的Tm低3℃)。较高的严谨条件有助于使探针序列和靶之间具有更高的特异性。核酸杂交的严谨条件是所属领域熟知的，可以在描述此方法的文献中找到，例如，Molecular CloningA Laboratory Manual，J.Sambrook，et al.，eds.，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，或者Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel，et al.，eds.，John Wiley & Sons，Inc.，New York。“高度严谨条件”的一个实例是65℃，6×SSC。高度严谨条件的另一个实例是在65℃杂交，杂交缓冲液由3.5×SSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清清蛋白，2.5mM NaH2PO4[pH7]，0.5％SDS，2mMEDTA组成。(SSC是0.015M氯化钠/0.15M柠檬酸钠，pH7；SDS是十二烷基磺酸钠；EDTA是乙二胺四乙酸)。杂交后，将DNA转移膜上，在室温用2×SSC洗涤，然后用0.1×SSC/0.1×SDS洗涤直至温度达到68℃。在另一个例子中，可用甲酰胺杂交溶液代替杂交水溶液。这时严谨杂交条件可以是，例如50％甲酰胺溶液，42℃。还可以使用其他条件，试剂等，也可以达到类似的严谨程度。所属领域技术人员熟知这些条件，因此这里不再描述。应当认识到，所属领域技术人员能够控制条件使得可以清楚地鉴定本发明的IL1RL-1核酸的同源序列和等位基因。所属领域技术人员还熟知筛选细胞的方法，表达这些分子文库，然后从文库中分离出相关核酸分子并测序。
根据本发明给出的全长人和鼠cDNA的克隆，可以用标准菌落杂交技术从cDNA文库中分离出其它哺乳动物序列例如与相关人和鼠核酸相应的(小鼠，牛等的)cDNA，还可以用同源性搜索进行识别，例如用这里描述的任何算法或所属领域已知的算法在GenBank中搜索。例如GenBank序列号Y07519.1和D13695.1是小鼠IL1RL-1的同源序列，在本发明的各个方面都可以和本发明的同源鼠序列互换使用，而不背离本发明的精神。
相应这里所说的核酸，术语“分离的”意思是(i)在体外通过例如聚合酶链式反应(PCR)扩增；(ii)通过克隆产生重组体；(iii)通过切割和凝胶分离进行纯化；或者(iv)通过例如化学合成进行合成。分离的核酸可以容易地通过所属领域熟知的重组DNA技术获得。因此，在其5’和3’端的限制性位点已知的，或者已公开了其聚合酶链式反应(PCR)的引物序列的载体中所含有的核苷酸序列被认为是分离的，但是以天然状态存在的或是存在于其天然宿主中的核酸序列则不是分离的。分离的核酸可以被纯化，但是不需要纯化。例如在克隆或表达载体内的分离的核酸是不纯的，因为在细胞内它可能只包含微量的物质。但是这样的核酸如本文所用的术语一样是分离的，因为它可以很容易用所属领域普通技术人员所公知的标准技术获得。
根据本发明，本发明的任何上述IL1RL-1核酸的表达，包括上述序列的独特片段，可以用不同的方法确定。这里所说的相关核酸的“独特片段”是指较大核酸的“特征片段”。例如，独特片段应足够长，以确保它的精确序列在人基因组中除上述定义的每一个核酸之外都不存在。所属领域普通技术人员仅用常规实验就可以确定一个片段在人基因组中是否是独特的。但是，独特片段不包括完全由本申请的申请日之前公开的核苷酸序列组成的片段。
独特片段可以用作Southern和Northern blot检测的探针，以识别核酸，或者可以用于扩增检测例如使用PCR进行的检测。如所属领域技术人员所知，优选使用大的探针如200，250，300个或更多个核苷酸用于特定用途如Southern和Northern blots，而优选使用较小的片段用作其它用途如PCR。独特片段也可以用于产生融合蛋白以生成抗体，或者结合多肽片段，或者生成免疫检测成分。同样地，独特片段可以用于产生非融合片段，例如IL1RL-1多肽，它可用于，例如抗体的制备，免疫检测或治疗。独特片段进一步可用作反义分子，以分别抑制上述核酸和多肽的表达。
所属领域技术人员应当认识到，独特片段的大小取决于它们在遗传密码上的保守性。因此，SEQ ID NO1，和3及其互补序列的一些区域的独特片段较长，而其它序列的独特片段较短，一般是12到32个核苷酸长(例如12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31和32个碱基)或者更多，直至每个公开的序列的全长。如上所述，本发明公开了每个序列的每一个片段，从第一个核苷酸，第二个核苷酸等等开始，直至离末端8个核苷酸，以每个序列的第8位，第9位，第10位核苷酸等等之后的任一个结束，直至最后一个核苷酸，(该序列如上所述是独特的)。例如，事实上SEQ ID NO1从第1个核苷酸到第1357个核苷酸区域，或者SEQ ID NO3从第1个核苷酸到第2058个核苷酸区域的任何片段，或其具有20个或更多个核苷酸的互补序列都是独特的。所属领域技术人员熟知选择这种序列的方法，典型地是基于独特片段能将所感兴趣的序列选择性地与人基因组中的其它序列区分开。将片段序列与已知数据库中的序列相比较就足够了，虽然还可以在体外进行验证性的杂交和测序分析。
本发明的特定方面包括选择性地与编码多肽的核酸分子结合以降低该多肽活性的反义寡核苷酸。
这里所说的“反义分子”，“反义寡核苷酸”，和“反义”所描述的寡核苷酸是寡核糖核苷酸，寡脱氧核糖核苷酸，修饰的寡核糖核苷酸，或者修饰的寡脱氧核糖核苷酸，它们可在生理条件下与含有特定基因的DNA或该基因的转录mRNA杂交，从而抑制该基因的转录和/或抑制该mRNA的翻译。反义分子应能通过与靶基因或其转录产物杂交从而干扰靶基因的转录或翻译。所属领域技术人员应当认识到反义寡核苷酸的确切长度以及它与靶互补的程度取决于所选择的特定靶，包括靶的序列以及组成该序列的特定碱基。优选反义寡核苷酸的组成和排布使其能够在生理条件下选择性地与靶结合，即在生理条件下相对于靶细胞中的其它序列更多地是与靶序列结合。基于SEQ ID NO1，和3，或等位基因或同源染色体和/或cDNA序列，所属领域技术人员可以很容易选择并合成可用于本发明的任何适当的反义分子。要达到足够的选择性和抑制能力，反义寡核苷酸应当包括至少10个，更优选地至少15个与靶互补的连续碱基，虽然在特定的条件下，长度为7个碱基的修饰寡核苷酸也可成功用于反义寡核苷酸(Wagner et al.，Nat.Med，1995，1(11)1116-1118；Nat.Biotech.，1996，14840-844)。最优选地，反义寡核苷酸含有20-30个碱基的互补序列。
虽然寡核苷酸可以是基因或mRNA转录物的任何区域的反义物，在优选的实施方案中，反义寡核苷酸相应于N末端或者5’上游位点，例如翻译起始，转录起始或者启动子位点。除此之外，反义寡核苷酸也可以靶定3’未翻译区域。在所属领域中，也可以靶定mRNA剪接位点，但是如果存在其它的mRNA剪接则不倾向于使用这种方式。除此之外，反义物优选靶定不影响mRNA二级结构的位点(参见，例如，Sainio et al.，Cell Mol.Neurobiol.14(5)439-457，1994)和不与蛋白质结合的位点。最后，虽然SEQ IDNO1和3，公开了cDNA序列，所属领域普通技术人员可以很容易获得上述序列的基因组DNA序列。因此，本发明还提供了与SEQ ID NO1和3相应的基因组DNA互补的反义寡核苷酸。类似地，无需过度的实验就可以获得其等位基因或者同源的人cDNA和基因组DNA的反义物。
本发明的寡核苷酸可以包括RNAi分子。RNA干扰或者说“RNAi”包括使用双链RNA(dsRNA)阻断基因表达(参见，例如Sui，G，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.995515-5520，2002)。本发明的实施方案中使用的RNAi策略方法是所属领域普通技术人员公知的。
在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸可以由“天然的”脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，或其任意组合组成。也就是说一个天然核苷酸的5’端和另一个天然核苷酸的3’端可以通过核苷间的磷酸二酯键共价结合，如天然状态那样。这些寡核苷酸可以通过所属领域公知的方法，通过人工操作或者用自动合成仪制备。它们也可以通过载体重组产生。
但是，在优选的实施方案中，本发明的反义寡核苷酸还包括“修饰的”寡核苷酸。也就是说，所述寡核苷酸可以通过多种方式修饰，修饰的方式不妨碍它们与其靶杂交，但是可以增强它们的稳定性或者它们对目标的靶定，或者增强它们的治疗效果。
这里所说的术语“修饰的寡核苷酸”是指这样的寡核苷酸(1)其中至少两个核苷酸通过合成的核苷间连接(即除一个核苷酸的5’端和另一个核苷酸的3’端之间的磷酸二酯键以外的连接)相连和/或(2)其中通常不与核酸相连的化学基团与该寡核苷酸共价连接。优选的核苷间连接是硫逐磷酸酯，膦酸烷基酯，二硫代磷酸酯，磷酸酯，硫逐磷酸烷基酯，氨基磷酸酯，氨基甲酸酯，碳酸盐，磷酸三酯，乙酰胺，羧甲基酯和肽。
术语“修饰的寡核苷酸”还包括具有共价修饰的碱基和/或糖的寡核苷酸。例如，修饰的寡核苷酸包括具有与除3’位置的羟基以外的以及除5’位置的磷酸基团以外的低分子量的有机基团共价连接的骨架糖。因此修饰的寡核苷酸可以含有2’-O-烷基化核糖基团。除此之外，修饰的寡核苷酸可以含有糖例如用阿拉伯糖代替核糖。因此本发明包括含有在生理条件下与编码SEQ ID NO2和/或4的多肽的核酸互补并与之杂交的修饰的反义分子的药物制备物，以及药学可接收的载体。
反义寡核苷酸可以作为药物组合物的一部分给药。这样的药物组合物可以含有反义寡核苷酸和所属领域公知的标准生理学和/或药学可接收的载体的组合。所述组合物应当是无菌的，并且在适于给患者施用的单位重量或单位体积中含有治疗有效量的反义寡核苷酸。术语“药学可接收的”是指不会干扰活性成分的生物学活性的效果的非毒性物质。术语“生理学可接收的”是指与生物系统例如细胞，细胞培养物，组织，或生物体相容的非毒性物质。载体的特征取决于给药的方式。生理学和药学可接收的载体包括稀释剂，填充物，盐，缓冲液，稳定剂，增溶剂，以及所属领域熟知的其它物质。
本发明还包括编码由SEQ ID NO1和/或3的核酸，片段及其变异体编码的蛋白质的表达载体，以及含有这些表达载体的宿主细胞。实际上，任何细胞，不论是原核的或真核的，只要能被异源DNA或RNA转化并能在培养基中生长或维持，都可以用于本发明。实例包括细菌细胞例如大肠杆菌，和哺乳动物细胞例如小鼠，仓鼠，猪，羊，灵长类动物等。细胞可以是多种组织类型，包括肥大细胞，成纤维细胞，卵母细胞和淋巴细胞，它们可以是初始细胞或细胞系。特定的例子包括CHO细胞和COS细胞。也可以使用不含细胞的转录系统代替细胞。
这里所说的“载体”可以是任何核酸，其中所需要的序列可以通过限制性切割和连接插入该核酸，以在不同的遗传环境中传递或者在宿主细胞中表达。载体通常是由DNA组成，虽然RNA载体也可以使用。载体包括但不限于质粒，噬菌粒和病毒基因组。克隆载体是能够在宿主细胞内复制，并且可由一种多种内切酶限制性位点表征的载体，其中该载体可以以确定的方式切割，并且所需的DNA序列可以连接到其中并使新的重组载体保留了其在宿主细胞中复制的能力。如果载体是质粒，当质粒在宿主细菌增加拷贝数的时候所需序列可以复制多次，或者在宿主通过有丝分裂繁殖之前在每个宿主中只复制一次。如果载体是噬菌体，可以在溶胞阶段主动复制，或者在溶源阶段被动复制。表达载体是所需的DNA序列可以通过限制性切割和连接插入其中并且与调控序列可操作地连接并通过RNA转录表达的载体。载体可以进一步包括一个或多个适用于识别已经被或没有被载体转化或转染的细胞的标记序列。标记包括，例如编码可以增加或减少对抗体或其它化合物的抗性或敏感性的的蛋白的基因，编码其活性可以用所属领域公知的标准检测方法检测的酶的基因(例如-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)，以及可见的能影响所转化或转染细胞，宿主，菌落或噬斑的表型的基因(例如绿色荧光蛋白)。优选的载体是能够自发复制并表达存在于DNA区段中并与之可操作地连接的结构基因产物的载体。
这里所说的编码序列和调控序列，当它们共价连接以使编码序列的表达或转录受到调控序列的影响或控制的时候称为“可操作地连接”。如果需要，编码序列可以翻译为功能蛋白。如果5’调控序列的启动子诱导导致了编码序列的转录，并且如果两个DNA序列之间的连接状态不会(1)导致出现移码突变，(2)干扰启动子区域指导编码序列的转录，或者(3)干扰相应RNA转录物翻译成蛋白质的能力，则两个DNA被称为可操作地连接。因此，如果启动子区域能够影响DNA序列的转录并使转录产物能够被翻译成所需的蛋白质或多肽，则启动子区域应当是可操作地与编码序列连接。
基因表达所需的调控序列的确切特征随种属或细胞类型的不同而不同，但是通常包括，转录和反义分别所必需的5’非转录和5’非翻译序列，例如TATA盒，帽子序列，CAAT序列，等等。这种5’非转录调控序列通常包括启动子区域，该启动子区域含有对可操作连接的基因进行转录控制的启动子序列。调控序列还可以含有所需的增强子序列或者上游活化子序列。本发明的载体可以任选地含有5’前导序列或信号序列。选择和设计合适的载体在所属领域普通技术人员的能力和判断力之内。
含有所有表达所必需元件的表达载体是商业可获得的，也是所属领域技术人员公知的。参见，例如，Sambrook et a1.，MolecularCloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989。可以通过向细胞中引入编码多肽或其片段或变体的异源DNA(RNA)构建基因工程细胞。该异源DNA(RNA)可操作地受到转录元件的控制，使其可以在宿主细胞中表达异源DNA。
哺乳动物细胞中优选的mRNA表达系统包括例如pcDNA3.1(可从Invitrogen，Carlsbad，CA获得)，其含有可选择的标记例如赋予G418抗性的基因(有助于选择稳定转染的细胞系)，以及人巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子序列。除此之外，适于在灵长类或犬细胞系中表达的是pCEP4载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其含有Epstein Barr病毒(EBV)复制起点，有助于使质粒成为多拷贝染色体外元件。另一种优选的表达载体是腺病毒，在Stratford-Perricaudet的文献中有描述，其是E1和E3蛋白缺陷型(J.Clin.Invest.90626-630，1992)。
本发明还包括所谓的表达试剂盒，使得技术人员可以制备所需的表达载体。这种表达试剂盒包括至少上述讨论的每一个编码序列的分离部分。也可以加入其它所需的组分，只要其中含有所需的上述序列。
还应当认识到本发明包括上述SEQ ID NO1和/或3，含有cDNA序列的表达载体转染宿主细胞和细胞系，如原核细胞(例如大肠杆菌)，或真核细胞(例如CHO细胞，COS细胞，酵母表达系统和昆虫细胞中的重组杆状病毒表达)的用途。特别有用的是哺乳动物例如小鼠，仓鼠，猪，羊，灵长类动物等的细胞。它们可以是多种组织类型，包括灵长类细胞和细胞系。特定的例子包括树突状细胞，U293细胞，外周血白细胞，骨髓干细胞和胚胎干细胞。
本发明还提供了由上述核酸(SEQ ID NO1和3)编码的分离的多肽(包括整个蛋白和部分蛋白)，还包括SEQ ID NO2和/或4的多肽，以及它们的独特片段。这种多肽可单独使用或作为融合蛋白的一部分生成抗体，或者作为免疫检测的组分。可以从生物样品包括组织或细胞匀浆中分离多肽，也可以在多种原核和真核表达系统中重组表达多肽，其是通过构建适合于表达系统的表达载体，将表达载体引入表达系统，分离重组表达蛋白。短的多肽，包括抗原性肽(例如由细胞表面的MHC分子呈递以进行免疫识别的肽)也可以用已知的肽合成方法化学合成。
就这里所说的多肽而言，术语“分离的”表示以足够纯的形式从其天然环境中分离出来，以使它能够用于本发明的任何目的。因此分离的表示足够纯以用于(i)产生和/或分离抗体，(ii)作为检测试剂，(iii)测序，(iv)作为治疗剂等。
每一个上述多肽的独特片段都具有如上所述的与核酸相关的独特片段的特征。所属领域技术人员应当认识到，独特片段的大小取决于各种因素如该片段是否由若干个保守蛋白域组成。因此，多肽的某些区域应当必须具有比较长的片段才是独特的，而其它区域只需要短的片段，一般是在5到12个氨基酸之间(例如5，6，7，8，9，10，11和12个氨基酸或更多，包括每一个整数直至每个多肽的全长)就可以。
多肽的独特片段优选是那些能保留该多肽的独特功能的片段。独特片段所保留的多肽的功能包括与抗体的相互作用，与其它多肽或其片段的相互作用，与其它分子的相互作用等。一种很重要的活性就是作为识别该多肽的特征。所属领域技术人员熟知选择独特氨基酸序列的方法，通常是基于独特片段能够将所感兴趣的序列与非家族成员区分开。所需要做的就是将所述片段的序列与已知数据库中的序列比较。
本发明包括上述多肽的变体。这里所说的多肽的“变体”是其中含有一个或多个天然(例如“野生型”具有选自SEQ ID NO2和4的氨基酸序列的多肽)多肽的初级氨基酸序列的修饰。能够产生多肽变体的修饰通常是对编码该多肽的核酸进行的，可以包括缺失，点突变，截断，氨基酸取代以及插入氨基酸或非氨基酸分子，其目的是(1)降低或消除多肽的活性；(2)增强多肽的一种性质，例如蛋白质在表达系统中的稳定性或者蛋白-配体连接的稳定性；(3)为蛋白提供一种新的活性或性质，例如插入抗原性表位或者插入可检测到的分子，或者(4)为多肽受体或其它分子提供同等的或更好的连接。可选择地，修饰可以是直接针对多肽的，例如切割，插入连接体分子，插入可检测到的分子，例如生物素，插入脂肪酸等。修饰也可以包括含有该多肽全部或部分氨基酸序列的融合蛋白。所属领域技术人员应当熟悉预测蛋白质序列发生改变对于蛋白质构象的影响，并可以根据已知方法“设计”一种变体多肽。这种方法的一个实例如Dahiyat and Mayoin Science 27882-87，1997所述，其中蛋白是完全新设计的。所述方法可以应用于已知蛋白，仅改变该多肽序列的一部分。使用Dahiyat and Mayo所述的的计算方法，可以得到任何上述多肽的特异变体，并进行检测以确定所述变体是否具有所希望的构象。
变体可以包括进行特定修饰的改变了与其生理活性无关的多肽性质的多肽。例如半胱氨酸残基可以被取代或者被删除以防止产生不希望的二硫键。类似地，可以改变特定的氨基酸以通过在表达系统中消除蛋白酶的蛋白质水解作用增强多肽的表达(例如酵母表达系统中的二元氨基酸残基，其中存在KEX2蛋白酶活性)。
编码多肽的核苷酸的突变优选保留了编码序列的氨基酸阅读框，优选不在核酸中产生可能杂交形成二级结构，例如发卡或环的区域，这不利于表达变体多肽。
可以通过选择氨基酸取代，或者通过在编码多肽的核酸的选定位点进行任意突变产生突变。然后表达变体多肽并检测其一种或多种活性以确定哪种突变得到的变体多肽具有所希望的性质。可以对其中所述多肽的氨基酸序列处于沉默状态，但是却具有在特定宿主中进行翻译的优选密码子的变体(或者非变体多肽)进行进一步突变。核酸在例如大肠杆菌中翻译的优选密码子是所属领域普通技术人员所熟知的。还可以对基因的非编码序列或cDNA克隆进行其它突变以增强多肽的表达。
所述领域技术人员应当认识到，可以对任意上述多肽进行保守性氨基酸取代，以提供上述多肽的功能相同的变体，即这些变体保留了每个多肽的功能。这里所说的“保守性氨基酸取代”是指氨基酸取代不显著改变多肽的三级结构和/或活性。可以使用所属领域普通技术人员公知的改变多肽序列的方法制备变体，包括那些描述此方法的参考文献中所述的方法，例如MolecularCloningA Laboratory Manual，J.Sambrook，et a1.，eds.，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，或者Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel，et al.，eds.，John Wiley & Sons，Inc.，New York。氨基酸的保守性取代包括在下列各组内的氨基酸取代(a)M，I，L，V；(b)F，Y，W；(c)K，R，H；(d)A，G；(e)S，T；(f)Q，N；和(g)E，D。
因此本发明包括多肽的功能相同的变体，即保留着天然(“野生型”)多肽的功能的多肽变体。产生每个多肽的功能等同性变体的多肽氨基酸序列的保守性氨基酸取代是通过改变编码所述多肽的核酸得到的。可以用所属领域普通技术人员所公知的多种方法进行这种取代。例如，根据Kunkel(Kunkel，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.82488-492，1985)所述的方法进行PCR定向突变，位点定向突变，或者化学合成编码多肽的基因以进行氨基酸取代。多肽的功能等同性变体的活性可以通过下述方法检测将编码改变的多肽的基因克隆到细菌或哺乳动物表达载体中，将载体引入合适的宿主细胞中，表达改变的多肽，用本文所述的方法检测多肽功能。
本发明如本文所述具有多种用途，其中一些在本文其它部分描述。首先，本发明使得可以分离多肽。可以用所属领域技术人员熟知的多种方法得到分离的分子。所述多肽可以从天然能产生该多肽的细胞中通过层析方法或免疫识别纯化。可选择地，可将表达载体引入细胞以生产所述多肽。在另一种方法中，可以将mRNA转录物通过显微注射或其它方法引入细胞中，以生产所述的编码多肽。mRNA在不含细胞的提取物例如网织红细胞溶解产物系统中的翻译也可以用于生产多肽。所属领域技术人员还可以很容易地用已知的方法分离多肽。这些方法包括但不限于免疫层析，HPLC，排阻层析，离子交换层析和免疫亲和层析。
在特定的实施方案中，本发明还包括衍生自多肽的“显性抑制”多肽。显性抑制多肽是一种蛋白质的无活性的变体，通过与细胞体系的相互作用，取代活性蛋白与细胞体系的相互作用或者与活性蛋白竞争，由此减少了活性蛋白的作用。例如，与配体结合但在与配体结合的同时不传递信号的显性抑制受体可以减少配体表达的生物学作用。同样地，显性抑制无催化活性的激酶可以正常地与靶蛋白相互作用，但是不能磷酸化靶蛋白，这可以减少靶蛋白响应细胞信号时发生的磷酸化。类似地，显性抑制转录因子可以与基因控制区域的启动子位点结合但是不增加基因转录，这可以通过占据启动子结合位点而又不增加转录来减少正常转录作用。
在细胞中表达显性抑制多肽的最终结果是降低了活性蛋白的功能。所属领域普通技术人员可以评估蛋白质显性抑制变体潜在的功能，并且使用标准的突变技术产生一种或多种显性抑制变体多肽。参见，例如，美国专利序列号5,580,723和Sambrook etal.，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989。所属领域技术人员然后可以检测减少了选定的活性和/或保留了此活性的突变多肽群体。其它类似的生成和检测蛋白质的显性抑制变体的方法对于所属领域普通技术人员是显而易见的。
本发明的cDNA的分离使技术人员有可能诊断由任何上述cDNA的异常表达表征的疾病。这些方法包括确定每一个所识别的核酸，和/或由其生成的多肽的表达。在上述情况下，这种确定可以通过任何标准的核酸确定性检测，包括聚合酶链式反应，或者用标记的杂交探针来进行，如下文例示。在后者的情况下，可以通过标准的免疫检测，用例如与分泌蛋白结合的抗体进行确定。
本发明还包括分离的肽结合试剂，例如，该试剂可以是抗体或者抗体的片段(“结合多肽”)，具有能选择性地与本发明的任何多肽(例如SEQ ID NO2或4)结合的能力。抗体包括多克隆和单克隆抗体，可以根据传统方法制备。
重要的是，如本领域熟知的，只有抗体的一小部分，抗原决定簇，与抗体与其表位的结合有关(参见，一般的，Clark，W.R.(1986)The Experimental Foundations of Modern ImmunologyWiley & Sons，Inc.，New York；Roitt，I.(1991)EssentialImmunology，7th Ed.，Blackwell Scientific Publications，Oxford)。pFc’和Fc区域，例如，是补体级联系统的效应物，但不涉及抗原结合。其pFc′区域被酶切了的，或者不含有pFc′区域的抗体称为F(ab’)2片段，保留有完整抗体的抗原结合位点。类似地，其Fc区域被酶切了的，或者不含有Fc区域的抗体称为Fab片段，保留有完整抗体分子的一个抗原结合位点。进一步，Fab片段由共价结合的抗体轻链和抗体重链的Fd部分组成。Fd片段是抗体特异性的主要决定因素(一个单独的Fd片段可以和多达十个不同的轻链结合而不会改变其抗体特异性)，Fd片段在分离过程中保持了表位结合能力。
在抗体的抗原结合部分中，如所属领域所熟知的，具有可以和抗原的表位直接相互作用的互补决定区(CDR)，以及维持抗原决定簇的三级结构的框架区(FR)(参见，一般的，Clark，1986；Roitt，1991)。在IgG免疫球蛋白的重链Fd片段和轻链中，具有四个框架区域(FR1到FR4)，分别被三个互补决定区(CDR1至CDR3)分隔开。CDR，特别是CDR3区域，更特别的是重链CDR3，主要负责抗体的特异性。
所属领域已知哺乳动物抗体的非CDR区域可以被同种或异种抗体的类似区域取代，而还保持原始抗体的表位特异性。这清楚地由“人化的”抗体的研究和使用所证明，其中非人的CDR与人FR和/或Fc/pFc’区域共价结合，产生功能性抗体。参见，例如，美国专利序列号4,816,567；5,225,539；5,585,089；5,693,762和5,859,205。因此，例如，PCT国际
发明者理查德·T·李 申请人:布赖汉姆妇女医院