用于疫苗和基因治疗的高滴度重组流感病毒的制作方法

专利名称：用于疫苗和基因治疗的高滴度重组流感病毒的制作方法
相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2003年5月28日申请的美国申请顺序号60/473,798的权益，所述申请记载的内容通过引用结合到本文中。
政府权利声明本发明是在美国政府资助下完成的(公共卫生服务部国立变态反应和感染性疾病研究所(National Institute of Allergy and InfectiousDiseases Public Health Service)的资助号为AI-47446)。美国政府在本发明中可以享有一定的权利。
背景技术：
负义RNA病毒分为7个科(弹状病毒科(Rhabdoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、玻那病毒科(Bornaviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)和沙粒病毒科(Arenaviridae))，其中包括常见的人类病原体(例如呼吸道合胞病毒、流感病毒、麻疹病毒和埃博拉病毒(Ebolavirus))以及对家禽业和养牛业具有重要经济影响的动物病毒(例如新城疫病毒和牛瘟病毒)。前面4科的特征是不分节段的基因组，而后面3科分别具有包括6-8个、3个或2个负义RNA区段的基因组。负义RNA病毒的共同特征是其RNA基因组的负极性；即病毒RNA(vRNA)与mRNA互补，因此自身没有感染性。为了启动病毒转录和复制，vRNA必须通过病毒聚合酶复合体和核蛋白分别转录成正义RNA或cRNA；对于甲型流感病毒，病毒聚合酶复合体由PB2、PB1和PA这3种聚合酶蛋白组成。在病毒复制期间，cRNA作为新vRNA分子的合成模板。对于所有负链RNA病毒，vRNA和cRNA 5′端和3′端的非编码区对病毒基因组的转录和复制来说都是至关重要的。与细胞mRNA转录物或病毒mRNA转录物不同，cRNA和vRNA在5′端都没有帽子，在3′端也都没有聚腺苷酸化。
从生物化学方面和/或在病毒感染过程中，已经阐明了许多病毒蛋白的基本功能。然而，反求遗传学系统更显著地增加了我们对有关负链分节段和不分节段的RNA病毒的病毒复制和致病性方面的知识，以及对开发减毒活病毒疫苗方面的知识。反求遗传学，作为用于分子病毒学的术语，定义为产生具有来自克隆cDNA的基因组的病毒(有关综述参见Neumann等，2002)。
为了启动负链RNA病毒的病毒复制，vRNA或cRNA必须与聚合酶复合体和核蛋白共表达。狂犬病毒是第一个完全从克隆cDNA产生的未分区段的负义RNA病毒Schnell等(1994)通过编码全长cRNA的cDNA构建体和用于L、P和N蛋白的蛋白表达构建体的共转染，产生了重组狂犬病毒，所述构建体全都处于T7 RNA聚合酶启动子的控制下。用提供T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒进行感染，结果产生感染性狂犬病毒。在该T7聚合酶系统中，在T7 RNA聚合酶控制下的全长cRNA的初级转录，产生无帽的cRNA转录物。然而，形成T7 RNA聚合酶的最适起始序列的3个胍核苷酸连接在其5′端。为了产生产毒性感染周期所必需的真实可靠的cRNA转录物3′端，使用肝炎δ核酶(HDVRz)序列，在cRNA转录物的3′端进行准确的自动催化切割。
自从Schnell等(1994)的首次报道后，采用类似技术的反求遗传学系统，已经产生了许多不分节段的负链RNA病毒(Conzelmann，1996；Conzelmann，1998；Conzelmann等，1996；Marriott等，1999；Munoz等，2000；Nagai，1999；Neumann等，2002；Roberts等，1998；Rose，1996)。对原拯救程序作出的精修包括从稳定转染的细胞系(Radecke等，1996)或从蛋白表达质粒(Lawson等，1995)表达T7 RNA聚合酶，或者用热激方法以提高拯救效率(Parks等，1999)。根据T7聚合酶系统，Bridgen和Elliott(1996)从克隆cDNA产生了布尼亚病毒(布尼亚病毒科)，证明用T7聚合酶系统人工产生分节段负义RNA病毒的可行性。
在1999年，在细胞RNA聚合酶I的基础上产生了基于质粒的反求遗传学技术，用于完全从克隆cDNA产生分节段甲型流感病毒(Fodor等，1999；Neumann和Kawaoka，1999)。RNA聚合酶I是一种核仁酶，其合成象流感病毒RNA一样不含5’帽或3’聚腺苷酸结构的核糖体RNA。含有流感病毒cDNA并邻接RNA聚合酶I启动子和终止序列的构建体的RNA聚合酶I进行转录，结果合成了流感vRNA(Fodor等，1999；Neumann和Kawaoka，1999；Neumann和Kawaoka，2001；Pekosz等，1999)。该系统十分有效，在转染后48小时，质粒转染细胞上清液中每毫升产生超过108个感染性病毒颗粒。
所需要的是完全从克隆cDNA制备高滴度正粘病毒(例如甲型流感病毒)的方法。
发明概述本发明提供一种分离的和/或纯化的核酸分子(多核苷酸)或所述核酸分子的互补序列，所述分子编码至少一种高滴度的蛋白或其部分，例如其滴度大于109/ml、例如大于1010/ml流感病毒。在一个实施方案中，所述分离的和/或纯化的核酸分子编码HA、NA、PB1、PB2、PA、NP、M或NS，或其部分，它们具有与SEQ ID NO1-8之一所编码的相应多肽基本上相同的活性。本文所用的“基本上相同的活性”包括为相应的全长多肽活性的约0.1％、1％、10％、30％、50％、90％、例如直到100％或更高的活性，或者为相应的全长多肽活性或可检测蛋白水平的约80％、90％或更高的可检测蛋白水平。在一个实施方案中，所述分离的和/或纯化的核酸分子编码的多肽与SEQ ID NO1-8之一所编码的多肽具有基本上相同的、例如具有至少80％、例如90％、92％、95％、97％或99％的毗连氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述分离的和/或纯化的核酸分子包括与SEQ ID NO1-8之一具有基本上相同的、例如具有至少50％、例如60％、70％、80％或90％或更高的毗连核酸序列同一性的核苷酸序列或其互补序列，并且，在一个实施方案中，也编码与SEQ ID NO1-8之一所编码的多肽具有至少80％、例如90％、92％、95％、97％或99％的毗连氨基酸序列同一性的多肽。在一个实施方案中，相对于SEQ ID NO1-8之一所编码的多肽来说，所述分离的和/或纯化的核酸分子编码具有一个或多个例如2、5、10、15、20或更多个保守氨基酸取代的多肽，例如具有高达10％或20％残基的保守取代的多肽。“保守氨基酸取代”是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，一组具有脂族侧链的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂族-羟基侧链的氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳族侧链的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；一组具有含硫侧链的氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸；苯丙氨酸-酪氨酸；赖氨酸-精氨酸；丙氨酸-缬氨酸；谷氨酸-天冬氨酸；和天冬酰胺-谷氨酰胺。
在另一个实施方案中，在低严格性、中等严格性和严格性条件下，使本发明的分离的和/或纯化的核酸分子或其互补序列与SEQ IDNO1-8之一或其互补序列杂交。例如，可以采用以下条件7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA，于50℃杂交，用2XSSC、0.1％SDS于50℃洗涤(低严格性)；更好是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA，于50℃杂交，用1X SSC、0.1％SDS于50℃洗涤(中等严格性)；还更好是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA，于50℃杂交，用0.5X SSC、0.1％SDS于50℃洗涤(严格性)；优选在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mM EDTA，于50℃杂交，用0.1X SSC、0.1％SDS于50℃洗涤(更严格)；更优选在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA，于50℃杂交，用0.1X SSC、0.1％SDS于65℃洗涤(非常严格)。在一个实施方案中，本发明的核酸分子编码的多肽与SEQ IDNO1-8之一具有基本上相同的、例如具有至少50％、例如60％、70％、80％或90％或更高的毗邻核酸序列同一性，优选具有与SEQ ID NO1-8之一所编码的相应全长多肽基本上相同的活性。
本发明的核酸分子可用于表达流感蛋白，以制备嵌合基因(例如含有其它病毒基因，包括其它流感病毒基因)和/或制备重组病毒。因此，本发明也提供分离的多肽、重组病毒和与包含本发明核酸分子或重组病毒接触的宿主细胞。
本发明也提供至少一种以下分离的和/或纯化的载体包含与流感病毒PA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB1 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB2 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒HA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NP cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒M cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NS cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，其中，至少一种载体包含编码HA、NA、PB1、PB2、PA、NP、M、NS或其部分的序列，它们与SEQ ID NO1-8之一所编码的相应多肽具有基本上相同的活性，所述序列例如编码与SEQ ID NO1-8之一所编码的多肽具有至少80％氨基酸同一性的多肽的序列。任选这两种载体可用于替代这样的载体包含与流感病毒M cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，例如包含与流感病毒M1 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，以及包含与流感病毒M2 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体。
本发明提供分离纯化的载体或质粒，所述载体或质粒表达或编码流感病毒蛋白，或者表达或编码流感vRNA，无论是天然vRNA还是重组vRNA。优选所述载体包含流感cDNA，例如甲型流感DNA(例如包含任何15种HA或9种NA亚型的任何甲型流感基因)、乙型流感DNA或丙型流感DNA(参见FieldsVirology(Fields等(主编)，Lippincott-Raven Publ.，Philadelphia，PA(1996)，第45和46章，所述文献通过引用具体地结合到本文中)，尽管可以设想任何生物体的所述基因都可用于本发明的载体或方法。相对于启动子来说，所述cDNA可以呈有义方向或反义方向。因此，本发明的载体可编码流感病毒蛋白(有义)或vRNA(反义)。任何合适的启动子或转录终止序列都可以用来表达蛋白或肽，例如病毒蛋白或肽，非病毒病原体蛋白或肽，或者治疗性蛋白或肽。
本发明提供一种组合物，所述组合物包含本发明的多种流感病毒载体。在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含a)至少两种选自以下的载体包含与流感病毒PA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB1 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB2 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒HA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NP cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NAcDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒M cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，以及包含与流感病毒NS cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，其中至少一种载体包含与本发明核酸分子操作性连接的启动子及转录终止序列；和b)至少两种选自以下的载体编码流感病毒PA的载体，编码流感病毒PB1的载体，编码流感病毒PB2的载体，以及编码流感病毒NP的载体。任选b)中描述的载体包含一种或多种编码NP、NS、M(例如M1和M2)、HA或NA的载体。优选编码病毒蛋白的所述载体还包含转录终止序列。
在另一个实施方案中，所述组合物包含a)至少两种选自以下的载体包含与流感病毒PA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB1 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB2 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒HA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NP cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NA和NB cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒McDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NS cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，以及包含与流感病毒BM2 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，其中至少一种载体包含与本发明核酸分子操作性连接的启动子及转录终止序列；和b)至少两种选自以下的载体编码流感病毒PA的载体，编码流感病毒PB1的载体，编码流感病毒PB2的载体，以及编码流感病毒NP的载体。任选b)中描述的载体包括一种或多种编码NP、NS、M、HA或NA的载体。优选编码病毒蛋白的所述载体还包含转录终止序列。
本发明的组合物也可包含目标基因或目标可读框，例如编码可用作疫苗的免疫原性肽或蛋白的外源基因。因此，本发明的另一个实施方案包括如上所述的其中一种载体被取代的本发明组合物，或者所述组合物还包含载体，所述载体包含启动子、5′流感病毒序列(任选包含5′流感病毒编码序列或其部分)、所需核酸序列(例如所需cDNA)、3′流感病毒序列(任选包括3′流感病毒编码序列或其部分)和转录终止序列，它们彼此按上述顺序连接在一起。优选所需要的核酸序列(例如cDNA)呈反义方向。将这样的组合物导入允许流感病毒复制的宿主细胞中，产生重组病毒，其中包含对应于所述载体序列的vRNA。在用于产生vRNA的所述载体中的启动子可以是RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子、T7启动子和T3启动子，并且任选所述载体包含转录终止序列，例如RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶II转录终止序列、RNA聚合酶III转录终止序列或核酶。在一个实施方案中，包含所需核酸序列的载体包含目标cDNA。所述目标cDNA，无论是在vRNA的载体上还是在产生蛋白的载体上，都可编码免疫原性表位(例如用于癌症治疗或疫苗的表位)或编码用于基因治疗的肽或多肽。当制备病毒时，含有目标基因或目标cDNA的载体或质粒可替代流感病毒基因的载体或质粒，或者可以是除所有流感病毒基因以外还包含的载体或质粒。
本发明的多种载体可以是物理连接的，或者每种载体可以各自的质粒或例如线性、核酸传递载体等其它形式存在。
对于启动子或任何其它载体来说，vRNA或病毒蛋白表达载体中的启动子或转录终止序列可以相同或不同。优选表达流感vRNA的载体或质粒包含适于在至少一种特定宿主细胞(例如禽类宿主细胞或哺乳动物宿主细胞，例如狗细胞、猫细胞、马细胞、牛细胞、羊细胞或包括人细胞在内的灵长类细胞)中表达的启动子，或者优选适于在不止一种宿主中表达的启动子。
在一个实施方案中，用于产生vRNA的一种或多种载体包括启动子，包括但不限于RNA聚合酶I启动子(例如人RNA聚合酶I启动子)、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子、T7启动子或T3启动子。优选vRNA载体的转录终止序列包括但不限于RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶II转录终止序列、RNA聚合酶III转录终止序列或核酶。本发明范围内的核酶包括但不限于四膜虫核酶、RNA酶P、锤头状核酶、发夹型核酶、肝炎核酶以及合成核酶。
在一个实施方案中，至少一种vRNA的载体包括RNA聚合酶II启动子、核酶序列、病毒编码序列、其它核酶序列和任选的RNA聚合酶II转录终止序列，它们彼此按上述顺序连接在一起。在一个实施方案中，至少两种和优选更多、例如3、4、5、6、7或8种用于产生vRNA的载体包括RNA聚合酶II启动子，从5′到3′方向依次排列的第一核酶序列、包括病毒编码序列在内的对应于病毒序列的序列、第二核酶序列、转录终止序列。每种vRNA载体中的每个RNA聚合酶II启动子可以与任何其它vRNA载体中的RNA聚合酶II启动子相同或不同。同样，每种vRNA载体中的每个核酶序列可以与任何其它vRNA载体中的核酶序列相同或不同。在一个实施方案中，在一个载体中的核酶序列是不同的。
本发明也提供一种制备流感病毒的方法。所述方法包括使细胞与本发明的多种载体例如序贯或同时接触，例如使用有效量的本发明的组合物以产生感染性流感病毒。本发明也包括从与所述组合物接触的细胞中分离病毒。因此，本发明还提供分离的病毒，以及与本发明的组合物或病毒接触的宿主细胞。在另一个实施方案中，本发明包括在使其它载体(或者是产生vRNA的载体或者是产生蛋白的载体)接触细胞之前，先使一种或多种载体(或者是产生vRNA的载体或者是产生蛋白的载体)接触细胞。
本发明的方法允许对流感病毒进行容易的操作，例如通过将减毒突变引入到病毒基因组中。此外，因为流感病毒诱导强体液免疫和强细胞免疫，所以本发明能大大增强了这些作为疫苗载体的病毒、特别是在病毒的天然变异体方面的可行性，这些天然变异体可序贯用于基因治疗的重复使用。
产生本文所述的病毒的方法不需要辅助病毒感染，可用于病毒诱变研究，以及生产疫苗(例如针对AIDS、流感、乙肝、丙肝、鼻病毒、丝状病毒、疟疾、疱疹和口蹄疫)和基因治疗载体(例如针对癌症、AIDS、腺苷脱氨酶缺乏症、肌营养不良、鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症和中枢神经系统肿瘤)。因此，提供了用于医疗(例如用于疫苗或基因治疗)的病毒。
本发明也提供用于给个体进行抗病原体免疫的方法，所述病原体例如细菌、病毒或寄生虫、或恶性肿瘤。该方法包括给予所述个体免疫该个体有效量的至少一种本发明分离的病毒，任选包括佐剂。所述病毒包括vRNA，该vRNA包含由病原体编码的多肽或肿瘤特异性多肽。
也提供增强或提高哺乳动物的内源蛋白表达的方法，所述哺乳动物患有以所述内源蛋白减少或缺乏为特征的适应症或疾病。该方法包括给予所述哺乳动物有效量的分离的本发明病毒，以增强或提高哺乳动物体内所述内源蛋白的含量。优选所述哺乳动物是人。
附图简述

图1.已建立的反求遗传学系统的示意图。在RNP转染方法(A)中，纯化的NP和聚合酶蛋白与体外合成的vRNA一起装配成RNP。细胞用RNP转染，再通过辅助病毒感染。在RNA聚合酶I方法(B)中，使含有RNA聚合酶I启动子、有待拯救的编码vRNA的cDNA和RNA聚合酶I终止子的质粒转染细胞。通过RNA聚合酶I进行胞内转录，得到合成的vRNA，其在辅助病毒感染后包装到子代病毒颗粒中。采用这两种方法，转染病毒(即含有来自克隆cDNA的RNA的病毒)选自辅助病毒群体。
图2.产生RNA聚合酶I构建体的示意图。通过PCR扩增来自流感病毒的cDNA，用BsmBI消化，克隆到pHH21载体的BsmBI位点上(E.Hoffmann，博士论文，Justus，Liebig-University，Giessen，德国)，该载体含有人RNA聚合酶I启动子(P)和小鼠RNA聚合酶I终止子(T)。终止序列上游的胸腺嘧啶核苷酸(*T)代表流感病毒RNA的3′端。甲型流感病毒序列用粗体字母表示。(SEQ ID NO29-40)。
图3.产生分节段负义RNA病毒的反求遗传学方法。将含有RNA聚合酶I启动子、8种病毒RNA区段的cDNA和RNA聚合酶I终止子的质粒与蛋白表达质粒一起转染到细胞中。尽管可以用表达PA、PB1、PB2和NP的质粒产生感染性病毒，但是所有其余的结构蛋白的表达(用圆框表示)提高了病毒产生的效率，这取决于所产生的病毒。
图4.不同流感病毒的滴度。
发明详述定义本文所用的术语“分离和/或纯化”是指本发明的载体、质粒或病毒的体外制备、分离和/或纯化，使得不再结合体内物质，或者说基本上从体外物质中纯化出来。本发明的分离的病毒制备物通常是通过体外培养和扩增而得到的，并且基本上不含其它感染因子。
本文所用的“基本上不含”是指对特定感染因子来说，低于用标准检测方法对其进行检测的检测水平。
“重组”病毒是已经经过体外操纵(例如使用重组DNA技术)而改变其病毒基因组的病毒。
本文所用的术语“重组核酸”或“重组DNA序列或区段”是指这样的核酸例如DNA其衍生或分离自同一来源，随后可在体外因化学修饰而改变，致使其序列不是天然存在的，或者虽对应于天然存在的序列但其定位与在天然基因组中的定位不同。“衍生”自同一来源的DNA的一个实例可以是已鉴定为有用片段并随后以基本纯的形式化学合成的DNA序列。“分离”自同一来源的DNA的一个实例可以是用化学方法(例如用限制性内切核酸酶)从其来源切下或取出的有用的DNA序列，致使其可通过基因工程方法进行进一步操作如扩增，供本发明使用。
流感病毒的复制甲型流感病毒具有8条单链负义病毒RNA(vRNA)的基因组，总共编码10种蛋白。流感病毒生命周期通常起始于血凝素(HA)与宿主细胞表面含唾液酸受体的结合，其后是受体介导的胞吞作用。晚期胞内体的低pH触发HA变构，因而暴露出HA2亚基的N端(所谓融合肽)。融合肽促使病毒和胞内体膜融合，然后基质蛋白(M1)和RNP复合体释放到细胞质内。RNP由核蛋白(NP)组成，核蛋白将vRNA和病毒聚合酶复合体包入其中，该聚合酶复合体是由PA、PB1和PB2蛋白所形成的。RNP转运到细胞核中，在此进行转录和复制。RNA聚合酶复合体催化3个不同的反应合成具有5′帽子和3′多聚腺苷酸结构的mRNA，合成全长互补RNA(cRNA)，最后以cDNA为模板合成基因组vRNA。随后，新合成的vRNA、NP和聚合酶蛋白装配成RNP，从核中输出，转运到质膜，在此进行子代病毒颗粒的出芽。通过除去唾液酸寡糖中的唾液酸，从细胞表面释放出新装配的病毒体，阻止病毒颗粒的自我聚集，因此神经氨酸酶(NA)蛋白在感染后期起到至关重要的作用。尽管病毒装配包括蛋白-蛋白相互作用和蛋白-vRNA相互作用，但是这些相互作用的性质基本上尚未知晓。
尽管乙型和丙型流感病毒在结构和功能上均类似于甲型流感病毒，但还是有一些差异。例如，乙型流感病毒没有具离子通道活性的M2蛋白。同样，丙型流感病毒也没有具离子通道活性的M2蛋白。然而，CM1蛋白可能具有这一活性。可通过本领域众所周知的方法，参见例如Holsinger等(1994)和WO01/79273，测定离子通道蛋白的活性。
本发明可以使用的细胞系和流感病毒根据本发明，任何支持流感病毒有效复制的细胞都可用于本发明，所述细胞包括表达减少或降低水平的一个或多个唾液酸(流感病毒受体)的突变细胞。由该方法得到的病毒可以制备成重配(reassortant)病毒。
优选所述细胞是经WHO检验或确认的连续细胞系。证明这些细胞系的要求包括对至少一个谱系的生长特征、免疫学标记、病毒易感性、致瘤性和储藏条件进行表征，以及通过在动物、鸡胚和细胞培养物中做实验进行表征。所述表征用于证实所述细胞没有可检测的外来因子(adventitious agents)。在一些国家，还需要做细胞核学实验。另外，致瘤性优选在与用于疫苗生产的细胞具有相同传代水平的细胞中进行试验。在进行疫苗生产的灭活或减毒之前，病毒优选通过已显示能得到稳定结果的方法进行纯化(参见例如World HealthOrganization，1982)。
优选建立待用细胞系的完整表征，使其包括用于终产物纯度的合适试验。可用于表征本发明所用细胞的数据包括(a)有关其来源、衍生过程和传代史的信息；(b)有关其生长和形态学特征的信息；(c)外来因子的检验结果；(d)区别特征，例如将这些细胞与其它细胞系清楚地区分开来的生物化学、免疫学和细胞遗传学模式；和(e)致瘤性试验结果。优选所用宿主细胞的传代水平或群体倍增尽可能低。
优选所述细胞中生产的病毒在配制疫苗或基因治疗制剂之前已经高度纯化。一般而言，纯化过程使得细胞DNA、其它细胞组分和外来因子完全除去。也可使用彻底降解或变性DNA的方法。参见例如Mizrahi，1990。
疫苗本发明的疫苗可包括免疫原性蛋白，所述蛋白包括任何病原体的糖蛋白，例如来自一种或多种细菌、病毒、酵母或真菌的免疫原性蛋白。因此，在一个实施方案中，本发明的流感病毒可以是流感病毒的疫苗载体或包括但不限于以下的其它病毒病原体的疫苗载体慢病毒例如HIV、乙肝病毒、丙肝病毒，疱疹病毒例如CMV或HSV或口蹄疫病毒。
通过超滤，浓缩完整病毒体疫苗，然后通过区带离心或色谱进行纯化。可以在纯化前或纯化后使用福尔马林或β-丙内酯等来进行灭活。
亚单位疫苗包括纯化的糖蛋白。可按以下方法制备所述疫苗使用经去垢剂处理而破坏的病毒悬液，通过例如超速离心纯化表面抗原。因此，亚单位疫苗主要含有HA蛋白，但也含有NA。所用的去垢剂可以是阳离子去垢剂例如十六烷基三甲基溴化铵(Bachmeyer，1975)，阴离子去垢剂例如脱氧胆酸铵(Laver & Webster，1976)；或非离子去垢剂例如商品名为TRITON X100的去垢剂。也可以在蛋白酶例如菠萝蛋白酶处理病毒体后，分离血凝素，然后通过例如Grand和Skehel(1972)所介绍的方法进行纯化。
片段疫苗(split vaccine)包括经过溶解脂质的试剂处理的病毒体。片段疫苗可以如下制备在搅拌下，用脂质溶剂例如乙醚或氯仿以及去垢剂，处理如上获得的纯化病毒的含水悬液(灭活或未灭活)。病毒包膜脂质的分解产生病毒颗粒片段。回收水相，其中含有片段疫苗，其主要由血凝素和神经氨酸酶(其原有的脂质环境被去除)以及核心或其降解产物组成。然后，将残留的感染性颗粒灭活，如果之前尚未灭活的话。
灭活疫苗.可以用已知方法灭活本发明的复制型病毒，提供本发明的灭活流感病毒疫苗，所述方法例如但不限于福尔马林或β-丙内酯处理。用于本发明的灭活疫苗类型可包括完整病毒(WV)疫苗或亚病毒颗粒(SV)(片段)疫苗。WV疫苗含有完整的灭活病毒，而SV疫苗含有用去垢剂破坏而溶解含脂质病毒包膜、再通过化学方法灭活残余病毒的纯化病毒。
另外，可以使用的疫苗还包括含有分离的HA和NA表面蛋白的疫苗，所述疫苗称为表面抗原或亚单位疫苗。一般而言，针对SV和表面抗原(即纯化的HA或NA)疫苗的应答都是类似的。一种含有与流行病毒免疫相关的NA抗原和无关HA的实验灭活WV疫苗看来有效性要比常规疫苗差(Ogra等，1977)。优选含有这两种相关表面抗原的灭活疫苗。
减毒活病毒疫苗.根据已知的方法步骤，减毒活流感病毒疫苗也可用于预防或治疗流感病毒感染。优选按照已知方法(参见例如Murphy，1993)，通过将来自减毒供体病毒的减毒基因转移到分离的或重配的(reassorted)复制型病毒中，优选用一步法完成减毒过程。因为抗甲型流感病毒的抗性是由产生抗HA和NA糖蛋白的免疫应答介导的，所以编码这些表面抗原的基因必须来自重配病毒或高生长临床分离株。减毒基因来自减毒亲本。在这一方法中，赋予减毒的基因优选不编码HA和NA糖蛋白。另外，这些基因不能转移给带有临床病毒分离株表面抗原的重配子。
已经对许多供体病毒重复减毒流感病毒的能力进行了评价。作为非限制性实例，A/Ann Arbor(AA)/6/60(H2N2)冷适应(ca)供体病毒可以用于减毒疫苗生产(参见例如Edwards，1994；Murphy，1993)。另外，可以通过将ca供体病毒与本发明的强毒复制型病毒交配，产生减毒重配活病毒疫苗。然后在H2N2抗血清的存在下，在25℃选择重配子代(限制强毒病毒的复制)，其抑制带有减毒A/AA/6/60(H2N2)ca供体病毒表面抗原的病毒的复制。
已经对在人类中的一系列H1N1和H3N2重配病毒进行了评价，并且发现是令人满意的(a)感染性，(b)对血清反应阴性儿童和初次免疫的成人来说是弱毒的，(c)免疫原性，(d)遗传稳定。ca重配子的免疫原性平行于其复制水平。因此，由新野生型病毒获得ca供体病毒的6个可转移基因，可以重复地减毒这些病毒，用于接种易感成人和儿童。
其它减毒突变可以经定点诱变引入流感病毒基因，以拯救带有这些突变基因的感染性病毒。减毒突变可以引入基因组非编码区以及编码区。这些减毒突变也可以引入HA或NA以外的基因，例如PB2聚合酶基因(Subbarao等，1993)。因此，也可以产生带有经定点诱变引入的减毒突变的新的供体病毒，而所述新的供体病毒可用于减少活的减毒重配H1N1和H3N2候选疫苗，其方式类似于上述A/AA/6/60ca供体病毒。同样，其它已知的合适减毒供体株可以与本发明的流感病毒重配，以得到适于哺乳动物免疫接种的减毒疫苗(Enami等，1990；Muster等，1991；Subbarao等，1993)。
优选所述减毒病毒保留来自编码与原始临床分离株的抗原决定簇基本类似的病毒的基因。这是因为减毒疫苗的目的是为了提供与原始临床分离毒株基本上相同的抗原性，而同时缺乏感染性，以至于疫苗在接种的哺乳动物中最小可能地引起严重致病性病症。
因此，可以按照已知方法，将所述病毒减毒或灭活，配制并作为疫苗给药，以在动物例如哺乳动物体内诱导免疫应答。下述方法在本领域中是众所周知的确定这些减毒或灭活疫苗是否保留与临床分离株或由其衍生的高生长株相似的抗原性。所述已知方法包括利用抗血清或抗体消除表达供体病毒抗原决定簇的病毒；化学选择(例如金刚烷胺或金刚乙胺)；HA和NA活化和抑制；DNA筛选法(例如探针杂交或PCR)，以证实减毒病毒中不存在编码抗原决定簇的供体基因(例如HA或NA基因)。参见例如Robertson等，1988；Kilbourne，1969；Aymard-Henry等，1985；Robertson等，1992。
药物组合物适于接种或胃肠外或口服给药的本发明药物组合物包含减毒流感病毒或灭活流感病毒，任选还包含无菌的含水或非水溶液剂、悬浮剂和乳化剂。所述组合物还可包含本领域已知的助剂或赋形剂。参见例如Berkow等，1987；Avery′s Drug Treatment，1987；Osol，1980；Katzung，1992。本发明的组合物通常为单剂量(单位剂量)形式。
常规疫苗通常含有约0.1-200μg、优选10-15μg血凝素，这来自加入其组合物的各毒株。构成本发明疫苗组合物主要成分的疫苗可包括甲型、乙型或丙型病毒或其任何组合，例如，这三种型别中的至少两种，不同亚型的至少两种，同型中的至少两种，相同亚型的至少两种或不同的分离株或重配株。人甲型流感病毒包括H1N1、H2N2和H3N2亚型。
供胃肠外给药用制剂包括无菌水性或非水性溶液剂、混悬剂和/或乳剂，其可含有本领域已知的助剂或赋形剂。非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)以及注射用有机酯类，例如油酸乙酯。载体或闭合敷料(occlusiVe dressings)可用于增加皮肤渗透性并增加抗原吸收。供口服给药用液体剂型通常可包括含有所述液体剂型的脂质体溶液剂。用于悬浮脂质体的合适的形式包括乳剂、混悬剂、溶液剂、糖浆剂和酏剂，其含有本领域常用的惰性稀释剂，例如纯净水。除了惰性稀释剂外，所述组合物也可包括佐剂、润湿剂、乳化剂和悬浮剂，或者甜味剂、矫味剂或芳香剂。参见例如Berkow等，1992；Avery′s，1987；Osol，1980；Katzung，1992。
当本发明的组合物用于给予个体时，它还可包含可提高所述组合物功效的盐类、缓冲剂、佐剂或其它物质。对于疫苗来说，可以使用能增强特异性免疫应答的佐剂。通常，佐剂和组合物可以混合在一起，然后给予免疫系统，或者可以单独给予，但是给予免疫生物体的同一部位。Osol(1980)提供了适用于疫苗组合物的材料的实例。
通过将至少2株流感病毒株、例如2-50株或其间的任意范围或数值的复制型流感病毒进行混合，提供疫苗的异质性。优选具有现代抗原组成的甲型或乙型流感病毒株。按照本发明，可以使用本领域已知技术，在单株流感病毒中提供用于变异的疫苗。
本发明的药物组合物还可包含或者另外包含至少一种化疗化合物，例如用于基因治疗和疫苗的化合物，用于基因治疗的化合物例如免疫抑制剂、抗炎药或免疫增强剂，用于疫苗的化合物包括但不限于γ-球蛋白、金刚烷胺、胍、羟基苯并咪唑、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、缩氨基硫脲类、美替沙腙、利福平、利巴韦林、嘧啶类似物、嘌呤类似物、膦甲酸、膦乙酸、阿昔洛韦、二脱氧核苷、蛋白酶抑制剂或更昔洛韦。参见例如Katzung(1992)，第798-800页和第680-681页及其中引用的参考文献。
所述组合物也可含有可变的、但是少量的无内毒素甲醛和防腐剂，其已发现是安全的并且在接受所述组合物的生物体内不会产生不想要的效果。
药用目的给予所述组合物(或其诱导的抗血清)可以是为了“预防”或者“治疗”目的。当用于预防目的时，在出现病原体感染的任何症状之前，给予作为疫苗的本发明组合物。预防性给予所述组合物的作用是预防或缓解任何其后的感染。当用于预防目的时，在出现任何疾病症状之前，给予本发明的基因治疗组合物。预防性给予所述组合物的作用是预防或缓解一种或多种与所述疾病有关的症状。
当用于治疗目的时，在检测到有实际感染症状时，给予减毒或灭活病毒疫苗。治疗性给予所述化合物的作用是缓解任何实际感染。参见例如Berkow等，1992；Avery，1987；Katzung，1992。当用于治疗目的时，当检测到疾病症状或指征时，给予基因治疗组合物。治疗性给予所述化合物的作用是缓解所述疾病症状或指征。
因此，本发明减毒或灭活疫苗组合物可以在感染发作之前(以预防或缓解预期的感染)或实际感染开始之后给予。同样，对于基因治疗，所述组合物也可以在出现障碍或疾病的任何症状之前或者在检测到一种或多种症状之后给予。
所述组合物是“药理学上可接受的”是指受体患者可以耐受给予所述组合物。所述药物是以“治疗有效量”给予是指所给予的用量在生理上是有意义的。本发明的组合物在生理上是有意义的，是指其存在产生在受体患者生理学上可检测的变化，例如增强至少一个针对感染性流感病毒至少一个毒株的初次或继发的体液或细胞免疫应答。
所提供的“保护性”并不是绝对的，即流感感染并不总是可以预防或消灭的，虽然与对照群体或一组患者相比，有统计学显著性改善。保护性可仅限于减轻流感病毒感染症状发作的严重程度或减慢其速度。
给药本发明的组合物可通过或者被动免疫或者主动免疫而赋予抗一种或多种病原体例如一种或多种流感病毒株的抗性。在主动免疫中，预防性给予宿主(例如哺乳动物)灭活或减毒活疫苗组合物，给药宿主的免疫应答可防止感染和/或疾病。对于被动免疫，可以回收诱导的抗血清，然后给予怀疑受到至少一种流感病毒株引起的感染的接受者。本发明的基因治疗组合物可通过主动免疫而产生预防或治疗水平的所需基因产物。
在一个实施方案中，将所述疫苗在足以产生免疫应答的时间和用量的条件下给予雌性哺乳动物(在受孕或分娩时或之前)，所述免疫应答起到同时保护母体和胎儿或新生儿的作用(被动给予穿过胎盘的抗体或母乳中的抗体)。
因此，本发明包括预防或缓解障碍或疾病(例如由至少一株病原体引起的感染)的方法。本文所说的疫苗预防或缓解疾病，是指如果其给药引起症状或病症全部或部分缓解(即抑制)，或者使个体产生针对所述疾病的全部或部分免疫力。本文所说的基因治疗组合物预防或缓解疾病，是指如果其给药引起疾病症状或病症全部或部分缓解(即抑制)，或者使个体产生针对所述疾病的全部或部分免疫力。
可以通过达到预期目的的任何方式，使用上述药物组合物，给予本发明的至少一种灭活或减毒流感病毒或其组合物。
例如，可以通过各种胃肠外途径，例如皮下、静脉内、皮内、肌内、腹膜内、鼻内、口服或经皮途径，给予所述组合物。胃肠外给药可以通过快速浓注或者通过长时间逐渐输注的方式进行。使用本发明药物组合物的优选方式是通过肌内或皮下给药。参见例如Berkow等，1992；Avery，1987；Katzung，1992。
对于预防、抑制或治疗流感病毒相关病原体，通常的方案包括给予有效量的上述疫苗组合物，可以作为单次给药，或者在1周和约24个月之间的周期内或者其间的任何范围或数值内，作为加强或增强剂量重复给药。
按照本发明，组合物的“有效量”是指足以达到所需生物学效果的用量。人们知道，有效量将取决于接受者的年龄、性别、健康状况和体重，同时治疗的种类(如果有的话)、治疗频率和所需效果的特点。下面提供的有效剂量的范围并不是对本发明的限制，而是代表优选的剂量范围。然而，最优选剂量将因各受试者而异，这是本领域技术人员可理解和可确定的。参见例如Berkow等，1992；Avery′s，1987；Katsung，1992。
对于哺乳动物(例如人)或鸟类成年生物来说，减毒病毒疫苗的剂量可为约103-107噬斑形成单位(PFU)/kg，或其间的任意范围或数值。灭活疫苗剂量范围可为约0.1-200μg、例如50μg血凝素蛋白。然而，通过常规方法检定、使用现有疫苗作为出发点，所述剂量应当是安全有效的。
可以将每剂复制型病毒疫苗中免疫活性HA的剂量标准化，使其含有合适的量，例如1-50μg或其间的任意范围或数值，或者为美国公共卫生服务部(U.S.Public Health Service，PHS)推荐量，通常是对于3岁以上儿童每份15μg，对于3岁以下儿童每份7.5μg。NA的用量也可以标准化，然而，该糖蛋白在加工、纯化和储藏中可能不稳定(Kendal等，1980)。每剂0.5ml的疫苗优选含有约10-500亿个病毒颗粒，优选100亿个病毒颗粒。
下面通过以下实施例进一步描述本发明。
实施例1材料与方法细胞与病毒.将293T人胚肾细胞和Madin-Darby狗肾(MDCK)细胞分别在补充10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)和含有5％新生小牛血清的改良Eagle培养基(MEM)中进行培养。所有细胞都维持在37℃/5％CO2中。流感病毒A/WSN/33(H1N1)和A/PR/8/34(H1N1)在10日龄鸡胚中繁殖。
质粒的构建.为了产生RNA聚合酶I构建体，将衍生自A/WSN/33或A/PR/8/34病毒RNA的克隆cDNA引入到RNA聚合酶I启动子和终止序列之间。简而言之，使用含有BsmBI位点的引物，通过PCR扩增该克隆cDNA，用BsmBI消化，克隆到pHH21载体的BsmBI位点，所述载体含有人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子，其间被BsmBI位点间隔开(图2)。分别通过使用以下质粒pSCWPB2、pGW-PB1和pSCWPA(都得自Debi Nayak博士，Universityof Califormia Los Angeles)和pWH17、pWNP152、pT3WNA15(Castrucci等，1992)、pGT3WM、pWNS1，将A/WSN/33株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因进行PCR扩增。流感A/PR/8/34病毒的PB1基因通过使用pcDNA774(PB1)(Perez等，1998)作为模板进行扩增。引物序列参见图6。为了确保这些基因不含不需要的突变，用自动测序仪(Applied Biosystem Inc.，CA，USA)，按照生产商推荐的方案，对来自PCR的片段进行测序。按照Huddleston等(1982)介绍的方法，对编码A/WSN/33病毒HA、NP、NA和M1基因的cDNA进行克隆并亚克隆到真核表达载体pCAGGS/MCS(处于鸡β-肌动蛋白启动子的控制下)中(Niwa等，1991)，分别得到pEWSN-HA、pCAGGS-WSN-NP0-14、pCAGGS-WNA15和pCAGGS-WSN-M1-2/1。来自A/PR/8/34病毒的M2和NS2基因通过PCR扩增并克隆到pCAGGS/MCS中，得到pEP24c和pCA-NS2。最后，用pcDNA774(PB1)、pcDNA762(PB2)和pcDNA787(PA)，在巨细胞病毒启动子的控制下表达PB2、PB2和PA蛋白(Perez等，1998)。
感染性流感病毒颗粒的产生.使用Trans IT LT-1(Panvera，Madison，Wisconsin)，按照生产商的说明书，用最多达17种质粒以不同数量转染293T细胞(1×106)。简而言之，将DNA和转染试剂混合在一起(每μg DNA 2μl Trans IT LT-1)，在室温下孵育45分钟，然后加入到细胞中。6小时后，用含有0.3％牛血清白蛋白和0.01％胎牛血清的Opti-MEM(Gibco/BRL，Gaithersburg，Maryland)更换DNA-转染试剂混合物。转染后，在不同时间收获上清液中的病毒，在MDCK细胞上测定其滴度。因为该方法不需要辅助病毒，所以回收的转染病毒无需噬斑纯化就可直接进行分析。
质粒转染细胞产生的病毒百分率测定.转染后24小时，293T细胞用0.02％EDTA分散成单细胞。然后将细胞悬液进行10倍稀释，转移到长满单层MDCK细胞的24孔板中。通过血细胞凝集试验来检测病毒。
免疫染色测定.用流感病毒感染后9小时，细胞用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤2次，用3.7％低聚甲醛(溶于PBS)在室温下固定20分钟。然后，按照Neumann等(1997)介绍的方法，用0.1％Triton X-100处理和加工。
结果通过质粒驱动的病毒RNA区段、3种聚合酶亚基和NP蛋白的表达，产生感染性病毒.尽管用纯化病毒体提取的RNP混合物转染细胞，产生感染性流感病毒颗粒，但是当用8种不同的体外产生的RNP时，该策略不一定有效。为了完全从cDNA产生感染性流感病毒，体内产生8种病毒RNP。因此，制备含有A/WSN/33病毒全长病毒RNA的cDNA的质粒，所述cDNA邻接人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子。原则上来说，这8种质粒转染到真核细胞，将导致所有8种流感病毒vRNA的合成。然后，通过蛋白表达质粒共转染所产生的PB2、PB1、PA和NP蛋白将与vRNA一起装配成可复制和转录的功能性vRNP，最终形成感染性流感病毒(图3)。用蛋白表达质粒(1μg pcDNA762(PB2)、1μg pcDNA774(PB1)、0.1μgpcDNA787(PA)和1μg pCAGGS-WSN-NP0/14)和各1μg以下RNA聚合酶I质粒(pPolI-WSN-PB2、pPolI-WSN-PB1、pPolI-WSN-PA、pPolI-WSN-HA、pPolI-WSN-NP、pPolI-WSN-NA、pPolI-WSN-M和pPolI-WSN-NS)，转染1×106293T细胞。使用减少量的pcDNA787(PA)的做法是根据以前的观察结果(Mena等，1996)，并根据用于产生病毒样颗粒(VLP)的最佳条件的数据(数据未显示)。293T细胞转染后24小时，在上清液中发现7×103pfu病毒/ml(实验1，表1)，首次证明采用反求遗传学完全能够从质粒产生甲型流感病毒。
表1.用于从克隆cDNA产生流感病毒的质粒系列*
*293T细胞用指定质粒转染。24小时(实验1和2)或48小时(实验3-8)后，测定MDCK细胞上清液中的病毒滴度。
+除非另有说明，否则质粒用代表A/WSN/33病毒RNA的cDNA来构建。
用所有病毒结构蛋白的共表达，产生流感病毒的效率.尽管病毒NP和聚合酶蛋白的表达对质粒驱动流感病毒的产生是足够的，但是其效率还可以提高。在先前的研究中，所有流感病毒结构蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2和NS2)的表达，产生VLP，所得VLP含有编码氯霉素-乙酰转移酶报道基因的人工vRNA(Mena等，1996)。因此，结构蛋白完整组分的利用度、而不仅是病毒RNA复制和转录所需要的那几种，可以提高病毒生产效率。为此，用以下最佳数量的病毒蛋白表达质粒(根据VLP产生而判断；未发表的数据)转染293T细胞1μg pcDNA762(PB2)和pcDNA774(PB1)；0.1μgpcDNA787(PA)；1μg pEWSN-HA、pCAGGS-WSN-NP0/14和pCAGGS-WNA15；2μg pCAGGS-WSN-M1-2/1；0.3μg pCA-NS2；和0.03μg pEP24c(对于M2)，以及各1μg RNA聚合酶I质粒(实验2，表1)。用相同系列的RNA聚合酶I质粒(除了PB1基因之外，因为pPolI-PR/8/34-PB1被取代，以便产生重配病毒)以及仅表达PA、PB1、PB2和NP的质粒(实验3，表1)或表达所有流感结构蛋白的质粒(实验4，表1)，转染第二系列细胞。得到的WSN病毒在转染后24小时(实验1和2，表1)或36小时并无很大差异(数据未显示)。然而，当提供所有流感病毒结构蛋白时，发现带有PR/8/34-PB1的病毒产量增加10倍以上(实验3和4，表1)。缺乏一个表达PA、PB1、PB2、NP蛋白的质粒的阴性对照不能得到任何病毒(实验5-8，表1)。因此，根据所产生的病毒，所有甲型流感病毒结构蛋白的表达极大提高了反求遗传学方法的效率。
随后，使用用于产生带有A/PR/8/34-PB1基因的病毒的质粒系列，来测量细胞转染后病毒产生的动力学。在3次实验中有2次，在感染后24小时首次检测出病毒。当时测出的滴度＞103pfu/ml，在转染后48小时增加到＞106pfu/ml(表2)。为了估计质粒转染细胞产生病毒的百分率，将293T细胞在转染后24小时用EDTA(0.02％)处理以分散细胞，然后进行有限稀释研究。在该实验中，在该时间点在培养上清液中没有发现游离病毒。该结果表明，每103.3个细胞中有1个细胞会产生感染性病毒颗粒。
表2.质粒转染到293T细胞后病毒产生的动力学*
*用编码除PB1基因外的A/WSN/33病毒基因的8种RNA聚合酶I质粒，以及如上所述9种蛋白表达质粒，来转染293T细胞，该A/WSN/33来自A/PR/8/34病毒。在不同时间点，我们测定了MDCK细胞培养上清液中的病毒滴度。ND＝未做。
在NA蛋白中含有FLAG表位的流感病毒的回收.为了证实新反求遗传学系统允许将突变引入到甲型流感病毒基因组中，产生在NA蛋白中含有FLAG表位的病毒(Castrucci等，1992)。用RNA聚合酶I质粒(pPolI-WSN-NA/FL79)以及所需的RNA聚合酶I和蛋白表达质粒来转染293T细胞，所述RNA聚合酶I质粒含有同时编码NA蛋白以及在所述蛋白头部下面的FLAG表位的cDNA。为了证实回收病毒(PR8-WSN-FL79)确实能表达NA-FLAG蛋白，对感染PR8-WSN-FL79或A/WSN/33野生型病毒的细胞进行免疫染色测定。抗FLAG表位的单克隆抗体检测出感染PR8-WSN-FL79的细胞，而不是感染野生型病毒的细胞。PR8-WSN-FL79病毒的回收率与未标记的野生型病毒相同(数据未显示)。这些结果表明，新反求遗传学系统允许将突变引入到甲型流感病毒基因组中。
在PA基因中含有突变的感染性流感病毒的产生.为了产生在PA基因中具有突变的病毒，引入两个沉默突变，产生限制性内切核酸酶的新识别序列(Bsp120I，在mRNA的846位，以及PvuII，在mRNA的1284位)。先前，不能通过反求遗传学修饰该基因，因为缺乏可靠的选择系统。回收了转染病毒PA-T846C和PA-A1284。通过两次连续有限稀释，将回收的转染病毒进行生物学无性繁殖。为了证实回收的病毒确实是在PA基因中带有突变的转染子，通过逆转录酶-PCR得到PA基因的cDNA。PA-T846C和PA-A1284C病毒在PA基因中具有预期突变，新引入限制位点的存在证明了这一点。没有逆转录步骤的相同病毒样品和引物通过PCR扩增没有产生任何产物(数据未显示)，表明PA cDNA确实来源于vRNA，而不是用于产生病毒的质粒。这些结果说明，不用辅助病毒时，怎样产生和回收带有突变基因的病毒。
讨论本文所述反求遗传学系统允许完全从克隆cDNA有效产生甲型流感病毒。Bridgen和Elliott(1996)也使用反求遗传学产生了布尼奥罗病毒(布尼亚病毒科)，但是它仅含有3个负义RNA区段，并且其产生的效率低，仅为102pfu/107细胞。尽管病毒在实验中产量不同，对于含有8个区段的流感病毒来说，始终观察到＞103pfu/106细胞。对于上述反求遗传学系统的高效率来说，有几种解释。与体外产生RNP不同(Luytjes等，1989)，RNP在体内是通过使用RNA聚合酶I进行vRNA的胞内合成并且通过质粒驱动的病毒聚合酶蛋白和NP的表达而产生。另外，使用容易转染质粒的293T细胞(Goto等，1997)，确保大量细胞得到所有病毒产生所需质粒。另外，RNA聚合酶I(这在生长细胞中是最丰富表达的酶)产生大量转录物，可能有助于系统的总效率。这些特点导致相当丰富的vRNA转录物和足够量的病毒蛋白，用于包裹vRNA，在核中形成RNP，并将这些复合体输出到细胞膜，在此新病毒进行装配，然后释放。
以前建立的反求遗传学系统(Enami等，1990；Neumann等，1994；Luytjes等，1989；Pleschka等，1996)需要辅助病毒感染，并因此需要选择方法，以允许从极大量的辅助病毒中回收少量的转染子。已经采用所述策略产生带有一个以下来自cDNA基因的流感病毒PB2(Subbarao等，1993)、HA(Enami等，1991；Horimoto等，1994)、NP(Li等，1995)、NA(Enami等，1990)、M(Castrucci等，1995；Yasuda等，1994)和NS(Enami等，1991)。大多数选择方法除了用于HA和NA基因之外，依赖于生长温度、宿主范围限制或药物敏感性，因此限制了反求遗传学在基因产物功能性分析中的应用。甚至是在可以使用具有HA和NA基因用于可靠的抗体驱动的选择系统时，仍然难以产生具有显著生长缺陷的病毒。相比之下，本文所述的反求遗传学系统不需要辅助病毒，并允许产生在任何基因区段中都带有突变的转染子或者带有严重生长缺陷的转染子。具有可将任何可行的突变引入甲型流感病毒基因组中的技术，将使研究人员致力于许多长期课题的研究，例如病毒基因组非翻译区中的调节序列的性质、病毒蛋白结构与功能的关系和宿主范围限制和病毒致病性的分子基础。
尽管灭活流感疫苗是可用的，但是其功效还不是最佳的，这部分是因为其诱导局部IgA和细胞毒性T细胞应答的有限能力。目前正在进行的冷适应活流感疫苗的临床试验表明，所述疫苗是最佳减毒的，所以它们不会引起流感症状，但是仍会诱导保护性免疫力(有关综述参见Keitel & Piedra，1998)。然而，初步结果表明，这些活病毒疫苗的效果将不会比最好的灭活疫苗更显著(有关综述参见Keitel &Piedra，1998)，这尚需要作进一步改进。一个可能的做法是用上述反求遗传学系统来修饰冷适应疫苗。或者，可以通过从使用反求遗传学开始，产生一种编码内部蛋白的基因中带有多重减毒突变的“母种”甲型流感株。上述反求遗传学系统最令人着迷的用途可能是，如果发生怀疑包括流感病毒新HA或NA亚型在内的大流行，能快速生产出减毒活病毒疫苗。
这一新反求遗传学系统可能会加强流感病毒作为疫苗载体的应用。病毒可以经工程改造，使其除表达流感病毒蛋白之外，还表达外源蛋白或免疫原性表位。人们可以例如产生具有外源蛋白作为第9区段的病毒(Enami等，1991)并将其用作活疫苗。流感病毒不仅刺激强烈的细胞介导的免疫应答和体液免疫应答，而且还提供各种各样的病毒体表面HA和NA蛋白(例如15种HA和9种NA亚型及其流行变异株)，允许对同一目标群体进行重复免疫。
已经通过使用痘苗-T7聚合酶系统来表达病毒结构蛋白和vRNA，产生了具有编码报道基因的人工vRNA的流感VLP(Mena等，1996)。使用反求遗传学，人们现在可以产生含有vRNA的VLP，所述vRNA编码vRNA转录和复制所需的蛋白(即PA、PB1、PB2和NP)，以及编码目标蛋白。所述VLP可以是有用的基因传递载体。重要的是，它们缺乏编码病毒结构蛋白的基因，这将确保VLP-基因治疗后将不会产生感染性病毒。因为流感病毒基因组不整合到宿主染色体中，所以VLP系统将适用于仅需要短期转导细胞的基因治疗(例如用于癌症治疗)。与腺病毒载体(Kovesdi等，1997)不同，流感VLP可同时含有HA和NA变异体，允许对目标群体进行重复治疗。
正粘病毒科包括甲、乙、丙型流感病毒，以及最新分类的托高土病毒(Thogotovirus)。完全从本文所述的克隆cDNA产生感染性甲型流感病毒的策略将适用于任何正粘病毒，并且也许适用于其它分节段负义RNA病毒(例如布尼亚病毒科、沙粒病毒科)。不受技术限制地操纵病毒基因组的能力，对病毒生命周期及其调控、病毒蛋白的功能和病毒致病性的分子机制的研究来说，具有深远意义。
实施例2为了开发用于流感A/Puerto Rico/8/34的反求遗传学系统，根据生产商的方案，用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)，从A/Puerto Rico/8/34(H1N1)、Madison高生长变异株(PR8HG)的尿囊液中提取病毒RNA。用MMLV-RTase(Promega)和Unil2引物，合成cDNA。通过PCR扩增该cDNA过夜，使用以下引物系列PB1Ba PB1-1和PB1-1735R(前片段)和PB1-903和Ba-PB1-2341R(后片段)Ba-PB1-1 CACACACGGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGCA(SEQID NO9)173PB1-1735R GGGTTTGTATTTGTGTGTCACC(SEQ ID NO10)233PB1-903 CCAGGACACTGAAATTTCTTTCAC(SEQ ID NO11)Ba-PB1-2341RCACACAGGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGCATTT(SEQ IDNO12)PB2Ba PB2-1和B2 1260R(前片段)和WSNPB2 seq-2和Ba-PB2-2341R(后片段)Ba-PB2-1 CACACAGGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGTC(SEQID NO13)B2 1260R CACACACGTCTCCATCATACAATCCTCTTG(SEQ IDNO14)WSNPB2 seq-2 CTCCTCTGATGGTGGCATAC(SEQ ID NO15)Ba-PB2-24341RCACACAGGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT(SEQ IDNO16)PABm-PA-1 CACACACGTCTCCGGGAGCGAAAGCAGGTAC(SEQID NO17)Bm-PA-2233RCACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGTACTT(SEQ IDNO18)HABm-HA-1CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGG(SEQ IDNO19)Bm-NS-890RCACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT(SEQ IDNO20)NPBm-NP-1 CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGTA(SEQID NO21)
Bm-NP-1565RCACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT(SEQ IDNO22)NABa-NA-1CACACAGGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGAGT(SEQID NO23)Ba-NA-1413RCACACAGGTCTGGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT(SEQID NO24)MBm-M-1 CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGTAG(SEQID NO25)Bm-M-1027RCACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT(SEQ IDNO26)NSBm-NS-1 CACACACGTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGTG(SEQID NO27)Bm-NS-890RCACACACGTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT(SEQ IDNO28)DNA聚合酶pfu天然DNA聚合酶(Stratagene)。
所得PCR产物进行凝胶电泳分离，然后用凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中提取出来。将提取的基因用Takara连接试剂盒ver.II(Takara)连接到pT7Blue平端载体(Novagen)中。5小时后，将连接的基因转化到JM109(PB2、M和NS基因)或DH5α(PA、PB1和NP)中。每个基因的6个菌落在TB上培养8小时。从细菌培养物中提取质粒，对每基因的4个克隆进行测序。
pT7Blue中的PA、NP、M和NS基因用Bsm BI酶(New EnglandBiolabs)切割。PB1基因用Bsa I(New England Biolabs)切割。将切下的基因与已经用Bsm BI消化的pPolIR载体连接过夜，所述载体含有人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子。pT7Blue中PB2基因的前段用Bsr GI(New England Biolabs)和Bam HI(Roche)切割，而后段用Bsr GI(New England Biolabs)和Spe I(Roche)切割。将切割的片段混合在一起，用Bsa I消化。6小时后，消化的基因用PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化，连接过夜，连接在pPolIR载体的Bsm BI位点之间。
用连接的PB1、PA、NP、M和NS-pPolIR基因转化JM109(M和NS基因)或DH5α(PB1、PA和NP基因)过夜。转化细菌的菌落在LB中培养过夜。用连接的PB2-pPolIR转化JM109过夜。
从细菌培养物中提取质粒，通过酶消化，证实基因插入序列。将PB2-PolIR转化的细菌菌落在LB中培养8小时。然后提取质粒，通过酶消化证实基因插入序列。所有pPolI构建体都进行测序，以确保没有不想要的突变。
将用于PR8HG的PPolIR构建体转染到293T人胚肾细胞中，所述细胞携带A/WSN/33(WSN)-HA和NA、A/HongKong/483/97(HK)-HAavir和NA、或A/Kawasaki/01(Kawasaki)-HA和NA PolI构建体和聚合酶蛋白的4种蛋白的表达构建体和A/WSN/33的NP。转染293T细胞的上清液进行连续稀释(从未稀释至10-7)，然后感染9日龄含胚鸡胚尿囊腔中。收获感染鸡胚的尿囊液，用HA测定法检测其病毒滴度(表3)。
表3
对HA阳性样品(具有WSN-HA NA的病毒(10-2)和具有HK-HAavir NA的病毒(未稀释))进行10-2-10-8的连续稀释，然后每一稀释度均取100μl感染含胚的鸡胚。收获感染的鸡胚尿囊液，通过HA测定法检测其病毒滴度(表4)。从质粒制备的A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的50％鸡胚感染剂量(EID50)为1010.33/ml，而HA滴度为1∶3200。
制备这样的重组病毒其HA和NA基因来自A/HongKong/213/2003(H5N1)，而甲型流感病毒的其它基因来自PR8HG。重组病毒的滴度为1010.67EID50/ml，而HA滴度为1∶1600。
表4
PR8基因序列PAAGCGAAAGCA GGTACTGATC CAAAATGGAA GATTTTGTGCGACAATGCTTCAATCCGATG ATTGTCGAGC TTGCGGAAAA AACAATGAAAGAGTATGGGGAGGACCTGAA AATCGAAACA AACAAATTTG CAGCAATATGCACTCACTTGGAAGTATGCT TCATGTATTC AGATTTTCAC TTCATCAATGAGCAAGGCGAGTCAATAATC GTAGAACTTG GTGATCCAAA TGCACTTTTGAAGCACAGATTTGAAATAAT CGAGGGAAGA GATCGCACAA TGGCCTGGACAGTAGTAAACAGTATTTGCA ACACTACAGG GGCTGAGAAA CCAAAGTTTCTACCAGATTTGTATGATTAC AAGGAGAATA GATTCATCGA AATTGGAGTAACAAGGAGAGAAGTTCACAT ATACTATCTG GAAAAGGCCA ATAAAATTAAATCTGAGAAAACACACATCC ACATTTTCTC GTTCACTGGG GAAGAAATGGCCACAAAGGCAGACTACACT CTCGATGAAG AAAGCAGGGC TAGGATCAAAACCAGACTATTCACCATAAG ACAAGAAATG GCCAGCAGAG GCCTCTGGGATTCCTTTCGT
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实施例3流感病毒A/Hong Kong/213/2003(H5N1，HK213)在鸡的全身都可进行复制，引起致命感染。此外，该病毒对鸡胚也是致命的。因此，尽管其表面蛋白与目前流行的高致病性禽流感病毒密切相关，但是HK213不能用作疫苗株，因为如果将其在含胚鸡胚中进行培养，会产生品质很差的尿囊液。此外，采用高毒力病毒生产疫苗，对疫苗生产者来说不安全。为了测试使用A/PR/8/34作为母种疫苗株的可行性，HK213血凝素(HA)基因切割位点(含有多个碱性氨基酸)从强毒表型突变成无毒表型(从RERRRKKR(SEQ ID NO9)变成----TETR)。含有突变型HA基因的病毒在鸡体内产生非致命性局部感染。此外，突变型病毒对鸡胚来说也是非致命性的。因此，突变型病毒在含胚卵中生长，可生产高品质的尿囊液，并且因为呈减毒形式，所以该病毒对疫苗生产者来说是安全的。
在含胚鸡胚中产生这样的重组病毒含有神经氨酸酶(NA)和来自HK213的突变型HA基因以及来自高滴度A/PR/8/34(H1N1，HG-PR8)病毒(实施例2)的所有其它基因，其在鸡胚中的生长比起A/PR/8/34 PR8的其它毒株来说要高10倍(1010EID50/ml；HA滴度1∶8,000)。表达表面蛋白的该重组病毒与当前流行的高致病性禽流感病毒有关，在含胚鸡胚中可生长至高滴度(图4)。因此，用当前流行的流感病毒株的HA和NA基因取代HG-PR8中的HA和NA基因，得到可安全生产的疫苗株，并且证明了PR8-HG作为母种疫苗株的用途。
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所有出版物、专利和专利申请都通过引用结合到本文中。尽管在上述说明书中已经描述了本发明涉及到的某些优选实施方案，而且为了说明的目的，已经给出了大量细节，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明允许其它的实施方案并且在不偏离本发明基本原则的情况下，对某些本文描述的细节可以进行适当修改。
序列表<110>河冈义裕(Kawaoka，Yoshihiro)<120>用于疫苗和基因治疗的高滴度重组流感病毒<130>800.038WO1<150>US 60/473,798<151>2003-05-28<160>40<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>2233<212>DNA<213>流感病毒<400>1agcgaaagca ggtactgatc caaaatggaa gattttgtgc gacaatgctt caatccgatg 60attgtcgagc ttgcggaaaa aacaatgaaa gagtatgggg aggacctgaa aatcgaaaca120aacaaatttg cagcaatatg cactcacttg gaagtatgct tcatgtattc agattttcac180ttcatcaatg agcaaggcga gtcaataatc gtagaacttg gtgatccaaa tgcacttttg240aagcacagat ttgaaataat cgagggaaga gatcgcacaa tggcctggac agtagtaaac300agtatttgca acactacagg ggctgagaaa ccaaagtttc taccagattt gtatgattac360aaggagaata gattcatcga aattggagta acaaggagag aagttcacat atactatctg420gaaaaggcca ataaaattaa atctgagaaa acacacatcc acattttctc gttcactggg480gaagaaatgg ccacaaaggc agactacact ctcgatgaag aaagcagggc taggatcaaa540accagactat tcaccataag acaagaaatg gccagcagag gcctctggga ttcctttcgt600cagtccgaga gaggagaaga gacaattgaa gaaaggtttg aaatcacagg aacaatgcgc660aagcttgccg accaaagtct cccgccgaac ttctccagcc ttgaaaattt tagagcctat720gtggatggat tcgaaccgaa cggctacatt gagggcaagc tgtctcaaat gtccaaagaa780gtaaatgcta gaattgaacc ttttttgaaa acaacaccac gaccacttag acttccgaat840gggcctccct gttctcagcg gtccaaattc ctgctgatgg atgccttaaa attaagcatt900
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<213>流感病毒<400>3agcgaaagca ggtcaattat attcaatatg gaaagaataa aagaactacg aaatctaatg 60tcgcagtctc gcacccgcga gatactcaca aaaaccaccg tggaccatat ggccataatc 120aagaagtaca catcaggaag acaggagaag aacccagcac ttaggatgaa atggatgatg 180gcaatgaaat atccaattac agcagacaag aggataacgg aaatgattcc tgagagaaat 240gagcaaggac aaactttatg gagtaaaatg aatgatgccg gatcagaccg agtgatggta 300tcacctctgg ctgtgacatg gtggaatagg aatggaccaa taacaaatac agttcattat 360ccaaaaatct acaaaactta ttttgaaaga gtcgaaaggc taaagcatgg aacctttggc 420cctgtccatt ttagaaacca agtcaaaata cgtcggagag ttgacataaa tcctggtcat 480gcagatctca gtgccaagga ggcacaggat gtaatcatgg aagttgtttt ccctaacgaa 540gtgggagcca ggatactaac atcggaatcg caactaacga taaccaaaga gaagaaagaa 600gaactccagg attgcaaaat ttctcctttg atggttgcat acatgttgga gagagaactg 660gtccgcaaaa cgagattcct cccagtggct ggtggaacaa gcagtgtgta cattgaagtg 720ttgcatttga ctcaaggaac atgctgggaa cagatgtata ctccaggagg ggaagtgagg 780aatgatgatg ttgatcaaag cttgattatt gctgctagga acatagtgag aagagctgca 840gtatcagcag atccactagc atctttattg gagatgtgcc acagcacaca gattggtgga 900attaggatgg tagacatcct taggcagaac ccaacagaag agcaagccgt ggatatatgc 960aaggctgcaa tgggactgag aattagctca tccttcagtt ttggtggatt cacatttaag1020agaacaagcg gatcatcagt caagagagag gaagaggtgc ttacgggcaa tcttcaaaca1080ttgaagataa gagtgcatga gggatatgaa gagttcacaa tggttgggag aagagcaaca1140gccatactca gaaaagcaac caggagattg attcagctga tagtgagtgg gagagacgaa1200cagtcgattg ccgaagcaat aattgtggcc atggtatttt cacaagagga ttgtatgata1260aaagcagtca gaggtgatct gaatttcgtc aatagggcga atcaacgatt gaatcctatg1320catcaacttt taagacattt tcagaaggat gcgaaagtgc tttttcaaaa ttggggagtt1380gaacctatcg acaatgtgat gggaatgatt gggatattgc ccgacatgac tccaagcatc1440gagatgtcaa tgagaggagt gagaatcagc aaaatgggtg tagatgagta ctccagcacg1500gagagggtag tggtgagcat tgaccgtttt ttgagaatcc gggaccaacg aggaaatgta1560ctactgtctc ccgaggaggt cagtgaaaca cagggaacag agaaactgac aataacttac1620tcatcgtcaa tgatgtggga gattaatggt cctgaatcag tgttggtcaa tacctatcaa1680tggatcatca gaaactggga aactgttaaa attcagtggt cccagaaccc tacaatgcta1740tacaataaaa tggaatttga accatttcag tctttagtac ctaaggccat tagaggccaa1800tacagtgggt ttgtaagaac tctgttccaa caaatgaggg atgtgcttgg gacatttgat1860accgcacaga taataaaact tcttcccttc gcagccgctc caccaaagca aagtagaatg1920cagttctcct catttactgt gaatgtgagg ggatcaggaa tgagaatact tgtaaggggc1980aattctcctg tattcaacta taacaaggcc acgaagagac tcacagttct cggaaaggat2040
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<223>合成引物<400>9cacacacggt ctccgggagc gaaagcaggc a 31<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>10gggtttgtat ttgtgtgtca cc 22<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物
<400>11ccaggacact gaaatttctt tcac 24<210>12<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>12cacacaggtc tcctattagt agaaacaagg cattt 35<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>13cacacaggtc tccgggagcg aaagcaggtc 30<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>14cacacacgtc tccatcatac aatcctcttg 30
<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>15ctcctctgat ggtggcatac 20<210>16<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>16cacacaggtc tcctattagt agaaacaagg tcgttt36<210>17<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>17cacacacgtc tccgggagcg aaagcaggta c 31<210>18<211>35<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>18cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg tactt 35<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>19cacacacgtc tccgggagca aaagcagggg 30<210>20<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>20cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg gtgtttt 37<210>21<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>21cacacacgtc tccgggagca aaagcagggt a 31<210>22<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>22cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg gtattttt 38<210>23<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>23cacacaggtc tccgggagca aaagcaggag t 31<210>24<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>24cacacaggtc tggtattagt agaaacaagg agtttttt 38
<210>25<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>25cacacacgtc tccgggagca aaagcaggta g 31<210>26<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>26cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg tagttttt 38<210>27<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>27cacacacgtc tccgggagca aaagcagggt g 31<210>28<211>37
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>28cacacacgtc tcctattagt agaaacaagg gtgtttt 37<210>29<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成载体序列<400>29gggttattgg agacggtacc gtctcctccc ccc 33<210>30<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成载体序列<400>30ggggggagga gacggtaccg tctccaataa ccc 33<210>31<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成载体/流感病毒cDNA序列<220>
<221>其他特征<222>(1)...(18)<223>n＝A、T、C或G<400>31cgtctcntat tagtagaa18<210>32<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成载体/流感病毒cDNA序列<220>
<221>其他特征<222>(1)...(17)<223>n＝A、T、C或G<400>32ttttgctccc ngagacg 17<210>33<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成载体/流感病毒cDNA序列<220>
<221>其他特征
<222>(1)...(17)<223>n＝A、T、C或G<400>33cgtctcnggg agcaaaa 17<210>34<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成载体/流感病毒cDNA序列<220>
<221>其他特征<222>(1)...(18)<223>n＝A、T、C或G<400>34ttctactaat angagacg18<210>35<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成载体/流感病毒cDNA序列<400>35tattagtaga a 11<210>36<211>10<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成载体/流感病毒cDNA序列<400>36gggagcaaaa 10<210>37<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成载体/流感病毒cDNA序列<400>37gggttattag tagaa 15<210>38<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成载体/流感病毒cDNA序列<400>38ttttgctccc ccc 13<210>39<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成载体/流感病毒cDNA序列
<400>39ggggggagca aaa 13<210>40<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成载体/流感病毒cDNA序列<400>40ttctactaat aaccc 1权利要求
1.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含核酸区段或所述核酸区段的互补序列，所述核酸区段编码流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、PB1、PB2、PA、NP、M、NS或其部分，它们具有与SEQ ID NO1-8之一所编码的相应多肽基本上相同的活性。
2.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含核酸区段或所述核酸区段的互补序列，所述核酸区段编码流感病毒HA、NA、PB1、PB2、PA、NP、M或NS，它们具有与SEQ ID NO1-8之一所编码的相应多肽基本上相同的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸具有与SEQ ID NO1-8之一或其互补序列基本上相同的核苷酸序列。
4.权利要求1或2的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸在中等严格性条件下与SEQ ID NO1-8之一或其互补序列杂交。
5.权利要求1或2的分离的多核苷酸，所述多核苷酸还包含启动子。
6.权利要求5的分离的多核苷酸，其中所述启动子是RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子、T3启动子或T7启动子。
7.权利要求1或2的分离的多核苷酸，其中相对于SEQ ID NO1-8之一所编码的相应多肽来说，所述多核苷酸编码具有一个或多个保守取代的多肽。
8.一种组合物，所述组合物包含多种流感病毒载体，所述载体包括a)至少两种选自以下的载体包含与流感病毒PA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB1 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB2cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒HA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NP cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒M cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，或者包含与流感病毒NS cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，其中至少一种载体包含与权利要求1或2的多核苷酸操作性连接的启动子及转录终止序列；和b)至少两种选自以下的载体包含与编码流感病毒PA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒PB1的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒PB2的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒NP的DNA区段操作性连接的启动子的载体，并且任选还选自以下的载体包含与编码流感病毒HA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒NA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒M1的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒M2的DNA区段操作性连接的启动子的载体，或者包含与编码流感病毒NS2的DNA区段操作性连接的启动子的载体，其中任选至少一种载体包含与权利要求1或2的多核苷酸操作性连接的启动子。
9.一种组合物，所述组合物包含多种流感病毒载体，所述载体包括a)至少两种选自以下的载体包含与流感病毒PA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB1 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB2cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒HA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NP cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NB cDNA和NA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒M cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，或者包含与流感病毒NS cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，其中至少一种载体包含与权利要求1或2的多核苷酸操作性连接的启动子及转录终止序列；和b)至少两种选自以下的载体包含与编码流感病毒PA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒PB1的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒PB2的DNA区段操作性连接的启动子的载体，或者包含与编码流感病毒NP的DNA区段操作性连接的启动子的载体，并且任选还选自以下的载体包含与编码流感病毒HA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒NA和NB的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒M的DNA区段操作性连接的启动子的载体，或者包含与编码流感病毒NS2的DNA区段操作性连接的启动子的载体，其中任选至少一种载体包含与权利要求1或2的多核苷酸操作性连接的启动子。
10.权利要求8或9的组合物，其中所述血凝素(HA)是A型HA。
11.权利要求8或9的组合物，其中所述血凝素(HA)是B型HA。
12.权利要求8或9的组合物，其中a)的多种载体包含RNA聚合酶I启动子或RNA聚合酶II启动子。
13.权利要求12的组合物，其中所述RNA聚合酶I启动子是人RNA聚合酶I启动子。
14.权利要求8或9的组合物，其中所有a)的载体都包含RNA聚合酶II启动子。
15.权利要求8或9的组合物，其中每种a)的载体都在各自的质粒上。
16.权利要求8或9的组合物，其中每种b)的载体都在各自的质粒上。
17.权利要求8或9的组合物，其中每种b)的载体还包含RNA转录终止序列。
18.权利要求8或9的组合物，所述组合物还包含载体，所述载体包含启动子、包含5′流感病毒非编码序列的5′流感病毒序列、目标cDNA、包含3′流感病毒非编码序列的3′流感病毒序列和转录终止序列，它们彼此按上述顺序连接在一起。
19.权利要求18的组合物，其中所述目标cDNA呈有义方向。
20.权利要求18的组合物，其中所述目标cDNA呈反义方向。
21.权利要求18的组合物，其中所述目标cDNA包含编码病原体免疫原性多肽或肽或治疗性多肽或肽的可读框。
22.一种制备流感病毒的方法，所述方法包括使细胞与有效量的权利要求8-21中任一项的组合物接触，以产生感染性流感病毒。
23.权利要求22的方法，所述方法还包括分离所述病毒。
24.通过权利要求22的方法所获得的病毒。
25.一种制备基因传递载体的方法，所述方法包括使细胞与有效量的权利要求18-21中任一项的组合物接触，以产生流感病毒；并且分离所述病毒。
26.通过权利要求25的方法所获得的病毒。
27.一种接触了权利要求8-21中任一项的组合物的细胞。
28.一种被权利要求24或26的病毒感染的细胞。
29.一种载体，所述包含启动子和核酸区段，所述核酸区段包含编码流感病毒蛋白的核酸，其中所述流感病毒蛋白是流感病毒PA，其具有与SEQ ID NO1所编码的多肽基本上相同的活性；流感病毒PB1，其具有与SEQ ID NO2所编码的多肽基本上相同的活性；流感病毒PB2，其具有与SEQ ID NO3所编码的多肽基本上相同的活性；流感病毒NP，其具有与SEQ ID NO4所编码的多肽基本上相同的活性；流感病毒HA，其具有与SEQ ID NO7所编码的多肽基本上相同的活性；流感病毒NA，其具有与SEQ ID NO8所编码的多肽基本上相同的活性；流感病毒M cDNA，其具有与SEQ ID NO5所编码的多肽基本上相同的活性；和/或流感病毒NS，其具有与SEQID NO6所编码的多肽基本上相同的活性。
30.一种制备流感病毒的方法，所述方法包括使细胞与以下载体接触包含与流感病毒PA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB1 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB2 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒HA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NP cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒M cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NS cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与编码流感病毒PA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒PB1的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒PB2的DNA区段操作性连接的启动子的载体，以及包含与编码流感病毒NP的DNA区段操作性连接的启动子的载体，以便产生感染性病毒，其中在至少一种包含病毒cDNA的载体中的启动子包括与权利要求1或2的多核苷酸连接的启动子，而权利要求1或2的多核苷酸又与转录终止序列连接。
31.权利要求30的方法，其中还包括以下载体包含与编码流感病毒HA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒NA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒M1的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒M2的DNA区段操作性连接的启动子的载体，以及包含与编码流感病毒NS2的DNA区段操作性连接的启动子的载体。
32.权利要求30或31的方法，其中还包括载体，所述载体包含启动子、包含5′流感病毒非编码序列的5′流感病毒序列、目标cDNA或其片段、包含3′流感病毒非编码序列的3′流感病毒序列和转录终止序列，它们彼此按上述顺序连接在一起。
33.权利要求32的方法，其中所述目标cDNA包含编码病原体免疫原性多肽或肽或治疗性多肽或肽的可读框。
34.权利要求32的方法，其中所述目标cDNA呈有义方向。
35.权利要求32的方法，其中所述目标cDNA呈反义方向。
36.权利要求32的方法，其中所述多核苷酸不是编码对应于SEQID NO7所编码多肽的HA的多核苷酸，和/或不是编码对应于SEQ IDNO8所编码多肽的NA的多核苷酸。
37.权利要求30-36中任一项的方法，所述方法还包括分离所述病毒。
38.通过权利要求30-37中任一项的方法所获得的病毒。
39.一种接触了权利要求38的病毒的细胞。
40.一种被权利要求38的病毒感染的细胞。
41.一种用于给个体进行抗病原体免疫的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的权利要求38的病毒，以对该个体进行免疫。
42.一种分离的流感病毒，所述病毒包含对应于权利要求1-7中任一项的多核苷酸的多核苷酸。
全文摘要
本发明提供一种可用于制备高滴度流感病毒的组合物，例如在不存在辅助病毒的情况下制备高滴度流感病毒的组合物，其包含来自高滴度流感病毒分离株的序列。
文档编号C12N7/04GK1826407SQ200480021259
公开日2006年8月30日 申请日期2004年5月27日 优先权日2003年5月28日
发明者河冈义裕 申请人:威斯康星旧生研究基金会