专利名称：用于增加来自海洋微生物的生物质和/或生物质成分的产率的方法
技术领域：
本发明涉及在好气条件(aerobic conditions)下培养海洋微生物的方法，其中在20-100小时中使用连续发酵过程生产100-300g/l的细胞干物质CDM。
背景技术：
在通过微生物的批量、补料分批或连续培养的生物质或构成生物质有效(significant)部分的成分的工业生产中，希望获得最高可能的生物质生产率。进一步地，构成基本上连续运转的发酵过程的优点是较少的人力需要以及较少的用于工艺控制的潜在需要。连续发酵过程依赖于足够稳定的使用菌株，并且如果这种菌株是可利用的，论及可获得包括产品浓度和产品可回收性的整个培养肉汤(broth)的特点，使用连续发酵过程可能提供容许较高均匀度的制造过程。
US 5,244,921描述了用于从例如Nitzschia alba的硅藻以商业上可行的产率生产二十碳五烯酸(EPA)的方法，其在60小时中的产率少于70gCDM/l。
US 5,711,983涉及用于从包括隐甲藻(Crypthecodinium sp)的海洋甲藻类(dinoflagellates)以商业上可行的产率生产二十二碳六烯酸(DHA)的方法。报到产率的范围是在75小时中为23gCDM/l和在160小时中为33gCDM/l。
EP 0823475 A1涉及从Schizochytrium属SR21生产DHA和DPA。报到所得到的产率是在150小时中最多为60gCDM/l。
US 5,518,918涉及包括选自Thraustochytrium和Schizochytrium的微生物的微生物系统生物质。获得的CDM少于8g/l。
WO 01/04338涉及培养微生物寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)用于合成多聚不饱和脂肪酸的方法。获得的产率在140小时中少于46gCDM/l。
US 6,582,941涉及Schizochytrium菌株。获得的产率在120h中少于60gCDM/l。
WO 01/54510涉及以补料分批发酵过程培养的真核微生物，以及特别是Thraustochytriads目(order)的微海藻，并且强调将整个发酵过程分为2个阶段的重要性一个用于起始的生物质积累，以及一个阶段容许在特定的营养限制和低氧压力的条件下发生多烯脂肪酸的累积。获得包含至少20％w/w脂类的大于100g/l的细胞干物质，同时DHA的生产率(ω-3 C226，二十二碳六烯酸)可高于补料分批发酵过程的0.3g/l/h。然而，可能由于涉及发酵过程的复杂特性，在进行的31个相同的发酵批量内显示DHA-生产率以～2的系数变化(参见实施例4)。WO 01/54510也显示当利用连续发酵过程时可获得达到20g/l细胞干物质的产率(参见实施例9)。
因此仍然需要用于简化培养含油的、生产多烯酸的微藻同时保持高多烯酸生产率的发酵过程的方法。
发明概述本发明提供用于培养营养缺陷型海洋微生物，产生极高生物质生产率的改进方法，其中可从连续操作的发酵罐(fermentor)收获100-300g/l产率的细胞干物质，其中培养肉汤的滞留期(residence time)在20-100小时范围之内，同时保持约0.5g脂类/g生物质干物质的脂类含量和至少0.2gDHA/l/h的多烯酸生产率。
考虑到现有技术，最令人惊奇的是，可获得这种高多烯酸生产率而不用使细胞生长和多烯酸生产分开。
在第一个方面，本发明涉及在好气条件下以Yg/l的细胞干物质CDM，于发酵罐中连续培养营养缺陷型海洋微生物的方法，其中Y是从100-300g/l的范围，包括在包含以每升培养肉汤适量(Y×h)克逐步加入碳源的培养基中培养所述的营养缺陷型海洋微生物，其中h是从1.1-3.0的范围，并且滞留期为20-150h，特别是20-100h的滞留期。
规定h的范围，可理解给出的碳源的数量不含任何缔合水(associatedwater)。在下列章节中，可理解给出的氮源的量是氮的量。
发明详述众所周知微生物为了生长需要碳源。同样培养基中碳源的浓度对于细胞干物质的最后产率也很重要。
令人惊讶地我们已经发现通过增加喂饲至连续运转的发酵过程的培养基中碳源的浓度，有可能获得100-300g/l级别的表示为细胞干物质CDM的产率(Y)，当在限制碳源或氮源用于生物质形成同时保持高脂类和高多烯酸生产率的培养基中培养海洋微生物时，在少于100h中产生所述量的生物质。
应以每升培养肉汤Y×h克的量加入碳源，其中h是从1.1至3.0的范围，优选从1.1-2.5的范围，更优选从1.2-2.0的范围。
应产生有效量的例如酪蛋白氨基酸和/或(NH4)2SO3形式的氮，其为碳源量的0.002至0.2倍(Y×h×f)，优选为碳源量的0.004至0.1倍，更优选为碳源量的0.01至0.04倍。
因此，在一个实施方案中本发明涉及在好气条件下连续培养营养缺陷型海洋微生物的方法，其中可在已知点在20-100小时内从发酵罐收获Yg/l的细胞干物质，其中Y包括在100-300g/l的范围内，包括在培养基中培养所述的海洋微生物，该培养基包括i)以每升培养肉汤适量(Y×h)克连续加入的碳源，其中h包括在1.1-3.0的范围内；以及ii)以Y×h×f的量连续加入的氮源，其中f包括在0.002至0.2的范围内。
也需要通过将这些成分加入生长培养基来向微生物提供为生物质形成所需要的附加成分，例如盐、矿物质和维生素。所加入成分的量应为当进一步加入这些成分时将对获得的生物质浓度不具有显著的影响。
培养方法的设计可应用许多不同的培养方法设计。
在优选的实施方案中，而不是以任何方式限制本发明的范围，该培养方法是包括3个培养步骤的连续发酵过程a)起始的批量生产，然后是b)补料分批生产，然后是c)连续生产过程，其中以恒定的给料量连续加入培养基，并且其中连续除去培养肉汤以使得保持总的肉汤重量，因此我们也要求保护一种在好气条件下以Yg/l的细胞干物质CDM，于发酵罐中连续培养营养缺陷型海洋微生物的方法，其中Y是从100-300g/l的范围，包括在包含以每升培养肉汤适量(Y×h)克逐步加入碳源的培养基中培养所述的营养缺陷型海洋微生物，其中h是从1.1-3.0的范围，并且滞留期为20-100h，其中连续发酵过程包括3个培养步骤a)起始的批量生产，然后是b)补料分批(fed batch)生产，然后是c)连续生产过程。
阶段a)和b)主要用作一个目的，即容许生物质浓度的水平达到＞当在阶段c)中获得恒定状态时达到的生物质浓度的＞50％，这容许在接近于阶段c)中最终获得的稳态生物质浓度的浓度开始从阶段c)收获生物质。
用于起始的批量阶段以及用于补料分批阶段的培养基组合物应反映这个目的。
应在阶段a)的培养基中的碳源耗尽前发生阶段a)至阶段b)的转换。
阶段b)至阶段c)的转换应发生在i)适于达到上述阶段a)和b)的共同(collective)目的的时间，和ii)依赖于阶段b)中使用的饲养培养基中碳和氮源浓度，以及阶段a)的批量培养基中碳和氮源浓度的时间。
应理解当进入恒定状态时，连续生产过程的特性构成关于获得的生物质生产率的全过程的性状和所使用的培养基的技术规格。
对于本领域的技术人员来说显然连续发酵过程通常使用恒定的培养肉汤滞留期。然而，对于本领域的技术人员来说也已知变化滞留期可提高连续发酵过程的总性能并且这种变化在本发明的范围之内，因此我们要求保护下列两种方法根据本发明的方法，其中连续培养过程中培养肉汤的滞留期保持恒定并且是在20-100h的范围内；以及根据本发明的方法，其中连续培养过程中培养肉汤的滞留期在20-100h范围内变化。
氮的量也可变化并且应相应于碳源的量，以使得有机和无机氮的总浓度，Nkonc是Y×h×f。
当根据本发明培养海洋微生物时，有可能获得可从发酵罐收获的CDM形式的生物质生产率，其范围为每升培养基每小时0.67至15g的细胞干物质，同时保持脂类含量为约0.5g/g生物资源干物质，以及同时保持至少0.20gDHA/l/h的高多烯酸生产率，优选至少0.25gDHA/l/h，更优选至少0.30gDHA/l/h，最优选至少0.35gDHA/l/h。
在优选的实施方案中，根据本发明的方法可生产浓度为0.20-0.40gDHA/l/h的多烯酸，优选浓度为0.25-0.4gDHA/l/h，更优选浓度为0.30-0.40gDHA/l/h，最优选浓度为0.35-0.40gDHA/l/h。
在一个实施方案中在10％以上饱和度的溶解氧水平进行本发明所述的发酵。然而，根据WO 01/54510，更低水平进行发酵可能进一步增强多烯脂肪酸形成中的生产率。对于本领域技术人员来说，当发酵控制的一个目的是保持溶解氧水平在较低水平时，使用连续发酵过程相对于饲养分批发酵过程的优点是明显的，因为在连续生产过程中可仅仅通过调节通气(aeration)和固定水平的振荡速率获得这种控制，而在补料分批生产中这种控制必须依赖于发酵过程中自始至终进行溶解氧的精密测量。进一步地，这种溶解氧的精密测量可能遭到失败。
因此，我们也要求保护一种在好气条件下以Yg/l的细胞干物质CDM，于发酵罐中连续培养营养缺陷型海洋微生物的方法，其中Y是从100-300g/l的范围，包括在包含以每升培养肉汤适量(Y×h)克逐步加入碳源的培养基中培养所述的营养缺陷型海洋微生物，其中h是从1.1-3.0的范围，并且滞留期为20-100h，其中连续发酵过程包括3个培养步骤a)起始的批量生产，然后是b)补料分批生产，然后是c)连续生产过程，并且其中保持步骤c)中溶解氧压力的水平低于10％的饱和度，优选低于5％的饱和度，更优选低于1％的饱和度。
在一个实施方案中在20至35℃范围的培养温度，特别为25至30℃的范围下进行本发明所述的发酵。
培养基中的pH应包括在3.0至9.0的范围内，特别为在5.0至7.5的范围中。
营养缺陷型的海洋微生物本发明所述的优选的营养缺陷型的海洋微生物是藻类，特别是微藻或藻样微生物，优选Stramenopiles类，更优选Hamatores sp、Proteromonads sp、Opalines sp.、Developayella sp、Diplophrys sp、Labrinthulids sp、Thraustochytrids sp、Biosecids sp、卵菌(Oomycetes sp)、Hypochytridiomycetessp、Commation sp、Reticulosphaera sp、Pelagomonas sp、Pelagococcus sp、Ollicola sp、Aureococcus sp、Parmales sp、Diatoms sp、Xanthophytes sp、Phaeophytes sp(褐藻)、Eustigmatophytes sp、Raphidophytes sp、Synurids sp、Axodines sp、Chrysomeridales sp、Sarcinochrysidales sp、Hydrurales sp、Hibberdiales sp、或Chromulinales sp的成员。
本发明所述的特别优选的海洋微生物是Thraustochytrids sp，特别是Schizochytrium sp或Thraustochytrium sp。最优选的是Schizochytrium sp，特别是S.limacinum sp，优选菌株SR21(FERM BP-5034)。
脂类含量本发明的方法可用来生产多种脂类化合物，特别是不饱和的脂类，优选多不饱和的脂类(即，含有至少2个不饱和碳-碳键，例如双键的脂类)，以及更优选高度不饱和的脂类(即，含有4个以上不饱和碳碳键的脂类)，例如ω-3和/或ω-6多聚不饱和脂肪酸，包括二十二碳六烯酸(即，DHA)；和其他天然存在的不饱和、多不饱和和高度不饱和的化合物。如在此所使用的，术语″脂类″包括磷脂；游离脂肪酸；脂肪酸的酯类；三甘油酯；甾醇和固醇酯；类胡萝卜素；叶黄素(例如，氧化类胡萝卜素)；碳氢化合物；异戊二烯类衍生的化合物和其他本领域已知的脂类。特别地本发明的方法在生产多烯酸中很有用。
由本发明所述方法生产的细胞干物质中的脂类含量是可通过氯仿∶甲醇混合物提取的成分，并且构成所生产生物质的至少40％，优选所生产生物质的至少45％，更优选所生产生物质的50％，甚至优选所生产生物质的至少55％。在一个实施方案中氯仿∶甲醇比率是2∶1(v/v)，优选在一个实施方案中氯仿∶甲醇比率是2∶1(v/v)，0.1％丁基羟基甲苯。
某些海洋微生物，类似的例如，Thraustochytrids sp.，生产合乎需要的长链多聚不饱和脂肪酸(LC PUFA)，如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。
同样富集LC PUFA′s的人类饮食的临床效果已经得到广泛地证明。特别感兴趣的LC PUFA′s是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。然而，关于成年人饮食中EPA∶DHA的最佳比率还没有达到一致，并且进一步地，Thraustochytrids sp.生产生物质、脂类和LC PUFA′s的高效能力不必与一个菌株中产生EPA∶DHA最佳比率的能力相结合。
因此，改进Thraustochytrids种属的生物质、脂类和LC PUFA生产率和/或与本发明的应用相结合而产生的EPA∶DHA比率的特性方面可能是极为有益的。
实施例实施例1Schizochytrium limacinum，SR21(FERM BP-5034)的深低温保藏将来源于″国立生命科学和人类技术研究所，工业科学技术办事处，日本″(″National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology，Japan″)，在琼脂上培养保藏的培养物通过使琼脂上的细胞悬浮在″1/2TM″中(如下所述)来转入摇瓶。使摇瓶(具有100ml培养基″OMEPRK_A″(如下所述)+10ml悬浮细胞的500ml锥形瓶)于28℃和150rpm，在Unitron，Infors AG恒温控制的旋转振荡器中培养25h。向摇瓶加入25ml加热消毒的甘油。在室温下培养40min后取1ml等分转入低温试管。
通过在flamingo-box(20×20cm w/4cm flamingo壁、盖和底)中孵育低温试管，使低温试管(40pc.)在-20℃缓慢冷冻24h，然后将低温试管(cryotube)转移至-80℃冷冻。
在-80℃保存低温试管备用。
用于培养的培养基″OmePRK_A″Tropic Marin(Article 10135) 16.7gKH2PO4 5g酪蛋白氨基酸，无维生素 3g″MikroPM″(如下所述)20ml″VitapM″(如下所述) 20ml-全部混合。
用NaOH/HCl调节pH至7.0。
用自来水调节体积至900ml。
在121℃加热杀菌20min。
最后加入100ml，其含33gGlucose·1H2O，其已在0.25微米滤器中无菌过滤。
将100ml无菌转入空的、加热消毒的500ml锥形摇瓶。
″1/2TM″Tropic Marin 16.7g/l溶解于自来水中。
在121℃加热杀菌20min。
″MikroPM″MnSO4·1H2O 0.98gFeSO4·7H2O 3.93gCuSO4·5H2O 0.39gZnCl2 0.39g柠檬酸 19.6g-全部混合，用去离子化的水调节体积至1.01。
″VitapM″硫胺素-二氯化物 2.28g核黄素 0.19g烟酸 1.53g钙D-泛酸(Panthothenat) 1.9g吡哆醛HCl0.38gD-生物素 0.075g叶酸 0.19g-全部混合，用去离子化的水调节体积至1.01。
实施例2Schizochytrium limacinum菌株SR21的生长将在室温下融解的来自1个低温试管的细胞转入包含在40ml的圆柱形玻璃杯中的10ml″OmePRK_A″培养基中，进行无菌培养，并且在28℃和150RPM培养24h(Unitron，Enfors AG)。
将如此产生的培养肉汤转入包含在500ml锥形摇瓶中的100ml″OmePRK_A″培养基中，在28℃和150RPM无菌培养24h(Unitron，Enfors AG)。
将如此产生的90ml培养肉汤用于接种发酵罐。
实施例3在30-35h的肉汤滞留期连续培养SR21菌株使用21的Porton型玻璃/不锈钢发酵罐。
容许菌株在1.01培养基″OME8″上生长20h，其中保持-通过加入NaOH/H3PO4控制pH在6.0-7.0的范围中-温度在28℃-以300rpm线性增加到400rpm振荡-以1.0l/min通气(aeration)-溶解氧压力在饱和度的10％以上在20.1h用培养基″OME8a″(如下所述)以0.057g/min引发培养物的补料分批喂养。保持给料速度直到100h。
从20至80h，使振荡从400rpm线性增加至500rpm；其它的工艺参数维持先前的设定值。
在100h，通过改变饲养培养基为″OME17b″(如下所述)，增加给料速度至0.5g/min以及保持总的培养肉汤重量为1000g执行连续培养模式，其中容许通过泵送从发酵罐移出培养肉汤。
进一步地，在100h使振荡速率增加至800rpm。通过人工加入葡萄核油控制泡沫。
根据OD测量值(650nm，1cm比色杯，测量前在去离子化的水中400倍稀释肉汤)以及从培养物的呼吸能力(通过来自Innovo Air Tech.Instruments的1313发酵监测器测量废气中的％O2)判断，在～160h获得稳定状态。
在190h，取出50ml样品，在Heraus Labofuge Ae中500rpm室温离心10min；用～35ml″1/2TM″轻轻洗涤如此产生的沉淀颗粒，重复离心，在-80℃冷冻如此产生的沉淀颗粒，然后在来自Heto Lab Equipment的HetosiccCD52-1冰冻干燥器上冷冻干燥。
因此确定104.1g/l的悬浮固体物质干重浓度。
因为所有的培养基由可溶成分唯一组成，把这个数字作为细胞干重浓度。
利用来自ACCU-CHEK的″Keto-diabur-test 5000″条结合适当稀释的样品确定，从25h开始残余葡萄糖浓度是＜＜1g/l。
在本实施例中Y＝104.1g/l，h＝1.24，以及f＝0.021。
″OME8″Tropic Marin 16.7gKH2PO4 5g
酪蛋白氨基酸，无维生素 3g(NH4)2SO4 0.5g″MikroPM″20g″VitaPM″ 20g-全部混合，用NaOH/H3PO4调节pH至6.5，并且将体积调节至700ml。
在121℃与包含在发酵罐中的培养基一起加热杀菌这种培养基40分钟。加热杀菌并冷却至40℃以下后，将自来水中的33g葡萄糖·1H2Ow/在121℃单独加热杀菌40分钟前，调节体积至300ml加入发酵罐/培养基如此产生″OME8″，准备pH-在发酵罐中调节至6.5然后接种。自始至终使用自来水。
″OME8a″所有的成分表示为g/l。
在用NaOH/H3PO4调节pH至5.0后，所有的成分-除了葡萄糖外-以最终培养基体积的40％v/v于121℃一起加热消毒40分钟。
以最终培养基体积的60％v/v单独加热消毒葡萄糖，然后在冷却到40℃以下后加入另一个成分。
自始至终使用自来水。
Tropic Marin 16.7g/lKH2PO4 5g/l″MikroPM″20g/l″VitaPM″ 20g/l酪蛋白氨基酸，无维生素 45g/l(NH4)2SO4 7.5g/l葡萄糖·1H2O 495g/l″OME17b″所有成分表示为g/l。
在用NaOH/H3PO4调节pH至5.0后，所有成分-除了葡萄糖外-以最终培养基体积的40％v/v在121℃一起加热消毒40min。
以最终培养基体积的60％v/v单独加热消毒葡萄糖，然后在冷却到至40℃以下后加入另一个成分。
自始至终使用自来水。
Tropic Marin 16.7g/lKH2PO45g/l″MikroPM″ 20g/l″VitaPM″ 20g/l酪蛋白氨基酸，无维生素 12.94g/l(NH4)2SO42.15g/l葡萄糖·1H2O142.3g/l实施例4在60-70h的肉汤滞留期连续培养SR21菌株如实施例3中所描述的用下列改良法进行这种培养当在100h执行连续培养模式时，设置供液速率为0.25g/min。
进一步地，在190h将饲养培养基从″OME17b″改变为″OME17c″(如下所述)。
在285h、350h、450h和500h，如实施例3所描述的测定细胞干重浓度分别为188.6；152.54；189.07和182.75g/l。振荡和通气率从最初的在100h 800rpm和11/min减小到在～400h，550rpm和0.75l/min。
如实施例3中所描述的测定-从25h开始残余葡萄糖是＜＜1g/l。
″OME17c所有的成分表示为g/l。
在用NaOH/H3PO4调节pH至5.0后，所有的成分-除了葡萄糖外-以最终培养基体积的40％v/v于121℃一起加热消毒40分钟。
以最终培养基体积的60％v/v单独加热消毒葡萄糖，然后在冷却到至40℃以下后加入另一个成分。
自始至终使用自来水。
Tropic Marin16.7g/lKH2PO410g/l″MikroPM″ 40g/l″VitaPM″ 40g/l酪蛋白氨基酸，无维生素 25.88g/l(NH4)2SO44.3g/l葡萄糖·1H2O 284.6g/l从上可知在285h，Y＝189g/l；h＝1.37以及f＝0.021；
在350h，Y＝153g/l；h＝1.70以及f＝0.021；在450h，Y＝189g/l；h＝1.37以及f＝0.021，在500h，Y＝183g/l；h＝1.42以及f＝0.021。
应当注意细胞生产率内的变化令人惊讶地是很小的(当h恒定时，如在285h和450h的结果所分别说明的，Y也几乎是恒定的)。
实施例5来自高细胞密度连续培养的细胞干物质中的脂类含量。
将从通过冷冻干燥洗涤过的50ml肉汤样品所收获的物质重悬浮在～40ml″1/2TM″中。从重悬浮液用氯仿∶甲醇(2∶1v/v，0.1％w/v丁基羟基甲苯(BHT))提取脂类，并且在蒸发所有的氯仿∶甲醇后测定提取的脂类的量。将如此回收的脂类储存在-80℃，然后在40℃经受甲基化并且根据标准的HPLC方法分析DHA。
因此通过这些方法可确定细胞干物质中的脂类含量和多烯酸生产率。
在实施例3描述的发酵中(滞留期～30-35h)，在190h细胞干物质中脂类含量测定为(＞＝)47.5％w/w。
在实施例4描述的发酵中(滞留期～60-70h)，在350h(在减小振荡/通气前)细胞干物质中脂类含量测定为(＞＝)60.1％w/w，并且多烯酸含量为21(总脂肪酸的％DHA)。
在实施例4描述的发酵中(滞留期～60-70h)，在450h(在减小振荡/曝气后)细胞干物质中脂类含量测定为(＞＝)56.4％w/w，并且多烯酸含量为23(总脂肪酸的％DHA)。
在实施例4描述的发酵中(滞留期～60-70h)，在500h细胞干物质中脂类含量测定为(＞＝)48.2％w/w，并且多烯酸含量为25(总脂肪酸的％DHA)。
在实施例4描述的发酵中(滞留期～60-70h)，在350h、450h和500h，多烯酸生产率分别是0.30、0.38和0.34gDHA/l/h。
应当注意DHA的生产率内的变化令人惊讶地是很小的。
总之实施例4显示有可能利用本发明的方法在60-70的滞留期产生高细胞浓度和高DHA浓度。
权利要求
1.一种在好气条件下以Yg/l的细胞干物质CDM，于发酵罐中连续培养营养缺陷型海洋微生物的方法，其中Y是从100-300g/l的范围，包括在包含以每升培养肉汤适量(Y×h)克逐步加入的碳源的培养基中培养所述的营养缺陷型海洋微生物，其中h是从1.1-3.0的范围，并且滞留期为20-100h。
2.根据权利要求1的方法，其中培养基包括以每升培养肉汤适量(Y×h×f)克逐步加入的氮源，其中f是从0.002至0.2的范围。
3.根据权利要求1的方法，其中该培养基包括为生物质形成所需要的、以不限制获得的生物质浓度的数量逐步加入的盐、矿物质和任选维生素。
4.根据权利要求1的方法，其中h是从1.1-2.5的范围，特别是从1.2-2.0的范围。
5.根据权利要求2-4中任何的方法，其中f是从0.004至0.1的范围，特别是从0.01至0.04的范围。
6.根据前述权利要求中任何的方法，其中营养缺陷型的海洋微生物是藻类。
7.根据前述权利要求中任何的方法，其中营养缺陷型的海洋微生物是Thraustochytrids sp。
8.根据前述权利要求中任何的方法，其中Thraustochytrids sp.选自Schizochytrium或Thraustochytrium。
9.根据前述权利要求中任何的方法，其中培养温度是从20-35℃。
10.根据前述权利要求中任何的方法，其中培养基的pH是在3.0-9.0的范围。
11.根据前述权利要求中任何的方法，其中所产生的生物质的至少40％由可通过氯仿∶甲醇混合物萃取的成分组成。
12.根据权利要求11的方法，其中氯仿和甲醇以2∶1(v/v)的比率混合。
13.根据前述权利要求中任何的方法，其中获得至少0.2g DHA/l/h的多烯酸生产率。
14.根据前述权利要求中任何的方法，其中连续培养过程中培养肉汤的滞留期保持恒定并且是在20-100h的范围内。
15.根据前述权利要求中任何的方法，其中连续培养过程中培养肉汤的滞留期是在20-100h的范围内变化的。
16.根据权利要求1的方法，其中连续培养包括下列3个培养步骤a)起始的批量生产过程，然后是b)补料分批生产过程，然后是c)连续生产过程。
17.根据权利要求16的方法，其中从步骤c)开始溶解氧的水平保持在10％的饱和度以下。
全文摘要
本发明提供在好气条件下以Yg/l的细胞干物质CDM，于发酵罐中连续培养营养缺陷型海洋微生物的优化方法，其中Y是从100－300g/l的范围，包括在包含以每升培养肉汤适量(Y×h)克逐步加入的碳源的培养基中培养所述的营养缺陷型海洋微生物，其中h是1.1－3.0的范围，并且滞留期为20－100h。该方法保持高产量的细胞脂类，特别是多烯酸。
文档编号C12P7/64GK1845986SQ200480025011
公开日2006年10月11日 申请日期2004年8月24日 优先权日2003年9月1日
发明者莫根斯·沃姆佩尔曼 申请人:诺维信公司