用于纯化和结晶目的分子的组合物的制作方法

专利名称：用于纯化和结晶目的分子的组合物的制作方法
用于纯化和结晶目的分子的组合物 发明领域和背景
本发明涉及组合物，该组合物能用于纯化和结晶目的分子。 蛋白质和其他大分子越来越多地用于研究、诊断和治疗中。蛋白
质一般通过占生产过程主要成本的(最高占总成本的60%)大规模纯 化的重组技术生产。因此，由于与纯化有关的高成本，重组蛋白质产 物的大规模利用受到阻碍。
目前蛋白质的纯化方法依靠使用不同层析技术的组合。这些技术 根据蛋白质的电荷、疏水性或大小及其他特性而分离蛋白质混合物。 一些不同的层析树脂可用于每种这些技术中，允许对纯化方案进行准 确的修正以得到用于分离的特定靶蛋白质。每一种这些分离方法的要 点在于可使蛋白质以不同的速率经过长柱，当其进一步通过该柱时实 现提高了的物理分离，或者选择性地粘附至分离介质，使得能经不同 的溶剂差分洗脱。有时，设计柱使得杂质在那里结合而在"流过的溶 液(flow-through)"中发现所需的蛋白质。
亲和沉淀(AP)是用于蛋白质沉淀最有效和最先进的方法 [Mattiasson 1998 ) ; Hilbrig和Freitag (2003 ) J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 790 (1-2 ) : 79-90。目前现有技术的AP应 用配体偶联的"智能聚合物(smart polymers)"。"智能聚合物"[或 刺激-响应性"智能"聚合物或亲和大配体(AML) I为那些以很大的性 质改变对小的物理或化学刺激，例如pH、温度、放射线等的变化作出 响应的聚合物。这些聚合物可以有很多形态；其可溶于水溶液中，吸 附或接枝在水相-固相的接触面上，或交联以形成水凝胶Hoffman J Controlled Release (1987 ) 6: 297-305; Hoffman Intelligent polymers. In: Park K ， ed. Controlled drug delivery. Washington : ACS Publications, (1997) 485-98 Hoffman Intelligent polymers in medicine and biotechnology. Artif Organs (1995 ) 19: 458-467]。通常，当聚合 物的临界响应受刺激时，溶液中的智能聚合物将呈现突然的浑浊如同 各分相一样；表面吸附的或接枝的智能聚合物将塌陷，将接触面从亲 水的转化至疏水的；而该智能聚合物(以水凝胶形式交联的)将表现出急剧的塌陷并且释放许多溶胀的溶液。当进行逆向刺激时这些现象 也反转，不过在聚合物必须重溶解或凝胶必须重溶胀在水介质中时反 转的速率通常较慢。
"智能"聚合物可以物理混合或化学偶联至生物分子以产生聚合物 -生物分子系统的大家族，其可对生物学的以及物理的或化学的刺激作 出响应。生物分子可以是聚合物-偶联的，包括蛋白质和寡肽、糖和多
糖、单-和双-链寡核苷酸和DNA质粒、单纯的脂类和磷脂以及广谱的 识别配体和合成的药物分子。
许多结构参数控制智能聚合物特异性地沉淀目的蛋白的能力；智 能聚合物应当包含配体偶联的活性基团；不与杂质强烈作用；能使配 体与靶蛋白有效作用；在介质性质改变时能产生完全的聚合物的分 相；形成致密的沉淀；排除杂质在凝胶结构中的截留以及沉淀形成后 很容易溶解。
虽然许多不同的天然及合成的聚合物已用于AP中Mattiasson (1998) J. Mol. Recognit. 11: 211],但是理想的智能聚合物仍是难以 确定的，例如用现有智能聚合物进行的亲和沉淀未能满足上述的一种 或一些条件Hlibrig和Freitag (2003)，上文。
有效的或简单的蛋白质纯化技术的可利用性在蛋白质结晶中也是 有用的，其中蛋白质的纯度深远地影响晶体的生长。蛋白质的构象结 构是了解其生物学功能以及最终设计新的药物疗法的关键。蛋白质的 构象结构通常通过其晶体的X射线衍射进行测定。不幸的是，在大多 数情况下生成足够高质量的蛋白质晶体是非常困难的，并且该困难是 蛋白质样品的科学测定和结构鉴定的主要限制因素。从过饱和溶液生 成蛋白质晶体的现有方法是冗长和费时的，并且才有超过100， 000个 不同蛋白质的小于百分之二已经被生长成适于X射线衍射研究的晶 体。
膜蛋白是对结晶产生最大挑战的蛋白质组。虽然膜蛋白的数量预 期将构成蛋白质组的三分之一，可得到的膜蛋白的三维结构的数量仍 然在20个左右。当希望结晶膜蛋白时必须克服许多障碍。这些包括， 天然来源中蛋白质的低丰度、需要从其天然环境中(即脂双分子层) 溶解疏水膜蛋白以及在去污剂溶液中其变性、凝集和/或降解的倾向。 由于一些去污剂可能会妨碍稳定的配体与靶蛋白的结合，对增溶去污剂的选择就存在另外的问题。
已在膜蛋白的结晶中尝试了两种方法。
直至最近，利用从蛋白质_去污剂复合物的溶液中直接生长成的晶
体测定了大部分的膜蛋白的x射线晶体结构。只有当被结晶的溶质是
蛋白质和去污剂的复合物而不是单独的蛋白质时，蛋白质-去污剂复合 物的晶体生长才可被认为与可溶蛋白质的等同。尽管结晶组装同时将 去污剂部分带入闭合的同格中，实际的晶格接触还是由蛋白质-蛋白质 相互作用形成的。为了提高有效表面积以使这些蛋白质之间接触，研
究表明添加抗体片段将提高产生晶体的几率Hunte和Michel ( 2002 ) Curr. Opin. Struct. Biol. 12: 503-508。然而，由于需要单克隆抗体的 产生，其特异于每种膜蛋白，将该技术应用至不同的膜蛋白是困难的。 此外，认为没有哪一种去污剂胶束可以完全和准确地再生蛋白质 的脂双层环境。
因此，结晶膜蛋白的工作必须致力于在脂双层环境内产生晶体。 利用该方法已经进行了许多尝试以产生膜蛋白的晶体。这些包括在形 成包含连续双分子层结构的胶状物质脂质立方相(cubic phase)Landau和Rosenbuch (1996 ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14532-14535中生长的细菌视紫红质晶体的产生，以及在cubo中结晶，其在 古生物的七个-跨膜螺旋蛋白质的结晶中被证实是成功的[Gordeliy (2002 ) Nature 419: 484-487; Luecke ( 2001 ) Science 293: 1499-1503; Kolbe ( 2000) Science 288: 1390-1396; Royant ( 2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10131-10136。然而，使用cubo内方法的其他膜蛋白的 晶体没有直接从蛋白质-去污剂复合物溶液生成的晶体的高质量Chiu (2000) Acta. Crystallogr. D. 56: 781-784。
因此对没有上述限制的用于分子纯化和结晶的组合物和其使用方 法有广泛认同的需求，并且其也是非常有益的。 发明概述
本发明的一个方面提供包括至少一种能结合靶分子或目的细胞的 配体的物质组合物，当与配位体离子或分子共-孵育时，所选的附着于 至少一种配位部分的该至少一种配体能指引该物质组合物形成非-共价
复合物o
本发明的另一方面提供纯化靶分子或目的细胞的方法，该方法包括(a)将包含靶分子或目的细胞的样品和一种组合物接触，该组合 物包括(i)至少一种能结合靶分子或目的细胞的配体，该至少一种 配体附着于至少一种配位部分；和(ii)能非-共价结合该至少一种配 位部分的配位体，当共-孵育时该至少一种配位部分和配位体能形成复 合物；以及(b)收集包含结合至靶分子或目的细胞的复合物的沉淀， 由此纯化耙分子或目的细胞。
根据本发明下述优选实施方案的更进一步的特征，该方法进一步 包括从沉淀回收目的分子。
本发明的又一个方面提供检测患者中与目的分子相关的疾病的易 感性或存在的方法，该方法包括将获自受体的生物样品和组合物接 触，组合物包括(i)至少一种能结合靶分子或目的存在的配体，该 至少一种配体附着于至少一种配位部分；和(ii)能非-共价结合该至 少一种配位部分的配位体，当共-孵育时该至少一种配位部分和配位体 能形成复合物，其中包含目的分子的复合物的形成为患者中与目的分 子相关的疾病的易感性或存在的指示。
本发明的又一个方面提供用于结晶目的分子的组合物，该组合物 包括(i)至少一种能结合靶分子或目的存在的配体，该至少一种配 体附着于至少一种配位部分；和(ii)能非-共价结合该至少一种配位 部分的配位体，其中当共-孵育时该至少一种配位部分和配位体能形成 复合物，且因此选择组合物以使当目的分子结合至该配位体时能确定 该目的分子的相对空间位置和方向，由此在诱导结晶的条件下促进其 中晶体的生成。
本发明的另外一个方面提供结晶目的分子的方法，该方法包括将 包含目的分子的样品和一种结晶组合物接触，该组合物包括(i)至 少一种能结合目的分子的配体，该至少一种配体附着于至少一种配位 部分；和(ii)能非-共价结合该至少一种配位部分的配位体，当共-孵 育时该至少一种配位部分和配位体能形成复合物，且因此选择组合物 以使当目的分子结合至该配位体时能确定该目的分子的相对空间位置 和方向，由此在诱导结晶的条件下促进其中晶体的形成。
本发明的仍然另外的一方面提供包含一种分子的物质组合物，该 分子具有能结合目的分子的第一区域和能结合配位体离子或分子的第 二区域，设计该第二区域使得该分子暴露于配位体离子或分子时形成聚合物。
本发明仍是另外一个方面提供除尽来自样品的靶分子或目的细胞
的方法，该方法包括(a)将包含靶分子或目的细胞的样品和组合物 接触，组合物包括(i)至少一种能结合目的分子的配体，该至少一 种配体附着于至少一种配位部分；和(ii)能非-共价结合该至少一种 配位部分的配位体，当共-孵育时该至少一种配位部分和配位体能形成 复合物；以及(b)除去包含结合至靶分子或目的细胞复合物的沉淀， 由此除尽来自样品的靶分子或目的细胞。
本发明的另外一个方面提供增强靶分子免疫原性的方法，该方法 包括将靶分子和一种组合物接触，该组合物包括(i)至少一种能结 合耙分子或目的细胞的配体，该至少一种配体附着于至少一种配位部 分；和(ii)能非-共价结合该至少一种配位部分的配位体，其中进行 接触使得该至少一种配位部分和配位体能形成包含目的靶分子的复合 物，由此增强目的靶分子的免疫原性。
根据所述优选实施方案的更进一步的特征，目的分子选自蛋白 质、核酸序列、小分子化学试剂和离子。
根据所述优选实施方案的更进一步的特征，该至少一种配体选自 生长因子、激素、核酸序列、抗体、抗原表位标记、亲和素、生物素、 酶的底物和酶。
根据所述优选实施方案的更进一步的特征，该至少一种配体通过 接头结合至至少一种配位部分。
根据所述优选实施方案的更进一步的特征，配位部分选自螯合 剂、生物素、核酸序列、抗原表位标记、缺电子的分子和富电子的分 子。
根据所述优选实施方案的更进一步的特征，配位体离子或分子选 自金属离子、亲和素、核酸序列、缺电子的分子和富电子的分子。
本发明通过提供用于分子纯化的组合物和方法成功地克服了目前 已知构型的不足。
除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语具有本发明所述 技术领域的普通技术人员通常理解的相同的意思。虽然与此处所述的 类似的或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但是合适的 方法和材料描述如下。如有冲突，以包含定义的本专利说明书为准。此外，材料、方法和实施例仅是解释性的而并不试图作为限制。 附图简述
此处参照附图仅举例描述本发明。对于目前对附图详细的具体参 考，强调指出所显示的详细说明是举例而言的，且仅是为了本发明优 选实施方案的解释性讨论的目的，并且是为了提供什么是最有效的以 及很容易地理解本发明原理的描述和概念方面的原因而存在。关于这 一点，相比本发明最基本的理解所需并不试图更详细地呈现本发明的 构成细节，


使得本领域技术人员显然知晓本发明的一些形式 怎样可以体现在实践上。
在附图中
图la-f用示意图举例说明了本发明组合物的一些构型。图la-c显 示结合至两个配位部分的配体。图ld-f显示结合至多个配位部分的配 体。Z表示配位部分。图2a-b用示意图举例说明了利用本发明的组合 物对靶分子的沉淀。共价结合到双螯合剂的配体与靶分子孵育(图 2a)。添加金属(M+、 M2+、 M3+、 M4+)结合螯合剂并且形成包含与 金属离子非-共价结合的靶分子的阵列(图2b)。
图3a-e用示意图举例说明了靶分子从沉淀中的分级回收。图3a显 示添加游离螯合剂竟争性地参与配体结合的螯合剂和金属的结合。图 3b显示配体结合的靶分子从游离的竟争性螯合剂和复合的金属中基于 比重的分离。图3d显示配体结合的靶分子上样至固定化的金属柱以允 许复合物的结合。在合适的洗脱条件下靶分子被洗脱而配体配位部分 的分子未洗脱。可另外加入脱盐阶段用于靶分子的进一步纯化。配体 螯合剂分子的再生通过添加竟争性螯合剂至柱，随后经透析或超滤而 实现(图3e)。
图4用示意图举例说明了靶分子从沉淀中的直接洗脱，其中螯合
剂-金属复合物得到维持，而靶分子和配体间的结合降低了
图5用示意图举例说明了在靶分子的洗脱之后沉淀单元(即配体-
配位部分)的再生。在这种情况下，通过添加竟争性的螯合剂和应用
合适的分离步骤，例如透析和超滤而实现回收。
图6a-c用示意图举例说明了利用核酸序列作为配位部分沉淀乾分
子。在靶分子存在下孵育含有共价结合双核苷酸序列(配位部分)的
配体(图6a)。互补序列的添加导致包含配体-配位部分靶分子互补序列(配位体分子，图6b)的阵列的形成。还显示了不-对称的配位 序列(图6c)。
图7a-b用示意图举例说明了利用生物素作为配位部分来沉淀耙分 子。在靶分子的存在下孵育带有共价结合双-生物素或生物素衍生物例 如DSB-X生物素的配体(图7a)。亲和素(或其衍生物)的引入产 生包括配体-配位部分(生物素)靶分子亲和素的网络(图71))。
图8a-c用示意图举例说明了利用富电子的分子作为配位部分沉淀 靶分子。在靶分子存在下孵育带有共价结合的双富电子体的配体(图 8a)。倾向于形成复合物的双(也可以是三、四)缺电子衍生物的添 加导致产生包括配体-配位部分(缺电子分子)靶分子双-缺电子部 分的非-共价网络(图8b)。苦味酸和吲哚系统也可用于本发明(图8c)。
图9用示意图举例说明了用结合的A蛋白(ProA)作为配体沉淀 靶抗体。合适的配位体的添加产生A蛋白-配位部分配位体靶分子 的网络。
图10a-b用示意图举例说明了用于膜蛋白结晶的本发明复合物的用 途。呈现了结晶组合物中2D(或3D)结构的一般构型，其中配位体自 身相互间并不相连(图10a)。图10b中举例说明了利用以两个抗原和 导向该特异性抗原的单克隆抗体(mAb)作为配位体修饰的特异性配 体的更具体的实施例。
图lla-b用示意图举例说明了用于膜蛋白晶体形成的金属复合物 (图lla)和核-复合物(图lib)的用途。图llc用示意图举例说明了 使用本发明组合物的三维膜复合物。蛋白质的疏水结构域由去污剂胶 粒环绕。Z表示多价配位体(即，至少二-价配位体)。
图12用示意图举例说明了由通过合适的螯合剂，结合至单个金属 配位体的三个配体组成的非-共价组合物的形成其中该螯合剂通过共价 接头结合至配体。
图13a-b用示意图举例说明了对三个目的配体进行修饰以包含异 羟肟酸衍生物(图13a)，使得三非-共价配体复合物在铁离子的存在 下形成(图13b)。
图14用示意图举例说明了用于产生配体-螯合剂分子的两步合成 方法。
图15a-b用示意图举例说明了当仅改变存在于介质中的阳离子时，通过利用相同的配体-接头-螯合剂分子来形成双(图15a)和三(图 15b)非-共价配体。
图16a-c用示意图举例说明了通过缺/富电子关系而配位的本发明 的组合物。通过用缺电子部分修饰配体(图16a)并且合成三共价富电 子部分(图16b)，形成了参见图16c中结构的复合物。
图17用示意图举例说明了用于富电子的配体或缺电子的配体衍生
物制备的两步合成方法。
图18用示意图举例说明了多肽在利用富电子或缺电子部分用于形 成配体复合物的用途。
图19用示意图举例说明了利用螯合剂-金属以及富电子和缺电子 的关系的配体复合物的形成。
图20用示意图举例说明了用于制备螯合剂-缺电子衍生物的单步 合成方法。
图21a-b用示意图举例说明了通过利用相同的螯合剂-缺电子(儿 茶酚-TNB )衍生物并且仅改变介质中的阳离子而形成二和三非共价缺 电子部分。
图22a-b用示意图举例说明了添加包含一个富电子部分的多肽以 形成二聚物和三聚物。
图23a-b用示意图举例说明了通过添加包含结合至两个螯合剂的 配体的组合物来形成聚合物复合物，螯合剂通过电子富/缺关系配位。
图24用示意图举例说明了限制非共价蛋白质二聚物的运动自由度 的一种可能性。通过添加合适的金属经由配体-接头-螯合剂的形成非共 价二聚物后，加入共价缺电子体(例如，三硝基苯-三硝基苯-TNB-TNB)导致两个邻近的蛋白质上两个易接近的富电子残基(例如，Trp) 的同时结合,'由此强加了运动限制并且允许晶体结构的形成。
图25用示意图举例说明了分别可用作本发明组合物中的配位部分 和配位体离子的螯合剂和金属。
图26用示意图举例说明了可用作本发明组合物中的配位部分的富 电子和缺电子体。
优选实施方案的描述
本发明为组合物，其可用于纯化和结晶目的分子。
参考附图和所附的说明，本发明的原理和操作将得到更好的理解。
在详细阐明本发明的至少一种实施方案之前，可以理解的是本发 明并不限于以下描述中详细阐述或通过实施例例证的应用。本发明有 其他的实施方案或能以不同的方式操作或进行。另外，可以理解的是 此处所用的词组和术语是用于描述而不应该被认为是限制。
成本有效的蛋白质，例如用于治疗的蛋白质的商业规模的生产， 主要依赖快速和有效的纯化方法的发展，因为纯化步骤通常占据蛋白 质大规模生产所用成本的大部分。
因此对简单的、经济合算的方法有需求，该方法可用于纯化蛋白 质及其他商业上重要的分子。
在蛋白质纯化中，现有技术为亲和沉淀(AP)，其基于与结合目 的蛋白质的识别单元偶联的"智能"聚合物的利用。这些智能聚合物 在其物理状态或特性中产生大的、有时不连续的变化而响应环境刺激 的微小变化，产生水溶液的分相或者凝胶大小的数量级的变化以及目 的分子的沉淀。然而，目前由于一些障碍包括，沉淀过程中杂质的截 留、杂质吸附至聚合物基体、蛋白质识别单元的降低的亲和性以及可 能导致活性降低的纯化蛋白质的工作条件，还没有实现智能聚合物的 前景。
在促使本发明实践的过程中，本发明人设计了新的组合物，其能
如在下文和随后的实施例部分举例说明的那样，本发明的组合物 特异性地结合靶分子以形成非共价复合物，其可在温和条件下沉淀和 收集。此外，与现有的纯化组合物相反，本发明的组合物并没有被固 定化(例如固定到智能聚合物上)，其会降低配体接近靶分子的亲和 力、限制所用配体的量、要求使用需要高级维护的复杂实验设备 (HPLC)、导致柱的淤塞和限制对于单一共价结合配体的柱的利用率。
因此，本发明的一个方面提供一种物质组合物，其适合于靼分子 或目的细胞的纯化。
靶分子可以是大分子例如蛋白质、碳水化合物、糖蛋白或核酸序 列(例如，DNA如质粒、RNA)或小分子例如化学试剂。尽管此处提 供的大部分实施例描述了蛋白质类的靶分子，可以理解的是本发明不限于上述靶物质。
靶细胞可以是真核细胞、原核细胞或病毒细胞。
本发明的物质组合物包括至少一种能结合目的分子或细胞的配体 以及所选的当用配位体离子或分子共-孵育时能指引该物质组合物形成 非-共价复合物的至少一种配位部分。
如此处使用的术语"配体"是指合成的或天然存在的分子，优选呈
现高亲和力(例如，KD<1(T5)地结合目的靶分子的以及两个之间能特 异性地相互作用的分子。当目的靶物质为细胞时，选择能结合蛋白质、 碳水化合物或化学试剂的配体，其在该细胞表面上表达(例如，细胞 标记物)。优选地，配体与目的分子或细胞的结合为非共价结合。本 发明这方面的配体可以是单、双(抗体、生长因子)或多化合价的配 体并且可以呈现对一种或多种目的分子或细胞的亲和力(例如，双特 异性抗体)。可用于本发明的配体的实例包括，但不限于，抗体、模 拟物(例如，Affibodies⑧参见美国专利5， 831， 012、 6， 534， 628 和6， 740， 734)或其片段、抗原表位标记、抗原、生物素和其衍生物、 亲和素和其衍生物、金属离子、受体和其片段(例如，EGF结合结构 域)、酶(例如，蛋白酶类)和其突变体(例如，催化惰性的)、底 物(例如，肝素)、植物凝集素(例如，刀豆素A)、碳水化合物(例 如，肝素)、核酸序列例如、适体和Spiegelmers [Wlotzka ) (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 8898-02、染料，其常模拟天然底物或 辅因子的结构而与酶的催化部位相互作用且由生色团组成(例如，偶 氮染料、蒽醌或酞菁)，连接至反应基团(例如，单或二氯代三吖溱 环，参见，Denzili (2001 ) J Biochem Biophys Methods. 49 (1-3): 391-416)、小分子化学试剂、受体配体(例如，生长因子和激素)、 具有相同的结合功能的不同的化学结构的模拟物或其片段(例如，EGF 结构域)、离子配体(例如，钙调蛋白)、A蛋白、G蛋白和L蛋白 或其模拟物(例如，PAM，参见Fassina ( (1996 ) J. Mol. Recognit. 9: 564-9、化学试剂(例如，cibacron蓝、其结合酶和血清白蛋白；氨基 酸例如，赖氨酸和精氨酸、其结合丝氨酸蛋白酶类)以及磁性分子如 高自旋有机分子和聚合物(参见http : 〃www.chem.unl.edu/rajca/highspiii.html)。
如此处使用的短语"配位部分"是指对配位体离子或分子具有足够亲和力(例如，KD<10—5)的任何分子。当与配位体离子或分子共孵育 时，该配位部分可指引本发明的物质组合物形成非共价复合物。可用 于本发明的配位部分的实例包括但不限于，抗原表位(与抗体的抗体 结合部位结合的抗原决定簇抗原)、抗体、螯合剂(例如，His-标记， 参见随后实施例部分的实施例1中的其他实例，图1、 25和26)、生 物素(参见图7)、核酸序列(参见图6)、A或G蛋白(图9)、缺 电子和富电子分子(参见随后实施例部分的实施例2和图8)及其他上 述的分子(参见配体的实例)。
可以理解的是许多配位部分可与上述配体结合(参见图la-f)。 进一步可以理解的是，不同的配位部分可以结合至配体如螯合剂 和富/缺电子分子以形成如图19中所示的复合物。这种结合部分的组合 可以介导如图23a-b和24中分别举例说明的包含目的分子的聚合物或 有序的片层(即，网络)的形成。
题，选择配位部分以防止配位部分-配体相互作用或配位部分-耙分子相 互作用的可能性。例如，如果配体是对目的免疫球蛋白具有亲和力的 抗原，则配位部分优选不是能结合该抗原的抗原表位标记或抗体。
如此处使用的短语"配位体离子或分子"是指可溶性实体(即，分 子或离子)，其对配位部分表现出足够的亲和力(即，KD<1(T5)且同 样能指引本发明的物质组合物形成非共价复合物。可用于本发明的配 位体分子的实例包括但不限于，亲和素及其衍生物、抗体、富电子分 子、缺电子分子等。可用于本发明的配位体离子的实例包括但不限于， 单、二或三价金属。图25举例说明了可用作本发明配位体离子的螯合 剂和金属的实例。图26列出了可用于本发明的富电子分子或缺电子分 子的实例。生成抗体和抗体片段以及单链抗体的方法在Harlow和 Lane ， Antibodies: A Laboratory Manual ， Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988，此处引入作为参考；Goldenberg,美 国专利4, O36, 945和4， 331， 647和其中包含的参考文献；也参见 Porter, R.R.Biochem. J. 73: 119-126 (1959); Whitlow和Filpula， Methods 2: 97-105 (1991 ); Bird等.，Science 242: 423-426 ( 1988); Pack等.，Bio/Technology 11: 1271-77 (1993);以及美国专利4， 946， 778]中描述。优选地，本发明的组合物包括配位体离子或分子。
本发明的配体可以直接结合至配位部分，取决于两个的化学性 质。然而要采取措施以维持配体对目的分子的识别(例如，亲和力)。
必要时(例如，空间位阻)，可经接头将配体连接至配位部分。图14 显示用于使用常见配体对代表性的螯合剂进行修饰的常规合成途径。 Margherita等.(1993 ) J. Biochem. Biophys. Methods 38: 17-28提供了
可用于将配体附着于本发明的配位部分的合成方法。
当配体和结合到配体上的配位部分都是蛋白质时(例如，分别为
生长因子和抗原表位标记)，融合蛋白质的合成可经分子生物学方法
(例如，PCR)或生化方法(固相肽合成)完成。
本发明的复合物具有不同的复杂度水平，例如，单体(参见图12 和13ab描述了三个配体复合物)、二聚物、聚合物(参见图23a-b描 述的聚合物经实施例部分实施例3所述的结合性接头的形成)、片层
(参见图24，其中当靶分子的单个表面暴露的Trp残基与TNB—TNB 体形成富/缺电子关系时形成片层)以及可形成三维(3D)结构的晶格
(如当超过一个表面暴露的Trp残基形成富/缺电子关系时)。得到很 好地证实的是复合物复杂度越高，结构越刚性使得能够用于如下文进 一步描述的结晶方法中。此外，大的复合物将更快地发生分相，不需 要使用另外的离心步骤。
如下文所述，本发明的组合物可以被组装在纯化试剂盒中，其可 包含另外的緩冲液和添加剂。可以理解的是这种试剂盒可以包括用于 纯化来自单一样品的许多分子的许多配体。然而，为了简化沉淀(例 如，使用相同的反应緩冲液、温度条件、pH等)以及进一步的纯化步 骤，选择相同的配位部分和配位体离子或分子。
如上文所提及的，本发明的组合物可用于纯化来自样品的目的分 子或细胞。
因此，本发明的另一个方面提供纯化目的分子的方法。 如此处使用的术语"纯化"是指至少通过依靠结合至本发明的组合
物而改变其溶解度并且沉淀而从样品分离目的分子(即，分相)。
本发明的方法通过将包含目的分子的样品与本发明的组合物接触
并且收集包含由本发明的物质组合物和目的分子形成的复合物的沉
淀，由此纯化目的分子。如此处使用的术语"样品"是指包含目的分子以及可能一种或多种 污染物(即，不同于所需目的分子的物质)的溶液。例如当目的分子 为分泌的重组多肽时，样品可以是条件培养基，其可能包含重组多肽、 血清蛋白以及代谢物以外的分泌自该细胞的其他多肽。当样品不包含 污染物时，纯化是指浓缩。
为了起始纯化，首先将本发明的物质组合物与样品接触。此优选 通过添加结合于配位部分的配体至样品而允许目的分子结合至该配 体，随后添加配位体离子或分子以允许目的分子的复合物的形成和沉 淀而完成。为了避免复合物的快速形成(其可能导致杂质的截留)， 优选在搅动时将配位体緩慢添加至样品。还可以通过添加游离的配位 体(即，不与配体结合的)实现可控制的沉淀速度，其还可引起在各
种应用中有益的较小的复合物的形成，例如下文进一步描述的免疫原 的形成。
一旦形成上述复合物(数秒至数小时)，可通过离心促进复合物 的沉淀(例如，超离心)，虽然有时(例如，大复合物的情况)离心 不是必须的。
取决于目的分子所需的用途，沉淀可经进一步的纯化步骤以从复 合物回收目的分子。此可通过使用本领域熟知的许多生化方法完成。 其实例包含，但不限于，经疏水作用层析的分级分离(例如经苯基琼
脂糖凝胶)、乙醇沉淀法、等电聚焦、反相HPLC、 二氧化硅层析、 肝素琼脂糖凝胶层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、层析聚焦、 SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、幾基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层 析(例如使用A蛋白、G蛋白、抗体、特异性底物、配体或抗原作为 捕获试剂)。
可以理解的是可以将纯净的反应溶液(例如，緩冲液)简单添加 至沉淀以洗脱在复合物形成时被沉淀的低亲和力结合的杂质。
进一步可理解的是任何上述纯化方法可以对样品重复应用(即， 沉淀)以提高靶分子的产量和/或纯度。
优选地，选择该物质组合物和配位体离子或分子以使靶分子从形 成的复合物快速和筒便的分离。例如，目的分子可直接从复合物洗脱， 条件是所用的洗脱条件不干扰配位部分结合至配位体(参见图4-5)。 例如，当用于复合物中的配位部分为螯合剂时，可使用高的离子强度来洗脱目的分子，因为已经很好地确证其不影响金属螯合剂的相互作 用。或者，可使用采用离液盐的洗脱，因为已经表明金属螯合剂的相
互作用对能使靶分子在这种条件洗脱的高盐条件耐受[Porath (1983 ) Biochemistry 22: 1621-1630。
可通过与配位体金属竟争的游离的(未修饰的)螯合剂(即，配 位部分)的添加而将复合物重新溶解(图3)。其后可使用超滤或透析 除去大部分的螯合金属和竟争性的螯合剂。溶解的复合物(即，目的 分子配体-配位部分)随后可被上样至固定化的金属亲和柱例如，亚 氨基二乙酸(IDA)和次氮基三乙酸(NTA)。可以理解的是当使用 高亲和力的螯合剂时(例如，儿茶酚)，采取措施而使用采用相同的 或对固定化的金属具有类似结合亲和力的其他螯合剂修饰的固定化的 金属亲和离子柱，以避免配体螯合剂试剂从柱上洗脱下来而不是结 合在柱上。
合适的洗脱条件的应用将导致靶分子的洗脱而保持配体-配位部分 结合在柱上。最终的脱盐步骤可用于获得终产品。
配体-配位部分的再生具有高的经济价值，因为这种融合分子的合 成可能耗费此处所述方法涉及的成本以及工作的大部分。因此，例如， 可通过将竟争性螯合剂上样到上述柱或者改变柱的pH，随后经可将游 离的螯合剂和所需的配体-配位部分分离的超滤，而实现配体-配位部分 的回收。
上述纯化方法可应用于各种重组体和天然物质的分离，这些重组 体和天然物质具有很高的研究或临床价值如重组生长因子和血液蛋白 质产物(例如，冯.威利布兰德因子和凝血因子，其分别是在用于冯-威 利布兰德疾病和甲型血友病的替代治疗中有效的治疗性蛋白质)。
如上文所提及的，本发明的组合物也可用于分离特定的细胞群体。
已确认由于人器官的缺乏，体外器官发生作为一个最佳替代而出 现。为此，必须分离能分化成任何所需细胞谱系的干细胞。因此，例 如，为了分离造血千/祖细胞，可使用结合至细胞群独有的表面标记如 CD34和CD105[参见Pierelli( 2001 )Leuk. Lymphoma 42( 6 ): 1195-206
的许多配体。
另一个实例为利用植物凝集素配体，如刀豆素A[Sharon ( 1972)Science 177: 949; Goldstein (1965 ) Biochemistry4: 876分离红细胞。
可利用特异于目的病毒细胞的各种配体实现病毒细胞的分离[参见 http: 〃www.bdbiosciences.com/clontech/archive/JAN04UPD/Adeno-X. shtml]。
具体地，可通过设计成包含肝素配体[Kohleisen ( 1996) J Virol Methods 60 (1 ) : 89-101的本发明的组合物来分离反转录病毒。
利用上述方法的细胞分离可经之前的样品分批步骤，实施该步骤 以基于细胞密度或大小分离细胞(例如，离心)以及进一步的选择性 细胞富集(例如，FACS)步骤而完成。
除了其纯化能力外，本发明的组合物还可用于除尽样品中不想要 的分子或细胞。
此通过将包含不想要的靶分子或目的细胞的样品与本发明的组合 物接触使得形成复合物(上述)并且除去沉淀而完成。该净化的样品 为上清液。
该方法具有各种用途，如用于除尽来自骨髓样品的肿瘤细胞、为 了分离和富集T细胞和CD"细胞或CD"+细胞而除尽来自外周血、脾 脏、胸腺、淋巴或骨髓样品的B细胞和单核细胞、除尽来自生物样品 的病原体和不需要的物质(例如，朊病毒、毒素)、蛋白质的纯化(例 如，除尽高分子量的蛋白质如BSA)等。
如上文所提及的，为了从给定样品中除尽大量靶物质，例如为了 从生物液体除去高丰度的蛋白质(例如，白蛋白、IgG、抗胰蛋白酶、 IgA、转铁蛋白和亲血球蛋白，参见 http : 〃 www.chem.agilent.com/cag/prod/ca/51882709small.pdf)可^吏用多个配 体。
相对现有沉淀组合物(例如，智能聚合物)，本发明新的组合物 的独特特性提供了许多优点， 一些优点概括如下。
U)低成本的纯化；该方法不依赖复杂的实验设备如HPLC，因 此规避了机器维护和运行的成本。
(ii) 易于放大；本方法不受具有扩散限制的亲和柱载量的限制。 事实上，对添加的沉淀复合物的量没有限制。
(iii) 温和的沉淀方法；避免了pH、离子强度或温度很大改变产 生的限制。(iv) 控制整个沉淀过程；沉淀可通过将合适的配位体离子或分子 緩慢添加到沉淀混合物；单和/或多价配位体的使用；对配位部分具有 不同亲和力的配位体离子或分子的使用；在非共价聚合物、片层或晶 格形成之前、之中或之后，添加非固定的游离配位部分以避免杂质的 非特异性结合和截留Mattiasson等"(1998) J. Mol. Recognit. 11: 211-216; Hilbrig和Frehag ( 2003 ) J. Chromatogr. B 790: 79-90；以 及通过改变温度条件而控制。已证实各种分子在温度降低时呈现较低 的溶解度，因此，控制温度条件可以调节沉淀的速率和程度。不过可 以理解的是，由于快速的沉淀过程，低温条件可能引起杂质的截留， 而高温条件可能引起靶分子的低产量(例如，变性温度)。因此在考 虑上述参数时采取措施以达到最适的温度条件。
(v) 降低的杂质本底；杂质不能结合配位体并且同样地其不能紧 密结合至非共价的基质，允许在洗脱步骤之前被除去。此外，来自配 体生物本底的杂质(与配体共同纯化的分子)连同配体本身可能变为 修饰过的条件是配体和杂质具有相同的化学性质(例如，均为蛋白 质)，并且可能成为沉淀复合物的一部分。在合适的洗脱条件下，粑 分子将被回收而j务饰的杂质不会被回收。
(vi) 在均匀溶液中的结合；已证实在均匀溶液中的结合比在不均 匀的相中更快并且更有效，如在亲和层析中AC， Schneider等.，(1981) Aim. NY Acad. Sci. 369， 257-263; Lowe ( 2001) J. Biochem. Biophys. Methods 49， 561-574。例如，已知在许多亲和分离策略中，高分子量 聚合物(用于AP)在溶液中形成非常巻曲的和粘滞的结构，其妨碍引 入的大分子如靶分子的进入。
(vii) 没有上文进一步所述的配体的固定化。
(viii) 简便的复合物的重溶；复合物通过非共价作用而产生。
(ix) 严格条件下的消毒；该组合物不与基质共价结合并且因而可 从任何装置移去，应用允许消毒条件以清除装置(柱)中的非特异性 结合的杂质。
本发明组合物将目的分子以有序的复合物如二聚物、三聚物、聚 合物、片层或晶格排列的能力还使得其能用于促进大分子如蛋白质， 尤其是膜蛋白的结晶。如本领域所熟知的，晶体结构代表分子在三维 空间的有序排列。这种有序排列可通过在给定的空间降低游离分子的数目而产生(参见图10a-b和lla-c)。
因此，本发明的又一个方面提供用于结晶目的分子的组合物。
如此处使用的术语"结晶"是指目的分子的固化以致形成其原子的 有规则地重复的内部排列和常见的外部平的表面。
本发明的组合物包含至少一种能结合目的分子的配体，该配体附 着于至少一种配位部分；和能非-共价结合该至少一种配位部分的配位 体，当共-孵育时该至少一种配位部分和配位体能形成复合物，并且因 此选择组合物以使当目的分子结合至配位体时能确定该目的分子的相 对空间位置和方向，由此在诱导结晶的条件下促进其中晶体的形成。
可以理解的是共价多配体复合物的使用之前已在可溶性蛋白质的 结晶中尝试Dessen( 1995 )Biochemistry 34: 4933-4942; Moothoo( 1998 ) Acta. Cryst. D 54 1023-1025; Bhattacharyya ( 1987) J. Biol. Chem. 262: 1288-1293。然而，每个分子具有超过两个配体的多配体复合物的合成 是技术上困难的和昂贵的；此外，多配体复合物合成之前靶蛋白的三 维结构应该已知，其在配体间具有最佳的距离以结合足够的靶分子而 在该多配体复合物中占据所有的靶结合位点，因而，这些配体未曾用 于膜蛋白的结晶。
通过更快和更便宜地仅合成非共价多配体中的基本单元(具有配 体-配位部分的通用结构)，其是更容易实现的，本发明克服了这些问 题。该基本单元，仅通过多价配位体离子或分子的添加就形成非共价 的三-配体。因此，使用单个合成步骤来形成双、三、四或更高的可用 于结晶实验的多配体。
为了产生目的分子的晶体(优选膜蛋白)，使本发明的组合物与 样品接触，样品包含目的分子，优选以预定的纯度和浓度提供。
通常，结晶样品为液态样品。例如，当目的分子为膜蛋白时，本 发明的结晶样品为膜制备物。生成膜制备物的方法在Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)中描述。
一旦目的分子结合至本发明的組合物，使得其相对空间位置和方 向得到很好的确定，样品就经受合适的结晶条件。本领域已知的一些 结晶方法可用于样品以促进目的分子的结晶。结晶方法的实例包含， 但不限于，自由界面扩散法Salemme， F.R. ( 1972) Arch. Biochem.Biophys.lSl: 531539、在悬浮或滴入方法中的蒸气扩散(McPherson， A. (1982 ) Preparation and Analysis of Protein Crystals, John Wiley 和Son, New York, pp82誦127)以及液态的透析(Bailey， K. (1940) Nature 145: 934-935)。
目前，悬滴法是用于从溶液中生长大分子晶体的最常用的方法； 该方法尤其适于生成蛋白质晶体。通常，将包含蛋白质溶液的小滴点 样至盖玻片上并且悬浮在包含具有较高浓度沉淀剂库的密封室中。随 着时间的过去，小滴中的溶液通过来自小滴的水蒸气的扩散而与该库 平衡，因此緩慢提高小滴内蛋白质和沉淀剂的浓度，其进而导致蛋白 质的沉淀或结晶。
利用上述方法获得的晶体具有优选小于3A，更优选小于2.5A,更 加优选小于2A的分辨率。
本发明的组合物在检验来自复杂混合物的分析物如血清样品中具 有显著的有效性，其具有显著的诊断优点。
因此，本发明涉及检测患者中与目的分子相关的疾病的易感性或 存在的方法。
与目的分子相关的疾病的实例为前列腺癌，其可通过前列腺特异 性抗原的存在而检测PSA，例如，>0.4ng/ml， Boccon-Gibod Int J Clin Pract. (2004) 58 ( 4 ) : 382-90。
本发明的组合物与获自患者的生物样品接触，借此包含目的分子 的复合物形成的水平指示患者中与目的分子相关的疾病的易感性或存 在。
如此处使用的短语"生物样品"是指从患者分离的组织或液体样 品，包含但不限于，例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤、呼吸 的、肠的和泌尿生殖道的外表部分、眼泪、唾液、乳汁、血细胞、肿 瘤、神经元组织、器官以及体内细胞培养组分的样品。
为了便于复合物中目的分子的检测和定量，优选对生物样品或组 合物进行标记(例如，焚光、放射性标记)。
本发明的组合物还可用于定性或定量存在于液态或气体样品中的 物质，其可能在临床、环境、健康和安全、遥感学、军事、食物/饮料 和化学加工应用中具有重要的作用。
异常蛋白质的相互作用控制许多病原性的病症的发展。例如，神经系统中突触蛋白质的异常相互作用和错折叠是各种神经系统病症中 导致神经退行性变的重要的发病事件。这些包括阿尔茨海默氏病
(AD)、帕金森氏症(PD)和Lewy体痴呆(DLB )。在AD中，错 折叠的淀粉状蛋白P多肽1-42(AP )、淀粉状蛋白前体蛋白代谢作用 的蛋白水解产物在神经元内质网和细胞外累积为凝集体(即，血小 板)。本发明的组合物可用于打乱这种大分子复合物而因此治疗该病 症。
给药和药物组合物产生的方法由例如，Fingl，等.，(1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics" ， Ch.l p.l描述。
本发明的组合物可被包括在诊断或治疗试剂盒内。例如，特定疾 病的组合物可和合适的緩冲液和防腐剂一起被包装在一种或多种容器 中并且用于诊断或用于直接的治疗。
因此，配体和配位部分可被置于一个容器中而配位体分子或离子 可被置于第二个容器中。优选地，容器包含标签。合适的容器包含， 例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可由各种材料如玻璃或塑料制 成。
此外，也可加入其他添加剂如稳定剂、緩冲液、封阻剂等。
用于增强抗原的免疫原性潜力的许多方法在本领域中已知。例 如，半抗原载体偶联，其涉及利用将抗原性分子(例如，多肽)交联 至更大的载体如KLH、 BSA、甲状腺球蛋白和卵清蛋白来提高该分子 的分子大小， 一个已知控制免疫原性的参数[参见Harlow和Lane (1998) A laboratory manual Infra]。然而，抗原性分子的共价交联导 致其中的结构变化，因此限制了抗原的呈递。已尝试将抗原性分子非 共价固定至各种基质来绕过该问题[Sheibani Frazier ( 1998 ) Bio Techniques 25: 28。因此，本发明的组合物可用于介导同样的作用。
因此，本发明还涉及利用本发明的组合物增强目的分子免疫原性 的方法。如此处使用的术语"免疫原性"是指分子激起生物体内免疫应 答(例如，抗体反应)的能力。
该方法通过将目的分子与本发明的组合物接触而完成，借此由此 形成的复合物被用作免疫原。可将这种复合物注射至动物宿主以产生 免疫应答。
因此，例如为了产生抗体反应，将上述免疫原性组合物经皮下注射入动物宿主中(例如，兔或小鼠)。在l-4次注射(即，推进)后， 收集血清(约首先注射的14周)并且例如通过利用上述样品中分析物 检测的方法来测定抗体效价，其中配体为比如A蛋白。可选择的或另 外，进行亲和层析或ELISA。
可以理解的是本发明的组合物具有许多其他的用途，其在此处未 清楚地描述，例如那些属于亲和层析的用途[参见例如，Wen-Chien和 Kelvin (2004) Analytical Biochemistry 324: 1-10。
本发明另外的目的、优点和新的特征对于本领域技术人员参阅下 列并不试图限制的实施例后将是显而易见的。另外，上文所述以及下 列权利要求部分要求的本发明的每个不同实施方案和方面将在下列实 施例中找到实验性的支持。
实施例
参考下列实施例，与上述说明书 一起以非-限制性方式举例说明本 发明。
通常，此处所用的术语和本发明中所用的实验方法包括分子的、 生化的、微生物学的和重组的DNA技术。所述技术在文献中得到充分 说明。参见，例如，"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook 等.，(1989 ) ; "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.( 1994 ); Ausubel等.，"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley和Sons, Baltimore, Maryland (l卿)；Perbal， "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988 ) ; Watson等.，"Recombinant DNA"， Scientific American Books, New York; Birren等，(eds ) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4， Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);美国专利4, 666， 828; 4, 683， 202; 4， 801， 531; 5， 192， 659和5， 272, 057中阐述的方法;"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-HI Cellis， J.E., ed. (1994 ); "Current Protocols in Immunology" Volumes l陽lll ColiganJ.E., ed. (1994) ; Stites等. (eds ) ， "Basic and Clinical Immunology"(第8版)，Appleton & Lange， Norwalk， CT( 1994 ); Mishell和Shiigi( eds ), "Selected Methods in Cellular Immunology", H.Freeman和Co., New York (1980 ); 可 用的免疫测定法在专利和科学文献中被广泛地描述，参见，例如，美国专利3， 791， 932; 3， 839， 153; 3， 850， 752; 3， 850， 578; 3， 853， 987; 3， 867， 517; 3， 879， 262; 3， 901， 654; 3， 935， 074; 3， 984， 533; 3， 996， 345; 4， 034， 074j 4， 098， 876. ， 4， 879， 219. ， 5， 011， 771和5， 281， 521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait， M.J" ed.( 1984 ); "Nucleic Acid Hybridization" Hames， B.D.，和HigginsS.J., eds. (1985) ; "Transcription and Translation" Hames， B.D.，以及 HigginsS.J" Eds. (1984) ; "Animal Cell Culture" Freshney， R.I.， ed. (1986) ; "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal， B., ( 1984 )和 "Methods in Enzymology"Vol.l-317 , Academic Press ; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications" ， Academic Press, SanDiego， CA( 1990 ); Marshak等.,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996);此处所有这些引入作为参考就如完全阐述一样。其他的一 般参考文献贯穿该说明书而提供。为了方便阅读而提供其中被认为是 本领域熟知的方法。其中包含的全部信息此处引入作为参考。
^^脊合唐-金虞复合^合^ 痴傳茇合參 螯合剂以不同特异性和亲和力结合金属的能力在文献中得到很好 的描述。为了产生本发明的非共价多配体复合物，修饰接头(具有所 需长度)结合特定的配体和螯合剂以产生下列配体--接头--螯合剂的 通用结构。
随后，通过添加合适的金属，将形成非共价多配体复合物。(图 12)。
例如，合成异鞋肟酸(其为已知的铁螯合剂)衍生物(图13a )以 使在FeS+离子存在时形成非共价多配体复合物(图13b)。图14显示 用于使用常见配体修饰典型的螯合剂的常规合成途径。上述合成可与 上文Margherita等.，1999所述的类似。
螯合剂的用于制备非共价多配体复合物的用途可具有一个另外的 优点，该优点来自 一 些螯合剂以不同的化学计量结合不同金属的能 力，如在1， 10-菲咯啉2-Cu2+或[1， 10-菲咯啉l3-Ru3+[Onfelt等"(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 5708-5713的情况下。该现象可用于利用相同的配体一接头--螯合剂衍生物来形成双 (图lh)和三(图15b)非共价多配体复合物。
冉^ ,鬯f-凝鬯f《合參合4举^斧,應谬^合參 电子受体很容易和"兀过度的"杂环吲哚环体系形成分子复合物。 p引哚苦味酸是约130年前描述的该类型的第一个复合物[Baeyer，和 Caro, ( 1877) Ber.l0: 1262并且数年后使用相同的电子受体从茉莉 花油分离出了吲哚。苦味酸此后常常被用于分离和鉴定来自反应混合 物的吲哚复合物。后来，引入1， 3， 5-三硝基苯作为络合剂并且常用 于相同的目的[Merchant和Salagar， ( 1963 ) Current Sci. 32: 18。 已经用电子受体例如收敛酸[Marion， L"和Oldfield， C.W" (1947) Cdn. J. Res. 25B 1、间三硝苯基卣化物[Triebs， W" (1961 )Chem. Ber. 94: 2142、2， 4， 5， 7-四硝基誦9-药酮Hutzinger， O.，和Jamieson， W.D.， Anal. Biochem. (1970) 35， 351-358,以及用l陽氟代画2， 4-二硝 基苯和l-氯代-2,4-二硝基苯Elguero等"(1967 )Anals Real Soc. Espan. Fis. Quim.( Madrid )ser. B 63， 905( 1%7 ); Wilshire， J.F.K" Australian J.Chem. 19， 1935 (1966)制备了吲哚的其他固体复合物。
图16a，举例说明了配体——接头——缺电子(缺E.)衍生物的一个 实例，而图16b，呈现了可使用的富电子共价三聚物的一个实例。可预 料的是，通过将三硝基苯(图16a)和吲哚(图16b)衍生物混合将形 成多配体复合物(图16c )。可以理解的是也可以合成反向复合物，即，
含有富电子部分的配体衍生物和缺电子的共价三聚物。
图17显示了用于上述配体衍生物制备的可能的合成途径。 包含Trp残基(或任何其他富电子或缺电子部分)的合成肽(或 任何多肽)也可用于非共价多配体复合物的制备。图18显示了可形成 具有四个Trp残基(四个富电子部分)合成肽的一个实例， 一个具有 用缺电子体(三硝基苯)修饰的配体衍生物的四-非共价配体。
可组合上述实施例1和2中所述的两种复合能力以形成非共价多 配体复合物。这种非共价多配体复合物的通用结构的一个实例在图19中显示。
为此，需要与缺电子部分共价结合的螯合剂。用于生成这种组合
的合成途径在图20中呈现。
例如，能结合1V^+和M"金属的螯合剂(例如，儿茶酚)在M2+ 和M"金属存在时能形成非共价-二配体(图21a)或者非共价-三配体 (图21b)。
具有Trp残基(或任何其他富电子残基)的肽(或多肽)的存在 可能会引起图22a-b中所示结构的形成。
上述两种结合关系的组合(螯合剂-金属和富电子-缺电子)可以带 来另外的优点。例如，形成非共价多配体聚合复合物的能力。这可通 过将两个螯合剂和一个处于其间的富电子部分合成而实现(图23a)。 在配体--缺电子衍生物存在时预期将形成图23b中所绘的复合物，其 代表一种配体的非共价聚合物。
一旦形成二聚物、三聚物、四聚物等(通过例如配体--螯合剂衍 生物)，将会希望限制上述运动的自由度以便实现高度的有序排列。 如果目的蛋白质具有富电子部分(例如Trp)，该富电子部分能接近共 价的二-缺电子部分(如例如二-三硝基苯、TNB—TNB)，则可在两个 非共价二聚物之间形成复合物(图24)。这将导致蛋白质和多配体的 有序片层的形成。
可以理解的是也可将本发明的为了解释而在上下文的各个实施方 案中描述的某些特征组合用于单个实施方案中。反之，本发明的为了 简便起见而在上下文的单个实施方案中所述的不同特征也可单独或以 任何合适的亚组合形式提供。
虽然联系本发明的具体的实施方案对本发明进行了描述，但显然 许多替换、改进和改变对于本领域技术人员是显而易见的。因此，其 目的是包括所有这样的替换、改进和改变，其落入附加的权利要求的 精神和较宽的范围内。说明书提及的所有出版物、专利和专利申请此 处整体引入说明书作为参考，就如每个单独的出版物、专利或专利申 请此处具体和单独地引入作为参考一样。此外，该申请中任何参考文
明的现有技术.
权利要求
1. 一种包括至少一种能结合靶分子或目的细胞的配体的物质组合物，当与配位体离子或分子共-孵育时，所选的附着于至少一种配位部分的所述至少一种配体能指引该物质组合物形成非-共价复合物。
2. 权利要求l的组合物，其中所述的复合物是聚合复合物。
3. 权利要求l的组合物，进一步包括所述的配位体离子或分子。
4. 权利要求l的组合物，其中所述的目的靶分子选自蛋白质、核 酸序列、小分子化学试剂和离子。
5. 权利要求1的组合物，其中所述的目的靶细胞选自真核细胞、 原核细胞和病毒细胞。
6. 权利要求l的组合物，其中所述的至少一种配体选自生长因子、 激素、核酸序列、抗体、抗原表位标记、亲和素、生物素、酶的底物 和酵。
7. 权利要求l的组合物，其中所述的至少一种配体经接头附着于 所述的至少一种配位部分。
8. 权利要求l的组合物，其中所述的配位部分选自螯合剂、生物 素、核酸序列、抗原表位标记、缺电子分子和富电子分子。
9. 权利要求l的组合物，其中所述的配位体离子或分子选自金属 离子、亲和素、核酸序列、缺电子分子和富电子分子。
10. —种纯化乾分子或目的细胞的方法，该方法包括(a) 将包含靶分子或目的细胞的样品和一种组合物接触，该组 合物包括(i) 至少一种能结合靶分子或目的细胞的配体，所述至少一种 配体附着于至少一种配位部分，和(ii) 能非-共价结合所述的至少一种配位部分的配位体，当共-孵育时所述至少一种配位部分和所述配位体能形成复合物；和(b) 收集包含结合至靶分子或目的细胞的所述复合物的沉淀，由 此纯化靶分子或目的细胞。
11. 权利要求10的方法，其中目的分子选自蛋白质、核酸序列、 小分子化学试剂和离子。
12. 权利要求10的方法，其中目的靶细胞选自真核细胞、原核细 胞和病毒细胞。
13. 权利要求10的方法，其中所述的至少一种配体选自生长因子、 激素、核酸序列、抗体、抗原表位标记、亲和素、生物素、酶的底物 和酵。
14. 权利要求10的方法，其中所述的至少一种配体经接头附着于 所述的至少一种配位部分。
15. 权利要求10的方法，其中所述的配位部分选自螯合剂、生物 素、核酸序列、抗原表位标记、缺电子分子和富电子分子。
16. 权利要求10的方法，其中所述的配位体离子或分子选自金属离子、亲和素、核酸序列、缺电子分子和富电子分子。
17. 权利要求10的方法，进一步包括从所述沉淀回收目的分子。
18. —种检测受试者中与目的分子相关的疾病的易感性或存在的 方法，该方法包括将获自受试者的生物样品和一种组合物接触，该组 合物包括(i) 至少一种能结合目的分子的配体，所述的至少一种配体附 着于至少一种配位部分；和(ii) 能非-共价结合所述的至少一种配位部分的配位体，当共-孵 育时所述的至少一种配位部分和所述的配位体能形成复合物，其中包 含目的分子的复合物的形成指示患者中与目的分子相关的疾病的易感 性或存在。
19. 权利要求18的方法，其中目的分子选自蛋白质、核酸序列、 小分子化学试剂和离子。
20. 权利要求18的方法，其中所述的至少一种配体选自生长因子、 激素、核酸序列、抗体、抗原表位标记、亲和素、生物素、酶的底物 和酵。
21. 权利要求18的方法，其中所述的至少一种配体经接头附着于 所述的至少一种配位部分。
22. 权利要求18的方法，其中所述的配位部分选自螯合剂、生物 素、核酸序列、抗原表位标记、缺电子分子和富电子分子。
23. 权利要求18的方法，其中所述的配位体离子或分子选自金属 离子、亲和素、核酸序列、缺电子分子和富电子分子。
24. —种用于结晶目的分子的组合物，该组合物包括(i) 至少一种能结合目的分子的配体，所述至少一种配体附着于至少一种配位部分；和(ii)能非-共价结合所述的至少一种配位部分的配位体，其中当 共-孵育时所述至少一种配位部分和配位体能形成复合物，因此选择组 合物以使当目的分子结合至该配位体时能确定所述目的分子的相对空 间位置和方向，由此在诱导结晶的条件下促进其中晶体的生成。
25. 权利要求24的组合物，其中目的分子选自蛋白质、核酸序列、 小分子化学试剂和离子。
26. 权利要求24的组合物，其中所述的至少一种配体选自生长因 子、激素、核酸序列、抗体、抗原表位标记、亲和素、生物素、酶的 底物和酶。
27. 权利要求24的组合物，其中所述的至少一种配体经接头附着 于所述的至少 一种配位体。
28. 权利要求24的组合物，其中所述的配位部分选自螯合剂、生 物素、核酸序列、抗原表位标记、缺电子分子和富电子分子。
29. 权利要求24的组合物，其中所述的配位体离子或分子选自金 属离子、亲和素、核酸序列、缺电子分子和富电子分子。
30. —种使目的分子结晶的方法，该方法包括将包含目的分子的 样品和结晶组合物接触，该结晶组合物包括(i) 至少一种能结合目的分子的配体，所述至少一种配体附着 于至少一种配位部分；和(ii) 能非-共价结合所述至少一种配位部分的配位体，当共-孵育 时所述至少一种配位部分和配位体能形成复合物，因此选择结晶组合 物以使当目的分子结合至该配位体时能确定所述目的分子的相对空间 位置和方向，由此在诱导结晶的条件下促进其中晶体的生成。
31. 权利要求30的方法，其中目的分子选自蛋白质、核酸序列、 小分子化学试剂。
32. 权利要求30的方法，其中所述的至少一种配体选自生长因子、 激素、核酸序列、抗体、抗原表位标记、亲和素、生物素、酶的底物 和酵。
33. 权利要求30的方法，其中所述的至少一种配体经接头附着于 所述的至少一种配位部分。
34. 权利要求30的方法，其中所述的配位部分选自螯合剂、生物素、核酸序列、抗原表位标记、缺电子分子和富电子分子。
35. 权利要求30的方法，其中所述的配位体离子或分子选自金属、 亲和素、核酸序列、缺电子分子和富电子分子。
36. —种包含一种分子的物质组合物，所述分子具有能结合目的 分子的第一区域和能结合配位体离子或分子的第二区域，所述的第二 区域被设计成使得当该分子暴露于所述配位体离子或分子时形成聚合 物。
37. 权利要求36的组合物，其中所述的第二区域能结合超过两个 配位体离子或分子。
38. 权利要求36的组合物，其中所述的配位体离子或分子的结合是非共价的结合。
39. —种除尽来自样品的靶分子或目的细胞的方法，该方法包括(a) 将包含靶分子或目的细胞的样品和一种组合物接触，该组 合物包括(i) 至少一种能结合目的分子的配体，所述至少一种配体附着 于至少一种配位部分；和(ii) 能非-共价结合所述至少一种配位部分的配位体，当共-孵 育时所述至少一种配位部分和配位体能形成复合物；和(b) 除去包含结合至靶分子或目的细胞的复合物的沉淀，由此除 尽来自样品的靶分子或目的细胞。
40. 权利要求39的方法，其中目的分子选自蛋白质、核酸序列、 小分子化学试剂和离子。
41. 权利要求39的方法，其中目的靶细胞选自真核细胞、原核细 胞和病毒细胞。
42. 权利要求39的方法，其中所述的至少一种配体选自生长因子、 激素、核酸序列、抗体、抗原表位标记、亲和素、生物素、酶的底物 和酵。
43. 权利要求39的方法，其中所述的至少一种配体经接头附着于 所述的至少一种配位部分。
44. 权利要求39的方法，其中所述的配位部分选自螯合剂、生物 素、核酸序列、抗原表位标记、缺电子分子和富电子分子。
45. 权利要求39的方法，其中所述的配位体离子或分子选自金属、 亲和素、核酸序列、缺电子分子和富电子分子。
46. —种增强目的靶分子的免疫原性的方法，该方法包括将目的 靶分子和一种组合物接触，该组合物包括(i) 至少一种能结合靶分子或目的细胞的配体，所述的至少一 种配体附着于至少一种配位部分；和(ii) 能非-共价结合所述至少一种配位部分的配位体， 其中进行接触使得所述至少一种配位部分和配位体能形成包含目的靶分子的复合物，由此增强目的靶分子的免疫原性。
47. 权利要求46的方法，其中目的分子选自蛋白质、核酸序列、 小分子化学试剂和离子。
48. 权利要求46的方法，其中所述的至少一种配体选自生长因子、 激素、核酸序列、抗体、抗原表位标记、亲和素、生物素、酶的底物 和酶。
49. 权利要求46的方法，其中所述的至少一种配体经接头附着于 所述的至少一种配位部分。
50. 权利要求46的方法，其中所述的配位部分选自螯合剂、生物 素、核酸序列、抗原表位标记、缺电子分子和富电子分子。
51. 权利要求46的方法，其中所述的配位体离子或分子选自金属 离子、亲和素、核酸序列、缺电子分子和富电子分子。
全文摘要
提供一种物质组合物。该组合物包括至少一种能结合靶分子或目的细胞的配体，当与配位体离子或分子共-孵育时，所选的附着于至少一种配位部分的该至少一种配体能指引该物质组合物形成非-共价复合物。还提供了使用该组合物进行靶物质纯化、结晶和免疫的方法。
文档编号C12NGK101415721SQ200480026353
公开日2009年4月22日 申请日期2004年7月22日 优先权日2003年7月24日
发明者G·帕特科尼克 申请人:阿菲辛克生物科技有限公司