专利名称：具有提高的果糖发酵能力的酵母菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有提高的碳水化合物发酵能力的酵母菌株，具体而言，涉及用编码改进的己糖转运蛋白基因的基因转化的菌株，更具体地，用突变的HXT3基因转化的菌株。
在葡萄酒的乙醇发酵期间，己糖(例如葡萄糖和果糖)通过微生物的活动被转化为乙醇，具体而言，通过Saccharomyces属酵母菌株。S.cerevisiae是葡萄酒制造中优选的酵母，选出的S.cerevisiae菌株被用作为接种葡萄汁及进行乙醇发酵的启动者。葡萄汁含有等量的葡萄糖和果糖，其中典型地，总己糖的水平在160至300g/L的范围内。S.cerevisiae是亲葡萄糖(glucophilic)酵母，相对于生长底物中存在的其它任何碳源而言更优选葡萄糖。结果，在乙醇发酵期间，葡萄汁的果糖/葡萄糖比率逐步增加。目前已通过实践证实，发酵之后，瓶装的葡萄酒中发现的果糖总是比葡萄糖的量要大。发酵期间，果糖和葡萄糖的比率强烈不平衡可能是发酵停滞的主要原因。
在分子水平上，已对酵母的发酵能力进行了相当广泛的研究。通过酵母的活动进行的糖代谢早期步骤之一是运送糖穿过质膜。编码用于不同的糖的转运蛋白的特定基因在酵母中表达。在Saccharomyces中，己糖(例如葡萄糖和果糖)的摄取受到特定的己糖转运蛋白的调节，所述转运蛋白属于单糖促进因子(facilitator)的超家族(Reifenberger，E.，Freidel，K.andCiriacy，M.(1995)16(1)，157-167)。至今，已经鉴定出了超过16种编码此类基因的基因，特别是所谓的HXT基因(其代表己糖转运”hexosetransport”)。单个HXT基因和同源体的表达取决于环境因素，例如酵母细胞所感受到的己糖浓度。已经有人提出，己糖的摄取由两种动力学上不同的系统催化(Bisson，L.F.，Coons，D.M.，Kruckeberg，A.L.and Lewis D.A.(1993)Crit Rev Biochem Mol Biol 28，295-308；Lagunas，R.(1993)FEMSMicrobiol Rev 104，229-242)。
一种系统具有对己糖的高亲和度。这种高亲和度的组分在生长于相对高的己糖浓度(例如，2％葡萄糖)的细胞中是不存在的。在这些条件下，酵母细胞表达低亲和度的转运蛋白。构建缺乏多种HXT基因的突变体酵母菌株使得可以鉴定出酵母中的主要葡萄糖转运蛋白(Reifenberger，E.，Boles，E.and Ciriacy，M.(1997)，Eur.J.Biochem.245324-333)。在缺乏HXT1至HXT7基因的酵母菌株中，在含有高和低葡萄糖浓度(0.1％至5％)的培养基中的生长，葡萄糖摄取和葡萄糖消耗都低于检测水平。在用仅表达HXT1至HXT7中的一种基因的突变体酵母菌株进行的一系列实验中显示HXT1p和HXT3p是低亲和度的转运蛋白(km≈50-100mM己糖)，HXT4p较低，而HXT2p、HXT6p和HXT7p是高亲和度的转运蛋白(km≈1-4mM己糖)，与这些突变体的培养条件(0.1％或5％葡萄糖)无关(Reifenberger，E.，Freidel，K.and Ciriacy，M.(1995)Yeast 11，S457)。相对果糖而言，所有己糖载体都对葡萄糖展示出较强的亲和度。对于低亲和度的载体HXT1(对葡萄糖而言，km≈110mM，而对果糖来说则＞300mM)和HXT3(对葡萄糖而言，km≈65mM，而对果糖来说是125mM)而言更是如此。
已分析出了葡萄酒发酵期间HXT载体的作用(Luyten，K.，Riou，C.andBlondin，B.(2002)Yeast 19，1-15 and Riou，C.Luyten，K.de Chazal，E.andBlondin，B.(2001)Yeast 18，S293)。其显示，在酿制葡萄酒的发酵条件下，若干种载体(HXT1、HXT3、HXT6、HXT7)参与己糖转运。
遵循消费者的要求和国际上制作葡萄酒的实践，大比例的天然品质葡萄酒被发酵至干。这意味着葡萄酒中残余的己糖的量通常小于1g/L。果糖是发酵终点存在的主要的糖，因为果糖比葡萄糖更难于发酵，因此发酵在结尾时通常进行缓慢。取决于酵母的活性，这可能导致缓慢的或停滞的发酵。人们预计，具有强的发酵果糖的能力的酵母能更为迅速地达到发酵终点。
已从自然界中分离出了能更好地发酵果糖的酵母菌株，此类所谓的亲果糖酵母已被成功用于进一步降低葡萄汁中的糖含量。它们还已被成功用于停滞的发酵中，以通过用新的酵母细胞接种来去除残余的糖。法国的Institut National de Recherche Agronomique已分离出了被称为Fermichamp的亲果糖酵母菌株67J INRA Narbonne，其可从DSM Food Specialties商业获得。
除了发酵葡萄进行葡萄酒制作之外，还有其它工业过程中，其中发酵速率和/或效率可被提高，以增加产生的乙醇的量。此类过程的例子是通过发酵从淀粉中获得的葡萄糖以及发酵从含木聚糖的化合物中获得的木糖来生产燃料乙醇。
人们需要具有提高的碳水化合物利用能力的酵母菌株。
令人惊奇地，我们发现，在HXT3转运蛋白之中存在更好地利用碳水化合物的能力。本发明涉及经过分离的HXT3基因，其编码具有提高的转运碳水化合物的能力的HXT3己糖转运蛋白或其功能性片段。碳水化合物可以例如是己糖(葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖)和戊糖(木糖、核糖、阿拉伯糖)。优选地，获得了利用选自由果糖、葡萄糖或木糖构成的组的至少一种碳水化合物的提高的能力，更优选地，是由果糖和木糖构成的组。在制作葡萄酒的情况中，如上文所述，果糖利用的提高是优选的。额外的优点是发酵速率也可被根据本发明的HXT3己糖转运蛋白提高。
可以通过用突变的或野生型HXT3基因转化过的酵母发酵期间，比较两种碳水化物(包括希望被分析的一种)的比率来测量某种类型的碳水化合物转运的提高。野生型HXT3基因优选具有根据SEQ ID NO25的核酸序列，其与来自Saccharomyces cerevisiae基因组数据库(Stanford)的已知S288C HXT3转运蛋白基因相同。
用于测量的用HXT3基因转化的酵母可以是任何希望的酵母菌株，只要能在同一物种中转化两种基因。合适的酵母菌株例如是Saccharomycescerevisae、S.uvarum、S.bayanus、S.pastorianus、S.paradoxus。本领域技术人员将能选出针对目标应用的酵母菌株。优选地，采用Saccharomycescerevisae用于测量。
当分离出的HXT3转运蛋白具有增加的转运果糖的能力时，优选通过比较发酵期间的葡萄糖/果糖比(在与实施例4所述相同的条件下)来测量它相对于野生型己糖转运蛋白而言提高的转运果糖的能力。
本发明还涉及新的核酸序列，其编码HXT3转运蛋白，所述转运蛋白具有从SEQ ID NO26衍生的氨基酸序列，并且在选自由Leu 207、Met208、Ile 209、Thr 210、Leu 211、Gly 212所构成的组的位置上具有至少一种突变。优选地，所述突变选自由Leu 207、Met 208、Ile 209、Thr 210、Leu 211所构成的组，更优选地，选自由Met 208、Ile 209、Thr 210所构成的组，最优选地，突变在Ile 209处发生。
此外还可以存在其它突变。优选的作用于改进表型的其它突变是在由野生型HXT3转运蛋白的第324、388、389、392、414、415、449、471位构成的组的至少一处上或附近发生的突变。当HXT3转运蛋白是根据SEQ ID NO26的序列时，该组更具体地由Met 324、Leu 388、Tyr 389、Ile 392、Glu 414、Gly 415、Ile 449、Leu 471构成。
优选地，下述的任何突变可以单独或组合形式额外存在Met 324Ile、Leu 388 Met、Tyr 389 Trp、Ile 392 Val、Glu 414 Gln、Gly 415 Asn、Ile 449 Val、Leu 471 Ile。
上下文中，术语“突变的”或“突变”或“多种突变”表示，编码HXT3转运蛋白的核酸的核苷酸序列不同于该物种的野生型HXT3序列。或者，术语“突变的”或“突变”或“多种突变”可以指编码HXT3转运蛋白的核酸的核苷酸序列较之编码内源HXT3转运蛋白的基因序列的变化。此外，用于本文中的术语“突变的”或“突变”或“多种突变”指，己糖转运蛋白氨基酸序列较之天然的或内源的或野生型氨基酸序列的改变。
突变可以是保守的或非保守的突变。
术语“保守取代”用来指野生型氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。这些家族是本领域已知的，它们包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
术语“非保守取代”用来表示野生型氨基酸残基被具有不同侧链的氨基酸残基所取代。
令人惊奇地，我们发现，即便是Ile 209 Val的保守突变也可对亲果糖表型做出贡献，其中，前三个字符代表野生型HXT3蛋白质的氨基酸，中间三个数字代表蛋白质中突变的位置(从Met起始，其氨基酸编号为001)，后三个字符代表根据本发明的突变的HXT3蛋白的氨基酸。
上面鉴定出了HXT3基因中的大量特定突变，它们可单独或组合以利于提高酵母的碳水化合物利用能力。上面鉴定出了HXT3基因中的大量特定突变，它们可单独或组合以利于提高酵母的果糖利用能力。此外已经发现，这种突变的HXT3基因可以转移到非亲果糖菌株中，由此提高该非亲果糖菌株在发酵期间利用果糖的能力。因此，本发明涉及经过分离的HXT3基因，其中包含一种或多种突变，所述突变能提高基因产物转运果糖的能力。本发明还涉及本文中鉴定的由此获得的特定基因和基因产物，以及包含外源突变HXT3基因的酵母菌株。
在上下文中，术语“外源”指，在一种生物的基因组中天然不存在，但是通过重组事件、突变事件或其它事件(例如，通过天然选择或通过育种)由酵母获得的基因。
在考虑到本发明公开的主题的情况下，本领域技术人员知道，可以找到作用相当但是在突变的确切数量和位置上有所不同的等同物。然后可按照实施例所述对这些突变体利用果糖的能力加以试验，可以容易地选出具有优点的重组体。
或者，可用本领域已知的若干种突变方法向任何给定的酵母菌株的HXT3基因中引入突变，以使得该菌株更为亲果糖。合适的酵母菌株的例子是Saccharomyces cerevisae、S.uvarum、S.bayanus、S.pastorianus、S.paradoxus。酵母的其它属也可被根据本发明的HXT3基因所转化，以增加其碳水化合物发酵能力，例如，Candida。
此外，技术人员可以发现，与上述位置邻近的突变可能产生有用的重组。因此，上文提到的任何突变体HXT3基因都包括在本发明中。
令人惊奇地，HXT3基因在果糖发酵中有着重要的作用。
根据本发明的突变允许对大量的HXT3载体加以改造，以提高在任何给定的酵母菌株中利用果糖的能力。
本发明还涉及获得具有亲果糖性质的酵母细胞的方法，其中，包含编码HXT3转运蛋白的基因的酵母细胞被改造，使得HXT3转运蛋白具有提高的转运果糖的能力，所述方法包括如下步骤a)突变HXT3基因b)选择出具有提高的亲果糖性质的酵母细胞。
对编码HXT3转运蛋白的基因进行改造可以通过本领域技术人员已知的突变或重组技术来进行。它们的组合也是可行的，例如，首先转化基因，然后进行诱变或在转化的部分进行点突变。本领域技术人员知道如何进行此类突变。诱变被描述于例如WO04/070022中，其可以类似的方式进行于Saccharomyces。编码HXT3转运蛋白的基因可以是天然的或重组的。
在任何给定的酵母菌株或在Fermichamp自身中，突变的HXT3基因还可以是过量表达的。较之“标准”基因的过量表达，该基因的过量表达能诱发更高的发酵速率。这表明，突变的蛋白质在过量表达时更有效率。这使得可以通过转移突变的HXT3基因来提高其它酵母对果糖的利用，如在实施例中所述。这可以引起经济方面的很高的兴趣，因为对果糖的利用是发酵终点处发酵速率的限制性因素。
此外，还发现，HXT3转运蛋白过量表达时，发酵-糖酵解通量被提高。由两种基因的过量表达诱发的发酵能力的区别因此不仅仅局限于对果糖的转运能力，其对于其它碳水化合物的发酵来说也是重要的。这可以在很多希望有高发酵速率的领域找到应用，例如乙醇生产和烘焙。
本发明还涉及根据本发明的酵母用于发酵碳水化合物的用途，更优选地，用于发酵果糖和葡萄糖。本发明还涉及由根据本发明的菌株产生的发酵产物，例如，乙醇、葡萄酒、啤酒、清酒、伏特加、金酒(ginever)、龙舌兰酒。
实施例实施例1 菌株和培养条件用于本研究的S.cerevisiae菌株列于表1中。
表1.Saccharomyces cerevisiae菌株
菌株V5从Champagne葡萄酒菌株8130获得。通过使8130菌株形成孢子随后分离出抗5-氟乳清酸的ura3突变体来获得该菌株。
V5 HXT1-7Δ该菌株缺失了HXT3-6-7(缺失范围位于染色体IV上的1 164 600至1 154 055)(位置根据Saccharomyces cerevisiae基因组数据库，Stanford)和HXT5-1-4(缺失范围位于染色体VIII上的296 399至287 180)基因簇。该菌株还缺失HXT2(缺失位于染色体XIII上的288125至289 658位)，导致HXT1至7基因的完全缺失。该菌株不能在葡萄糖或果糖上生长。
于28℃在含有2％葡萄糖或2％麦芽糖的YPD培养基(除了用p4H7质粒转化过的酵母菌株)上对酵母菌株进行培养(V5 HXT1-7Δ)。为评估不同整合突变体菌株的生长表型，将它们培养于人造培养基上(0.67％无氨基酸的Yeast Nitrogen Base、25mg/l尿嘧啶(uracile)、5％葡萄糖)。用含有HXT3转运蛋白基因的p4H7质粒转化过的酵母菌株被培养于人造培养基上(如上所述，但不含尿嘧啶)。在人造葡萄汁(MS300)(其中含有100g/l葡萄糖、100g/l果糖和额外的115mg/l甲硫氨酸和25mg/l尿嘧啶(不用于经过转化的酵母菌株))上进行类似分批酿制葡萄酒的发酵实验。该培养基含有大约430mg/l可吸收的氮。将预培养的细胞以106细胞/ml的密度接种到工作体积为1.11、装备有发酵锁的发酵罐中。发酵在28℃持续搅拌(500rpm)下进行。上述条件使得发酵动力学类似于以工业规模生产葡萄酒的条件。
实施例2 将HXT3整合进V5 HXT1-7Δ菌株通过基因组整合，从V5或Fermichamp获得的HXT3基因被重新引入到V5 HXT1-7缺失菌株中，引入位点位于它们各自的基因簇的原始位置。使用引物HXT3P1和I2HXT3，通过PCR扩增出HXT3基因。在酵母中进行转化时，这些PCR扩增产物被用于基因组整合，这允许HXT3基因的单个拷贝整合到其自身的启动子之后。针对HXT3，使用C1HXT3ORF和C2HXT3p.引物通过PCR来验证整合的正确性。
所有引物列于表2中。
表2.用于在V5 HXT1-7中整合HXT3的引物
下划线与HXT7终止子同源；大写字母与HXT3同源；双下划线与p4H7启动子同源；斜体与p4H7终止子同源；加粗与HXT7启动子同源。
实施例3 构建含有HXT3 ORF的p4H7多拷贝质粒使用引物HXT3p426和HXT3t426，从V5或Fermichamp菌株的基因组DNA通过PCR扩增出HXT3基因。通过在Sacharomyces cerevisiae中进行体内重组，在Hamacher et al.，2002.Microbiology，vol 148，2783-2788中所述的质粒p4H7中克隆HXT3基因。p4H7质粒具有截短的HXT7启动子和CYC1终止子。首先用BamH1和EcoR1对p4H7质粒进行线性化。引物HXT3p426的5’末端与用BamH1和EcoR1线性化的p4H7质粒的BamH1末端(HXT7启动子)同源。引物HXT3t426的5’末端与与用BamH1和EcoR1线性化的p4H7质粒的EcoR1末端(终止子侧)同源。按照图2所述，将关于HXT3的PCR扩增产物和用BamH1和EcoR1线性化的p4H7质粒用于酵母。针对在最小限度培养基(含有葡萄糖作为唯一碳源)上的生长能力对转化子加以选择。得到的重组质粒具有HXT3 ORF，其位于截短的、不受调节的HXT7启动子之后，导致HXT3过量表达。所有引物都列于表2中。
实施例4 分析方法监测发酵通过每20分钟对发酵罐重量损失进行自动测量来测定CO2释放。通过对释放的CO2进行多项式光滑来自动计算CO2产生速率。这种发酵监测方法提供了高重现性。对释放出的总CO2的测量被用于检查糖发酵是否完成。实验进行至少重复两次，显示出有代表性的结果。
监测葡萄糖和果糖消耗发酵期间，每天取培养基至少两次，将其离心以去除细胞，将上清液储存于-20℃，之后通过HPLC进行葡萄糖和果糖测量。使用装有Aminex87H柱(Bio-Rad Laboratories)的Hewlet-Packard HP系列1100系统，通过HPLC来分析糖。将发酵上清液按照1/6稀释于流动相(0.004MH2SO4)中，通过折射仪来检测糖。
实施例5 对Fermichamp菌株的HXT3基因进行序列分析使用引物HXT3P2和HXT3P1(引物如表2所示)，通过PCR来扩增HXT3基因。纯化之后，对PCR产物进行测序，结果显示于表3A和3B中。HXT3基因的启动子区域(-900至1位核苷酸)仅显示6处突变，而编码区域(1至1700位核苷酸)则含有38处突变。与亲葡萄糖的野生型菌株S288C相比，这些突变中的十处导致了蛋白质序列中的氨基酸变化。这些变化中的大多数都在包括一个跨膜结构域和一个外部环的蛋白质区域内成簇(
图1)。大多数变化是保守取代。来自菌株V5的HXT3基因与S288C看起来相同(Saccharomyces cerevisiae基因组数据库，Stanford)。
表3A.与S288C(和V5)比较，来自Fermichamp的HXT3基因(启动子)中的亲果糖性突变。
表3B.与S288C(和V5)比较，来自Fermichamp的HXT3基因(开放读码框)中的亲果糖性突变。
实施例6 整合进V5HT1-7Δ菌株中的HXT3的表达通过材料和方法中所述的整合，将来自V5或Fermichamp的HXT3基因引入V5HT1-7Δ菌株。表2中给出了在HTX3基因作进行整合的位置细节。用含有HXT3基因的PCR产物转化酵母之后，在仅含葡萄糖作为碳源的培养基上直接对转化子进行选择。
含有整合进来的来自V5或Fermichamp的HXT3基因的V5 HXT1-7D被获得，其被分别命名为V5 HXT1-7ΔHXT3(V5)和V5 HXT1-7ΔHXT3(Fermichamp)。
针对发酵性质、发酵速率和葡萄糖/果糖利用来检验得到的菌株。V5HXT1-7ΔHXT3(V5)和V5 HXT1-7ΔHXT3(Fermichamp)展示出不同的糖类利用情况(图3a、3b)。对果糖和葡萄糖利用的相对速率不同，表达来自Fermichamp的HXT3基因的菌株展示出较高的使用果糖的能力。表达来自Fermichamp的HXT3基因的菌株将葡萄糖/果糖比保持在较高的水平上。
对发酵期间比率变化的比较显示，表达来自Fermichamp的HXT3基因的菌株展示出与Fermichamp菌株相似的情况，而表达来自V5的HXT3基因的菌株则展示出“标准的”葡萄糖/果糖曲线，类似于Fermivin(图3d、3e)。因此，通过表达Fermichamp HXT3基因，V5 HXT1-7Δ中的Fermichamp果糖利用能力被诱发。
发酵速率情况也受表达的HXT3载体的显著影响。虽然在发酵的第一部分没有观察到差别，但是当表达来自Fermichamp的基因时，在发酵终点获得了更高的发酵速率(图3c)。与之一致地，携带该基因的重组子中，发酵时间减少。发酵终点处更好的发酵速率和在终点处更好地使用果糖(其是存在的主要的糖)的能力一致，也与该后期中的较小葡萄糖/果糖不平衡的现象一致。
实施例7 HXT3基因过量表达的作用在V5 HXT1-7Δ过量表达来自Fermichamp和来自V5的HXT3基因。来自Fermichamp或V5的HXT3基因被引入到多拷贝质粒中，这允许相应基因的被正调节和高表达(见材料和方法)。
如图4所示，较之整合的、单拷贝的菌株，HXT3基因的过量表达不会显著改变菌株的果糖/葡萄糖利用。但是，能观察到果糖利用改进的较小程度的增加。
在含有葡萄糖和果糖(50/50)的MS300培养基上，来自V5和Fermichamp的HXT3基因的过量表达诱发了非常不同的对于发酵速率的作用。较之整合进去的单拷贝，来自V5的HXT3基因的过量表达对于发酵速率仅有一点影响(图5)。来自Fermichamp的HXT3基因的过量表达则诱发了发酵速率的强烈提高以及发酵时间的明显减少。通过过量表达来自Fermichamp的HXT3基因获得的发酵速率比用来自V5的基因所获得的要高很多。
为研究过量表达对发酵速率的影响是否是由于对果糖的更好利用，我们在仅含有葡萄糖或果糖的MS培养基中对过量表达HXT3的菌株的发酵能力进行了实验。如图6a、6b所示，来自Fermichamp的HXT3的过量表达，较之来自V5的基因的过量表达，诱发了高得多的发酵速率，而与被发酵的糖无关。较之表达V5基因的菌株而言，发酵能力的强烈提高在使用葡萄糖和使用果糖的情况下都能观察到。由两种基因的过量表达诱发的发酵能力的区别因此独立于它们转运果糖的能力。
用纯的糖进行发酵时，HXT3基因(在整合的菌株中)的单拷贝表达不会导致相同的情况(图7a、7b)。当仅有果糖存在于培养基中时，来自Fermichamp的HXT3基因使得发酵终点有了显著的改进。而使用葡萄糖进行糖发酵时，两个基因间仅能观察到发酵情况的轻微变化。这表明，当HXT3基因表达较低时，发酵速率的区别主要是提高的转运果糖的能力导致的。
实施例8 评价多种突变对果糖发酵表型的作用构建嵌合的HXT3蛋白通过构建表达嵌合蛋白(含有来自Fermichamp的HXT3序列的部分以及来自标准(V5)HXT3序列的其它部分)的菌株，来展示FermichampHXT3蛋白中若干组突变的作用。
构建含有单个、无活性的HXT3基因的菌株为制造此类嵌合体，构建出若干种具有被破坏的HXT3拷贝的酵母菌株。这些菌株是通过将KanMX盒插入到含有来自Fermichamp或来自V5的单个HXT3基因的菌株之一的HXT3序列中来制得的。此类菌株构建的原理展示于图8中。
通过用含有KanMX基因(侧翼是HXT3 Fermichamp序列)的PCRDNA产物来转化菌株V5 HXT1-7ΔHXT3(Fermichamp)，制得菌株V5HXT1-7ΔHXT3(Fermichamp)ΔKanMX571-650。该DNA片段是通过PCR扩增获得的，其中使用携带有KanMX基因(Güldener et al.，1996.NucleicAcids Res.24，2519-2524)的PUG6质粒作为DNA基质(DNA matrix)，部分地由标准(V5)HXT3序列编码，另外的部分由HXT3 Fermichamp序列编码。这些嵌合HXT3蛋白的表达使得被转化的酵母能恢复在葡萄糖上的生长，并针对在YPD(YP-葡萄糖2％)的生长来进行选择。
表达嵌合HXT3蛋白的菌株图11中展示了表达的嵌合蛋白。
通过用引物IA397-416和IA818-798(表5)，从V5菌株DNA中扩增HXT3片段，等同397至818位，并且用PCR产物来转化菌株V5HXT1-7ΔHXT3(Fermichamp)ΔKanMX571-650，获得表达嵌合HXT3V5TM3-6的菌株。在YPD培养基上选择转化子。得到的菌株表达HXT3蛋白，其序列由Fermichamp HXT3基因编码，只除了核苷酸397至818位(氨基酸132-272位)是由V5 HXT3序列编码的。这相应于用标准的氨基酸T200和I209去替换Fermichamp HXT3中两个突变的氨基酸A200和V209。
通过用引物IIIC973-992和IIIC1232-1213(表5)，从FermichampDNA进行对HXT3片段的PCR扩增，等同973至1232位，并且转化菌株V5 HXT1-7ΔHXT3(V5)ΔKanMX1107-1157，获得表达嵌合HXT3FmpTM7-9的菌株。在YPD培养基上选择转化子。得到的菌株表达HXT3蛋白，其序列由V5 HXT3基因编码，只除了核苷酸932至1232位(氨基酸325-410位)是由Fermichamp HXT3序列编码的。这相应于在标准的HXT3序列中引入Fermichamp M388、W389、V392这三处突变的氨基酸。
通过用引物IIID973-992和IIID1 1280-1261(表5)，从FermichampDNA进行对HXT3片段的PCR扩增，等同973至1280位，并且转化菌株V5 HXT1-7ΔHXT3(V5)ΔKanMX1107-1157，获得表达嵌合HXT3FmpTM7-9L9的菌株。在YPD培养基上选择转化子。得到的菌株表达HXT3蛋白，其序列由V5HXT3基因编码，只除了核苷酸932至1280位(氨基酸325-427位)是由Fermichamp HXT3序列编码的。这相应于在标准的HXT3序列中引入Fermichamp M388、W389、V392、Q414、N415这五处突变的氨基酸。
表5用于扩增HXT3 DNA的引物
通过定点诱变来改变氨基酸在pUC19质粒中克隆夹自Fermichamd的HXT3基因用引物BamHXT3ATG_F和HindHXT3STOP_R(表6)，从基因组Fermichamp DNA中通过PCR扩增HXT3编码DNA。这些引物允许对完整的ORF进行扩增，并在HXT3序列的5’末端加上了BamHI限制性位点，在3’末端加上了HindIII位点。用BamHI和HindIII限制性酶来消化pUC19 DNA和扩增出的HXT3 Fermichamp DNA，纯化并用于连接。连接混合物被用于转化E.coli，DH5a。
定点诱变将携带有HXT3基因的重组PUC19质粒DNA用于定点诱变。用Stratagene QuikChangeTM定点诱变试剂盒来进行定点诱变，其中使用含有想要的突变的两种互补寡核苷酸引物用于用PfuTruboTM DNA聚合酶进行的扩增。
寡核苷酸对FmpT200-F和FmpT200-R(表6)被用于定点诱变，以产生构建体HXT3FmpT200。这导致HXT3的标准氨基酸T200对Fermichamp HXT3序列的A200进行取代(图12)。
寡核苷酸对FmpI209-F和FmpI209-R(表6)被用于定点诱变，以产生构建体HXT3FmpI209。这导致HXT3的标准氨基酸I209对FermichampHXT3序列的V209进行取代(图12)。
使用引物IA 397-416和IA 818-798(表5)进行PCR扩增得到突变的HXT3基因，PCR产物被用于转化菌株V5 HXT1-7ΔHXT3(Fermichamp)ΔKanMX571-650。在YPD培养基上选择经过转化的菌株。获得两种菌株。一种表达构建体HXT3FmpT200，被命名为V5 HXT1-7ΔHXT3FmpT200。另一种表达构建体HXT3FmpI209，被命名为V5HXT1-7ΔHXT3FmpI209。
表6.用于在pUC19中克隆HXT3以及用于点突变的引物
大写字母与HXT3同源；斜体限制性位点；加粗用于氨基酸改变的引入突变。
对乙醇发酵期间葡萄糖-果糖利用情况的分析，其中使用表达嵌合或突变HXT3载体的菌株在于MS300培养基(含有100g/L葡萄糖和100g/L果糖)上进行乙醇发酵期间，对表达嵌合及突变HXT3蛋白的菌株的性质进行评估。对糖利用性质进行检测，其被表示为作为发酵进程函数的葡萄糖/果糖比率发展图。
表达嵌合HXT3V5TM3-6的菌株的葡萄糖-果糖利用情况显示于图13中。该菌株显示了与V5菌株相同的糖利用情况。这表明，从Fermichamp蛋白上除下的氨基酸中的一种或两种，A200或(和)V209对于Fermichamp HXT3提供的果糖利用性质来说是重要的。从Fermichamp除掉这两种突变的氨基酸会导致果糖利用性质的丢失。
表达嵌合HXT3FmpTM7-9的菌株的葡萄糖-果糖利用情况显示于图14中。该菌株显示了与V5菌株相同的糖利用情况。这表明，Fermichamp的3个突变的氨基酸M388、W389、V392的引入对于诱发Fermichamp HXT3提供的果糖利用性质来说是不足够的。
表达嵌合HXT3FmpTM7-9L9的菌株的葡萄糖-果糖利用情况显示于图15中。该菌株显示了与V5菌株相同的糖利用情况。这表明，5个氨基酸M388、W389、V392、Q414、N415单独使用对于诱发Fermichamp HXT3提供的果糖利用性质来说是不够的。
表达突变的Fermichamp载体HXT3FmpT200的菌株的葡萄糖-果糖利用情况显示于图16中。该菌株显示了与Fermichamp菌株相同的糖利用情况。这表明，氨基酸A200对于Fermichamp HXT3提供的果糖利用性质来说是不重要的。
表达突变的Fermichamp载体HXT3FmpI209的菌株的葡萄糖-果糖利用情况显示于图17中。该菌株显示了与V5菌株相同的糖利用情况。这表明，氨基酸Ile 209的存在对于Fermichamp HXT3提供的果糖利用性质来说是重要的。
序列表<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司法国农业科学研究院<120>具有提高的果糖发酵能力的酵母菌株<130>21568WO<150>EP 03078992.9<151>2003-12-19<160>30<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>23<212>DNA<213>引物<400>1gtgcgggatc cgaaggcaat atc 23<210>2<211>27<212>DNA<213>引物<400>2gatcggatcc atcatcacgt tcctagc 27<210>3<211>63<212>DNA<213>引物<400>3aagtgacggg cgatgagtaa gaaagaaata actgactcat tagaccatca tcacgttcct 60agc63<210>4<211>20<212>DNA<213>引物<400>4ttaagcatga tcgtctaggc 20<210>5<211>68<212>DNA
<213>引物<400>5aacacaaaaa caaaaagttt ttttaatttt aatcaaaaac tgagttaaac aatcatgaat 60tcaactcc 68<210>6<211>65<212>DNA<213>引物<400>6gaatgtaagc gtgacataac taattacatg actcgagacg gtttagcgtg aaattatttc 60ttgcc 65<210>7<211>20<212>DNA<213>引物<400>7gacacagtga catatgcacc 20<210>8<211>21<212>DNA<213>引物<400>8gccaatactt cacaatgttc g21<210>9<211>60<212>DNA<213>引物<400>9tgttggtggt attgccgttt tatctcctat gttgatttct ttcgtacgct gcaggtcgac 60<210>110<211>62<212>DNA<213>引物<400>10cacagagttg gagtagttct tagtaccgaa gttggtacag gcataggcca ctagtggatc 60tg 62
<210>11<211>60<212>DNA<213>引物<400>11tttcgaaact tctattgttt tcggtgtcgt caacttcttc ttcgtacgct gcaggtcgac 60<210>12<211>62<212>DNA<213>引物<400>12acataacagc agaccatacc aatggcacca tataacaaac gcataggcca ctagtggatc 60tg 62<210>13<211>20<212>DNA<213>引物<400>13ttgggtgata tgtacggtcg 20<210>14<211>20<212>DNA<213>引物<400>14agagatgctc ttgcttcgtc 20<210>15<211>20<212>DNA<213>引物<400>15ggtatcatga tccaatctct 20<210>16<211>20<212>DNA<213>引物<400>16ggccataatc tagtgactcc 20<210>17
<211>20<212>DNA<213>引物<400>17ggtatcatga tccaatctct 20<210>18<211>20<212>DNA<213>引物<400>18atcatacagt taccagcacc 20<210>19<211>31<212>DNA<213>引物<400>19cgaggggatc caatcatgaa ttcaactcca g 31<210>20<211>31<212>DNA<213>引物<400>20cgaggaagct tcgtgaaatt atttcttgcc g 31<210>21<211>37<212>DNA<213>引物<400>21cctaaggaaa tgagaggtac tttagtctcc tgttacc 37<210>22<211>37<212>DNA<213>引物<400>22ggtaacagga gactaaagta cctctcattt ccttagg 37<210>23<211>40<212>DNA<213>引物
<400>23cctgttacca actgatgatt accttgggta ttttcttggg40<210>24<211>40<212>DNA<213>引物<400>24cccaagaaaa tacccaaggt aatcatcagt tggtaacagg40<210>25<211>1704<212>DNA<213>Saccharomyces cerevisiae<400>25atgaattcaa ctccagattt aatatctcca caaaagtcaa gtgagaattc gaatgctgac 60ctgccttcga atagctctca ggtaatgaac atgcctgaag aaaaaggtgt tcaagatgat120ttccaagctg aggccgacca agtacttacc aacccaaata caggtaaagg tgcatatgtc180actgtgtcta tctgttgtgt tatggttgcc ttcggtggtt tcgttttcgg ttgggatact240ggtaccattt ctggtttcgt cgcccaaact gatttcttga gaagattcgg tatgaagcat300aaagatggta gttattattt gtctaaggtt agaactggtt taattgtctc cattttcaac360attggttgtg ccattggtgg tattattttg gctaaattgg gtgatatgta cggtcgtaaa420atgggtttga ttgtcgttgt tgttatctac atcatcggta ttattattca aattgcatcc480atcaacaaat ggtaccaata tttcatcggt agaattattt ccggtttggg tgttggtggt540attgccgttt tatctcctat gttgatttct gaagtcgctc ctaaggaaat gagaggtact600ttagtctcct gttaccaact gatgattacc ttgggtattt tcttgggtta ctgtaccaac660ttcggtacta agaactactc caactctgtg caatggagag ttccattagg tttgtgtttt720gcctgggctt tgtttatgat cggtggtatg actttcgttc cagaatcccc acgttatttg780gttgaagctg gtcaaattga cgaagcaaga gcatctcttt ccaaagttaa caaggttgcc840ccagaccatc cattcattca acaagagttg gaagttattg aagctagtgt tgaagaagct900agagctgctg gttcagcatc atggggtgag ttgttcactg gtaagccggc catgtttaag960cgtactatga tgggtatcat gatccaatct ctacaacaat tgactggtga taactatttc 1020ttctactatg gtactaccgt ttttaacgct gttggtatga gtgattcttt cgaaacttct 1080attgttttcg gtgtcgtcaa cttcttctct acttgttgtt ctttgtacac tgtcgatcgt 1140
tttggacgtc gtaactgttt gttatatggt gccattggta tggtctgctg ttatgtagtt 1200tacgcttctg ttggtgtcac cagactatgg ccaaatggtg aaggtaatgg ttcatccaag 1260ggtgctggta actgtatgat tgtctttgcc tgtttctata ttttctgttt tgctaccact 1320tgggctccaa ttgcttatgt tgttatttct gaaactttcc cattgagagt caagtctaag 1380gctatgtcta ttgctacagc tgctaattgg ttgtggggtt tcttgattgg tttcttcact 1440ccatttatta ctggtgctat taacttctac tacggttacg ttttcatggg ctgtatggtt 1500ttcgcctact tctacgtttt cttctttgtg ccagaaacta agggtttgac tttggaagaa 1560gtcaatgata tgtacgctga aggtgttcta ccatggaagt ctgcttcatg ggttccaaca 1620tctcaaagag gtgctaacta cgatgctgat gcattgatgc atgatgacca gccattctac 1680aagaaaatgt tcggcaagaa ataa 1704<210>26<211>567<212>PRT<213>Saccharomyces cerevisiae<400>26Met Asn Ser Thr Pro Asp Leu Ile Ser Pro Gln Lys Ser Ser Glu Asn1 5 10 15Ser Asn Ala Asp Leu Pro Ser Asn Ser Ser Gln Val Met Asn Met Pro20 25 30Glu Glu Lys Gly Val Gln Asp Asp Phe Gln Ala Glu Ala Asp Gln Val35 40 45Leu Thr Asn Pro Asn Thr Gly Lys Gly Ala Tyr Val Thr Val Ser Ile50 55 60Cys Cys Val Met Val Ala Phe Gly Gly Phe Val Phe Gly Trp Asp Thr65 70 75 80Gly Thr Ile Ser Gly Phe Val Ala Gln Thr Asp Phe Leu Arg Arg Phe85 90 95Gly Met Lys His Lys Asp Gly Ser Tyr Tyr Leu Ser Lys Val Arg Thr100 105 110
Gly Leu Ile Val Ser Ile Phe Asn Ile Gly Cys Ala Ile Gly Gly Ile115 120 125Ile Leu Ala Lys Leu Gly Asp Met Tyr Gly Arg Lys Met Gly Leu Ile130 135 140Val Val Val Val Ile Tyr Ile Ile Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser145 150 155 160Ile Asn Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe Ile Gly Arg Ile Ile Ser Gly Leu165 170 175Gly Val Gly Gly Ile Ala Val Leu Ser Pro Met Leu Ile Ser Glu Val180 185 190Ala Pro Lys Glu Met Arg Gly Thr Leu Val Ser Cys Tyr Gln Leu Met195 200 205Ile Thr Leu Gly Ile Phe Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Phe Gly Thr Lys210 215 220Asn Tyr Ser Asn Ser Val Gln Trp Arg Val Pro Leu Gly Leu Cya Phe225 230 235 240Ala Trp Ala Leu Phe Met Ile Gly Gly Met Thr Phe Val Pro Glu Ser245 250 255Pro Arg Tyr Leu Val Glu Ala Gly Gln Ile Asp Glu Ala Arg Ala Ser260 265 270Leu Ser Lys Val Asn Lys Val Ala Pro Asp His Pro Phe Ile Gln Gln275 280 285Glu Leu Glu Val Ile Glu Ala Ser Val Glu Glu Ala Arg Ala Ala Gly290 295 300Ser Ala Ser Trp Gly Glu Leu Phe Thr Gly Lys Pro Ala Met Phe Lys305 310 315 320Arg Thr Met Met Gly Ile Met Ile Gln Ser Leu Gln Gln Leu Thr Gly325 330 335Asp Asn Tyr Phe Phe Tyr Tyr Gly Thr Thr Val Phe Asn Ala Val Gly
340 345 350Met Ser Asp Ser Phe Glu Thr Ser Ile Val Phe Gly Val Val Asn Phe355 360 365Phe Ser Thr Cys Cys Ser Leu Tyr Thr Val Asp Arg Phe Gly Arg Arg370 375 380Asn Cys Leu Leu Tyr Gly Ala Ile Gly Met Val Cys Cys Tyr Val Val385 390 395 400Tyr Ala Ser Val Gly Val Thr Arg Leu Trp Pro Asn Gly Glu Gly Asn405 410 415Gly Ser Ser Lys Gly Ala Gly Asn Cys Met Ile Val Phe Ala Cys Phe420 425 430Tyr Ile Phe Cys Phe Ala Thr Thr Trp Ala Pro Ile Ala Tyr Val Val435 440 445Ile Ser Glu Thr Phe Pro Leu Arg Val Lys Ser Lys Ala Met Ser Ile450 455 460Ala Thr Ala Ala Asn Trp Leu Trp Gly Phe Leu Ile Gly Phe Phe Thr465 470 475 480Pro Phs Ile Thr Gly Ala Ile Asn Phe Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Met485 490 495Gly Cys Met Val Phe Ala Tyr Phe Tyr Val Phe Phe Phe Val Pro Glu500 505 510Thr Lys Gly Leu Thr Leu Glu Glu Val Asn Asp Met Tyr Ala Glu Gly515 520 525Val Leu Pro Trp Lys Ser Ala Ser Trp Val Pro Thr Ser Gln Arg Gly530 535 540Ala Asn Tyr Asp Ala Asp Ala Leu Met His Asp Asp Gln Pro Phe Tyr545 550 555 560Lys Lys Met Phe Gly Lys Lys565
<210>27<211>567<212>PRT<213>突变的HXT3蛋白<400>27Met Asn Ser Thr Pro Asp Leu Ile Ser Pro Gln Lys Ser Ser Glu Asn1 5 10 15Ser Asn Ala Asp Leu Pro Ser Asn Ser Ser Gln Val Met Asn Met Pro20 25 30Glu Glu Lys Gly Val Gln Asp Asp Phe Gln Ala Glu Ala Asp Gln Val35 40 45Leu Thr Asn Pro Asn Thr Gly Lys Gly Ala Tyr Val Thr Val Ser Ile50 55 60Cys Cys Val Met Val Ala Phe Gly Gly Phe Val Phe Gly Trp Asp Thr65 70 75 80Gly Thr Ile Ser Gly Phe Val Ala Gln Thr Asp Phs Leu Arg Arg Phe85 90 95Gly Met Lys His Lys Asp Gly Ser Tyr Tyr Leu Ser Lys Val Arg Thr100 105 110Gly Leu Ile Val Ser Ile Phe Asn Ile Gly Cys Ala Ile Gly Gly Ile115 120 125Ile Leu Ala Lys Leu Gly Asp Met Tyr Gly Arg Lys Met Gly Leu Ile130 135 140Val Val Val Val Ile Tyr Ile Ile Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser145 150 155 160Ile Asn Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe Ile Gly Arg Ile Ile Ser Gly Leu165 170 175Gly Val Gly Gly Ile Ala Val Leu Ser Pro Met Leu Ile Ser Glu Val180 185 190
Ala Pro Lys Glu Met Arg Gly Thr Leu Val Ser Cys Tyr Gln Leu Met195 200 205Val Thr Leu Gly Ile Phe Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Phe Gly Thr Lys210 215 220Asn Tyr Ser Asn Ser Val Gln Trp Arg Val Pro Leu Gly Leu Cys Phe225 230 235 240Ala Trp Ala Leu Phe Met Ile Gly Gly Met Thr Phe Val Pro Glu Ser245 250 255Pro Arg Tyr Leu Val Glu Ala Gly Gln Ile Asp Glu Ala Arg Ala Ser260 265 270Leu Ser Lys Val Asn Lys Val Ala Pro Asp His Pro Phs Ile Gln Gln275 280 285Glu Leu Glu Val Ile Glu Ala Ser Val Glu Glu Ala Arg Ala Ala Gly290 295 300Ser Ala Ser Trp Gly Glu Leu Phe Thr Gly Lys Pro Ala Met Phe Lys305 310 315 320Arg Thr Met Met Gly Ile Met Ile Gln Ser Leu Gln Gln Leu Thr Gly325 330 335Asp Asn Tyr Phe Phe Tyr Tyr Gly Thr Thr Val Phe Asn Ala Val Gly340 345 350Met Ser Asp Ser Phe Glu Thr Ser Ile Val Phe Gly Val Val Asn Phe355 360 365Phe Ser Thr Cys Cys Ser Leu Tyr Thr Val Asp Arg Phe Gly Arg Arg370 375 380Asn Cys Leu Leu Tyr Gly Ala Ile Gly Met Val Cys Cys Tyr Val Val385 390 395 400Tyr Ala Ser Val Gly Val Thr Arg Leu Trp Pro Asn Gly Glu Gly Asn405 410 415Gly Ser Ser Lys Gly Ala Gly Asn Cys Met Ile Val Phe Ala Cys Phe
420 425 430Tyr Ile Phe Cys Phe Ala Thr Thr Trp Ala Pro Ile Ala Tyr Val Val435 440 445Ile Ser Glu Thr Phe Pro Leu Arg Val Lys Ser Lys Ala Met Ser Ile450 455 460Ala Thr Ala Ala Asn Trp Leu Trp Gly Phe Leu Ile Gly Phe Phe Thr465 470 475 480Pro Phe Ile Thr Gly Ala Ile Asn Phe Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Met485 490 495Gly Cys Met Val Phe Ala Tyr Phe Tyr Val Phe Phe Phe Val Pro Glu500 505 510Thr Lys Gly Leu Thr Leu Glu Glu Val Asn Asp Met Tyr Ala Glu Gly515 520 525Val Leu Pro Trp Lys Ser Ala Ser Trp Val Pro Thr Ser Gln Arg Gly530 535 540Ala Asn Tyr Asp Ala Asp Ala Leu Met His Asp Asp Gln Pro Phe Tyr545 550 555 560Lys Lys Met Phe Gly Lys Lys565<210>28<211>1704<212>DNA<213>突变的HXT3基因<400>28atgaattcaa ctccagattt aatatctcca caaaagtcaa gtgagaattc gaatgctgac 60ctgccttcga atagctctca ggtaatgaac atgcctgaag aaaaaggtgt tcaagatgat120ttccaagctg aggccgacca agtacttacc aacccaaata caggtaaagg tgcatatgtc180actgtgtcta tctgttgtgt tatggttgcc ttcggtggtt tcgttttcgg ttgggatact240ggtaccattt ctggtttcgt cgcccaaact gatttcttga gaagattcgg tatgaagcat300aaagatggta gttattattt gtctaaggtt agaactggtt taattgtctc cattttcaac360
attggttgtg ccattggtgg tattattttg gctaaattgg gtgatatgta cggtcgtaaa420atgggtttga ttgtcgttgt tgttatctac atcatcggta ttattattca aattgcatcc480atcaacaaat ggtaccaata tttcatcggt agaattattt ccggtttggg tgttggtggt540attgccgttt tatctcctat gttgatttct gaagtcgctc ctaaggaaat gagaggtact600ttagtctcct gttaccaact gatggttacc ttgggtattt tcttgggtta ctgtaccaac660ttcggtacta agaactactc caactctgtg caatggagag ttccattagg tttgtgtttt720gcctgggctt tgtttatgat cggtggtatg actttcgttc cagaatcccc acgttatttg780gttgaagctg gtcaaattga cgaagcaaga gcatctcttt ccaaagttaa caaggttgcc840ccagaccatc cattcattca acaagagttg gaagttattg aagctagtgt tgaagaagct900agagctgctg gttcagcatc atggggtgag ttgttcactg gtaagccggc catgtttaag960cgtactatga tgggtatcat gatccaatct ctacaacaat tgactggtga taactatttc 1020ttctactatg gtactaccgt ttttaacgct gttggtatga gtgattcttt cgaaacttct 1080attgttttcg gtgtcgtcaa cttcttctct acttgttgtt ctttgtacac tgtcgatcgt 1140tttggacgtc gtaactgttt gttatatggt gccattggta tggtctgctg ttatgtagtt 1200tacgcttctg ttggtgtcac cagactatgg ccaaatggtg aaggtaatgg ttcatccaag 1260ggtgctggta actgtatgat tgtctttgcc tgtttctata ttttctgttt tgctaccact 1320tgggctccaa ttgcttatgt tgttatttct gaaactttcc cattgagagt caagtctaag 1380gctatgtcta ttgctacagc tgctaattgg ttgtggggtt tcttgattgg tttcttcact 1440ccatttatta ctggtgctat taacttctac tacggttacg ttttcatggg ctgtatggtt 1500ttcgcctact tctacgtttt cttctttgtg ccagaaacta agggtttgac tttggaagaa 1560gtcaatgata tgtacgctga aggtgttcta ccatggaagt ctgcttcatg ggttccaaca 1620tctcaaagag gtgctaacta cgatgctgat gcattgatgc atgatgacca gccattctac 1680aagaaaatgt tcggcaagaa ataa 1704<210>29<211>1704<212>DNA<213>突变的HXT3基因II<400>29atgaattcaa ctccagattt aatatctcca caaaagtcaa gtgagaattc gaatgctgac 60ctgccttcga atagctctca ggtaatgaac atgcctgaag aaaaaggtgt tcaagatgat120
ttccaagctg aggccgacca agtacttacc aacccaaata caggtaaagg tgcatatgtc180actgtgtcta tctgttgtgt tatggttgcc ttcggtggtt tcgttttcgg ttgggatact240ggtaccattt ctggtttcgt cgcccaaact gatttcttga gaagattcgg tatgaagcat300aaagatggta gttattattt gtctaaggtt agaactggtt taattgtctc cattttcaac360attggttgtg ccattggtgg tattattttg gctaaattgg gtgatatgta cggtcgtaaa420atgggtttga ttgtcgttgt tgttatctac atcatcggta ttattattca aattgcatcc480atcaacaaat ggtaccaata cttcatcggt agaattattt ccggtttggg tgttggtggt540attgccgttt tatctcctat gttgatttct gaagtcgctc ctaaggaaat gagaggtgct600ttagtctoct gttaccaact gatggttaca ttgggtattt tcttgggtta ctgtaccaao660ttcggtacta agaactactc caactctgtg caatggagag ttccattagg tttgtgtttt720gcctgggctt tgtttatgat cggtggtatg actttcgttc cagaatcccc acgttatttg780gttgaagctg gtcaaattga cgaagcaaga gcatctcttt ccaaagttaa caaggttgcc840ccagaccatc cattcattca acaagagttg gaagttattg aagctagtgt tgaagaagct900agagctgctg gttcagcatc atggggtgag ttgttcactg gtaagccggc catgtttaag960cgtactatga taggtatcat gatccaatct ctacaacaat tgactggtga taactatttc 1020ttctactatg gtactaccgt ttttaacgct gttggtatga gtgattcttt cgaaacttct 1080attgttttcg gtgtcgtcaa cttcttctcc acttgttgtt ctctgtacac cgttgaccgt 1140tttggccgtc gtaactgttt gatgtggggt gctgtcggta tggtctgctg ttatgttgtc 1200tatgcttctg ttggagtcac tagattatgg ccaaatggtc aaaacaacgg ctcatccaag 1260ggtgctggta actgtatgat tgtctttgcc tgtttctata ttttctgttt cgctactacc 1320tgggccccaa ttgcttatgt cgttgtttct gaaactttcc cattgagagt caagtctaag 1380gctatgtcta ttgctacagc tgctaactgg atctggggtt tcttgattgg tttcttcact 1440ccatttatta ctggtgctat taacttctac tacggttacg ttttcatggg ctgtatggtt 1500ttcgcctact tctacgtttt cttctttgtg ccagaaacta agggtttgac tttggaagaa 1560gtcaatgata tgtacgctga aggtgttcta ccatggaagt ctgcttcatg ggttccaaca 1620tctcaaagag gtgctaacta cgatgctgat gcattgatgc atgatgacca gccattctac 1680aagaaaatgt tcggcaagaa ataa 1704<210>30<211>567
<212>PRT<213>突变的HXT3蛋白II<400>30Met Asn Ser Thr Pro Asp Leu Ile Ser Pro Gln Lys Ser Ser Glu Asn1 5 10 15Ser Asn Ala Asp Leu Pro Ser Asn Ser Ser Gln Val Met Asn Met Pro20 25 30Glu Glu Lys Gly Val Gln Asp Asp Phe Gln Ala Glu Ala Asp Gln Val35 40 45Leu Thr Asn Pro Asn Thr Gly Lys Gly Ala Tyr Val Thr Val Ser Ile50 55 60Cys Cys Val Met Val Ala Phe Gly Gly Phe Val Phe Gly Trp Asp Thr65 70 75 80Gly Thr Ile Ser Gly Phe Val Ala Gln Thr Asp Phe Leu Arg Arg Phe85 90 95Gly Met Lys His Lys Asp Gly Ser Tyr Tyr Leu Ser Lys Val Arg Thr100 105 110Gly Leu Ile Val Ser Ile Phe Asn Ile Gly Cys Ala Ile Gly Gly Ile115 120 125Ile Leu Ala Lys Leu Gly Asp Met Tyr Gly Arg Lys Met Gly Leu Ile130 135 140Val Val Val Val Ile Tyr Ile Ile Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser145 150 155 160Ile Asn Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe Ile Gly Arg Ile Ile Ser Gly Leu165 170 175Gly Val Gly Gly Ile Ala Val Leu Ser Pro Met Leu Ile Ser Glu Val180 185 190Ala Pro Lys Glu Met Arg Gly Ala Leu Val Ser Cys Tyr Gln Leu Met195 200 205
Val Thr Leu Gly Ile Phe Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Phe Gly Thr Lys210 215 220Asn Tyr Ser Asn Ser Val Gln Trp Arg Val Pro Leu Gly Leu Cys Phe225 230 235 240Ala Trp Ala Leu Phe Met Ile Gly Gly Met Thr Phe Val Pro Glu Ser245 250 255Pro Arg Tyr Leu Val Glu Ala Gly Gln Ile Asp Glu Ala Arg Ala Ser260 265 270Leu Ser Lys Val Asn Lys Val Ala Pro Asp His Pro Phe Ile Gln Gln275 280 285Glu Leu Glu Val Ile Glu Ala Ser Val Glu Glu Ala Arg Ala Ala Gly290 295 300Ser Ala Ser Trp Gly Glu Leu Phe Thr Gly Lys Pro Ala Met Phe Lys305 310 315 320Arg Thr Met Ile Gly Ile Met Ile Gln Ser Leu Gln Gln Leu Thr Gly325 330 335Asp Asn Tyr Phe Phe Tyr Tyr Gly Thr Thr Val Phe Asn Ala Val Gly340 345 350Met Ser Asp Ser Phe Glu Thr Ser Ile Val Phe Gly Val Val Asn Phe355 360 365Phe Ser Thr Cys Cys Ser Leu Tyr Thr Val Asp Arg Phe Gly Arg Arg370 375 380Asn Cys Leu Met Trp Gly Ala Val Gly Met Val Cys Cys Tyr Val Val385 390 395 400Tyr Ala Ser Val Gly Val Thr Arg Leu Trp Pro Asn Gly Gln Asn Asn405 410 415Gly Ser Ser Lys Gly Ala Gly Asn Cys Met Ile Val Phe Ala Cys Phe420 425 430Tyr Ile Phe Cys Phe Ala Thr Thr Trp Ala Pro Ile Ala Tyr Val Val
435 440 445Val Ser Glu Thr Phe Pro Leu Arg Val Lys Ser Lys Ala Met Ser Ile450 455 460Ala Thr Ala Ala Asn Trp Ile Trp Gly Phe Leu Ile Gly Phe Phe Thr465 470 475 480Pro Phe Ile Thr Gly Ala Ile Asn Phe Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Met485 490 495Gly Cys Met Val Phe Ala Tyr Phe Tyr Val Phe Phe Phe Val Pro Glu500 505 510Thr Lys Gly Leu Thr Leu Glu Glu Val Asn Asp Met Tyr Ala Glu Gly515 520 525Val Leu Pro Trp Lys Ser Ala Ser Trp Val Pro Thr Ser Gln Arg Gly530 535 540Ala Asn Tyr Asp Ala Asp Ala Leu Met His Asp Asp Gln Pro Phe Tyr545 550 555 560Lys Lys Met Phe Gly Lys Lys56权利要求
1.一种经过分离的HXT3己糖转运蛋白或其功能片段，所述蛋白或其功能片段具有提高的转运碳水化合物的能力。
2.一种经过分离的HXT3己糖转运蛋白，其转运果糖的能力相对于具有SEQ ID NO26的野生型己糖转运蛋白转运果糖的能力来说有所提高。
3.如权利要求1-2中任意一项所述的经过分离的HXT3己糖转运蛋白，具有选自由如下物质构成的组的氨基酸序列-一种序列，来自SEQ ID NO26，并且至少具有选自由Gln 206、Leu 207、Met 208、Ile 209、Thr 210、Leu 211、Gly 212所构成的组的位置上的突变，优选地，至少具有Ile 209位置上的突变；或者-SEQ ID NO27
4.如权利要求3所述的经过分离的HXT3己糖转运蛋白，额外至少包含选自由Met 324、Leu 388、Tyr 389、Ile 392、Glu 414、Gly 415、Ile449、Leu 471所构成的组的位置上的突变；优选地，该突变是Met 324Ile、Leu 388 Met、Tyr 389 Trp、Ile 392 Val、Glu 414 Gln、Gly 415 Asn、Ile 449 Val或Leu 471 Ile。
5.一种经过分离的核酸序列，编码如权利要求1-4中任意一项所述的HXT3己糖转运蛋白。
6.如权利要求5所述的经过分离的核酸序列，具有根据SEQ ID NO28、SEQ ID NO29或其功能同源物的序列。
7.重组酵母细胞，其经过了如权利要求5-6中任意一项所述的核酸的转化。
8.获得具有提高的亲果糖性质的酵母细胞的方法，其中，包含编码HXT3转运蛋白的基因的酵母细胞被改变，使得所述HXT3转运蛋白具有提高的转运果糖的能力，所述方法包括如下步骤a.突变所述的HXT3基因，以及b.选择出具有提高的亲果糖性质的酵母细胞。
9.可通过权利要求8的方法获得的酵母细胞。
10.如权利要求7或9中任意一项所述的酵母细胞，其中，所述酵母是Saccharomyces cerevisae、S.uvarum、S.bayanus、S.pastorianus或S.paradoxus。
11.如权利要求9或10中任意一项所述的酵母用于发酵碳水化合物的用途。
全文摘要
本发明涉及具有提高的碳水化合物发酵能力的酵母菌株，具体而言，涉及用编码改进的己糖转运蛋白基因的基因转化的菌株，更具体地，用突变的HXT3基因转化的菌株。
文档编号C12N15/81GK1902218SQ200480038036
公开日2007年1月24日 申请日期2004年12月20日 优先权日2003年12月19日
发明者帕特瑟·雅克·马里·佩勒因, 布鲁诺·博洛尼丁, 让-马里·萨博雷洛勒斯, 卡洛勒·圭劳麦 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司, 法国农业科学研究所