分泌肿瘤坏死因子－α的重组卡介苗及其构建方法

专利名称：分泌肿瘤坏死因子－α的重组卡介苗及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗及其构建方法，具体涉及一种包含卡介苗主要分泌抗原Ag85B信号肽片断和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的重组卡介苗及其构建方法，得到的重组卡介苗rBCGTNF-α用于预防和治疗浅表性膀胱肿瘤，属于基因工程技术领域。
背景技术：
自从1976年Morales首次报告应用卡介苗(BCG)膀胱灌注治疗表浅性膀胱肿瘤以来，BCG作为一种有效的免疫佐剂已在防治膀胱肿瘤方面取得了良好效果，目前BCG膀胱灌注已被视为膀胱肿瘤最有效的辅助治疗之一。尽管BCG在预防和治疗表浅性膀胱肿瘤方面具有良好的疗效，但仍有许多问题需要解决。首先是进一步增强膀胱肿瘤对BCG灌注的免疫反应性。国内外文献表明，表浅性膀胱肿瘤切除术后，即使进行规范的BCG膀胱灌注治疗，仍有10％-20％的患者缺乏免疫反应而导致肿瘤复发[苟欣等“卡介苗和白细胞介素-2预防膀胱癌复发长期观察”，医药导报第21卷第9期(2000)]。其次是减少其副作用。在BCG膀胱灌注后，患者常有尿频、尿急、尿痛、血尿等膀胱炎症状，多数可自行缓解，但仍有少数患者会出现膀胱挛缩、BCG败血症等严重并发症。
国外研究认为BCG的抗瘤机制与局部细胞免疫、直接细胞毒性作用、细胞因子的细胞杀伤等密切相关，其中IL-2、IFN-γ、TNF-α等多种细胞因子参与到免疫反应中并发挥重要的作用。体外实验研究表明，BCG联合TNF-α可通过抑制MMP-2的表达，明显增强对膀胱肿瘤细胞的杀伤作用。临床上也有人全身或局部应用TNF-α联合化疗药物治疗晚期实体肿瘤，经随机对照研究发现疗效明显好于单纯化疗组[李恩孝“重组改构人肿瘤坏死因子治疗恶性肿瘤的随机研究”，中国癌症杂志，13.4(2003)]。但TNF-α存在半衰期短、用量大及毒性强的缺点，同时高昂的治疗费用限制了其在临床上的推广。近年来国内外专家开始重视BCG转变为疫苗载体的分子生物学研究，并取得了明显的进展。目前，国内外已将重组BCG疫苗应用于日本血吸虫病、结核病的动物试验及临床中，并取得了良好的效果[甘燕等“多糖佐剂FQ2对日本血吸虫rBCG Sj26GST疫苗增效作用及其机理的初步探讨”，中国人兽共患病杂志，19.2(2003)]。国外成功构建分泌鼠白介素-2的重组BCG，并对膀胱肿瘤动物模型的免疫刺激作用及对肿瘤细胞的杀伤作用进行研究[Yamada等“分泌小鼠白细胞介素-2的重组卡介苗增强单核细胞介导的膀胱肿瘤的杀伤作用”J Urol，164(2)526(2000)]，发现重组卡介苗具有明显抗肿瘤活性及高效表达IL-2的作用，同时可以减少卡介苗的用量及毒副作用。但借助基因工程技术构建分泌TNF-α的重组卡介苗，以提高膀胱肿瘤疗效的研究尚未见报道。

发明内容
本发明的目的在于针对传统卡介苗的不足，提出一种分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗rBCGTNF-α及其构建方法，得到的rBCGTNF-α具有BCG和TNF-α的双重效果，通过在膀胱腔内局部高效表达TNF-α，既可以协同加强BCG介导的细胞免疫反应，促进T-cell、NK-cell对膀胱肿瘤的杀伤作用，也可直接杀伤膀胱肿瘤细胞。
为实现这一目的，本发明利用基因工程技术将起分泌作用的卡介苗Ag85B信号肽和TNF-α的基因片段克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表达载体pMSTNF-α，然后采用电转化技术将pMSTNF-α导入BCG构建重组卡介苗rBCGTNF-α，Ag85B信号肽是BCG自身起分泌作用的抗原，可以协助外源基因分泌至细胞外。依靠pMSTNF-α在BCG的复制和信号肽的分泌作用，能够高效分泌TNF-α。
本发明分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗rBCG TNF-α的构建方法通过下述步骤实现步骤1卡介苗穿梭表达载体的构建与鉴定根据GeneBank已有的卡介苗主要分泌抗原Ag85B信号肽和TNF-α的基因序列，分别设计Ag85B信号肽和TNF-α的扩增引物，Ag85B信号肽的上下游酶切位点分别为BamHI和EcorI，TNF-α的上下游酶切位点分别为EcorI和SalI。分别经聚合酶链式反应(PCR)合成得到Ag85B信号肽和TNF-α的基因片段。先将Ag85B信号肽克隆到pMV261载体中得到pMS，再将TNF-α基因片段与pMS载体的信号肽连接，得到卡介苗穿梭表达载体pMSTNF-α。
步骤2卡介苗的培养选取卡介苗BCG为上海丹麦株(H37Rv56209)，由上海生物制品所提供。BCG专用液体培养基为含有10％的营养剂ADC(albumin-extrose-catalase)、0.5％吐温80和0.2％甘油的Middlebrook7H9 broth(Difco产品)。将卡介苗放在含有液体培养基的烧瓶中进行摇床培养，摇床培养100转/分，三周后卡介苗处于对数生长期(OD600值＝0.6)，制得感受态卡介苗。
本发明所用的液体培养基中还可以加入青霉素100μg/ml、放线菌酮100μg/ml预防细菌感染。
步骤3电转化技术构建重组卡介苗rBCGTNF-α制备好感受态卡介苗后，在一离心管中混匀400μl含1×108cfu的感受态卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表达载体pMSTNF-α，置于基因脉冲仪中进行电转化得到阳性重组子，电转参数电压为2500V，电流为25μF，电阻为1000Ω。阳性重组子先在含有50μg/ml卡那霉素的固体培养基中筛选，培养两周后得到阳性克隆rBCGTNF-α，然后接种在含有50μg/ml卡那霉素的液体培养基摇床生长，大量培养。
电转化构建rBCGTNF-α采用含有50μg/ml卡那霉素的固体培养基Middlebrook 7H10(Difco产品)进行抗性筛选，液体培养基为含有50μg/ml卡那霉素的Middlebrook 7H9 broth。固体培养基及液体培养基还可加入青霉素100μg/ml、放线菌酮100μg/ml预防细菌感染。
步骤4重组卡介苗rBCGTNF-α的鉴定与功能检测抗酸染色初步确定rBCGTNF-α为抗酸杆菌，抽提rBCGTNF-α质粒DNA后，PCR扩增得到TNF-α的基因片断，Western blotting检测rBCGTNF-α培养上清中和菌体中有TNF-α蛋白的表达，ELISA方法检测到rBCGTNF-α培养上清中有高含量的TNF-α。
本发明所用试剂均为市购，本发明所用电转化方法及检测方法为常规已知方法。
本发明构建的重组卡介苗rBCGTNF-α与传统卡介苗比较，在采用相同剂量(106cfu/0.1ml)的情况下，能够在体外明显抑制膀胱肿瘤细胞，差别有显著性。分别应用于8只T739小鼠膀胱肿瘤模型(来自于该品系的膀胱肿瘤细胞种植于小鼠大腿内侧形成肿瘤)，采用肿瘤局部注射治疗的方法，发现重组卡介苗在肿瘤消退的小鼠数目(8/8vs.2/8)、肿瘤消退时间(1W vs.3W)、无瘤生存时间(9Wvs.2W)及对该肿瘤细胞的免疫力方面，均优于传统卡介苗。本发明构建的rBCGTNF-α如果能够应用于临床，预防和治疗表浅性膀胱肿瘤，不仅可以提高传统BCG的药物疗效，减少患者肿瘤复发的风险；而且可以减少膀胱肿瘤患者的医疗支出，既有利于患者，也有利于减轻社会医疗费用负担，因而有良好的推广价值和临床应用趋向。


图1为卡介苗主要分泌抗原Ag85B信号肽片断的PCR扩增电泳图。
图2为卡介苗主要分泌抗原Ag85B信号肽片断的测序图。
图3为TNF-α的PCR扩增电泳图。
图4为TNF-α的测序图。
图5为人卡介苗穿梭表达质粒pMSTNF-α的酶切电泳图。
图6为人卡介苗穿梭表达质粒pMSTNF-α的测序图。
图7为rBCGTNF-α的抗酸染色图。
图8为rBCGTNF-α抽提质粒DNA的PCR扩增电泳图。
图9为rBCGTNF-α的SDS-PAGE结果。
图10为rBCGTNF-α的Western Blotting结果。
图11为ELISA检测rBCGTNF-α的分泌结果。
具体实施例方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1步骤1卡介苗穿梭表达载体的构建与鉴定1.合成扩增引物根据GeneBank已有的卡介苗主要分泌抗原Ag85B信号肽和TNF-α的基因序列，分别设计Ag85B信号肽和TNF-α的扩增引物，分别为Ag85B sense5′-GGATCCATGACAGACGTGAG-3′antisense5′-CTGCCGTGCCGATCATCAAT-3′TNF-α sense5′-AGCGAATTCATGAGCACTGAAAGCATGAT-3′antisense5′-AGCGTCGACTCACAGGGCAATGATCCCAA-3′pMV261载体上的测序引物5′-GACAACTTGAGCCGTCCGTC-3′2.Ag85B信号肽基因装载到pMV261载体中合成信号肽基因并将其克隆到pUCm-T载体中连接(TAKARA)体系pUCm-T载体1μl信号肽片段(约50ng/μl)4μlSolμtion I 5μl16℃，连接过夜。
次日将pUCm-TAg85B质粒转化感受态细菌DH5a，步骤如下(1).取出冻存的DH5a(200μl/Tube)，冰中溶解；(2).取5μl连接液加入菌液中，轻轻混匀，冰浴30min；(3).42℃热休克1min 30sec，冰浴2min；(4).加入500μl LB液体培养基，于37℃摇床培养，100rpm×45min；(5).取200μl涂布至含有氨苄抗性的培养板上(100μg/ml)；(6).37℃倒置培养过夜，至菌落长出；(7).挑取单克隆至3ml含有氨苄抗性的LB培养基中，于37℃摇床培养，250rpm培养过夜。
抽提pUCm-TAg85B质粒DNA
挑选没有突变的菌落，抽提质粒。按照质粒抽提试剂盒实验步骤如下(1).将培养过夜的2ml菌液移至2ml离心管中，最高速离心30sec，弃尽上清；(2).在细菌沉淀中加入250μl Solution1液，振荡至彻底悬浮；(3).加入250μl Solution 2溶液，立即温和地上下翻转离心管5-10次以混匀，使菌体充分裂解直至形成透亮的溶液，此步骤应在5min内完成；(4).加400μ14℃预冷的Solution 3溶液，立即温和并充分地翻转离心管5-10次以混匀，室温静置2min，最高速离心10min；(5).将上清倒入新的离心管中，再次最高速离心10min；(6).小心吸取上清转移到DNA吸附柱中(吸附柱置于废液收集管中)，离心1min，弃滤液，并将吸附柱置于同一收集管中；(7).在吸附柱中加入500μlW1液，离心30sec，弃滤液，并将吸附柱置于同一收集管中；(8).在吸附柱中加入700μl W2液，离心30sec，弃滤液，并将吸附柱置于同一收集管中，重复一次；(9).最高速离心1min；(10).将吸附柱移入新的干净的1.5ml离心管中，在DNA吸附膜中央加入60μl预热到60℃的去离子水，室温静置1min，最高速离心1min，得到的即为质粒DNA溶液。
PCR扩增及电泳以抽提质粒DNA为模板，用合成的信号肽两端引物进行PCR扩增。
反应体系去离子水40.5μlbuffer 5μldNTPs 1μlPrimer sig-F1μlPrimer sig-R1μlTemplate1μlTaq酶 0.5μl
反应条件94℃ 3min94℃ 30sec54℃ 1min72℃ 30sec30cycles72℃ 10min结果图1示2-5为PCR扩增条带，与分子质量标记比较显示约120bp，与理论上所得的扩增片段大小相同。
对抽提的pUCm-TAg85B质粒DNA进行测序鉴定测序结果见图2，通过NCBI网站BLAST对照，碱基序列与Ag85B信号肽基因完全一致。表明PCR扩增得到的Ag85B信号肽基因完全正确。
将信号肽基因克隆到pMV261载体中(1).分别酶切信号肽基因所在的T载体和pMV261载体酶切体系去离子水 2μl 去离子水7μlbuffer 2μl buffer 2μlpUCm-TAg85B15μl pMV261 10μlEcoR I 0.5μlEcoR I 0.5μlBamHI 0.5μlBamHI 0.5μl37℃作用2hr，1％琼脂糖凝胶电泳。
(2).回收信号肽片段和切后的pMV261载体(申友凝胶回收试剂盒)，步骤如下①.在紫外灯切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体并切碎，计算凝胶重量；②.加入三个凝胶体积的DE-A溶液，混匀后于75℃加热，期间混和几次，直至凝胶块完全溶化(约5min)③.加入1/2个DE-A体积的DE-B溶液，混和均匀；④.吸取上述步骤中的混和液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管)中，离心3600rpm×1min，弃滤液；
⑤.将制备管置回离心管，加500μl W1溶液，离心3600rpm×30sec，弃滤液；⑥.将制备管置回离心管，加700μl W2溶液，离心3600rpm×30sec，弃滤液；以同样的方法再用W2溶液洗涤一次；⑦.将制备管置回离心管中，最高速离心1min，净弃W2溶液；⑧.将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25μl预热到60℃的水，室温静置1min，最高速离心lmin，得到DNA溶液。
(3).连接信号肽和pMV261连接体系连接buffer 1μlpMV261载体 3μl信号肽片段 5.5μl连接酶 0.5μl16℃连接过夜，得到含有信号肽基因的质粒pMS。
(4).转化(化转，步骤同前，菌液的抗性为卡那霉素)3.目的基因TNF-α电泳鉴定和DNA测序以抽提的质粒DNA为模板，用合成的TNF-α基因的两端引物进行PCR扩增。
反应体系去离子水 40.5μlbuffer 5μldNTPs1μlPrimer F 1μlPrimer R 1μlTemplate 1μlTaq酶0.5μl反应条件94℃ 3min94℃ 30sec54℃ 1min
72℃ 30sec35cycles72℃ 10min1％琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker证实。图3示IL为PCR扩增条带，与分子质量标记比较显示约702bp，与理论上所得的扩增片段大小相同。
DNA测序验证目的基因TNF-α将TNF-α的PCR产物连接到pUCm-T载体中(步骤同信号肽克隆到pUCm-T载体)，得到质粒pUCm-TTNF-α，转化感受态细菌DH5a，分别抽提质粒DNA后，进行DNA测序，测序结果如图4，通过NCBI网站BLAST对照，碱基序列与TNF-α基因完全一致。表明PCR扩增得到的目的基因片段完全正确。目的基因TNF-α全长cDNA装载入穿梭质粒pMS中回收TNF-α片断酶切pMS和pUCm-TTNF-α酶切体系water 2μlbuffer 2μlpUCm-TTNF-α 10μlEcoR I 0.5μlSal I 0.5μl37℃作用2hr，1％琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker证实片断大小分别为4602bp和702bp。回收pMS载体、TNF-α片段。
连接反应分别将pMS载体和TNF-α片段行体外连接，得到穿梭表达质粒pMSTNF-α连接体系连接buffer 1μlpMS载体 2μl外源基因片段6.5μl连接酶 0.5μl酶切验证穿梭表达质粒酶切体系water 2μlbuffer2μl穿梭表达质粒 15μlEcoR I0.5μlSal I 0.5μl37℃作用2hr，1％琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker证实。图5示IL为pMSTNF-α以EcoR I、SalI双酶切结果为4.6kb、702bp两条条带，同预期结果。
测序验证构建的穿梭表达质粒用pMV261载体上的测序引物对抽提的穿梭表达质粒pMSTNF-α进行测序验证。测序结果见图6，通过NCBI网站BLAST对照，碱基序列与TNF-α基因+Ag85B信号肽基因完全一致。
步骤2 卡介苗的培养选取卡介苗BCG为上海丹麦株(H37Rv56209)，由上海生物制品所提供。BCG专用液体培养基为含有10％的营养剂ADC(albumin-extrose-catalase)、0.5％吐温80和0.2％甘油的Middlebrook7H9 broth(Difco产品)。将卡介苗放在含有液体培养基的烧瓶中进行摇床培养，摇床培养100转/分，三周后卡介苗处于对数生长期(OD600值＝0.6)，按照下列步骤制备感受态卡介苗◆BCG在Middlebrook 7H9培养基37℃摇床培养(转速为100-120rpm)◆待培养液OD600值约0.6时将BCG菌液加入离心管中，冰浴2hr；◆将BCG菌液加入离心管中，在冰盒中预冷2hr；◆4℃离心8000g/min×15min，丢弃上清；用原始体积的1/10、预冷的浓度为10％甘油重悬菌体；◆重复上述操作共五次；◆弃上清，加入原始体积1/50的10％甘油重悬菌体即得到感受态细菌，放置室温下备用。
本发明所用的液体培养基中还可以加入青霉素100μg/ml、放线菌酮100μg/ml预防细菌感染。
步骤3 电转化技术构建重组卡介苗rBCGTNF-α◆在一离心管中混匀400μl感受态BCG(1×108)和2μl穿梭表达质粒(0.4μg)；◆冰浴10min后，转入预冷的0.2CM的电击转化杯中再冰浴10min，置于基因脉冲仪中进行电转化，电转参数电压为2500V，电流为25μF，电阻为1000Ω；◆质粒pMSTNF-α、pMV261及单纯BCG的作用时间分别为23.5、25、26毫秒；◆电转完成后，迅速加入1000μl培养基(MADC2Tw)，37℃下培养3hr；◆取100-200μl菌液涂抹于含有50μg/ml卡那霉素的固体培养基中，先正面朝上培养，3hr后翻转平皿，继续培养；◆两周后挑选阳性克隆，在含2-3ml液体培养基的试管里摇床生长。
▲注此处感受态BCG在转化时各做一阳性对照pBCG(BCG中只含有空白质粒pMV261)及阴性对照(BCG)。
电转化构建rBCGTNF-α后，采用含有50μg/ml卡那霉素的固体培养基Middlebrook 7H10(Difco产品)进行抗性筛选，液体培养基为含有50μg/ml卡那霉素的Middlebrook 7H9 broth，还可加入青霉素100μg/ml、放线菌酮100μg/ml预防细菌感染。
步骤4 重组卡介苗rBCGTNF-α的鉴定与功能检测1.rBCGTNF-α的Z-N法抗酸染色(初步鉴定)结果见图7染色后光学显微镜镜检(目镜10×，油镜100×)。在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色。
2.rBCGTNF-αDNA水平鉴定(PCR扩增、电泳鉴定)rBCGTNF-α质粒DNA的提取◆rBCG质粒DNA的提取将在三角烧瓶内培养四周的rBCG分瓶至15ml试管中，再在试管里摇床培养2周后使OD600约为1，收获前加入甘氨酸至20mg/ml以干扰胞壁的合成，继续培养一定时间后收集菌体；◆菌体用生理盐水洗两次后悬浮在裂解液(2mg/ml溶菌酶，0.3mol/L蔗糖，25mmol/L Tris-C1(pH＝8.0)，25mmol/L EDTA(pH＝8.0)，0.2mg/ml溴甲酚绿)中温浴24-48hr后，加入碱性SDS(20mg/mlSDS，3mol/LNaOH)；◆37℃水浴12-48hr直至液体清亮，加入3mol/L的NaAc(pH＝4.8)；◆40℃水浴12hr，离心收集上清；◆往溶解的菌体里加入600μl预冷的Nuclei Lysis Solution，轻微振荡10sec；◆加入3μlRNase Solution混合均匀。37℃放置15-30min；◆加入200μlProtein Precipitation Solution混合均匀，置于冰上5min；◆离心13000rpm×4min；◆将上清转入含有600μl的异丙醇里，上下混合均匀，离心13000rpm×1min；◆弃上清，用70％乙醇洗涤一次，离心13000rpm×1min；◆小心吸弃上清，室温干燥，加入TE溶解DNA。
PCR扩增反应及电泳鉴定PCR扩增反应的条件、方法同步骤1。电泳鉴定结果见图8示1-9为PCR扩增条带，与分子质量标记比较显示约702bp，与理论上所得的扩增片段大小相同。
3.rBCGTNF-α蛋白水平鉴定在液体培养基中培养至OD600值约为1时，先诱导两种rBCG分泌表达细胞因子(45℃，30min)，4000g/min×10min，离心2次，收获菌体及上清后，菌体先用超声裂解法破碎，再加入裂解液(2％SDS，0.1M DT，0.01％溴甲酚绿，0.06M Tris-Cl，10％甘油)煮沸5min提取蛋白。分别将样品用1×PBS洗涤三遍，以去除培养液中的白蛋白。收集第一遍洗涤液和最终的沉淀进行western blot鉴定。
SDS-PAGE分离rBCGTNF-α总蛋白将洗涤液和2×SDS上样缓冲液按1∶1混合(10μl+10μl)，沸水中变性10min后直接上样。
制备凝胶板按下列条件配制12％的分离胶和5％的浓缩胶
12％分离胶(6ml)5％浓缩胶(3ml)30％丙烯酰胺溶液2.4ml 0.5ml1.5mmol/L Tris-HCl PH8.81.55ml /0.5mmol/L Tris-HCl PH6.8/ 0.38ml去离子水1.93ml 2.1ml10％SDS 60μl 30μl10％APS 60μl 30μlTEMED 2.4μl 3μl电泳浓缩胶用8V/cm，分离胶用15V/cm，恒压电泳2hr，待溴酚蓝到达底部时结束。染色观察。
结果见图9示泳道1显示为TNF-α蛋白的条带(相对分子质量约26KD)，泳道2显示为IFN-α2a蛋白的条带(约19KD)，泳道3显示为IL-2蛋白的条带(约15.5KD)，泳道4及5在相应位置未见蛋白条带。
Western blotting检测TNF-α蛋白表达◆常规蛋白电泳分离样品；PVDF膜用甲醇浸湿，去离子水冲洗，再转移到Transferring buffer中平衡20min，电泳胶置Transferring buffer中平衡20min，裁4张与胶同样大小的Whatman 3mm滤纸，置Transferring buffer中平衡；◆按下列顺序装好blot负极—2层滤纸—电泳胶—PVDF膜—2层滤纸—正极，在这一步，要注意PAGE胶上的预染Marker是否清楚，为了避免在转膜之后膜上的Marker不清楚，可以在这一步，当胶和膜叠在一起时，对应胶上的Marker，用圆珠笔在膜的相应位置做上记号；◆5％脱脂牛奶/PBST 20ml，水平摇床，室温封闭1hr；也可以先室温封闭若干时间，4℃过夜；◆用PBST稀释一抗，5％BSA，稀释倍数1000倍，将膜封在塑料袋中，不留气泡，用胶带固定在可垂直旋转的小摇床上，偏转角度70-80度，水平摇床，室温1hr；先用PBST短暂地洗2次，再用＞4ml/cm2(膜面积)的PBST，室温洗15min；◆用PBST稀释二抗，5000倍或10000倍稀释5％BSA，水平摇床，室温1hr；先用PBST短暂地洗2次，再用＞4ml/cm2(膜面积)的PBST，室温洗15min；◆将检测试剂(ECL plus)从4℃取出，在打开前平衡至室温，检测试剂的A液与B液以40∶1的比例混合，检测试剂的用量为0.1ml/cm2；◆膜置于吸水纸上干燥，蛋白面朝上，检测试剂加在膜上，覆盖整个膜表面，室温2min；◆用镊子夹起PVDF膜，使膜的下边角搭在纸巾上，吸干多余的检测试剂；◆PVDF膜用保鲜膜封起，暗室曝光，时间10sec。
结果图10示1-2分别为rBCGTNF-α中的菌体和培养上清，均可见26KD的TNF-α蛋白表达；3-4为pBCG的菌体和培养上清，未见蛋白表达；5-6为BCG的菌体和培养上清，未见蛋白表达。
3.rBCGTNF-α自分泌TNF-α的测定rBCGTNF-α在试管中摇床培养10天，OD600值约为0.5时，装入离心管中，离心2000rpm×10min，仔细吸取上清。按照ELISA试剂盒说明书的操作步骤检测培养上清中TNF-α的水平。以标准品浓度作横坐标，测得的标准品OD620值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点绘制标准曲线；通过待测标本的OD620值在标准曲线上查出浓度。结果见图11示，与rBCGIFN-α2a和rBCGIL-2相比，只在rBCGTNF-α培养上清中检测到高表达的TNF-α为665.21pg/ml；而pBCG和BCG的培养上清中均未检测到TNF-α的表达。
权利要求
1.一种分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗的构建方法，其特征在于包括下述步骤1)卡介苗穿梭表达载体的构建分别设计Ag85B和TNF-α的扩增引物，Ag85B信号肽的上下游酶切位点分别为BamHI和EcorI，TNF-α的上下游酶切位点分别为EcorI和SalI，经聚合酶链式反应分别合成Ag85B信号肽和TNF-α基因片段，将Ag85B信号肽克隆到pMV261载体中，得到pMS，再将TNF-α基因片段与pMS载体的信号肽连接，得到穿梭表达载体pMSTNF-α；2)卡介苗的培养选取卡介苗为上海丹麦株，将卡介苗放在含有液体培养基的烧瓶中进行摇床培养，液体培养基含有10％的营养剂ADC、0.5％吐温80和0.2％甘油，摇床培养100转/分，三周后卡介苗处于对数生长期，OD600值＝0.6，制得感受态卡介苗；3)电转化技术构建分泌人TNF-α的重组卡介苗rBCGTNF-α在一离心管中混匀400μl含1×108cfu的感受态卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表达质粒pMSTNF-α，置于基因脉冲仪中进行电转化得到阳性重组子，电转参数电压为2500V，电流为25μF，电阻为1000Ω，阳性重组子先在含有50μg/ml卡那霉素的固体培养基中筛选，培养两周后得到阳性克隆rBCGTNF-α，然后接种在含有50μg/ml卡那霉素的液体培养基摇床生长，大量培养；4)重组卡介苗rBCGTNF-α的鉴定与功能检测进行Z-N法抗酸染色证实为抗酸杆菌，抽提rBCGTNF-α质粒DNA后，PCR扩增得到TNF-α基因片断，WesternBlot检测到rBCGTNF-α培养上清中和菌体中有TNF-α蛋白的表达，ELISA方法检测到rBCGTNF-α培养上清中有高含量的TNF-α。
2.根据权利要求1的分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗的构建方法，其特征在于所述的Ag85B和TNF-α的扩增引物分别为Ag85B sense5′-GGATCCATGACAGACGTGAG-3′antisense5′-CTGCCGTGCCGATCATCAAT-3′TNF-αsense5′-AGCGAATTCATGAGCACTGAAAGCATGAT-3′antisense5′-AGCGTCGACTCACAGGGCAATGATCCCAA-3′ 。
3.根据权利要求1的分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗的构建方法，其特征在于所述pMV261载体上的测序引物为5′-GACAACTTGAGCCGTCCGTC-3′。
4.根据权利要求1的分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗的构建方法，其特征在于所述液体和固体培养基中均含有100μ/ml青霉素和100μg/ml放线菌酮。
5.一种采用权利要求1或2的方法构建的分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗，其特征在于重组卡介苗包含Ag85B信号肽和TNF-α基因片段。
6.一种权利要求5的分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗的应用，其特征在于用于人膀胱肿瘤的预防和治疗。
全文摘要
本发明涉及一种分泌肿瘤坏死因子－α的重组卡介苗及其构建方法，利用基因工程技术将起分泌作用的卡介苗Ag85B信号肽和TNF－α的基因片段克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表达载体pMSTNF－α，然后采用电转化技术将pMSTNF－α导入BCG构建重组卡介苗rBCGTNF－α，依靠pMSTNF－α在BCG的复制和信号肽的分泌作用，能够高效分泌TNF－α。本发明得到的重组卡介苗rBCGTNF－α具有BCG和TNF－α的双重效果，能够有效预防和治疗浅表性膀胱肿瘤；利用重组卡介苗rBCGTNF－α在膀胱腔内的局部协同作用减少BCG和外用TNF－α的用量，可以克服BCG治疗的毒副作用。
文档编号C12N15/09GK1710073SQ20051002577
公开日2005年12月21日 申请日期2005年5月12日 优先权日2005年5月12日
发明者夏术阶, 刘海涛, 孙晓文 申请人:上海交通大学