专利名称：利用油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵领域，特别涉及一种利用油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂的方法。
背景技术：
有些微生物在一定条件下能够生产油脂作为细胞储存物，少数微生物油脂含量可达菌体干重的70％以上。微生物油脂的存积发生在某些种类的酵母、霉菌、和藻类细胞中，通常称其为产油微生物。已报道的产油微生物种类较多，酵母类的有红酵母属(Rhodotorha sp.)、隐球酵母属(Crytococcus sp.)假丝酵母属(Candida sp.)、油脂酵母属(Lipomyces sp.)等；产油霉菌主要集中在接合菌亚门(Zygomycotina)，特别是被孢霉属(Mortierella sp.)、毛霉属(Mucor sp.)，报道较多，另外半知菌类(Fungi Imperfecti)的头孢霉属(Cephalosporium)等也有报道。
目前，微生物油脂在工业上的生产方式主要是液态发酵，由于生产成本高昂，而只能生产那些通过农业生产很难得到因而能以高价出售的油脂，如富含多不饱和脂肪酸和γ-亚油酸的油脂，产品的范围很窄；要提高微生物油脂在油脂市场的份额，就必须寻找新的生产途径降低生产成本。秸秆这种可再生资源，量大、价格低廉且没有得到通分利用，人们正在努力将它转化为各种液态燃料，如通过微生物发酵生产酒精或直接热解使其转化为生物油，微生物发酵秸秆生产微生物油脂的研究目前还未见报道，本发明将丰富的秸秆资源与内生真菌资源相结合，从油脂植物中筛选出能够降解秸秆大量积累油脂的内生真菌菌株，并提供这些菌株利用秸秆固态发酵生产微生物油脂的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂的方法，将丰富的秸秆资源与内生真菌资源相结合，从油脂植物中筛选出能够降解秸秆大量积累油脂的内生真菌菌株，再利用该内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂。
本发明的技术方案如下本发明提供的利用油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂的方法，其步骤如下1)筛选分离高产油脂的内生真菌菌株通过无菌操作，将清洗干净并晾干的新鲜松柏纲或/和红豆杉纲油脂植物的叶、茎和果实切成片，接种到PDA固体培养基上，置于温箱中，在25～28℃下，培养3～9天，待植物组织切面长出菌丝后，挑取边缘部分移至新鲜的PDA固体培养基上，经纯化后，得到内生真菌；用插片培养的方法，挑取上述内生真菌菌体点接在PDA固体平板上，生长4～7天后制作临时装片，镜检观察菌丝内脂肪滴，筛选出在100倍显微镜下能看到菌丝内脂肪滴的内生真菌菌株；2)利用油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂将筛选出的内生真菌菌株在PDA培养基试管斜面上，25-30℃下培养4-6天后，转接到PDA液体培养基中，振荡培养5-7天后，收集菌体并用水充分洗涤后，烘干得干菌体；将所得干菌体用过量的体积比为2∶1的氯仿和甲醇混合溶剂在索氏抽提器中75-85℃回流6-8小时，用旋转蒸发仪减压去除溶剂，得微生物油脂，所得油脂重量与干菌体的重量之比为油脂含量，选取油脂含量在30％-40％的菌株作为种子菌株；将得到的种子菌株在PDA液体培养基中培养4-6天后，按固液比为1.0-2.0的接种量再接种到固体培养基中，20～32℃下培养6～12天；在75-85℃烘箱内烘干，再在索氏提取器中以石油醚为溶剂，75-85℃下回流6-8小时，用旋转蒸发仪蒸干溶剂后，制得微生物油脂；所述固态发酵培养基的组分包含汽爆秸杆、麸皮和水，所述汽爆秸杆、麸皮与水的重量份配比为5∶0.2～1∶10～50。
所述的内生真菌为Microspaeropsis，Phomopsis，Cephalosporium，Sclerocystis，或Nigrospora。
所述的汽爆秸杆为小麦、玉米和水稻秸秆。
所述固态发酵培养基中加入纤维素酶，纤维素酶的加入量为每克汽爆秸杆加入2～30个滤纸酶活单位的纤维素酶。
本发明的利用油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂的方法，与目前主要用淀粉、葡萄糖等为主要底物通过液态发酵生产微生物油脂方法相比，具有下述优点首先，秸秆是可再生资源，取之不尽用之不竭，且价格低廉，所以用它来生产微生物油脂不仅能大量生产满足市场需求，而且降低了生产成本，使其在市场上能与动、植物油脂相抗衡；其次，通过固态发酵生产微生物油脂没有废水排放，大大减少环境污染。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例11、将用水清洗干净并凉干的新鲜马尾松植物的叶、果实和切成2cm小段的茎，用70％的酒精漂洗60～90秒，无菌水清洗去除表面酒精，再用0.1％升汞浸泡30～60秒，无菌水清洗去除升汞；通过无菌操作，将茎的韧皮部及叶、果实切成0.1cm×0.5cm×0.5cm小片，接种到PDA固体培养基上，置于25℃温箱培养9天，待各植物组织切面长出菌丝后，挑取边缘部分移至新的固体培养基上，经纯化后，得内生真菌。
用插片培养的方法挑取菌体点接在PDA固体平板上，生长7天后制作临时装片，镜检观察菌丝内脂肪滴，筛选出在100倍显微镜下能看到菌丝内脂肪滴的菌株。
2、利用油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂将筛选出的内生真菌菌株在PDA培养基试管斜面上，25℃下培养6天后，转接到PDA液体培养基中，振荡培养7天后，收集菌体并用水充分洗涤后，烘干得干菌体；将所得干菌体用体积比为2∶1的氯仿和甲醇过量混合溶剂在索氏抽提器中85℃回流6小时，用旋转蒸发仪减压去除溶剂，选取油脂含量为30％-40％的菌株作为种子菌株；将得到的种子菌株在PDA液体培养基中培养6天后，按固液比为1.5的接种量再接种到固体培养基中，32℃培养下6天；在80℃烘箱内烘干，再在索氏提取器中以石油醚为溶剂，85℃下回流6小时，用旋转蒸发仪蒸干溶剂后，即制得微生物油脂。
所述固态发酵培养基所含组分及配比为汽爆玉米秸秆、麸皮与水的重量份配比为5∶1∶10。
实施例21、用水清洗新鲜南方红豆杉植物的组织表面，晾干后将茎切成约2cm的小段，叶、果实不切，用70％的酒精漂洗60～90秒，无菌水清洗去除表面酒精，再用0.1％升汞浸泡30～60秒，无菌水清洗去除升汞；通过无菌操作，将茎的韧皮部及叶、果实切成0.2cm×0.5cm×0.5cm小片，接种到PDA固体培养基上，置于28℃温箱培养3天，待各植物组织切面长出菌丝后，挑取边缘菌丝移至新的固体培养基上，经纯化后，即得内生真菌。
用插片培养的方法挑取菌体点接在PDA固体平板上，生长4天后制作临时装片，镜检观察菌丝内脂肪滴，筛选出在100倍显微镜下能看到菌丝内脂肪滴的菌株。
2、利用油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂将筛选出的内生真菌菌株在PDA培养基试管斜面上，27℃下培养4天后，转接到PDA液体培养基中，振荡培养6天后，收集菌体并用水充分洗涤后，烘干得干菌体；
将所得干菌体用体积比为2∶1的氯仿和甲醇过量混合溶剂在索氏抽提器中80℃回流6小时，用旋转蒸发仪减压去除溶剂，选取油脂含量为30％-40％的菌株作为种子菌株；将得到的种子菌株在PDA液体培养基中培养5天后，按固液比为1.0的接种量再接种到固体培养基中，20℃培养下12天；在85℃烘箱内烘干，再在索氏提取器中以石油醚为溶剂，75℃下回流8小时，用旋转蒸发仪蒸干溶剂后，即制得微生物油脂。
所述固态发酵培养基所含组分及配比为汽爆玉米秸秆、麸皮与水的重量份配比为5∶0.2∶50。
实施例31、用水清洗新鲜西藏柏木植物的组织表面，晾干后将茎切成约2cm的小段，叶、果实不切，用70％的酒精漂洗60～90秒，无菌水清洗去除表面酒精，再用0.1％升汞浸泡30～60秒，无菌水清洗去除升汞；通过无菌操作，将茎的韧皮部及叶、果实切成0.15cm×0.5cm×0.5cm小片，接种到PDA固体培养基上，置于27℃温箱培养6天，待各植物组织切面长出菌丝后，挑取边缘部分移至新的固体培养基上，经纯化后，即得内生真菌。
用插片培养的方法挑取菌体点接在PDA固体平板上，生长5天后制作临时装片，镜检观察菌丝内脂肪滴，筛选出在100倍显微镜下能看到菌丝内脂肪滴的菌株。
2、利用油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂将筛选出的内生真菌菌株在PDA培养基试管斜面上，30℃下培养5天后，转接到PDA液体培养基中，振荡培养5天后，收集菌体并用水充分洗涤后，烘干得干菌体；将所得干菌体用体积比为2∶1的氯仿和甲醇过量混合溶剂在索氏抽提器中75℃回流8小时，用旋转蒸发仪减压去除溶剂，选取油脂含量在30％-40％的菌株作为种子菌株；将得到的种子菌株在PDA液体培养基中培养4天后，按固液比为2.0的接种量再接种到固体培养基中，28℃培养下9天；在75℃烘箱内烘干，再在索氏提取器中以石油醚为溶剂；80℃下回流7小时，用旋转蒸发仪蒸干溶剂后，即制得微生物油脂。
所述固态发酵培养基所含组分及配比为汽爆小麦杆、麸皮与水的重量份配比为5∶0.2～1∶10～50。
实施例51、用水清洗新鲜桧柏植物的组织表面，晾干后将茎切成约2cm的小段，叶、果实不切，用70％的酒精漂洗60～90秒，无菌水清洗去除表面酒精，再用0.1％升汞浸泡30～60秒，无菌水清洗去除升汞；通过无菌操作，将茎的韧皮部及叶、果实切成0.1cm×0.5cm×0.5cm小片，接种到PDA固体培养基上，置于25℃(当然也可以是26℃、27℃或28℃)温箱培养3～9天，待各植物组织切面长出菌丝后，挑取边缘部分移至新的固体培养基上，经纯化后，即得内生真菌。
用插片培养的方法挑取菌体点接在PDA固体平板上，生长4～7天后制作临时装片，镜检观察菌丝内脂肪滴，筛选出在100倍显微镜下能看到菌丝内脂肪滴的菌株。
2、利用油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂将筛选出的内生真菌菌株在PDA培养基试管斜面上，26℃下培养4天后，转接到PDA液体培养基中，振荡培养6天后，收集菌体并用水充分洗涤后，烘干得干菌体；将所得干菌体用体积比为2∶1的氯仿和甲醇过量混合溶剂在索氏抽提器中80℃回流6小时，用旋转蒸发仪减压去除溶剂，选取油脂含量为30％-40％的菌株作为种子菌株；将得到的种子菌株在PDA液体培养基中培养5天后，按固液比为1.0的接种量再接种到固体培养基中，20～32℃培养下6～12天；在80℃烘箱内烘干，再在索氏提取器中以石油醚为溶剂；80℃下回流6小时，用旋转蒸发仪蒸干溶剂后，即制得微生物油脂。
所述固态发酵培养基所含组分及配比为汽爆小麦杆、麸皮与水的重量份配比为5∶0.2～1∶10～50。
实施例6
1、用水清洗新鲜龙柏植物的组织表面，晾干后将茎切成约2cm的小段，叶、果实不切，用70％的酒精漂洗60～90秒，无菌水清洗去除表面酒精，再用0.1％升汞浸泡30～60秒，无菌水清洗去除升汞；通过无菌操作，将茎的韧皮部及叶、果实切成0.2cm×0.5cm×0.5cm小片，接种到PDA固体培养基上，置于25℃(当然也可以是26℃、27℃或28℃)温箱培养3～9天，待各植物组织切面长出菌丝后，挑取边缘部分移至新的固体培养基上，经纯化后，即得内生真菌。
用插片培养的方法挑取菌体点接在PDA固体平板上，生长4～7天后制作临时装片，镜检观察菌丝内脂肪滴，筛选出在100倍显微镜下能看到菌丝内脂肪滴的菌株。
2、利用油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂将筛选出的内生真菌菌株在PDA培养基试管斜面上，28℃下培养5天后，转接到PDA液体培养基中，振荡培养6天后，收集菌体并用水充分洗涤后，烘干得干菌体；将所得干菌体用体积比为2∶1的氯仿和甲醇过量混合溶剂在索氏抽提器中83℃回流6小时，用旋转蒸发仪减压去除溶剂，选取油脂含量为30％-40％的菌株作为种子菌株；将得到的种子菌株在PDA液体培养基中培养5天后，按固液比为1.6的接种量再接种到固体培养基中，20～32℃培养下6～12天；在80℃烘箱内烘干，再在索氏提取器中以石油醚为溶剂；80℃下回流6小时，用旋转蒸发仪蒸干溶剂后，即制得微生物油脂。
所述固态发酵培养基所含组分及配比为汽爆水稻杆、麸皮与水的重量份配比为5∶0.2～1∶10～50。
本实施例在种子液接入的同时在固态发酵培养基中加入一定量的纤维素酶，纤维素酶的加入量为每克秸秆2～30个滤纸酶活单位。
权利要求
1.一种利用油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂的方法，其步骤如下1)筛选分离高产油脂的内生真菌菌株通过无菌操作，将清洗干净并晾干的新鲜松柏纲或/和红豆杉纲油脂植物的叶、茎和果实切成片，接种到PDA固体培养基上，置于温箱中，在25～28℃下，培养3～9天，待植物组织切面长出菌丝后，挑取边缘部分移至新鲜的PDA固体培养基上，经纯化后，得到内生真菌；用插片培养的方法，挑取上述内生真菌菌体点接在PDA固体平板上，生长4～7天后制作临时装片，，镜检观察菌丝内脂肪滴，筛选出在100倍显微镜下能看到菌丝内脂肪滴的内生真菌菌株；2)利用油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂将筛选出的内生真菌菌株在PDA培养基试管斜面上，25-30℃下培养4-6天后，转接到PDA液体培养基中，振荡培养5-7天后，收集菌体并用水充分洗涤后，烘干得干菌体；将所得干菌体用过量的体积比为2∶1的氯仿和甲醇混合溶剂在索氏抽提器中75-85℃回流6-8小时，用旋转蒸发仪减压去除溶剂，得微生物油脂，所得油脂重量与干菌体的重量之比为油脂含量，选取油脂含量为30％-40％的菌株作为种子菌株；将得到的种子菌株在PDA液体培养基中培养4-6天后，按固液比为1.0-2.0的接种量再接种到固体培养基中，20～32℃下培养6～12天；在75-85℃烘箱内烘干，再在索氏提取器中以石油醚为溶剂，75-85℃下回流6-8小时，用旋转蒸发仪蒸干溶剂后，制得微生物油脂；所述固态发酵培养基的组分包含汽爆秸杆、麸皮和水，所述汽爆秸杆、麸皮与水的重量份配比为5∶0.2～1∶10～50。
2.按权利要求1所述的利用油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂的方法，其特征在于，所述的内生真菌为Microspaeropsis，Phomopsis，Cephalosporium，Sclerocystis，或Nigrospora。
3.按权利要求1所述的利用油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂的方法，其特征在于，所述的汽爆秸杆为小麦、玉米和水稻秸秆。
4.按权利要求1所述的利用油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂的方法，其特征在于，所述固态发酵培养基中加入纤维素酶，纤维素酶的加入量为每克汽爆秸杆加入2～30个滤纸酶活单位的纤维素酶。
全文摘要
本发明涉及一种利用油脂植物内生真菌发酵秸秆生产微生物油脂的方法，首先从植物中分离得到内生真菌，用镜检法观察菌丝内油滴初步筛选出产油菌株，通过液态发酵测定其菌体油脂含量筛选出油脂高产内生真菌菌株；再使用所得油脂高产菌株以汽爆秸秆为主要底物通过固态发酵生产微生物油脂，其油脂产率为4～12％；本发明的优点在于使用取之不尽的可再生植物秸秆资源，价格低廉，可降低生产成本；而且固态发酵无废水排放，可减少环境污染。
文档编号C12R1/645GK1955302SQ20051011675
公开日2007年5月2日 申请日期2005年10月28日 优先权日2005年10月28日
发明者陈洪章, 彭小伟 申请人:中国科学院过程工程研究所