乙型肝炎的治疗、预防和诊断试剂的制作方法

专利名称：乙型肝炎的治疗、预防和诊断试剂的制作方法
背景技术：
发明领域本发明提供了用于在动物种类中感染乙型肝炎病毒(HBV)的治疗和预防的化合物。本发明还提供了诊断HBV感染或其它疾病状态的方法以及用于诊断试验方案的试剂。本发明还构思了监测人和其它动物种类包括动物模型的疾病状态的方法，以及提供研究对象感染HBV的易感性或其它疾病状态发展的指征。
现有技术的描述说明书中参考的发表物的详细目录也收集在本说明书的最后。
说明书中提到的任何现有技术在任何国家不是并且也不应当被当作该现有技术构成普通常识的一部分的确认或任何形式的暗示。
乙型肝炎病毒(HBV)造成虚弱疾病状态并能导致急性肝衰竭。HBV是DNA病毒，它经由RNA中间体复制并在其复制策略中利用了逆转录。HBV基因组性质复杂，具有部分双链DNA结构，有重叠的编码表面、前核心、核心、多聚酶和X基因的开放阅读框。
HBV前核心/核心基因含有两个符合读框的起始密码子，它们控制具有共末端N末端的(核心基因编码的)HBcAg和(前核心基因编码的)HBeAg的合成。实际上，前核心基因编码相同蛋白的两个形式HBeAg细胞外形式和P22或P25细胞内形式(此处称为P22)。前核心基因表达产物称为HBeAg/P22。细胞外蛋白是免疫介导的病毒清除机制的靶点。
与前核心蛋白相关，翻译从这个ORF的第一个AUG开始，得到有编码信号肽的前C区域的25kD多肽。信号肽的功能是将前体蛋白插入ER，在ER中肽被切割得到经由分泌途径运出的17kD蛋白产物。17-25kD蛋白是P22。运出过程中，切除基本C末端结构域以产生15-17kD可溶性蛋白，它最终被分泌进血清中并被测量为HBeAg，但是一些也会引入到细胞外膜。HBeAg/P22对于生产性病毒复制不是必需的。
HBcAg是21kD的磷蛋白，它的合成从第二个符合读框的起始密码子开始，从较短的基因组转录物翻译。HBcAg是核壳(nucleocapsid)的主要蛋白组分。C末端结构域是高度碱性的并且拥有非序列特异性核酸结合结构域。
位于重叠X开放阅读框区域(X-ORF)的基础核心启动子[BCR](核苷酸1744至1804)控制前核心和核心区域的转录并且指导前核心mRNA和前基因组/CmRNA这两个mRNA的合成。前核心mRNA编码HBeAg/P22，前基因组/CmRNA编码核心蛋白。DNA多聚酶起前基因组RNA(pgRNA)逆转录模板的作用。
影响HBeAg/P22合成的两个主要类型的突变是前核心蛋白突变(G1896A)和基础核心启动子(BCP)在核苷酸1762和核苷酸1764的突变，所有都导致了HBeAg/P22产生的减少并且导致增加的宿主免疫反应，虽然在一些患者这可能是瞬时的，并且在没有被免疫抑制的患者中与更具侵略性的肝疾病没有明显的相关性。前核心突变经常发生在相似的时间并且通常与核心基因的突变/删除相关。
前核心终止突变和HBV基因表型之间有相关性。核苷酸1896是鸟嘌呤核苷(G)并且见于RNA结构元件ε之内，它参与壳体化。这个与核苷酸1858碱基配对，核苷酸1858的突变联合在核苷酸1896的前核心终止突变能增强ε茎-环区域之内的病毒碱基配对。有基因型A HBV感染(北美和部分欧洲最普遍的基因型)的患者中，核苷酸1858是C。这个基因型中，核苷酸1896(G变A)和核苷酸1858(C变T)的突变对于稳定茎-环结构是必需的。基因型A HBV中核苷酸1858没有代偿性的突变，当C-1858试图与A-1896配对时导致未配对的碱基配对，这动摇了装配信号的茎-环结构。对于装配没有稳定的ε，可以发生壳体化的降低因而复制降低，得到复制缺陷病毒。因而，前核心终止密码子突变在基因型A中不太频繁发生，因为需要两个突变事件。相反，亚洲、非洲、地中海盆地或中东多于70％的慢性HBV携带者的HBV序列在核苷酸1858已经含有T。因而，只有在核苷酸1896的单个突变对于产生有稳定茎-环配对的前核心突变体是必需的。含有核苷酸1858是T的这些其它的基因型(基因型B、C、D和E)的患者中前核心终止突变HBV的这个更高频率反映了对于ε得到终止密码子和稳定茎-环结构只有单个突变(G1896A)是需要的(Hunt等，Hepatology.31(5)1037-44，1994；Lok等，Proc Natl AcadSciUSA.91(9)4077-81，1994)。
在许多有持续感染、暴发肝炎患者以及免疫抑制患者中检测到了造成T-1762和/或A-1764的BCP中的突变，尤其是在核苷酸1762和核苷酸1764。T-1762和A-1764的双突变与HBeAg/P22的降低(但是没有消失)和病毒荷载的增加相关(Gunther等，Adv Virus Res.5225-137，1999；Hunt等，1994同上)。一般地，一些基因型A感染的患者中发现了这个模式的前核心的改变。
核心蛋白能分成两个主要结构域，N末端装配结构域直到氨基酸位置144和功能上重要的富含精氨酸C末端结构域。C末端结构域对于前基因组RNA的结合和基因组复制以及参与核运输是必需的。有趣地，HBeAg阳性、免疫耐受阶段患者的HBV核心蛋白序列不含有或含有很少的氨基酸改变，提示较低的免疫压力可以导致临床较不明显的突变。HBcAg和HBeAg氨基酸改变的普及和前C缺陷的那些非常相似并且在慢性感染的多个阶段中可见。然而，一旦患者进入免疫再激活(清除)阶段，HBcAg和HBcAg氨基酸改变的平均比率增加多于五倍，簇集到受免疫压力和其后病毒“选择”影响的36个热点位置。这些热点位置与主要细胞毒性T淋巴细胞(CTL)[氨基酸18-30]和T辅助(TH)细胞[氨基酸50-70]区域以及分别在氨基酸残基75-90和120-140的两个B细胞[HBc/e1和HBc/e2]表位相关联(Gunther等，1999同上)。
为了理解带有慢性HBV感染的特殊人群，必须理解HBV感染的自然历史。有高达30％的慢性HBV感染的患者发展了肝硬化和或肝癌，对于将要评价临床试验或治疗每个患者必须分别定义各个的HBV病程。由于在世界上一些地方例如非洲、亚洲、中东、地中海盆地和南美洲非基因型A感染的HBV是常见的，HBeAg阴性的慢性肝炎目前代表了慢性肝炎的主要形式。
每年1至10％的慢性乙型肝炎携带者(有野生型病毒的患者中)发生了从HBeAg到抗HBeAg抗体的重要的自发血清转换(以及同时HBVDNA水平的降低)，但是从HBsAg到抗HBsAg抗体的血清转换和HBV从肝的清除非常罕见(每年1％或更低)。
慢性HBV感染定义为HBsAg持续超过六个月。HBV的持续是因为共价闭环(cccDNA)的稳定性质、免疫特殊部位的感染和/或HBV特异性的免疫抑制。相信HBeAg在HBV持续中有重要作用，这通过经由FAS介导的凋亡而耗尽HBeAg和HBcAg特异性Th1 CD4+T细胞(Milich等，J.Immunol 1602013-21，1998)。HBeAg跨越胎盘所以可以在新生儿建立对HBV的耐受，增加持续HBV感染垂直传播的频率。Th1/Th2反应的失调通过抗炎细胞因子例如IL-4和IL-10的产生促进了对HBeAg-HBcAg特异性CD8+T细胞反应和Th1效应细胞的抑制(Ferrari等，J Immunol.1453442-9，1990；Milich等，1998同上，Milich等，Proc Natl Acad Sci USA.926847-51，1995)。还有其它的机制可能造成慢性HBV感染的个人全身性CD4+T细胞低反应性，因为当与HBV阴性对照相比时对分裂素的反应是降低的并且在抗HBV治疗降低HBV病毒荷载后是增加的(Boni等，J Clin Inveest.102968-75，1998)。这个T细胞“低反应性”可能来自HBV感染的树状突细胞功能的降低，它们有IFN-γ、TFN-α和IL-12产生的降低因而有降低的CD8+T细胞反应的刺激(Beckebaum等，Immunology.109487-95，2003)。
总之，与成功清除感染的个体相比时，持续HBV感染中有功能性HBV特异性CD4+和CD8+细胞的降低。有持续性HBV感染的个体中，当通过对HLA-A2阳性的慢性携带者完整HBV抗原或确定的表位之增殖反应进行评价时，HBV特异性CD8+T细胞反应显著降低(Ferrari等，JImmunol.1453442-9，1990；Maini等，J Exp Med.1911269-80，2000)。特别是，在HBeAg阳性的慢性携带者，当用四聚体(tetramers)测量时，几乎检测不到识别核心表位(在区域c18-27)的特异性CD8+T细胞，并且产生IFN-γ能力的降低。在肝中也发现了HBV特异性CD8+T细胞，这里它们可以造成炎性反应但是在清除HBV感染是无效的(Jung等，Virology.261165-72，1999；Maini等，2000同上)。
宿主病毒关系是动态过程，其中许多病毒(例如HBV)试图使它们的不可见最大化，而宿主试图阻止和清除感染。最初，病毒必须结合并进入靶细胞并且为了复制和感染其它的细胞而迁移到合适的细胞腔室。病毒可以激发感染的细胞以产生抑制一个或多个阶段的病毒复制循环因而限制感染程度的细胞因子(例如TNF-α和IFN-γ)。
宿主单核细胞和巨噬细胞在对病毒的早期反应中有关键的作用，因为它们分泌对感染具有间接和直接作用的促炎性细胞因子，例如IL-1、TNF-α、IL-6、IL-12和IL-18。它们还能够招募单核细胞、天然杀伤(NK)细胞和T细胞行使功能并且它们还能够帮助转换到合适的Th功能以帮助清除病毒。
作为Toll样蛋白样受体(TLR)激活的结果，发生了导致这些促炎性细胞因子产生的对微生物病原体的天然免疫。TLR被鉴定为主要类型的模式识别受体。最近阐明了TLR参与细菌产物例如内毒素和肽聚糖的作用(Akashi等，J Immunol.1643471-3475，2000；Takeuchi等，Immunity，11443-451，1999；Tapping等，J Immunol.1655780-5787，2000)。已经鉴别了超过13个TLR并且它们在许多不同细菌的激活中有重要的作用。最近，这个被延伸到病毒，鼠模型中证实呼吸合胞体病毒(RSV)刺激了TLR-4(Kurt-Jones等，Nat Immunol.1398-401，2000；Haeberle等，J Infect Dis.1861199-1206，2002)。另外，已经显示麻疹病毒(MV)激活TLR-2依赖性信号(Bieback等，JVirol.768729-8736，2002)，并且已经显示双链RNA(许多病毒的核心)通过TLR-3直接介导反应(Matsumoto等，BiochemBiophys Res Commun.2931364-1369，2002)。
TLR的配体对TLR的刺激启动细胞内信号转导途径的复合网络的激活以协调接着发生的炎性反应。这些信号网络的重要组分是衔接(adaptor)蛋白MyD88(及相关蛋白)、一些蛋白激酶(包括IRAK-1、p38 MAP激酶和IкB激酶)、TRAF6和转录因子NF-кB(图7)。NF-кB的激活导致各种促炎性介质(例如TNFα、IL-1、IL-6和MCR-1)的表达(Akira，S.J Biol Chem 278，38105-8；2003；Barton，G.M.&Medzhitov，R.Science300，1524-52003；Beutler，B.等，J LeukocBiol 74，479-85；2003)。TLR3和TLR4也能经由MyD88非依赖性途径传导信号，涉及衔接分子TRIF(对于TLR3和4)和TRAM(对于TLR4)(Lien，E.& Golenbock，D.T.Nat Immunol 4，1162-4，2003)。
经TLR激活而诱导的信号反过来控制特异性免疫反应的激活。有证据证明特异性免疫系统只在病原体被天然免疫系统识别和处理后对病原体产生反应。为了激活的发生，T细胞受体需要共刺激分子，例如CD80和CD86，与肽-MHC复合物一起表达于抗原递呈细胞的表面。这些共刺激分子的表达部分受控于TLR(Pasare，C.& Medzhitov，R.Curr Opin Immunol 15，677-82，2003)。它们在激活B细胞产生类风湿因子也是重要的(Leadbetter，E.A.等Nature416，603-72002)。
调查病原体介导的TLR的下调的作用以及开发通过辅助天然免疫系统抵抗感染的机制是需要的。
发明简述除非上下文另外的需要，本说明书中自始自终，单词“包含”或变体例如“包括”或“含有”将理解为意在包括陈述的元件或整体或者元件或整体组，但不排除任何其它元件或整体或者元件或整体组。
本发明鉴别了细胞表面标记物，通过HBV特异性效应分子的存在或不存在调节它们的表达或活性。有人提出细胞表面标记物参与天然免疫，HBV指导的分子特异性调节这些标记物的水平或活性。所以细胞表面标记物和HBV特异性效应分子是有用的治疗和/或诊断靶点。特别是，本发明鉴别了在HBV特异性抗原存在下Toll样蛋白样受体(TLR)的调节，因而抗原和TLR是HBV感染有用的治疗和诊断标记物并监测治疗试验方案是有用的。在更加特定的实施方案中，HBV特异性效应分子是前核心蛋白，例如细胞内形式P22或P25或其分泌形式例如HBeAg。共同地，这些分子此处称为“HBeAg/P22”。
依据本发明优选的实施方案，鉴别出来TLR尤其是TLR-2和TLR-4在HBV或其突变形式的感染后受肝细胞上或内HBeAg/P22的存在或不存在的差异影响。HBV突变形式包括前核心突变体和/或BCP突变体。前核心蛋白(P22)或其分泌形式(HBeAg)和TLR特别是TLR-2和TLR-4因而是治疗或预防试剂的有用的靶点，包括治疗或帮助预防HBV感染的疫苗。它们也是有用的诊断靶点以确定研究对象是否被HBV感染或已经被HBV感染，或者研究对象是否容易被持续感染或具有持续感染或具有另外的疾病状态，并且能用作临床或流行病管理工具。
特别是，HBV感染导致了TLR的下调，这促进了感染过程。突变HBV例如前核心突变体的感染导致了TLR的上调。
所以本发明提供了能够调节HBV特异性效应分子例如HBeAg/P22和/或TLR例如TLR-2和TLR-4的水平的治疗和/或预防试剂。HBV特异性效应分子包括上调或下调(即调节)TLR例如TLR-2或TLR-4的任何分子。HBV中，例如，效应分子是HBeAg/P22。
本发明还提供了检测HBV感染或疾病状态的存在或对其易感性的方法，所述方法包括确定调节TLR信号传递水平的HBV特异性效应分子的存在或不存在，其中效应分子的存在或不存在或者TLR或TLR信号传递途径内组分的水平的升高或降低是HBV感染或相关疾病状态的存在或对其易感性的指征。
本发明还提供了通过调节TLR水平的HBV特异性效应分子之存在和/或水平，或确定肝细胞上TLR(例如TLR-2和/或TLR-4)的水平，诊断或评价HBV感染的方法。
本发明还提供了通过确定调节TLR信号传递水平的HBV特异性效应分子的存在和/或水平或者确定肝细胞上TLR和信号传递途径组分例如TLR-2和/或TLR-4和NF-кB的水平诊断或评价HBV感染的方法。
所以本发明构思了在HBV或其突变体感染或感染的易感性或持续性或清除的治疗、预防和/或诊断中有用的治疗和诊断试剂以及包含它们的组合物。本发明的这个方面特别延伸到HBV感染的治疗和诊断以及有或没有前核心突变的HBV感染之间的区别。
本发明也提供了治疗感染了HBV或具有疾病状态或对其具有易感性的研究对象的方法，所述方法包括给予所述研究对象有效量的试剂包括疫苗，该试剂下调细胞内或细胞外前核心表达产物的水平或者上调或下调TLR水平。
本发明还提供了监测对治疗的反应以及确定治疗方案的效力的方法。
另外，本发明构思了监测对旨在抗HBV感染或疾病状态发展的治疗试验方案的反应的方法，所述方法包括确定调节TLR信号传递的HBV特异性效应分子的水平或活性，其中效应分子的存在或不存在或者TLR或TLR信号传递途径内组分水平的升高或降低是HBV感染或相关疾病状态的存在或对其易感性的指征。
优选的哺乳动物是人。本发明也构思了动物模型。
附图简述

图1是显示了与前核心突变HBV感染的细胞相比，HBV野生型感染的细胞中TLR-2和TLR-4水平的图解表示。采用了杆状病毒系统。
图2是显示了与前核心突变HBV感染的细胞相比，HBV野生型感染的细胞中TLR-2和TLR-4水平的图解表示。采用100moi杆状病毒系统。
图3是肝细胞上TLR2水平的图解表示。上图脂肪变性实例病人(阴影线)、慢性HBV患者(阴影)和同型对照(虚线)肝活检组织肝细胞TLR2和TLR4的单个细胞悬浮液流式细胞仪柱状图。这个证实了与正常干活检组织个体相比慢性HBV患者肝细胞表面上TLR2的下调。
下图检查了三个HBeAg阳性HBV感染患者、五个HBeAg阴性HBV感染患者和五个脂肪变性对照(C)的外周血和肝活检组织。分析外周血(血液)CD14阳性单核细胞上的TLR2和TLR4。肝活检组织分离成为单个细胞悬浮液并且在流式细胞仪上运行。然后选择枯否细胞和肝细胞并测量TLR2和TLR4。几何平均荧光表达为与同型对照抗体的几何平均荧光的比例。数据表示为TLR的改变％。显示了各个试验的平均值和标准差。星号指出与对照相比p值＜0.05。
图4是TLR2、TLR4和TNF-α水平改变的图解表示。肝素化全血用各种剂量HBV病毒刺激20个小时，测量CD14阳性单核细胞上TLR2水平(B)和TLR4(A)。几何平均荧光表达为与同型对照抗体的几何平均荧光相比的比例。数据表示为TLR的改变％。图(C)代表如ELISA测量的上清中的TNF-α。显示了不同供者5个单独实验的平均值和标准差。TLR2的结果是显著的，有p＜0.02，如TNF结果有p＜0.02。
图5是TLR水平和TNF-α水平的改变的图解表示。肝素化全血用培养基(C)、野生型1×107个HBV病毒颗粒(WT)、肝炎B表面抗原(sAg)、HBV前核心蛋白(PC)和HBV核心蛋白(Co)刺激20个小时。测量CD14阳性单核细胞上TLR2和TLR4水平(上图)。几何平均荧光表达为与同型对照抗体的几何平均荧光的比例。下图代表如上证明的对于刺激的ELISA所测量的上清中的TNF-α。另外，证明了两个不同基因型的HBV(A和D)。数据表示为TLR的改变％。显示了不同供者5个单独试验的平均值和标准差。星号指出与对照相比p值＜0.05。
图6是显示了TLR和TNF水平改变的图解表示。流式细胞仪上运行假感染(M)、前核心(PC)和核心(C)杆状病毒构建体的HepG2细胞并测量TLR2和TLR4。几何平均荧光表达为与同型对照抗体的几何平均荧光的比例(上图)。数据呈现为TLR的改变％。下图代表进行TaqMan即时PCR(QPCR)的相同细胞。这个在384孔平板上使用Assays-On-Demand基因表达产物(Applied Biosystems)和ABI Prism7900HT序列检测仪(Applied Biosystems)进行。使用比较Ct法确定PCR产物的相对量，这里靶DNA的量用18s标准化并是相对于假cDNA(2-ΔΔCT)。如前所述，通过定向诱变和共转染使用1.3基因组长度的野生型(WT)HBV模板(基因型D，亚型ayw)(Invitrogen，Stratagene，CA)产生重组HBV杆状病毒构建体。平行地用每个细胞50个空斑形成单位(PFU)的复合感染(MOI)的WT、PC、BCP和PC/BCP重组HBV杆状病毒转导HepG2细胞。染色进行流式细胞仪分析前，使用无胎牛血清的MEM制成单个悬浮细胞。数据代表三个实验的平均值和标准差。星号指出如非参数Mann Whitney-U测试所确定地与对照相比p值＜0.05。
图7是TLR信号传递途径的图解表示。
优选实施方案详述本发明部分取决于如下的确定，即产生前核心蛋白或其分泌形式(例如HBeAg)的HBV的感染导致肝细胞(包括肝细胞和枯否细胞)和PBMC(包括外周单核细胞)中TLR-2和TLR-4水平的降低，而携带前核心突变和/或BCP突变的HBV的感染导致TLR-2和TLR-4的上调，并且也可以调节TLR信号传递。通过HBV特异性效应分子、前核心蛋白或其分泌形式例如HBeAg确定TLR-2和TLR-4水平的调节。前核心蛋白或其分泌形式例如HBeAg的存在、不存在或水平或者TLR-2和TLR-4的水平和/或前核心蛋白或其分泌形式例如HBeAg的功能或活性提供了HBV感染或者造成感染或对HBV感染的易感性或其持续性的HBV的类型的诊断指征。另外，前核心蛋白或其分泌形式例如HBeAg、TLR-2和TLR-4成了包括疫苗的试剂的治疗靶点，所述试剂调节前核心蛋白或其分泌形式例如HBeAg或TLR-2和/或TLR-4水平或TLR信号传递途径组分。
前核心蛋白或其分泌形式例如HBeAg此后称为“前核心蛋白/HBeAg”。本发明延伸到携带了前核心突变例如截断、点突变或无效突变的HBV变异体以及有下调HBV前核心基因转录的BCP突变的HBV变异体。
所以，本发明提供了调节前核心蛋白/HBeAg和/或TLR尤其是TLR-2和/或TLR-4的水平或者TLR信号传递途径组分的试剂，确定前核心蛋白/HBeAg和/或TLR-2和/或TLR-4和/或TLR信号传递途径组分的水平的诊断试剂，以及治疗和/或预防感染的方法包括HBV感染的疫苗的开发。
本发明还构思了监测对治疗试验方案的反应的方法以及确定治疗方案效力的方法。特别是，本发明提供了动物例如哺乳动物特别是人的感染和其它疾病状态发展的临床或流行病学管理工具。
本发明还允许有产生前核心蛋白/HBeAg的HBV或不基于TLR水平或TLR信号传递途径组分的病毒(即，前核心和/或BCP突变体)的感染之间的区别。
相应地，本发明的一个方面构思了检测HBV感染或疾病状态或对其易感性的存在的方法，所述方法包括确定调节TLR水平或活性的HBV特异性效应分子的存在或不存在或者确定TLR或其同源物的水平或活性，其中效应分子的存在或不存在或者TLR或其同源物水平的升高或降低是HBV感染或相关疾病状态存在或对其易感性的指征。
特别是，本发明提供了检测HBV感染或疾病状态或对其易感性的存在的方法，所述方法包括确定调节TLR信号传递水平的HBV特异性效应分子的存在或不存在，其中效应分子的存在或不存在或者TLR或TLR信号传递途径内组分水平的升高或降低是HBV感染或相关疾病状态的存在或对其易感性的指征。
另外，本发明的另一个方面构思了检测HBV感染或疾病状态或对其易感性的存在的方法，所述方法包括确定调节TLR水平或活性的HBV特异性效应分子的存在或不存在或者确定TLR或其同源物或TLR信号传递途径的组分的水平或活性，其中效应分子的存在或不存在或者TLR或其同源物或TLR信号传递途径组分水平的升高或降低是HBV感染或相关疾病状态存在或对其易感性的指征。
本发明的另一个实施方案提供了监测针对抗HBV感染或疾病状态发展的治疗试验方案的反应的方法，所述方法包括确定HBV特异性效应分子的水平或活性或者TLR或其同源物的水平或活性，其中效应分子的存在或不存在或者TLR或其同源物水平的升高或降低、TLR信号传递途径组分是HBV感染或相关疾病状态存在或对其易感性的指征。
本发明另一方面还涉及治疗感染HBV或具有疾病状态或对其具有易感性的研究对象的方法，所述方法包括给予所述研究对象有效量的试剂包括疫苗，所述试剂下调前核心蛋白/HBeAg或者上调或下调TLR或信号途径组分的水平。
详细描述本发明之前，将理解除非另外指出地，本发明不限于组分的特异性制剂、生产方法、给药方案等等，因为这些可以不同。也将理解此处使用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，而不是意在限制。
必须注意如本详述中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述的”包括复数方面，除非上下文另外清楚地指出。因而，例如提到的“化合物”包括单个化合物以及两个或多个化合物，提到的“活性剂”包括单个活性剂以及两个或多个活性剂等等。
在描述和要求保护的本发明中，使用与下面设置的定义一致的如下的术语。
此处交叉使用术语“化合物”、“活性剂”、“药理活性剂”、“药剂”、“活性物(active)”和“药物”，指的是诱导期望药理和/或生理作用的化学化合物。术语也包含此处特别提到的那些活性剂的药物可接受和药理活性成分，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、类似物等等。当使用术语“化合物”、“活性剂”、“药理活性剂”、“药剂”、“活性物”和“药物”时，将理解这包括活性剂本身以及药物可接受的药理活性盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等等。术语“化合物”不仅仅解释为化学化合物，还延伸到肽、多肽和蛋白质以及遗传分子例如RNA、DNA和其化学类似物。提到的“肽”、“多肽”或“蛋白质”包括有多糖或脂多糖组分的分子。术语“拮抗剂”是下调前核心蛋白/HBeAg或其它病原体特异性效应分子的水平或者下调TLR的化合物、活性剂、药理活性剂、药剂、活性物和药物的实例。“激动剂”或“增强剂”上调前核心蛋白/HBeAg或TLR例如TLR-2或TLR-4的水平。
本发明延伸到疫苗以及化合物或试剂的组合，例如TLR-2和/或4的激动剂或拮抗剂和核苷类似物或抗前核心/HBeAg抗体，或者抗病毒细胞因子(例如，IFN-∝、IFN-γ、IL-2、TNF-∝)或其它免疫调节剂。
所以本发明构思了用于调节前核心蛋白/HBeAg或TLR例如TLR-2和/或TLR-4的水平或者增强一般或特异性TLR信号传递的化合物。化合物对于降低或预防或治疗HBV感染或治疗另一个疾病状态有作用。携带要调节的TLR的优选细胞包括肝脏细胞。肝脏细胞包括肝细胞。提到的“化合物”、“活性剂”、“药理活性剂”、“药剂”、“活性物”和“药物”包括两个或多个活性物的组合，例如前核心蛋白/HBeAg的拮抗剂或TLR或TLR信号传递的激动剂或增强子。“组合”也包括多个部分，例如两个部分的药物组合物，这里试剂分别提供，分别给予或分发或者分发前混合到一起。
例如，多部分药物包装可以具有前核心蛋白/HBeAg或TLR的调节剂以及一个或多个抗微生物或抗病毒的试剂。使用术语“调节”或其衍变物例如“调控”或“调整”描述上调或下调。
如此处使用的术语“有效量”和“治疗有效量”的试剂指提供期望的治疗或生理作用的足够量的试剂。另外，“有效调节HBeAg或调解TLR的量”的试剂是足够量的试剂直接或间接上调或下调前核心蛋白/HBeAg的功能或者上调或下调特异性TLR例如TLR-2或TLR-4或者增强TLR信号传递。这个可以通过例如起前核心蛋白/HBeAg拮抗剂或TLR或其信号组分的激动剂(即增强子)作用的试剂来完成，例如本身是或模仿LTR信号途径组分的试剂，或者通过经由其它细胞受体诱导TLR信号传递途径的试剂或者拮抗TLR信号传递组分的抑制剂的试剂来完成。非期望的作用例如副作用有时和期望的治疗作用一起呈现；因而，执业医生权衡可能的利益和可能的危险决定什么是合适的“有效量”。所需的确切量将随着研究对象不同而不同，依赖于物种、研究对象的年龄和一般状态、给药模式等等。因而，明确确切的“有效量”是不可能的。然而，任何个体情况下合适的“有效量”可由本领域一般技术人员只是用常规试验确定。
“药物可接受的”载体、赋形剂或稀释剂指的是药物载体，包含不是生物学上或其它非期望的材料，即材料可以和所选的活性剂一起给予研究对象而不造成任何或基本副反应。载体包括赋形剂和其它添加剂例如稀释剂、去污剂、染色剂、湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等等。药物组合物根据制剂也可描述为疫苗组合物。
相似地，如此处提供的“药物可接受的”盐、酯、酰胺、前药或化合物的衍生物是非生物学上或其它非期望的盐、酯、酰胺、前药或衍生物。
如此处使用的术语“治疗的”和“治疗”指的是感染或疾病的症状的严重程度和/或频率、症状和/或潜在原因的消除、感染症状和/或它们的潜在原因发生的预防以及损伤的改善或纠正。间接损伤例如在病毒感染之后可以是肝损伤例如肝硬化或肝脏的肝细胞癌。
“治疗”患者涉及通过抑制感染或其它疾病状态或下游状态例如肝损伤或癌症对易感个体感染或其它疾病状态或不良生理事件的预防以及有临床症状的个体的治疗。一般地，这样的状态或紊乱是感染，更加特别的是病毒感染，甚至更加特别的是HBV的感染。因而，例如，“治疗”有感染或对容易发展感染的患者的主题方法包括感染或其它疾病状态的预防以及一旦确立感染或其它疾病状态的治疗。
提到的“HBV”或其全名“乙型肝炎病毒”包括所有的变异体，包括对特定治疗试剂例如核苷类似物或免疫试剂耐受的变异体。特别重要的变异体是HBV的前核心和/或BCP突变体。
如此处使用的“患者”指的是能从药物制剂和本发明的方法受益的动物，优选地是哺乳动物，更加优选的是人。对于能从目前描述的药物制剂和方法受益的动物类型没有限制。不管是人或非人的动物患者可以称为个体、研究对象、动物、宿主或接受者。本发明的化合物和方法可以应用于人医学、兽医学以及一般的家畜或野生动物的饲养。
本发明的化合物可以是大或小分子、核酸分子(包括反义或正义分子)、肽、多肽或蛋白质或杂交分子例如RNAi或siRNA复合物(包括RISC复合物和Dicer复合物)、核酶或DNAzyme。化合物需要修饰使得进入细胞更容易。如果化合物与细胞外受体相互作用那么这个修饰不是必需的。试剂的实例包括与前核心蛋白/HBeAg或TLR或调节前核心表达的遗传分子相互作用的化学试剂以及抗体。
如上面指出地，优选的动物是人。
实验室测试动物(包括动物模型)的实例包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠。兔和啮齿类动物例如大鼠和小鼠提供了方便的测试系统或动物模型。家畜类动物包括绵羊、牛、猪、山羊、马和驴。也构思了非哺乳动物动物例如鸟类(例如鸭)、斑马鱼、两栖动物(包括甘蔗蟾蜍)和果蝇类例如黑素原果蝇(Drosophila melanogaster)。
所以本发明提供了调节(例如激动或拮抗)前核心蛋白/HBeAg或调节(即增强或激活或拮抗)TLR例如TLR-2和/或TLR-4的试剂。
本发明构思了筛选如下试剂的方法，包括例如候选药物与前核心蛋白/HBeAg或TLR例如TLR-2或TLR-4或其部分接触。前核心蛋白/HBeAg或TLR分子此处称为是“靶”或“靶分子”。筛选步骤包括分析(i)药物和靶点之间复合物的存在，或(ii)编码靶点的核酸分子的表达水平的改变。一种形式的试验涉及竞争结合试验。这样的竞争结合试验中，靶点一般是标记的。游离的靶点从任何推测的复合物中分离，游离(即未复合的)标记物的量是受试试剂与靶分子结合的测量指标。也可以测量结合而不是游离靶点的量。标记化合物而不是靶点并且测量化合物在受试药物存在和不存在下与靶点结合的量也是可能的。这样的化合物可以抑制对于例如发现前核心蛋白/HBeAg的调节剂或HBV感染的治疗或预防所需的TLR的调节剂是有用的靶点。
药物筛选的另一个技术提供了对靶点具有合适的结合亲和力并且在Geysen(国际专利
发明者S·卢卡尼尼, K·维斯瓦纳坦 申请人:墨尔本保健公司, 默多克儿童研究所