专利名称：定量测定重组人内皮抑素体外活性的方法
技术领域：
本发明属于基因工程生物制品领域，涉及一种利用基因工程方法生产出的高活性可溶重组人内皮抑素(Endostatin)的体外活性的定量测定方法，以及这种方法在依赖血管生成疾病的抗血管生成治疗中的应用。本发明术语涉及重组人内皮抑素蛋白、重组人内皮抑素蛋白活性片段和PEG化长效重组人内皮抑素及活性片段。
背景技术：
人内皮抑素重组蛋白可从大肠杆菌表达系统，酵母表达系统、昆虫表达系统、真核细胞表达系统及病毒表达系统生产纯化得到。不同途径产生的或不同制备方法产生的重组人内皮抑素活性往往不相同。大肠杆菌表达系统产生的重组人内皮抑素是99％不溶性蛋白，需经复性处理使之可溶。由于制备工艺及来源不同，重组人内皮抑素蛋白有的报道有高活性，有的报道活性低，有的报道则无活性，有时体外表现有活性，体内则又无活性或低活性。所以工业化制备重组人内皮抑素蛋白用于广泛抗血管生成临床治疗中，必需解决该产品体内外定量活性测定方法，以保证获得高活性可溶的重组人内皮抑素蛋白使之在临床上显示较好的疗效。但目前国内外对血管生成抑制类药物和生物学活性测定方法尚未得到很好的解决，已有的测定方法采用bFGF或VEGF刺激的体外内皮细胞迁移试验可以获得体外定量生物学活性，但试验结果的重复性较差，操作较难控制，方法误差大到50％-250％，这主要是所用内皮细胞需先用bFGF或VEGF刺激后再进行抑制迁移试验，这种方法误差较大。采用内皮细胞增殖抑制试验同样也需要采用bFGF或VEGF刺激内皮细胞后再进行内皮细胞增殖抑制试验，所用内皮细胞培养重复性差，bFGF或VEGF本身的活性刺激效果重复等同性也差，实验敏感性差，所以往往缺乏重现性，使得体外活性测量误差较大，重现性差，难以反映重组人内皮抑素的真正的活性水平和应用效果。
发明内容
本发明是提供一种定量测定重组人内皮抑素体外活性的方法，为工业化规模生产重组人内皮抑素产品服务，确保产品活性稳定，使其在临床使用中安全有效、质量可定量控制，从而有效推动重组人内皮抑素在抗血管生成疾病治疗中的临床广泛应用。
为实现本发明的目的，定量测定重组人内皮抑素体外活性的方法，其特征在于测定过程中所用的血管内皮细胞是转导了血管内皮细胞生长因子VEGF基因或/和碱性成纤维细胞生长因子bFGF基因的血管内皮细胞。
进一步地，上述定量测定重组人内皮抑素体外活性的方法中，所述血管内皮细胞转导了稳定表达的VEGF基因或bFGF基因，或者是同时转导了VEGF和bFGF基因，这种血管内皮细胞包括牛毛细血管内皮细胞(BCE)、牛主动脉内皮细胞(C-PAE)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人肺微血管内皮细胞(HMVE-L)、人皮肤微血管内皮细胞及其它人血管内皮细胞如HHEC、ECV304细胞等，所述重组人内皮抑素，它们取自大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、真核细胞和病毒中生产的重组蛋白及活性片段和PEG化长效重组人内皮抑素及活性片段，通过基因工程方法制备。
本发明突出的实质性特点和显著的进步主要体现在试验中所用的内皮细胞不加入bFGF或VEGF刺激，直接用导入bFGF或/和VEGF基因的血管内皮细胞加入待测样品计算出定量活性单位，用这些血管内皮细胞可连续传代培养，不需要外加VEGF或/和bFGF刺激，因而在重组人内皮抑素蛋白、重组人内皮抑素蛋白活性片段和PEG化长效重组人内皮抑素及活性片段的体外血管内皮细胞增殖抑制、内皮细胞迁移抑制和血管形成抑制等方面，具有很好的定量测定效果。这种体外活性测量方法操作简便，所用血管内皮细胞可连续传代稳定，测量误差小，结果重现性好，可应用于工业化生产和临床抗血管生成治疗。
图1重组人内皮抑素体外增殖抑制试验(计数法)；图2重组人内皮抑素体外活性测定(MTT法)；图3重组人内皮抑素体外活性测定(LDH法)。
具体实施例方式
本发明涉及不同来源不同制备方法所获得的重组人内皮抑素蛋白、重组人内皮抑素蛋白活性片段和PEG化长效重组人内皮抑素及活性片段活性不相同，有的甚至没有活性，有的出现体外有活性体内无活性的问题。体外活性测定中所用内皮细胞有的不能连续传代培养，有的仅能传代有限的十几次，细胞来源较困难。有的血管内皮细胞体外对VEGF、bFGF刺激不敏感或对内皮抑素作用不敏感。体外活性测定中所用的VEGF、bFGF本身活性也有差异性和对内皮细胞刺激作用的不稳定性，使检测结果经常误差大和检测结果重现性差。因此建立重组内皮抑素稳定的体外定量活性测定方法对于促进该品种的工业化大规模生产及临床的广泛应用将是十分重要的。
本发明的技术方案和技术路线是采用真核表达基因载体pcDNA3.0或逆转录病毒载体pLNCX，将人VEGF165基因或人bFGF基因分别连接到这二个载体上，由于将基因连接到pcDNA3.0或pLNCX载体上进行基因克隆和筛选，这是公众知晓的通用技术，故描述从略。将携带VEGF165或bFGF基因的pcDNA3.0质粒通过常规的真核细胞脂质体转染血管内皮细胞，通常采用一种内皮细胞转染一种基因质粒，本申请也尝试同时转导了VEGF和bFGF双基因，但由于筛选抗性相同，难以区分二种基因的转染效率，可通过含不同抗性的载体携带二种不同基因进行转染细胞后筛选阳性克隆以解决二种基因同时转染同一细胞的技术难题。用逆转录病毒构建VEGF或bFGF基因时前面加入了一段白蛋白信号肽，构建完采用包装细胞PA317进行生产阳性病毒颗粒，通过在内皮细胞培养液中加入制备的病毒液转染内皮细胞，通过G418筛选得到阳性细胞克隆。
所采用的血管内皮细胞一般采用人脐静脉内皮细胞作为试验对象，并用人的其它血管内皮细胞如人肺微血管内皮细胞、人皮肤微血管内皮细胞等作验证。转入的人VEGF基因和/或人bFGF基因的血管内皮细胞，不管是采用质粒转染还是病毒转染，通过阳性细胞生长速度、传代次数、稳定性比较，确定采用一种血管内皮细胞作为重组人内皮抑素蛋白体外活性测定方法，通过比较不同转染方法转入不同基因的不同血管内皮细胞，最后本申请选定采用质粒一脂质体转染VEGF基因的人脐静脉内皮细胞作为体外活性的定量测定方法，但也不排除其余转染方法如逆转录病毒转染方法转导bFGF或/和VEGF基因的其它血管内皮细胞。
转染VEGF基因的人脐静脉内皮细胞传代较稳定，生长速度明显比未转染VEGF基因的内皮细胞快，体外测定活性时不需要再外加入VEGF或bFGF刺激，所用细胞系一致，直接加入不同稀释浓度(0.1-2μg/ml)的重组人内皮抑素培养48-72小时则可通过计数法、MTT法或LDH法获得不同的内皮细胞增殖数，与空白对照组进行比较，按下式可求出重组内皮抑素在各个剂量组下对血管内皮细胞的增殖抑制率。
细胞增殖率(％)＝(空白对照组细胞数或MTT、LDH的OD值-加药组细胞数或MTT、LDH的OD值)/空白对照组细胞数或MTT、LDH的OD值×100以各稀释度下内皮细胞增殖抑制率占最大抑制率的百分比为纵坐标，重组内皮抑素稀释倍数的对数为横坐标作图并进行直线回归，根据回归方程求出当内皮细胞增殖抑制率为最大抑制率的50％时的样品稀释倍数中的所含内皮抑素的量，这可定义为以该活性检测系统中可诱导产生50％最大细胞增殖抑制率的样品所含内皮抑素的量定义为一个活性单位(1Unit)。并可根据加样量和样品的蛋白浓度求出比活性。
由于转导人VEGF基因后内皮细胞增殖速度较快，细胞增殖抑制定量检测中细胞计数比较麻烦，MTT法敏感性又不太高，本申请曾试用LDL取代MTT法，其敏感性较MTT法稍高。而采用内皮细胞迁移法测定比内皮细胞增殖抑制法细胞计数简单些，并且重组人内皮抑素对抑制内皮细胞迁移的效果比抑制内皮细胞增殖效果更明显。同理采用转导VEGF基因的人脐静脉内皮细胞，培养时无须再加入bFGF或VEGF刺激，仅需在迁移板上槽中每孔加入不同稀释度的重组人内皮抑素，培养24h-48h后计数迁移的内皮细胞数，与空白对照组比较，按下式求出内皮抑素在各个剂量组下对内皮细胞的迁移抑制率。
迁移抑制率(％)＝(空白对照组迁移细胞数-加药组迁移细胞数)/空白对照组迁移细胞数×100以各稀释度下的迁移抑制率占最大抑制率的百分比为纵坐标，内皮抑素稀释倍数的对数为横坐标作图并进行直线回归，根据回归方程求出当迁移率为最大抑制率的50％样品稀释倍数时样品中所含内皮抑素的量，可定义为能诱导50％最大抑制率的样品中所含重组内皮抑素的量定义为一个活性单位(1Unit)，并根据加样量和样品的蛋白浓度求出比活性。无论是内皮细胞增殖抑制还是内皮细胞迁移试验求出活性单位是通用技术，已有广泛的公开报道，本发明改进之处是，试验中所用的内皮细胞不加入bFGF或VEGF刺激，直接用导入bFGF或/和VEGF基因的血管内皮细胞加入待测样品计算出定量活性单位，使这种体外测量方法操作简便，所用测定细胞可连续传代稳定，测量误差小，结果重现性好。
下面通过具体实施例进一步阐明本发明的内容，但这些实施例并不限制本发明的保护范围。
实施例1用VEGF基因或bFGF基因转染血管内皮细胞血管内皮细胞种类很多，本实施例以人脐静脉血管内皮细胞为例，在无菌条件下取新生儿脐带，放入含有青霉素-链霉素(105U/ml)的脐带保存液(含NaCl 140mmol/L，KCl 4mmol/L，Na2HPO45.2mmol/L，KH2PO41.5mmol/L，葡萄糖110mmol/L)中，用含双抗的PBS反复灌注冲洗脐静脉，用Hanks液配制的II型胶原酶灌注作用20min，用培养液冲洗经消化后的脐静脉，收集冲洗后含内皮细胞的培养液进行离心，加入含20％FBS、2ng/ml bFGF，1％BSA，90μg/ml肝素钠和100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640完全培养基进行培养。培养的内皮细胞经常规鉴定后，进行转导VEGF或bFGF实验。
先以含pcDNA3.0-VEGF 165质粒转导为例，对人脐静脉内皮细胞进行转染实验。取60mm细胞培养板，接种4ml 1×105个内皮细胞培养液，37℃ 5％ CO2孵箱中培养18小时，取4μg pcDNA3.0-VEGF 165质粒DNA于500μl OPTI-MEM液中混匀，取20μl Lipofectamine 2000加入到480μl OPTI-MEM液中混匀5分，然后两液混合30分后加入到用不含血清培养液漂洗过的内皮细胞中，37℃ 5％ CO2培养4小时，加入4ml含20％FBS的培养液继续培养72小时，转染VEGF基因的人脐静脉内皮细胞用含200μg/L G418的培养基筛选1周，筛选出阳性克隆后挑选克隆扩大培养，再用含G418 400mg/L的培养基筛选3天，换正常培养基培养则为转人VEGF基因的人脐静脉内皮细胞，经鉴定后保存备用。转导人bFGF基因的方法同上，用VEGF基因或/和bFGF基因转导其它血管内皮细胞的方法同上。用上述方法进行保存的内皮细胞一般可在传代30代以内使用，而文献报道采用逆转录病毒hTERT导入新生儿脐静脉内皮细胞(hUVEC)可经嘌呤霉素长期筛选；使其稳定表达并获端粒酶重建，最终获得传代40代以上永生化人静脉内皮细胞。但本申请需要的是导入VEGF或bFGF基因的hUVEC，使活性测定实验中不再外加VEGF或bFGF刺激，以减小测量误差，并反映出内皮抑素拮抗VEGF或bFGF的活性。因此，本申请采用逆转录病毒介导人VEGF基因或bFGF基因转染hUVEC。以逆转录病毒载体pLNC接上人VEGF 165基因转导为例，在人VEGF 165基因前面携带白蛋白信号肽基因序列，用20μlLipofectamnine 2000脂质体和8μg pLNC-VEGF质粒转染包装细胞PA317，转染方法同上，用G418筛选阳性克隆，挑选阳性克隆扩大培养，并收集病毒上清，细胞株冻存备用。将病毒上清液加入到上述培养的人脐静脉内皮细胞中，孵育3小时后加入培养液，并加入polybrene至终浓度2μg/ml，G418 500μg/ml，孵育2周后出现抗性克隆，4周后挑选克隆扩大培养，常规鉴定后冻存备用。
实施例2转染VEGF基因或bFGF基因的内皮细胞增殖抑制体外活性测定以转VEGF基因的hUVEC为例，用96孔细胞培养板上按1×104个细胞接种，10％FBS的RPMI-1640完全培养基37℃ 5％ CO2培养24h，重组人内皮抑素按不同稀释倍数加入，共设8个稀释梯度，每个梯度设三个复孔，空白对照组加入等体积样品溶剂，培养72小时，细胞用0.5ml 0.05％胰蛋白酶消化后显微镜下计数，见图1，然后直接用MTT法或LDH法在酶标仪上测量，分别见图2和图3。其中用MTT法时，在96孔细胞培养板每孔加入10μl MTT液37℃温育4小时，再加入20％SDS 100μl，振荡10分，在酶标仪上用波长570nm处比色测量，将各剂量组与对照组的OD值进行比较，按下式求出各稀释度下的抑制率内皮细胞增殖抑制率(％)＝(空白对照组的细胞数-加药组的细胞数)/空白对照组细胞数×100以各稀释度下的细胞增殖抑制率占最大抑制率的百分比为纵坐标，重组人内皮抑素稀释倍数的对数为横坐标作图并进行直线回归，根据回归方程求出细胞增殖抑制率为最大抑制率的50％时的样品稀释倍数。并定义为能诱导50％最大抑制率的样品中所含重组内皮抑素的量定义为一个活性单位，并可根据加样量和样品的蛋白浓度求出比活性。该测定方法为常规测定方法，本发明不同之处仅为所用细胞不同和实验中不加入刺激因子VEGF或bFGF，使实验操作简便和减少实验误差。
实施例3转染VEGF基因或bFGF基因的内皮细胞迁移抑制体外活性测定以转导VEGF基因的hUVEC为例，用含10％FBS的RPMI-1640培养液37℃ 5％ CO2培养细胞，胰蛋白酶消化培养细胞后配成1.8×105个/ml细胞悬液，在内皮细胞迁移板的上下层槽中加入同种培养液，37℃ 5％ CO2培养箱中孵育1h以上，将样品用自身缓冲液进行倍比稀释至8个稀释梯度，每个梯度设两个复孔，迁移板上槽中每孔加入10μl不同稀释度的重组内皮抑素，对照组加入样品本身缓冲液，再加入90μl细胞悬液，下槽加入540μl上述培养液和60μl同稀释度的待测样品。迁移板经37℃ 5％ CO2孵育24-48小时后将迁移膜经70％乙醇固定后用伊江染色，显微镜下计数迁移的内皮细胞，按下式计算迁移抑制率内皮细胞迁移抑制率(％)＝(空白对照组迁移细胞数-加药组迁移细胞数/空白对照组迁移细胞数×100以各稀释度下的内皮细胞迁移抑制率占最大抑制率的百分比为纵坐标，内皮抑素稀释倍数的对数为横坐标作图并进行直线回归，根据回归方程求出当迁移抑制率为最大抑制率的50％时的样品稀释倍数。以能诱导50％最大抑制率的样品中所含重组内皮抑素的量定义为一个活性单位，并根据加样量和样品的蛋白浓度求出比活性。本方法为常规检定方法，所以不详细叙述。本发明不同之处是所用细胞不同，并且不需要另外加入刺激因子VEGF或bFGF，使实验操作简便，减少实验误差。
权利要求
1.定量测定重组人内皮抑素体外活性的方法，其特征在于测定过程中所用的血管内皮细胞是转导了血管内皮细胞生长因子VEGF基因或/和碱性成纤维细胞生长因子bFGF基因的血管内皮细胞。
2.根据权利要求1所述的定量测定重组人内皮抑素体外活性的方法，其特征在于所述血管内皮细胞是牛毛细血管内皮细胞BCE、牛主动脉内皮细胞C-PAE、人脐静脉内皮细胞HUVEC、人肺微血管内皮细胞HMVE-L、人皮肤微血管内皮细胞或者人血管内皮细胞HHEC、ECV304。
3.根据权利要求1或2所述的定量测定重组人内皮抑素体外活性的方法，其特征在于所述重组人内皮抑素包括，重组人内皮抑素蛋白、重组人内皮抑素蛋白活性片段和PEG化长效重组人内皮抑素及活性片段。
4.根据权利要求3所述的定量测定重组人内皮抑素体外活性的方法，其特征在于所述重组人内皮抑素取自大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、真核细胞或病毒，通过基因工程方法制备。
全文摘要
本发明涉及一种利用基因工程方法生产出的高活性可溶重组人内皮抑素(Endostatin)的体外活性的定量测定方法，其主要特征在于试验中所用的内皮细胞不加入bFGF或VEGF刺激，直接用导入bFGF或/和VEGF基因的血管内皮细胞加入待测样品计算出定量活性单位。该方法操作简便，不需要外加VEGF或/和bFGF刺激，所用血管内皮细胞连续传代稳定，测量误差小，结果重现性好，在重组人内皮抑素蛋白、重组人内皮抑素蛋白活性片段和PEG化长效重组人内皮抑素及活性片段的体外血管内皮细胞增殖抑制、内皮细胞迁移抑制和血管形成抑制等方面，具有很好的定量测定效果，可应用于工业化生产和临床抗血管生成治疗。
文档编号C12N15/09GK101045941SQ20061003924
公开日2007年10月3日 申请日期2006年3月31日 优先权日2006年3月31日
发明者徐根兴, 朱浩文, 徐家明, 荣志刚, 赵延发, 钟慎政 申请人:江苏省基因药物工程技术研究中心