专利名称：一种水中藻类定量检测的新方法
技术领域：
本发明属于环境工程水质监测领域，特别适用于杀藻前后水体中的藻类含量的检测。
背景技术：
近年来水体中氮磷等营养物质增加，加速了湖泊水库的富营养化进程，导致气候适宜时藻类的大量繁殖，给湖泊水库为水源的饮用水生产带来诸多危害。因此，饮用水中藻类含量的检测，直接关系到人们饮水安全健康。但目前尚未有统一的藻类定量分析方法，所采用的藻类定量检测方法有以下几种直接镜检法—血球计数板法、浊度法、DO法、藻体COD法、叶绿素a(Chla)法等，但是，目前所采用的几种藻类定量检测方法步骤繁琐、结果较为粗糙。因此，需要有一种最快速、稳定、实用的测定水中活体藻类含量的方法。
脱氢酶活性检测作为一个反映微生物活性的指标，被广泛应用各个领域。但将脱氢酶活性的测定法引入藻类的定量检测中，国内外还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提出一种利用脱氢酶活性检测水体中活体藻类含量的新方法，提高水藻的监测效率和检测精度。
本发明提出的一种水中藻类定量检测的新方法，主要关键技术在将脱氢酶活性检测技术应用到水体中藻类含量监测。脱氢酶是生物体生命活动中必不可少的物质，因此脱氢酶活性测定法是一种应用广泛的检测方法，利用脱氢酶活性检测具有灵敏、快速、简便的特点，能够反映活体微生物活性的特性。而本发明将脱氢酶活性检测法进行了优化，使其更适合检测藻类。
本发明的检测方法主要步骤如下首先，配制不同浓度的TTC溶液，以80g/LNa2S为还原剂，制作在492nm波长处的标准曲线。
然后，取一定体积的待测水样抽滤，滤膜脱湿后置于离心管中。加放TTC溶液在32±1℃恒温水浴并加入加Tris-HCl缓冲溶液使pH保持在8.4，暗处发色培养。取出后，加甲醛终止反应，并加入石油醚和丙酮萃取。在492nm处测定有机相的吸光度，并标准曲线上查得TF生成量。
最后，计算脱氢酶活性，以脱氢酶活性值作为水中活体藻浓度的标度。
本发明工艺的特点本发明为一种水中藻类定量检测的新方法，在含藻类的水样中加入作为指示剂的人工受氢体，水中的有机质在脱氢酶的作用下，发生脱氢反应，人工受氢体接受氢原子被还原而显色或褪色，从而使溶液反应前后颜色深度发生变化。从颜色变化的程度推算出水体中脱氢酶活性值，以此作的衡量藻类浓度的度量。
优化后的脱氢酶活性检测法在检测水体中活体藻含量时较目前常用方法简单快速、经济廉价而且准确可行。
具体实施例方式
下面给出本发明的一个检测实例取50mL水样，按下述方法反复检测7次得到7个TTC-脱氢酶活性值1.标准曲线的制作(1)配制不同浓度的TTC溶液从1g/L的标准TTC溶液中分别吸取1，2，3，4，5，6mL分别注入容量为50mL的一组容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，即为工作液。各瓶中的TTC浓度分别为20，40，60，80，100，120mg/L。
(2)向6只具塞离心管中分别加入1mL上述系列溶液，再向每只离心管中加入2mL Tris～HCl缓冲液和2mL的蒸馏水；对照管加2mL Tris～HCl缓冲液和3mL蒸馏水，不加TTC溶液；所得每只离心管中的TTC分别为0，20，40，60，80，100，120μg。
(3)向各管加入1mL新配的80g/L Na2S，混合摇匀，置于32±l℃恒温水浴中发色20min。
(4)反应完全后，各管分别加入6mL石油醚和3mL丙酮，置于摇床，在32℃条件下，振摇5分钟以抽提TF。
(5)以滴管吸取上清液加入比色皿。在756分光光度计上以对照管为参比，492nm处比色。
2.TF生成量的测定(1)取一定体积待测水样抽滤。
(2)待滤膜脱湿后，将其置于离心管中，水样管中加2mL Tris-HCl缓冲液、2mL的蒸馏水和1mL TTC(8g/L)，对照管中加2mL Tris～HCl缓冲液和3mL蒸馏水。
(3)对照管中加1mL甲醛，将两管迅速置于32±1℃恒温水浴，暗处发色培养。
(4)1h后取出，向水样管中加1mL甲醛终止反应。
(5)向两管中加入6mL石油醚和3mL丙酮，置于摇床，在32℃条件下，振摇5分钟以抽提TF。
(6)静止数分钟，以滴管吸取离心管上清液加入比色皿。在756分光光度计上，以对照管为参比492nm处比色，得到吸光度值。
3.利用下式计算脱氢酶活性，以脱氢酶活性值作为水中活体藻浓度的标度。
X=At×V]]>X-脱氢酶活性，μg TF/mL水样·h；A-水样吸光度值对应的标准曲线上TF含量，μg；t-发色时间，h；V-水样体积，mL。
再从同一待测水样中取50mL水样，按叶绿素a法反复作7次得到7个叶绿素值。两组结果如表1，统计结果如表2表1 重复性实验的结果
表2 重复性实验统计结果
数据表明，在水样中藻类浓度较高时，TTC-脱氢酶活性检测法检测结果的变异系数比叶绿素a法要低得多，说明检测这类水样时的检测结果精密性更高，得到的结果更稳定。
权利要求
1.一种水中藻类定量检测的新方法，其特征在于利用水体中藻类的脱氢酶活性值来表征藻类的浓度，检测方法的主要步骤A.制作TF浓度与吸光度关系的标准曲线，制作标准曲线时使用的还原剂是80g/L Na2S溶液；B.然后，在浓缩后水样中加入TTC，暗处恒温水浴发色培养，取出后，终止反应，并加入萃取剂萃取，在492nm处测定有机相的吸光度，并标准曲线上查得TF生成量。C.发色培养前加入Tris～HCl缓冲液保持反应液的pH值稳定。D.计算脱氢酶活性，以脱氢酶活性值作为水中活体藻浓度的标度。
2.根据权利要求所述的一种水中藻类定量检测的新方法，其特征在于萃取剂使用的是丙酮和石油醚组成的双组分萃取剂。
全文摘要
本发明公开了一种水中藻类定量检测的新方法，属于环境工程水质监测领域。主要通过对水体中藻类脱氢酶活性的检定来间接表征水体中藻类浓度，首先，配制不同浓度的TTC溶液，以80g/LNa
文档编号C12Q1/02GK1885010SQ20061004436
公开日2006年12月27日 申请日期2006年5月31日 优先权日2006年5月31日
发明者裴海燕, 胡文容, 解军, 祁峰 申请人:山东大学