专利名称：利用长毛囊孔菌的发酵液进行分离制备eburicoic acid化合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用长毛囊孔菌的发酵液进行分离制备eburicoic acid化合物的方法。
背景技术：
根据文献L. Francisco, Q. Jose, R. Augusto, Lanostanoid triterpenesfrom Laetipoms sulphureus and apoptosis induction on HL-60 human myeloid leukemia cells. J. AW. TVod.， 2004， 67(12), 2008.记载，化合物Eburicoic acid有 诱导人HL-60骨髓白血病细胞凋亡的作用，其IC5。=23-27^iM， 3p-羟基乙酰化 eburicoic acid表现出最强的诱导人HL-60骨髓白血病细胞凋亡的作用 (IC5()=13-15|iM)。其化学结构如下<formula>complex formula see original document page 3</formula>
鉴于该化合物及其乙酰化物在诱导人HL-60骨髓白血病细胞凋亡方面表 现出的很好活性，将eburicoic acid开发成治疗人类白血病药物的原料药的工 作有进一步深入研究的价值。
长毛囊孔菌(Trametes versatillis.Berk)为多孑L菌禾斗(Polyporaceae)真菌，子 实体一般中等大，革质，3-7cmX4-10cm,厚2-3mm，表面被有长毛，灰色。 菌肉近白色，厚2-3mm。菌管长7mm，壁薄，管口直径0.5-1.5 mm，多角， 长形，灰色。生于针叶或阔叶林腐木上，主要分布在河北、安徽、江苏、江 西、海南、广东、云南等地。迄今，长毛囊孔菌子实体及发酵液化学成分皆未见报道。我们在研究长毛囊孔菌过程中发现该菌是一个很好的产生eburicoic acid的菌种，我们利用常规分离手段对长毛囊孔菌的发酵液进行了 分离鉴定，研究结果表明eburicoic acid是主要成分，主要来自菌丝体(其含量 约占菌丝体干重的1%)。研究结果表明该菌种产菌丝多(每升发酵液可产干燥 的菌丝体8克)，发酵时间短(14天)。因此继续开展培养基配方的优化工作有 很高的研究价值和应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用长毛囊孔菌的发酵液进行分离制备 eburicoic acid化合物的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 一种利用长毛囊孔菌的发 酵液进行分离制备eburicoic acid化合物的方法，按下述步骤操作制成采用 平皿转摇瓶液体培养的方法，首先用葡萄糖，去皮土豆，MgS04， KH2P04， VB,加水混合搅拌制成培养基；然后于暗中培养发酵得发酵液，分为发酵液 和菌丝体两个部分；萃取发酵液得到浸膏；烘干菌丝体以氯仿-甲醇提取得到 浸膏；经TLC检测后合并两部分浸膏，上柱层析分离，以氯仿-甲醇系统梯 度洗脱;在氯仿-甲醇洗脱部分经反复柱层析得到含化合物eburicoic acid的--组混合物；该混合物采用石油醚-丙酮洗脱分离，得到化合物eburicoic acid 纯品。
本发明方法可以按下述具体步骤操作制成采用平皿转摇瓶液体培养的方法，首先用葡萄糖15-25g，去皮土豆180-250g，MgSO4l-2g，KH2PO42.5-3.5g， VB,8-12mg，加水混合搅拌至1000ml制成培养基；然后在温度20-32°C， 转速150-200r/min条件下于暗中培养发酵12-20天后共得发酵液8-11升， 分为发酵液和菌丝体两个部分；发酵液以乙酸乙酯萃取两遍，得到1.8-2.4克 浸膏；菌丝体湿重400-450克，烘干后重70-85克；烘干后的菌丝体以体积 比为30-70:70-30的氯仿-甲醇提取两次，共得到5.5-6.5克的浸膏；经TLC 检测后合并两部分浸膏，上硅胶柱分离，以体积比为100-80:0-20的氯仿-甲 醇系统梯度洗脱，每100ml为-一个流份；在以体积比为99-90:1-10的氯仿-甲醇洗脱部分经反复柱层析得到含化合物eburicoic acid的一组混合物；该混 合物采用体积比为75-65:25-35的石油醚-丙酮洗脱分离，得到化合物eburicoic acid纯品。
采用本发明所述的技术方案可以为将eburicoic acid开发成治疗人类白血 病药物的原料药解决eburicoic acid的原料来源问题，该技术具有培养条件温
和、培养基配制简单易行、发酵时间短、产量大、易于大规模生产等优点。
具体实施例方式
实例1
采用平皿转摇瓶液体培养的方法，首先用葡萄糖20g，去皮土豆200g， MgS041.5g， KH2P043g， VB,10mg，加水混合搅拌至1000ml制成培养基； 然后在温度25°C，转速170r/min条件下于暗中培养发酵15天后共得发酵 液10升，分为发酵液和菌丝体两个部分；发酵液以乙酸乙酯萃取两遍，得到 2克浸膏；菌丝体湿重420克，烘干后重80克；干燥的菌丝体以氯仿-甲醇(体 积比40:60廣取两次，共得到6克的浸膏；经TLC检测后合并两部分浸膏， 上硅胶柱分离，以体积比为100-80:0-20的氯仿-甲醇系统梯度洗脱，每100ml 为一个流份；在氯仿-甲醇(体积比95:5)洗脱部分经反复柱层析得到含化合物 ebmicoic acid的一组混合物；该混合物采用石油醚-丙酮(体积比70:30)洗脱分 离，得到化合物eburicoicacid纯品。
实例2
采用平皿转摇瓶液体培养的方法，首先用葡萄糖15g，去皮土豆180g， MgSO41.0g， KH2P042.5g， VB,8mg，加水混合搅拌至1000ml制成培养基； 然后在温度20°C，转速150r/min条件下于暗中培养发酵12天后共得发酵 液约10升，分为发酵液和菌丝体两个部分；发酵液以乙酸乙酯萃取两遍，得 到1.8克浸膏；菌丝体湿重400克，烘干后重75克；干燥的菌丝体以氯仿-甲醇(体积比70:30)提取两次，共得到5.5克的浸膏；经TLC检测后合并两部 分浸膏，上硅胶柱分离，以体积比为100-80:0-20的氯仿-甲醇系统梯度洗脱， 每100ml为一个流份；在氯仿-甲醇(体积比90:10)洗脱部分经反复柱层析得 到含化合物eburicoic acid的一组混合物；该混合物采用石油醚-丙酮(体积比 75:25)洗脱分离，得到化合物eburicoic acid纯品。
实例3
采用平皿转摇瓶液体培养的方法，首先用葡萄糖25g，去皮土豆220g， MgSO42.0g， KH2P043.2g， VB,12mg，加水混合搅拌至1000ml制成培养基； 然后在温度32"C，转速200r/min条件下于暗中培养发酵18天后共得发酵 液12升，分为发酵液和菌丝体两个部分；发酵液以乙酸乙酯萃取两遍，得到 2.5克浸膏；菌丝体湿重450克，烘干后重82克；干燥的菌丝体以氯仿-甲醇 (体积比65:35)提取两次，共得到6.5克的浸膏；经TLC检测后合并两部分浸 膏，上硅胶柱分离，以体积比为100-80:0-20的氯仿-甲醇系统梯度洗脱，每100ml为一个流份；在氯仿-甲醇(体积比92:8)洗脱部分经反复柱层析得到含 化合物eburicoic acid的一组混合物；该混合物采用石油醚-丙酮(体积比65:35) 洗脱分离，得到化合物eburicoic acid纯品。
分别对实例l、 2、 3中所得化合物eburicoic add纯品进行理化及波谱数 据分析，结果如下
eburicoic acid， C31H5。03，无色针晶，m,p.: 274-275°C ， [a],=+39° (pridine; c=1.0) 。 EI画MS附/z (%): 470(14， [M]+)， 455(30)， 437(100)， 419(48), 55(88)。 HR-ESI-MS: 470.3712(计算值为470.3759)。 'H-NMR(C5D5N, 400MHz): 31,03(3H, d， 《/=7.0Hz， H-26), 1.04(3H, d,声7.0Hz， H-27), L04(6H, br.s H-18, H-26), L08(3H, s, H-19), l.即H， s， H-30)， 1.25(3H， s， H-28), 2.29(1H, m, H-25)， 2.66(1H， t, J=11.3Hz, H-20)， 3.45(1H, m， H-3), 4.90(1H, s, H-31a), 4.94(1H, s, H墨31b)。 l3C-NMR(C5D5N， 100MHz): S36.1(t, C-l), 28.7(t, C-2)， 78.0(d， C-3), 39.5(s, C-4), 50.9(d， C-5)， 18.7(t， C-6), 28.7(t, C-7), 135.2(s, C-8)， 134.3(s, C-9), 37.4(s, C-10), 2L3(t， C-11), 29.4(t, C-12), 44.9(s, C-13), 49.9(s, C-14), 30.9(t， C-15), 27.5(t， C-16), 47.7(d， C-17), 16.3(q, C-18)， 19.4(q, C-19), 49.2(d， C-20), 178.6(s， C-21), 31.8(t， C-22), 32.8(t， C-23), 155.9(s， C-24), 34.2(d, C-25), 22.0(q， C-26), 21.9(q, C-27), 28.6(q, C-28), 16.4(q， C-29)， 24.5(q, C-30), 107.0(t, C-31)。 以上数据与文献T. Tai， A. Akahori, T. Shingu， Triterpenes of Por/a cocas. Poria cocos.Phytochemistry，1993，32，1239.中记载一致。
权利要求
1、一种利用长毛囊孔菌的发酵液进行分离制备eburicoic acid化合物的方法，其特征是按下述步骤操作制成采用平皿转摇瓶液体培养的方法，首先用葡萄糖，去皮土豆，MgSO4，KH2PO4，VB1加水混合搅拌制成培养基；然后于暗中培养发酵得发酵液，分为发酵液和菌丝体两个部分；萃取发酵液得到浸膏；烘干菌丝体以氯仿-甲醇提取得到浸膏；经TLC检测后合并两部分浸膏，上柱层析分离，以氯仿-甲醇系统梯度洗脱；在氯仿-甲醇洗脱部分经反复柱层析得到含化合物eburicoic acid的一组混合物；该混合物采用石油醚-丙酮洗脱分离，得到化合物eburicoic acid纯品。
2、 如权利要求1所述的一种利用长毛囊孔菌的发酵液进行分离制备 eburicoic acid化合物的方法，其特征是按下述具体步骤操作制成采用平皿 转摇瓶液体培养的方法，首先用葡萄糖15-25g，去皮土豆180-250g， MgS04l-2g， KH2P042.5-3.5g， VB,8-12mg，加水混合搅拌至lOOOml制成培 养基；然后在温度20-32°C，转速150-200r/min条件下于暗中培养发酵12-20 天后共得发酵液8-11升，分为发酵液和菌丝体两个部分；发酵液以乙酸乙酯 萃取两遍，得到1.8-2.4克浸膏；菌丝体湿重400-450克，烘干后重70-85克； 烘千后的菌丝体以体积比为30-70:70-30的氯仿-甲醇提取两次，共得到5.5-6.5 克的浸膏；经TLC检测后合并两部分浸膏，上硅胶柱分离，以体积比为 100-80:0-20的氯仿-甲醇系统梯度洗脱，每100ml为一个流份；在以体积比 为99-90:1-10的氯仿-甲醇洗脱部分经反复柱层析得到含化合物eburicoic acid 的一组混合物；该混合物采用体积比为75-65:25-35的石油醚-丙酮洗脱分离， 得到化合物eburicoic acid纯品。
全文摘要
利用长毛囊孔菌的发酵液进行分离制备eburicoic acid化合物的方法，采用平皿转摇瓶液体培养的方法，首先用葡萄糖，去皮土豆，MgSO<sub>4</sub>，KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>，VB<sub>1</sub>加水混合搅拌制成培养基；然后培养发酵得发酵液，萃取发酵液得到浸膏，烘干菌丝体以氯仿-甲醇提取得到浸膏；合并两部分浸膏，上柱层析分离，以氯仿-甲醇系统梯度洗脱；在氯仿-甲醇洗脱部分经反复柱层析得到含化合物eburicoic acid的一组混合物；该混合物采用石油醚-丙酮洗脱分离，得到化合物eburicoic acid纯品。本发明可以为将eburicoicacid开发成治疗人类白血病药物的原料药解决eburicoicacid的原料来源问题，具有培养条件温和、培养基配制简单易行、发酵时间短、产量大、易于大规模生产等优点。
文档编号C12P33/00GK101200752SQ200610128390
公开日2008年6月18日 申请日期2006年12月15日 优先权日2006年12月15日
发明者刘吉开, 麻兵继 申请人:河南农业大学