专利名称：用于监测并改善疫苗功效的修饰的流感病毒的制作方法
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形成本发明的研究是由国家过敏症和传染病研究所的基金AI95357和国家卫生研究所的癌症中心支持(CORE)基金CA21765支持的。因此美国政府享有本发明中的某些权利。
CD附件的引用文献
不可用。
发明领域 总体上，本发明涉及增加一组流感病毒亚型的抗原性和/或免疫原性。
背景技术：
流感病毒 流感病毒(最著名的是A和B型病毒的特定株)是遍及世界的造成发病和致死的严重的病原，导致每年疾病暴发。周期性但没有间隔规律的流行性疾病发生并导致特别高水平的发病和死亡。该流行性疾病历史上是A型流感的新病毒亚型导致的，所述病毒亚型是由分节的基因组的重新排列(抗原性转变)产生的，而每年流行病一般是流感A和B型病毒的表面抗原进化(抗原性漂移)的结果。人流感病毒通常源自禽流感病毒株，因此流感感染在其基础上说是人畜共患病。也有证据表明猪可作为中间宿主(″混合容器″)来产生新的对人致病的源于禽的株(Scholtissek等，Virology 1985，147287)。1997年A型流感H5N1在香港的暴发表明高致病性A型流感病毒也可直接从禽物种转移至人(Claas等，Lancet 1998，351472；Suarez等，J.Virol.1998，726678；Subbarao等，Science 1998，279393；Shortridge，Vaccine1999，17(Suppl.1)S26-S29)。在2003年，东南亚的H5N1病毒包含了不同的同时流行的基因型，但在2004，被称为″Z-基因型″的单一基因型变得占优势(Li等，Nature 2004，430209)。当前的证据表明致死的人病例是由该基因型由鸟至人的直接传递而造成的，并表明它也感染猫，直接由猫向猫传递(Kuiken等，Science 2004，306241)。这一证据和其他的该病毒宿主范围改变和广泛分布的证据增加了担心，即H5N1病毒可获得允许由人向人传播的特性。人会对这种新的H5N1病毒没有免疫力，这能导致灾难性的流行性流感(Fouchier等，Nature 2005，435419)。A型流感病毒由在动物群中大量循环的株产生新致病株的潜力表明，疾病控制需要监测这些病毒并开发改良的抗病毒疗法和疫苗。新病毒株发展的速度需要在该监测努力中保持警惕，包括改进技术以评估疫苗对新株的功效。
正粘病毒科的A、B和C型流感病毒都有分节的负链RNA基因组，其在感染的细胞核中复制，具有约13kb的组合编码能力，并包含10种病毒蛋白的遗传信息。特别是，流感病毒有8个反义RNA(nsRNA)基因片段，编码至少10种多肽，包括RNA指导的RNA聚合酶蛋白(PB2，PB1和PA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、血凝素(HA，其在酶切割后由HA1和HA2亚基相连构成)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)(Krug等，参见The Influenza Viruses，R.M.Krug编，Plenum Press，纽约，1989，pp。89-152)。
近来开发的反向遗传学系统能操纵流感病毒基因组(Palese等，Proc。Natl。Acad。Sci。USA 1996，9311354；Neumann和Kawaoka，Adv.VirusRes.1999，53265；Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，969345；Fodor等，J.Virol.1999，739679)。例如，已证实，质粒驱动由pol I启动子表达8种流感nsRNA并共表达聚合酶复合蛋白，能导致形成感染性A型流感病毒(Hoffmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000，976108)。
流感病毒的病毒颗粒具有约125nm的大小，并由与核蛋白相连的反义病毒RNA核心组成，由带有脂双层结构的病毒被膜包围。病毒被膜内层主要由基质蛋白组成，而外层主要包含源于宿主的脂质材料。所谓″表面蛋白″，神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)，显示作病毒体表面上的钉状物。新流感病毒的感染性取决于特定宿主蛋白酶对HA的裂解，而NA涉及从细胞表面上释放后代病毒粒子并阻止新产生的病毒成簇。
嵌入病毒被膜的HA和NA蛋白是流感病毒的主要的抗原决定簇(Air等，Structure，Function，and Genetics，1989，6341-356；Wharton等，参见TheInfluenza Viruses，R.M.Krug编，Plenum Press，纽约，1989，pp。153-174)。由于流感分节基因组的重新排列，因此经常能产生新的HA和NA变体，新感染的生物对它们不具有记忆性免疫应答。HA糖蛋白是主要的中和抗体的抗原并涉及病毒颗粒与宿主细胞上的受体的结合。
来自不同病毒株的HA分子在核酸和氨基酸水平上都显示出显著的序列相似性。当比较不同亚型株时，该相似性水平会变化，一些株清楚展示出比其他有更高水平的相似性(Air，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1981，787643)。氨基酸相似性水平在一种亚型的病毒株和另一种亚型的病毒株之间会变化(Air，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1981，787643)。这种变化足以确立个别的亚型和不同株的进化系，但利用常规的生物信息学技术仍旧能比对不同株的DNA和氨基酸序列(Air，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1981，787643；Suzuki和Nei，MoI.Biol.Evol.2002，19501)。
流感疫苗 当前公共卫生机构批准用于美国和欧洲的流感疫苗是灭活流感疫苗以及在美国的活的减毒FLUMIST疫苗。代表流行病学上重要的流感A型和流感B型株的病毒在鸡蛋胚中生长，然后纯化病毒颗粒并通过化学方法灭活来形成疫苗原种。每年，WHO挑选最可能在当年流行的亚型来用于疫苗开发。
尽管流感疫苗自从1940年代早期就已应用于人免疫，而且用于马免疫的在1960年代晚期也使用了，但是由于存在广泛的动物群，加之能造成流行病的新流感病毒突发的威胁，促使研究新的疗法来打击该病毒。在流感领域中几种重要的进步在过去的几年中已经出现(综述于Cox和Subbarao，Lancet 1999，3541277-82)。例如，实验性的活、减毒、鼻内给药的三价流感疫苗展示出能高度有效地保护少儿抗流感A型H3N2和流感B型。其他改善当前(灭活)流感病毒疫苗功效的方法包括产生含特定减毒突变的冷适应和遗传工程流感病毒(综述于Palese等，J.Infect.Dis.，1997，176 Suppl1S45-9)。希望这些其中来自流行株的HA和NA基因通过重新排列而被掺入的基因工程改造的病毒能用作为安全的活流感病毒疫苗，在人体内诱导长期的保护性免疫应答。尽管冷适应疫苗显示出对儿童和年轻的成年人有效，但是它们被过度减毒以至于不能在老人(在美国是每年死于流感感染的20000-40000个个体的主要群体)中刺激出理想的免疫应答。
容易得到的疫苗将能提供最有效的抗突发流行流感的工具。在1997H5N1在香港暴发后，由两种不同方法产生的疫苗在人体中测试。产自A/鸭/新加坡/3/97的传统H5亚单位疫苗在人体内即使针对抗原性上紧密相关的株及在多次免疫接种后，都很少有免疫原性(Nicholson等.，Lancet 2001，3571937；Stephenson等，Journal of Infectious Disease 2005，1911210)。使用佐剂MF59能增加该H5疫苗的抗体滴度(Stephenson等，Vaccine 2003，211687)。用源自非致病性A/鸭/HK/836/80(H3N1)病毒的灭活的″分裂″疫苗和A/HK/156/97(H5N1)病毒的修饰的H5血凝素免疫，仅诱导出可检测的中和抗体滴度(Takada等，Journal of Virology 1999，738303)。因此，尽管这些H5N1疫苗有很好的容受性，但它们显示出不佳的免疫原性。当前缺少有效的抗H5N1病毒株的疫苗，增加了这些病毒造成流行病的威胁。
流感疫苗的免疫原性 血清抗体滴度法是被接受的测试免疫接种或病毒感染后免疫保护的替代方法。主要使用的血清抗体滴度法是病毒中和滴度测试和血凝素抑制(HI)滴度测试。这些测试基于在体外条件下来自人血清的流感抗体与抗原交叉反应的能力。对于给定的条件选择测试，不仅要基于它们提供一致和可用的结果的能力，而且基于它们易于使用并对每种类型的测试设备需求。
简而言之，病毒中和测试检测来自血清样品的抗体阻断流感病毒感染培养的细胞的能力。产生系列稀释(滴度)的血清样品并将这些稀释液的每一种与标准量的感染病毒组合在一起，由此进行测试。然后将每种稀释混合物提供给特定细胞培养物，并测试得到的感染率。病毒中和滴度测试被认为是非常有用和可靠的测试，能检测出现在给定个体中的免疫保护性抗体水平。可是它依赖于专门的细胞培养设施，因此并不能普遍适用。该方法也艰苦并且费时，因此难以适合筛选大量样品。
血凝素抑制(HI)测试能类似地检测来自血清样品的抗体与标准化的参照病毒的结合。该测试的基础是流感病毒会结合并粘附红血球的事实。在HI测试中，系列稀释的血清样品与标准量的参照病毒混合并在一段孵育期后加入红血球。然后可视化检测参照病毒与红血球连接成复合物。将抑制血凝素的最高稀释度的血清读出作为血凝素抑制滴度。尽管疫苗免疫原性不如其他测试灵敏，但是由于其技术和实验室需求相对简单，因而广泛使用HI测试。
考虑到以上所述的当前流感疫苗开发和评估的可用技术的局限，有需求要改进免疫原性评估技术来测试感染后的免疫应答以及疫苗功效。
发明简述 本发明提供了A型流感血凝素(HA)分子中的氨基酸替换，其能改变HA的抗原性和免疫原性。这些替换可通过改变受体特异性和/或抗体-抗原结合来改变抗原性位点。在多种具体实施方式
中，由替换导致的抗原性增加可用于增加对得自感染动物血清的血凝素(HI)测试的灵敏性。该信息对生产诊断参照病毒和新的流感疫苗来说是重要的。氨基酸替换优选产生其特征在于H5HA位置223上有天冬酰胺氨基酸替换的免疫原性分子。
因此，在某些方面，本发明包括流感病毒血凝素(HA)分子，其在受体结合位点中包含一个或多个氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在其受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性。流感病毒抗原性增加的HA分子可在对应于H5HA中第223位的位置上包括氨基酸天冬酰胺，其中包括的天冬酰胺导致增加与源自暴露于带有野生型HA分子的流感病毒的动物的抗血清的反应性。流感病毒抗原性增加的HA分子可在对应于H5HA中第223位的位置上包括氨基酸天冬酰胺，其中HA分子不源于人H5分离株A/HK/213/03，并且在第223位包括的天冬酰胺导致增加与源自暴露于流感病毒的动物的抗血清的反应性。在一些具体实施方式
中，氨基酸替换改变了糖基化位点。在一些具体实施方式
中，流感病毒是人A型流感病毒。例如，人A型流感病毒可以是H5亚型的成员。人A型流感病毒可以是A/越南/1203/04(H5N1)病毒。在一些具体实施方式
中，流感病毒是B型流感病毒。本发明包括源自禽流感病毒的流感病毒抗原性增加的HA分子。
在其他方面，本发明包括重组流感病毒，其包含流感病毒血凝素(HA)分子，所述流感病毒血凝素(HA)分子在受体结合位点中包含一个或多个氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在其受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性。重组病毒可包括修饰的HA分子，其源自A型流感病毒遗传背景中的H5N1流感病毒。A型流感病毒可以是支配株(master strain)病毒。重组病毒可用作血凝素抑制(HI)测试中的诊断参照病毒。重组流感病毒可包括在血凝素抑制(HI)测试试剂盒中。
本发明的另外一些方面包括反向遗传学系统，其用于制备含流感病毒血凝素(HA)分子的病毒，所述流感病毒血凝素(HA)分子在受体结合位点中包含氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在其受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性。
本文公开的本发明的另一些方面包括制备含流感病毒血凝素(HA)分子的方法，所述流感病毒血凝素(HA)分子在受体结合位点中包含一个或多个氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在其受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性。在一些具体实施方式
中，该方法包括导入能在反向遗传学系统中表达抗原性增加的HA分子的重组载体。
在相关方面，本发明进一步提供了确定流感病毒疫苗在动物中的功效的方法。在一些具体实施方式
中，该方法包括将源自免疫接种的动物的抗血清与流感病毒血凝素(HA)分子反应，所述血凝素(HA)分子在受体结合位点中包含一个或多个氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在流感病毒疫苗中存在的受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性。在一些具体实施方式
中，抗原性增加的HA分子源于人H5N1分离株A/HK/213/03，而且在对应于H5N1病毒HA中第223位的位置上包括的天冬酰胺导致增加与源自免疫接种的动物的抗血清的反应性。在一些具体实施方式
中，所述动物是人。在其他具体实施方式
中，所述动物是雪貂。
本发明的其他相关方面提供了产生含血凝素(HA)分子的流感病毒的方法，该方法包括培养反向遗传学系统，其中编码HA的DNA通过反向遗传学过程在受体结合位点中编码一个或多个氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性。
本发明进一步提供了增加血凝素抑制(HI)测试灵敏性的方法，该方法包括将源自免疫接种或感染的动物的抗血清与流感病毒血凝素(HA)分子反应，所述血凝素(HA)分子在受体结合位点中包含一个或多个氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性。在一些具体实施方式
中，增加HI测试灵敏性的方法导致血凝素抑制(HI)测试灵敏性至少增加2倍。在一些具体实施方式
中，增加HI测试灵敏性的方法导致血凝素抑制(HI)测试灵敏性至少增加4倍。
本发明的另一方面包括确定动物是否暴露于流感病毒的方法。在一些具体实施方式
中，该方法包括将源自动物的抗血清与诊断参照病毒反应，所述诊断参照病毒源自所讨论的流感病毒但包含流感病毒血凝素(HA)分子，所述血凝素(HA)分子在受体结合位点中包含氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在其受体结合位点中缺乏氨基酸替换而导致增加与抗血清反应性的HA分子的抗体更具抗原性。在一些具体实施方式
中，所述动物是人。在其他具体实施方式
中，所述动物是雪貂。
本发明在其他方面包括确定动物是否暴露于流感病毒的方法。在一些具体实施方式
中，该方法包括将源自动物的抗血清与诊断参照病毒反应，所述诊断参照病毒源自所讨论的流感病毒但包含修饰的流感病毒HA分子，所述HA分子在对应于H5HA中第223位的位置上包含氨基酸天冬酰胺，其中包含的天冬酰胺导致增加与源自暴露于带有野生型HA分子的流感病毒的动物的抗血清的反应性，导致增加与抗血清的反应性。在一些具体实施方式
中，确定动物是否暴露于流感病毒的方法包括将源自动物的抗血清与诊断参照病毒反应，所述诊断参照病毒源自所讨论的流感病毒但包含修饰的流感病毒HA分子，所述HA分子在对应于H5HA中第223位的位置上包含氨基酸天冬酰胺，其中HA分子不源于人H5分离株A/HK/213/03而且在第223位包含的天冬酰胺导致增加与源自暴露于流感病毒的动物的抗血清的反应性。在一些具体实施方式
中，所述动物是人。在其他具体实施方式
中，所述动物是雪貂。
本发明还包括的有流感疫苗病毒，其包含血凝素(HA)分子，所述血凝素(HA)分子在受体结合位点中包含氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性，而且其中修饰导致增加所述疫苗病毒的免疫原性。
本发明的一个方面包括分离的核酸，其编码流感病毒血凝素(HA)分子，所述血凝素(HA)分子在受体结合位点中包含氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性。在一些具体实施方式
中，由分离的核酸编码的流感病毒HA分子在对应于H5HA中第223位的位置上包含氨基酸天冬酰胺，其中HA分子不源于人H5分离株A/HK/213/03，而且在第223位包含的天冬酰胺导致增加与源自暴露于流感病毒的动物的抗血清的反应性。
本发明进一步包括制备编码流感病毒血凝素(HA)分子的核酸的方法，所述血凝素(HA)分子在受体结合位点中包含氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性。在一些具体实施方式
中，该方法包括将核苷酸序列导入编码受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的核酸中，其导致在HA分子序列中氨基酸替换，使HA分子对于针对缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性。
本发明符合本发明的这些和其他方面，如在详细说明和实施例中所更详细提及的。
图1的图显示了用分离于2003和2004的H5N1流感病毒接种的雪貂中的HI抗体滴度(A)；用ΔH5N1/03和ΔH5N1/04病毒免疫的雪貂中的HI和病毒中和滴度(B)。在图IA中，在用106EID50的H5N1病毒接种28天后收集血清并滴定测量到抗4个红血球凝聚单位(HAU)的同源病毒。数据是得自2或4个血清的代表值。在图IB中，从用ΔH5N1/03和ΔH5N1/04病毒的7μg HA免疫接种2次的雪貂中收集血清并分别滴定测量到抗4个HAU和100TCID50的同源病毒。
图2的图显示了用A/越南/1203/04(H5N1)病毒刺激后免疫接种和对照雪貂的鼻洗涤物中的病毒滴度。用ΔH5N1/04或ΔH5/04重组病毒免疫接种的雪貂用106EID50的A/越南/1203/04病毒鼻内接种。滴度是在3只雪貂鼻洗涤物中确定的平均值(log10EID50/0.1ml)±SD。
注意，免疫接种和对照组间滴度的差异是显著的，根据不成对t测验结果，P值为0.0028-0.0173。
图3是H5HA多肽的分子模型，其显示在A/鸭/新加坡/3/97(H5N3)病毒的HA 3D结构中第154和223位上的氨基酸位置。在图3A中，3D结构中的氨基酸受体结合位点被显示出。在图3B中，圆代表在三聚HA中所显示的单体和另两个单体(未显示)间的表面。在第223位的氨基酸位于一般出现在位置222的谷氨酰胺和一般出现在位置224的甘氨酸间的受体结合结构域的220环中。
详细说明 本发明提供了流感病毒血凝素(HA)分子的氨基酸序列改变，其使HA分子对于特异针对缺乏改变的HA分子的抗体更具抗原性。这种序列改变包括替换和缺失。产生的HA被称为″抗原性增加的HA″。
抗原性增加的HA分子可用于测试疫苗功效，因为该改变能增加血清中抗流感病毒的抗体的诊断测试的灵敏性。在特定的具体实施方式
中，病毒是A型流感病毒。在另外的具体实施方式
中，病毒也可以是B型流感病毒，而且在另一个具体实施方式
中，它可以是C型流感病毒。在流感是A型流感病毒的具体实施方式
中，它可以是A型流感病毒H5-亚型。在更特定的具体实施方式
中，H5-亚型HA分子被修饰从而在第223位包含氨基酸天冬酰胺(N223)，导致增加与源自暴露于H5-亚型流感病毒的动物的抗血清的反应性。在特定的具体实施方式
中，本发明的HA分子不是A/HK/213/03HA分子，其是在第223位带有天冬酰胺的天然产生的H5-亚型。流感病毒可以是H5亚型的人A型流感病毒，包括A/越南/1203/04(H5N1)病毒。
使HA分子更具抗原性的氨基酸改变能在HA的接受结合结构域(如图3A所描述的)中产生，尤其在受体结合结构域中的220环区域中。该改变可降低HA与红血细胞上唾液酸受体的结合，因而增加抗HA抗体抑制红血球凝聚的能力，导致扩大红血球凝聚抑制测试中抗体结合活性效应。另外，能产生使HA分子更具抗原性的氨基酸改变，来改变或缺失HA蛋白上的糖基化位点，尤其是掩盖HA上由HA特异性抗体识别的表位的糖基化位点。在另一个具体实施方式
中，对对应于H5HA亚型残基223的氨基酸残基进行氨基酸改变。在本发明的所有具体实施方式
中，使HA分子更具抗原性的氨基酸修饰能通过利用特异针对特定HA亚型的抗体的免疫测试来方便地鉴别。相对于HA分子与引发的抗体的结合活性，使HA分子更具抗原性的修饰将导致明显更高滴度的抗体结合活性。这种测试包括血凝素抑制(HI)测试。
在特定的具体实施方式
中，H5-亚型HA分子的丝氨酸残基(其可以是糖基化残基)替换为天冬酰胺(其是无糖基化或不同糖基化的)，导致增加抗原性。可是，其他替换也能导致明显增加的抗原性。这种替换可以是，但不必是，保守的，如苏氨酸换丝氨酸、或谷氨酰胺换天冬酰胺。它们可保留相对极性，如天冬酰胺换丝氨酸，或赖氨酸换天冬氨酸，其保留了极性而不维持相同变化。还考虑的有用诸如甘氨酸和丙氨酸的残基替换，其减少反应性侧链而对多肽结构不具有许多影响。最后，完全不保守的改变是可能的。另外，简单的免疫测试将表明特定改变是否能导致增加抗原性。
一些分离自中南美洲的禽H5N1病毒在第223位上具有碱性氨基酸——精氨酸。在人分离株A/HK/213/03的HA中在位置223上找到氨基酸天冬酰胺。该氨基酸残基位于一般出现在位置222的谷氨酰胺和一般出现在位置224的甘氨酸间的受体结合结构域的220环中(图3)。实验证据提示较高的HI滴度反映了受体特异性的改变。的确，一般出现在位置222的谷氨酰胺和一般出现在位置224的甘氨酸直接结合唾液酸受体。220环中或邻接于它的氨基酸对受体结合袋的构象是重要的(Ha等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2001，9811181)。尽管本发明不依赖任何对观察效果的特定解释，但可能的是，天冬酰胺替换在H5第223位上的丝氨酸导致构象改变并改变受体特异性。
在另一方面，本发明所述的修饰的更有抗原性的HA分子也更有免疫原性。该分子作为流感疫苗的成分，能诱发较强的或较有力的免疫应答，其接着导致更好的抗流感感染的保护作用。
源自禽类群体的流感病毒对公众健康而言是特别关注的。据信这些病毒特别可能造成人的流行性流感爆发。因此，来自具有增加的抗原性和/或免疫原性的禽亚型的HA分子将特别可用于进行与疫苗开发同时进行的免疫测试中。本文针对H5而示例的策略可用于增加抗其他HA亚型的HI(血凝素抑制)测试滴度，而且这特别可用于评估对禽流感的免疫性。在一些具体实施方式
中，受体结合位点中带有氨基酸替换的HA分子可源自禽流感病毒，包括亚型H1到H16在内。
本发明的一个方面包括将具有增加抗原性的HA分子的重组流感病毒用作免疫测试(尤其是HI测试，包括进行该测试的试剂盒)中的参照病毒。例如，H5HA分子中第223位上的天冬酰胺氨基酸替换能增加与带有α2，6连接的红血细胞(RBC)唾液酸受体(如来自鸡的那些)的结合，但降低与带有N-糖基唾液酸α2，3连接的受体(如来自马的那些)的结合。因此本发明的一个方面提供了所产生的对马RBC较低的结合而将需要较少量的抗体来抑制红血球凝聚。该观念，即导入增加抗原性(如通过抗体结合测得的)的氨基酸替换，能用于所有的16种HA亚型，包括来自A型禽流感病毒的那些。
本发明包括确定流感病毒疫苗在动物中的功效的方法。该方法包括将源自免疫接种的动物的抗血清与具有增加抗原性的血凝素(HA)分子的流感病毒反应。确定流感病毒疫苗在动物中功效的方法的一些方面，如实施例中所证实的，包括将源自免疫接种的动物的抗血清与在第223位含氨基酸天冬酰胺(N223)的流感病毒H5-亚型HA分子(如，来自人H5N1分离株A/HK/213/03的HA分子)反应。第223位上的天冬酰胺导致增加与源自暴露于不同H5流感病毒的动物的抗血清的反应性。免疫接种的动物可以是许多物种之任一，包括雪貂和人。
本发明还包括的有通过利用包括增加抗原性的HA分子的参照病毒增加HI测试灵敏性的方法。在一些具体实施方式
中，如当HA分子源于人H5N1分离株A/HK/213/03株时，氨基酸改变提供了第223位上的天冬酰胺，导致增加与源自暴露于在该位置带有不同氨基酸残基的H5流感病毒(如A/越南/1203/04)的动物的抗血清的反应性。这增加的反应性可以是任何水平的，包括反应性增加至少2倍或至少4倍。在常规滴定方法终点低于检测极限的情况下，灵敏性增加2倍或4倍尤其有重要意义。
在特定的具体实施方式
中，本发明还包括将重组流感病毒用作诊断参照病毒，其包括第223位上带有氨基酸天冬酰胺的修饰的H5-亚型HA分子，导致增加与源自暴露于H5流感病毒的动物的抗血清的反应性。在特定的具体实施方式
中，诊断参照病毒中的H5HA分子源于人H5N1分离株A/HK/213/03。在另一个具体实施方式
中，来自另一种流感株的H5分子的第223位发生天冬酰胺(或谷氨酸胺)替换。非常清楚的是，相同的方法可适于来自任何流感株的任何HA分子。在各种具体实施方式
中，动物可以是许多物种，包括雪貂和人。
除了在人疫苗临床试验中用作灵敏性增加的参照病毒之外，这些病毒可用于血清流行病学研究。通过像HI测试那样的快速和简单检测方法显示多少人感染有H5N1病毒，这方面数据的可获得性能提供重要的关于H5N1病毒在人中流行性的信息。该数据可用于评估H5N1病毒的人向人或在禽物种和人间传播的可能性。
本发明的其他方面包括通过将源自动物的抗血清与诊断参照病毒反应来确定动物是否暴露于流感病毒的方法。诊断参照病毒与暴露病毒源自相同的流感病毒株，但参照病毒含抗原性增加的HA分子。在一个具体实施方式
中，参照病毒包含在对应于H5HA中第223位的位置上带有天冬酰胺的HA分子，其中包含的天冬酰胺导致增加与源自暴露于带有野生型HA分子的流感病毒的动物的抗血清的反应性，导致增加与抗血清的反应性。在另一个具体实施方式
中，参照病毒包含流感病毒血凝素(HA)分子，所述流感病毒血凝素(HA)分子在对应于H5HA中第223位的位置上包含氨基酸天冬酰胺，而且HA分子不源于人H5分离株A/HK/213/03而且第223位上包含的天冬酰胺导致增加与源自暴露于流感病毒的动物的抗血清的反应性。在特定的具体实施方式
中，感染的病毒是H5N1病毒，而且参照病毒是人H5N1分离株A/HK/213/03，其在氨基酸第223位上包括天冬酰胺，导致增加与H5N1特异性抗血清的反应性。在本发明的不同方面，动物可以是任何物种，包括雪貂和人。
本发明还涵盖包括了增加抗原性的HA分子的流感疫苗。在特定的具体实施方式
中，病毒是人H5N1分离株。在更特定的具体实施方式
中，HA源自A/HK/213/03。在另一个具体实施方式
中，HA是H5修饰的，从而在第223位上包括氨基酸天冬酰胺。
在HA分子中导入修饰需要在基因水平操作，这是现有公知的，如以下会更详细地解释。一旦制备出修饰的HA基因，就可用许多方法，如″反向遗传学″方法，来将修饰的HA分子导入到流感病毒中，然后其能成为参照病毒用于测试疫苗功效，或成为诊断参照病毒用于跟踪流感流行性，包括动物-人的病毒传播和人-人的病毒传播。
在一些方面，本发明包括包含流感病毒血凝素(HA)分子的重组流感病毒，所述流感病毒血凝素(HA)分子带有至少一个氨基酸序列改变，使HA分子对于特异针对缺乏改变的HA分子的抗体更具抗原性。氨基酸序列改变可包括替换或缺失一个或多个氨基酸。修饰的HA分子可源自A型流感病毒遗传背景中的H5N1流感病毒。在一些具体实施方式
中，A型流感病毒是支配株病毒。含修饰的HA分子的重组病毒可用作血凝素抑制(HI)测试中的诊断参照病毒，所述HA分子对于特异针对缺乏氨基酸序列改变的HA分子的抗体更具抗原性。重组病毒也可包括在血凝素抑制(HI)测试试剂盒中。
在其他方面，本发明包括制备含血凝素(HA)分子的病毒的方法。例如，本发明的一个方面是制备含流感病毒血凝素(HA)分子的病毒的方法，所述流感病毒血凝素(HA)分子带有至少一个氨基酸序列改变，使HA分子对于特异针对缺乏改变的HA分子的抗体更具抗原性。该方法可包括导入能在反向遗传学系统中表达修饰的HA的重组载体。产生带有血凝素(HA)分子的流感病毒的方法可包括培养反向遗传学系统，其中编码HA的DNA通过反向遗传学过程在受体结合位点中编码氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子抗体更具抗原性。
还包括在本发明中的有制备编码血凝素(HA)分子的核酸的方法。HA分子可包含至少一个氨基酸序列改变，使HA分子对于特异针对缺乏改变的HA分子的抗体更具抗原性。在一些具体实施方式
中，该方法包括将核苷酸序列导入编码受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的核酸中，其导致在HA分子序列中氨基酸替换，使HA分子对于针对缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性。
定义 术语″流感病毒″在本文中用于定义病毒物种，其中的致病株造成被称为流感或流行性感冒的疾病。
术语″支配株病毒″指病毒株，其用于构建高度生长或减毒疫苗株。这些支配株通常向疫苗病毒提供6个基因片段(PB1，PB2，PA，NP，NA，M和NS)。支配株病毒可以是也可用作疫苗成分的株，包括病毒株A/PR/8/34。
术语″多肽″指氨基酸聚合物而且不指产物的特定长度；因此，肽、寡肽、和蛋白质包括在多肽的定义中。该术语也不指或排除多肽的翻译后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。
本文所用的″感染性″指病毒在细胞中复制并产生病毒颗粒的能力。感染性可以通过检测病毒(即病毒负荷)或通过观察在动物中的病程来评估。
本文所用的″个体″或″受试者″或″动物″指脊椎动物，其支持负链RNA病毒感染，特别是流感病毒感染，包括但不限于，鸟(如水鸟和鸡)和哺乳动物物种的成员，如犬、猫、狼、mustela、啮齿动物(racine、鼠等)、马、牛、绵羊、山羊、猪物种、和灵长类，后者包括人。在特定的具体实施方式
中，受试者是雪貂，其是用于研究流感的好的动物模型。在另一个具体实施方式
中，受试者是人。
本文所用的术语″免疫原性″指病毒或多肽能诱发体液或细胞免疫应答，并优选诱导这两者。免疫原实体也是有抗原性的。免疫原组合物是在向动物施用时诱导体液或细胞免疫应答、或这两者的组合物。
当分子能特异与免疫系统的抗原识别分子(如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)相互作用时，它是″抗原性的″。抗原性多肽含至少约5个、并优选至少约10个氨基酸的″表位″。多肽的抗原性部分在本文中也被成为″表位″，可以是对于抗体或T细胞受体识别而言的免疫显性部分，或者它可以是这样的部分，其通过缀合抗原性部分与载体多肽来产生针对分子的抗体从而用于免疫。抗原性分子本身不必是免疫原性的，即能在没有载体的条件下诱导出免疫应答。
本文所用的术语″氨基酸替换″指在该分子氨基酸序列中的特定位置上氨基酸的存在性。氨基酸替换相对于任何其他可能占据该位置的氨基酸而发生。氨基酸序列改变而产生的多肽可包括翻译后修饰，如糖基化、乙酰化、磷酸化或任何其它氨基酸修饰以及氨基酸替换的改变。
本文所用的术语″反向遗传学系统″指通过基因工程方法产生流感病毒颗粒、多肽、病毒粒子或核酸的方法。这些方法包括但不限于如Hoffmann所述的″质粒系统″(Hoffmann等，Vaccine 2002，203165；美国专利公开2002/0164770A1，2002年11月7日，其全文纳入本文参考)。一般而言，通过所属领域技术人员已知的基因工程方法，反向遗传学系统能产生带有特定序列的病毒颗粒、多肽、和/或核酸。这些系统在以下将更详细地描述。
本文所用的术语″受体结合位点″指感兴趣的受体(如红血细胞上的唾液酸受体)与其结合的HA分子部分。A/鸭/新加坡的H5分子的结构、和H5亚型血凝素的受体结合位点位置是已知的并被描述(Ha等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001 9811181)。该H5HA的分子模型(包括受体结合位点)如图3所示。
术语″诊断参照病毒″指带有增强的HA抗原性的病毒。该诊断参照病毒可用于免疫测试(如血凝素抑制测试)中。
术语″暴露病毒″指个体动物所暴露于其的病毒。该暴露可以是在日常活动过程中的，如与感染的受试者接触，如导致人暴露于感染性的流感病毒。暴露也可以归因于特定临床攻击，如在实验室测试条件下，其中实验室动物(如雪貂)被故意暴露于病毒。这种暴露能通过用流感疫苗免疫来清楚地产生。
词语″药学上可接受的″指分子实体和组合物，其在生理上是容许的并在向人施用时通常不产生过敏或相似的不需要的反应(如反胃、晕眩等)。本文所用的术语″药学上可接受的″优选指联邦或州政府管理机构所批准的，或美国药典或其它一般认可的药典所列可用于动物的，更特别地用于人。
术语″载体″指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂、或载体。该药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、豆油、矿物油、麻油等。水或水溶性盐溶液和水溶性葡聚糖和甘油溶液优选用作为载体，尤其用于注射液。合适的药物载体在E.W.Martin的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″(第18版)中有述。
本文所用的术语″佐剂″指增强对抗原免疫应答的化合物或混合物。佐剂能用作缓慢释放抗原的组织贮藏所，而且也能用作非特异增强免疫应答的淋巴系统刺激剂(Hood等，Immunology，第二版，Menlo Park，CABenjamin/Cummings，1984.p.384)。通常，单独用抗原初次刺激而缺少佐剂，将不能诱导出体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于，完全福氏佐剂、不完全福氏佐剂、皂角苷、矿物凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质(如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油或碳氢化合物乳剂、钥孔血蓝蛋白)、和潜在可用的人佐剂(如N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1’-2′-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰基氧)-乙胺、BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。佐剂优选是药学上可接受的。
本文所用的术语″分离的″指所参照的材料从其天然环境(如细胞或病毒)去除。因此，分离的生物材料没有一些或所有细胞成分，即天然材料在其中天然产生的细胞中的成分(如，细胞质或膜成分)。如果存在于细胞提取物或上清液中，则应当认为材料被分离。对于核酸分子，分离的核酸包括PCR产物、分离的mRNA、cDNA、或限制性片段。在另一个具体实施方式
中，分离的核酸优选切自它所存在的染色体中，更优选不再连接或相邻于非编码区域(但可连接于其天然调节区域或其部分)，或连接其它基因，这些其它基因当存在于染色体中时位于分离的核酸分子所含基因的上游或下游。在另一个具体实施方式
中，分离的核酸缺少一个或多个内含子。分离的核酸分子包括插入到质粒、粘粒、人工染色体等中的序列，即它形成了嵌合重组核酸构建体部分的时候。因此，在特定的具体实施方式
中，重组核酸是分离的核酸。分离的蛋白可与其他蛋白或核酸或这两者相连，在细胞中它和这些相连，或者如果它是膜-相连蛋白，则与细胞膜相连。分离的细胞器、细胞、或组织从生物体中找到它的解剖学位点上去除。分离的材料可以是但不必是纯化的。
本文所用的术语″纯化的″指在减少或消除不相关材料(即污染物)的存在的条件下分离出的材料，包括该材料从其中获得的天然材料。例如，纯化的病毒粒子优选基本无宿主细胞或培养物成分，包括组织培养物或卵蛋白质、非特异性病原等。本文所用的术语″基本上无″在分析性测试材料的上下文中可被操作性地使用。基本无污染物的纯化的材料优选至少50％纯，更优选至少90％纯，并更优选还有至少99％纯。纯度可通过色谱、凝胶电泳、免疫测试、组合分析、生物测试、和其它现有已知方法来评估。
纯化的方法是现有公知的。病毒颗粒可通过超滤或超离心来纯化，优选连续离心(参见Furminger，同上)。其它纯化方法在本文中也是可能的并纳入考量。纯化的材料可含少于约50％、优选少于约75％、并最优优选少于约90％的细胞成分、介质、蛋白、或其它不想要的成分或杂质(根据内容所需)，它与它们原来是相连的。术语″基本上纯″表示利用现有已知的常规纯化技术所能获得的最高程度的纯化。
在特定的具体实施方式
中，术语″约″或″近似″指统计学意义内的值的范围。该范围可以在大小的数量级内，优选在给定值或范围的50％内，更优选在20％内，更优选还在10％内，并更加优选在5％内。术语″约″或″近似″涵盖的容许变化取决于研究时的特定系统，并能由所属领域普通技术人员容易地认识到。
血凝素 血凝素(HA)是A和B型流感病毒的主要的被膜糖蛋白。在这些病毒中，C型流感病毒的血凝素-酯酶(HE)是HA同源体。通常由水鸟(已知是流感病毒的天然群体)引入的新亚型HA分子引起流感流行(参见Suzuki和Nei，MoI.Biol.Evol.2002；19(4)501-509)。
HA包含两条多肽链——HA1和HA2，由单一基因编码并源自单一前体分子的蛋白酶水解，包括丧失信号肽(Suzuki和Nei，同上；Air，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1981；78(12)7639-7643)。HA1有约320个氨基酸，是受体结合蛋白，并且是免疫应答的主要靶位。HA2有约220个氨基酸，并提供向病毒被膜的锚着(Suzuki和Nei，同上)。
根据它们的抗原性质，A型流感的HA基因被分成16种亚型。B和C型流感病毒HA(HE)基因不分成亚型。流感亚型H1至H 15和B和C型流感HA(HE)的序列示于Suzuki和Nei(同上)(图1)，其纳入参考。比较A型流感HA亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、和H12的序列，包括来自所有12种亚型的保守氨基酸残基示于Air(同上)的图，其纳入参考。这两篇引用文献公开了从中得到这些序列的菌株。
本发明的新HA分子由导入能导致抗原性增加的HA分子氨基酸序列变化而产生。分离编码该HA分子的核酸是常规的(参见Air，同上)，修饰核酸而在氨基酸序列导入变化也是常规的，如通过定点突变。
在另外的具体实施方式
中，来自特定HA亚型中的一株的HA分子已经包含相对于来自不同株的相同亚型的HA分子抗原性增加的氨基酸序列，如本文示例的A/HK/213/03相对于如A/越南/1203/04。在这种情况下，带有更大抗原性的HA分子的流感株可用作诊断参照株。在另一个具体实施方式
中，来自更大抗原性的HA的氨基酸残基可被导入或替换入较低抗原性的HA分子的序列中，从而使它成为抗原性增加的HA分子。
HA分子序列中的各种改变可导致增加抗原性。如上指明的，作为接受结合结构域和免疫应答的主要靶位的HA1链，是可在其中产生这种改变的链。这种改变可增加抗体针对HA分子的亲和性，如通过消除产生表位的糖基化位点、或通过对带有增强抗体结合亲和性的构象加以支持来产生。另外，该变化可导致降低与HA受体(如红血细胞上的唾液酸受体)的结合，使特异针对HA分子的抗体成为血凝素反应的更有效的竞争剂。能证明这些改变的各种免疫测试包括血凝素抑制(HI)测试，这是现有公知的。
HI测试包括完整的流感病毒颗粒，就如当前的疫苗一样。因此，本发明提供了带有增加抗原性的HA分子的流感病毒。该病毒最适宜通过″反向遗传学″方法产生，然而用经典的重排列来产生也是可能的。
反向遗传学方法 近来开发的反向遗传学系统能操作流感病毒基因组(Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，9311354；Neumann和Kawaoka，Adv.Virus.Res.1999，53265；Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，969345；Fodor等，J Virol 1999，739679；美国专利申请20040029251)。例如，已经证实，质粒驱动下的8种流感vRNA从polI启动子的表达和所有mRNA从polII启动子的能导致感染性A型流感病毒的形成(Hoffmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000，976108；美国专利公开20020164770，其描述的最小质粒反向遗传学系统、和其描述的基因工程方法纳入参考)。这些重组方法能特异产生针对多肽氨基酸序列进行特定改变的流感病毒类型。含所希望的替换的HA分子可以是重组流感病毒的部分。重组流感病毒可通过任何所属领域技术人员已知的方法来制备，包括遗传工程方法，如″仅有质粒″系统(Hoffmann等，Vaccine 2002，203165)。重组流感病毒可源自H5N1病毒。重组病毒可有疫苗开发中所用的H1N1病毒的遗传背景，如A/PR/8/34病毒或任何A型流感病毒，包括冷适应株A/Leningrad/134/17/57、A/Leningrad/134/47/57和A/AnnArbor/6/60。对应于HA分子序列的核酸可分离自病毒并测序。
分离并修饰特定核酸和蛋白的技术对所属领域技术人员来说是公知的。根据本发明，可利用现有技术中的常规的分子生物学、微生物学、和重组DNA技术。这些技术在文献中都有解释。如参见Sambrook，Fritsch &Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版.Cold SpringHarbor，NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989(在本文中称为″Sambrook等，1989″)；DNA CloningA Practical Approach，卷I和II(D.N.Glover编1985)；Oligonucleotde Synthesis(MJ.Gait编1984)；Nucleic AcidHybridization[B.D.Hames & SJ.Higgins编(1985)]；Transcription AndTranslation[B.D.Hames & SJ.Higgins，编(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney，编(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；Ausubel，F.M.等(编).Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley & Sons，Inc.，1994。这些技术包括利用带有改变了的核苷酸的寡核苷酸的定点突变来产生带有突变的PCR产物(如，Stratagene生产的″Quikchange″试剂盒)。
免疫测试 现有已知的各种检测抗体与抗原免疫特异结合的工具可用于检测本发明所述的结合和增加的抗原性。检测抗原和抗体间相互作用的早期方法包括通过在凝胶上沉淀来检测并分析复合物。另一个检测分析物-检测剂抗体结合对的方法包括使用与IgG反应的放射性碘标记的检测剂抗体或放射性碘标记的蛋白，如蛋白A。这些早期方法对所属领域技术人员来说是公知的，综述于Methods in Enzymology 1980，70166-198。
仅利用一种抗体来确定样品中分析物存在性的较晚的方法包括竞争结合试验。在该技术中，最常固定于固体支持物上的抗体将与已知量的标记的分析物一起暴露于怀疑含分析物的样品。然后两种分析物——标记的分析物和样品中的分析物，竞争抗体上的结合位点。确定游离的标记的分析物或结合的标记的分析物，并从该测试方法中得到样品中的竞争分析物的量。该方法的更完整的描述公开于″Basic Principles of Antigen-AntibodyReaction″(Labat，Methods in Enzymology，70，3-70，1980)。在该例子中，标记的分析物可以是标记有放射性同位素或酶标记的。
更现代的免疫测试利用双重抗体方法来检测分析物的存在性。这些技术也综述于Methods in Enzymology的以上引用的卷中。因此，根据本发明的一个具体实施方式
，针对每个要检测的标记使用一对抗体来确定各个标记物的存在。抗体对中的一个抗体在本文中被称为″检测抗体″，而所述抗体对中的另一抗体在本文中被称为″捕获抗体″。因此，本发明的一个具体实施方式
使用双重抗体三明治方法来检测生物流体样品中的分析物。在该方法中，分析物被夹在检测抗体和捕获抗体之间，捕获抗体被不可逆地固定于固体支持物上。检测抗体将含可检测的标记，从而鉴定抗体-分析物三明治的存在，由此鉴定分析物的存在。
固体支持物的早期普通形式包括聚苯乙烯板、试管或珠，它们全部都是放射免疫测试和酶免疫测试领域中公知的。最近，许多多孔材料，如尼龙、硝化纤维、醋酸纤维素、玻璃纤维、和其他多孔聚合物被用作固体支持物。
可用各种技术和相应的感应器。自动测试设备包括连续/随机存取测试设备。这种系统的例子包括PB Diagnostic System公司的OPUSTM和衣利诺伊北芝加哥Abbott Laboratories生产的IMXTM分析仪。PB DiagnosticSystem公司的自动测试仪器描述于美国专利5,051,237；5,138,868；5,141,871和5,147,609中。
可用于实现本发明的其他类型的免疫化学分析仪系统是光学免疫感应器系统。一般而言，光学免疫感应器是利用光学原理定量将感兴趣的化学或生化浓度或活性转换为电信号的装置。这些系统可被分成4大类反射技术，表面等离子体振子共振，光纤技术和集成光学装置。反射技术包括椭圆光度法、多集成反射光谱学、和荧光毛细管填充装置(fluorescentcapillary fill device)。光纤技术包括渐逝场荧光、光纤毛细管、和光纤荧光感应器。集成光学装置包括平面渐逝场荧光(planer evanescent fieldfluorescence)、输入分级偶联免疫感应器(input grading couplerimmunosensor)、Mach-Zehnder干涉计、Hartman干涉计和差分干涉计感应器(difference interferometer sensor)。当结合对的一个反应物与结合对的固定的第二反应物结合时，检测产生在预先确定的图像位置上的全息图像的存在，来完成结合反应的全息检测(参见Lichtenwalter等的美国专利5,352,582，于1994年10月4日公布)。光学免疫感应器的例子一般描述于G.A.Robins的综述文章(Advances in Biosensors 1991，1229-256)中。对这些装置的更具体的描述在例如美国专利4,810,658；4,978,503；和5,186,897；R.A.Brady等(Phil.Trans.R.Soc.Land.B.1987，316143-160)和G.A.Robinson等(见Sensors and Actuators，Elsevier 1992)中可找到。
血清学测试广泛用于确定流感诊断以及病毒株流行病学和抗原性研究中。尤其由于血凝素抑制(HI)测试最少的实验室需求并易于使用，因而其被广泛使用。预计本发明将通过增加其灵敏性而改善HI测试的适用性。HI测试也可用于显示修饰的HA分子的抗原性，并辅助表征修饰的HA分子作为比未修饰的分子抗原性更多或更少的分子。
HI测试确定来自血清样品的抗体结合标准化参照的能力。在HI测试中，系列稀释(滴度)的血清样品与标准量的红血球混合并可视化检测它们结合成复合物。测试结果是得到可视复合物的最低血清滴度水平。
如上所示，本发明提供了疫苗的改良生产和确认来治疗或预防流感病毒感染。本发明又特别适用于利用反向遗传学技术制备的疫苗。预计本发明将用于确认并查证免疫接种后的免疫应答。特别但并不排斥的是，本发明提供了在个体暴露于流感病毒后由于增强修饰的HA分子的抗原性而增强抗体检测。该增强的抗原性在增强用于检测免疫应答的测试(如HI测试)灵敏性中得到反映。
疫苗开发 如下示例的，本身含增加抗原性的HA分子的修饰的病毒更具免疫原性，其随之提供了更强的免疫应答和更好的疫苗潜力。
增强流感疫苗有效性的策略包括使用佐剂(Wood和Williams，同上)、共施用免疫刺激分子(Salgaller和Lodge，J.Surg.Oncol.1998，68122)和粘膜免疫接种策略。粘膜免疫策略包括将病毒包裹入微胶囊中(美国专利5,075,109，5,820,883，和5,853,763)并利用免疫强化膜性载体(WO 98/0558)。另外，口服施用的免疫原的免疫原性可通过利用红血细胞(rbc)或rbc外壳(美国专利5,643,577)、或通过利用蓝舌抗原(美国专利5,690,938)来增强。尽管这些方法有希望改善未来的免疫策略，但是在特定情况下使用它们需要确认并监视以确保疫苗有效性。预计本文中所述的发明将通过增加检测它们免疫原性效应的能力来增强这些策略。
实施例 以下实施例示例说明本发明的各方面，但其意并不局限于它。
实施例1接种的雪貂的血清抗体滴度 高致病性H5N1病毒得自世界卫生组织(WHO)在亚洲的合作实验室。使用这些病毒的所有工作均在St.Jude儿童研究医院的BL3+设施中进行。为了比较Z基因型的2003流感病毒(其在2004年占优势)和2004病毒的免疫原性，我们用分离自致命人病例的H5N1病毒(A/HK/213/03)(Guan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2004，1018156)和2004年分离自人、鸡、和隼的4种H5N1病毒接种雪貂(图1A)。雄性和雌性远系繁殖的雪貂通过St.Jude儿童研究医院动物资源中心的特殊饲养程序获得。动物是3-5个月大的，而且针对暴露于当前流行的A型流感H1N1、H3N2、和H5N1病毒和B型流感病毒的HI测试是血清阴性的。病毒于35℃在10天大的鸡蛋胚的尿囊腔中繁殖48h。鸡蛋胚单次传代后收获的尿囊液冻于-80℃并用于实验中。接种后28天用攻击病毒进行HI测试来滴定血清抗体。A/HK/213/03病毒诱导出高抗体滴度(1∶640-1∶1280)，而4个2004株诱导出非常低的HI滴度(1∶20-1∶40)。
针对2004H5N1病毒的相对低的HI滴度可能由于病毒诱导出综合免疫抑制(general immune suppression)产生的。可是，用包括A/HK/213/03和A/越南/1203/04的HA和神经氨酸酶的ΔH5N1-A/PR/8/34(6+2)疫苗免疫结果表明H5中的差异可能是该效应的主要贡献因素(图1B)。用2支分开施用的7μg剂量ΔH5N1/03疫苗免疫诱导出在HI和病毒中和测试中都可检测到的高水平的血清抗体(图1B)。在同样用ΔH5N1/04免疫后，在HI测试中检测到非常低(约1∶20)的滴度，而中和滴度高得多(约为ΔH5N1/03诱导出的一半)。以前的研究发现灭活的源自A/鸭/新加坡/3/97(H5N3)的疫苗几乎不或不诱导出可检测的血清抗体(Nicholson等，Lancet 2001，3571937；Stephenson等，Vaccine 2003，211687)。综合这些，这些结果表明一些H5分离株可能有不寻常的免疫原和/或抗原性质。比对H5氨基酸序列揭示出A/HK/213/03和A/越南/1203/04病毒的HA在HA1区有10个氨基酸的差异(表1b)。A/越南/1203/04病毒在天冬酰胺N154(N*154-S155-T156，N-X-S/T，X≠P)上有潜在的糖基化位点。序列比较揭示出有3个氨基酸(S120，K189和S223)出现在所有2004病毒中但不出现在A/HK/213/03中。K212是A/越南/1203/04病毒特有的。
实施例2重组ΔH5-A/PR/8/34病毒的产生与抗原表征 为了测试识别的氨基酸对免疫原性的影响和抗病毒刺激的保护作用，我们使用了8-质粒反向遗传学系统来产生重组病毒，其带有A/PR/8/34的7个基因片段和含单点突变的A/越南/1203/04的HA基因片段(Hoffmann等，Vaccine 2002，203165)。重组病毒通过DNA转染产生，其通过在裂解位点修饰H5HA而带来非致病性(Hoffmann等，Vaccine 2002，203165)。利用QuikChange
定点突变试剂盒(Stratagene，Cedar Creek，TX，美国)和一套H5HA特异性引物在PCR期间将点突变插入HA中。重排列的病毒含HA基因或HA和神经氨酸酶(NA)基因，其来自于A/PR/8/34(H1N1)病毒遗传背景中的H5N1病毒(对于该研究产生的病毒和它们的缩写名称，参见表1a)。鸡蛋胚单次传代后收获的尿囊液冻于-80℃并用于实验中。重组病毒的HA基因通过RT-PCR扩增并测序，以验证仅出现指定的突变。氨基酸改变通过测序重组病毒的HA片段来验证(表1a)。
为了评估重组HA的抗原性质和多样性，我们用一组共6种抗HA单克隆抗体进行HI测试(表2)。针对A/鸡/宾夕法尼亚/1370/83(H5N3)病毒HA的单克隆抗体(mAb)CP24、CP46、CP58、和406/7产自St.Jude儿童研究医院的传染病部。针对A/越南/1203/04病毒HA的单克隆抗体VN04-6和针对A/HK/213/03病毒HA的单克隆抗体HK03-3通过修改Kohler和Milstein所述的方法(Kaverin等，Journal of Virology 2004，78240；Koher等，EuropeanJournal of Immunology 1976，6511)来制备。5种单克隆抗体以相对高的滴度与ΔH5N1/03病毒反应，但仅有3种与ΔH5/04HA反应。ΔH5S155→N，T156→A/04、ΔH5S120-N/04和ΔH5R212→K/04病毒的反应性模式一般与ΔH5/04病毒的相似。ΔH5S120→N，S155→N，T156→A/04病毒的反应与ΔH5N1/03病毒的相似。4种单克隆抗体识别带有S223→N突变的ΔH5/04HA(ΔH5S223→N/04)。2003病毒HA中反向突变N223→S(ΔH5N223→S/03)导致显著降低HI滴度或丧失被单克隆抗体识别。
实施例3与用鸡和马红血细胞的HI测试 另一种有趣的观察结果在与鸡和马红血细胞(RBC)的HI测试中得到。有趣的是，重组ΔH5S223→N/04病毒较不能凝集1％马RBC，但它以高滴度(1∶1024)凝集鸡RBC。余下的重组病毒中没有一种在与鸡和马RBC的反应上差别这么大。
实施例4用H5突变的重组病毒免疫接种雪貂 我们通过肌肉内注射HA含量标准化的ΔH5N1/04、ΔH5/04、ΔH5S155→N，T156→A/04、ΔH5S120→N/04、和ΔH5S223→N/04病毒制剂免疫接种几组雪貂，每组3只，来评估灭活疫苗的免疫原性和保护功效。单一放射免疫扩散技术用于标准化ΔH5N1/03(Webby等，Lancet 2004，3631099)。余下的重组病毒用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，染色的凝胶通过在FUJIFILM发光成像分析仪LAS-1000plus上进行密度计量学测量法来分析，并通过比较参照蛋白制品来定量HA。接受两次注射7μgHA后，每只动物用A/越南/1203/04(H5N1)接种。几组雪貂，每组3只，通过肌肉内注射250μl含7μg灭活纯化病毒HA的无菌PBS来免疫接种。如(Liu等，Virology 2003，314580；Webby等，Lancet 2004，3631099)所述，疫苗病毒被灭活、浓缩、纯化。3只对照动物只注射250μl无菌PBS。免疫接种后第21天，收集血清并进行第二次肌肉内注射7μg HA。2周后，再次收集血清并用攻击病毒接种动物。
如前述，免疫接种动物和对照动物鼻内接种106个50％蛋感染剂量(egginfective dose)(EID50)的A/越南/1203/04病毒(Govorkova等，Journal ofVirology 2005，792191)。感染的临床征候、体重、和温度在两周内每天检测。处死表现出严重疾病征兆的雪貂。为了估计感染后的免疫应答，其他组的雪貂用106EID50的人和禽H5N1分离株A/HK/213/03、A/越南/3046/04、A/越南/3062/04、A/鸡/越南/39/04、和A/隼/HK/D0028/04接种。在接种后第28天从动物中收集血清。为了确定在上呼吸道中的病毒滴度，在第3、5、和7天洗鼻获取标本(Govorkova等，Journal of Virology 2005，792191)。在10天大的鸡蛋胚中滴定测量样品中的病毒并表示成log10EID50/0.1ml。所有免疫接种的动物的鼻洗涤物在第3天显示出病毒滴度为2.5-4.5log10EID50，第5天为0.5-2.5log10EID50，和第7天为0.25log10EID50或更少(图2)。未免疫接种的雪貂感染后一周的平均滴度为4.0log10EID50。3只对照雪貂中的两只发生了严重疾病征兆(重量大规模减轻和瘫痪)并被安乐处死，而且有一只死于感染。仅有一只免疫接种的雪貂严重生病。该只用ΔH5S120→N/04病毒免疫接种的雪貂显示出严重的神经学征兆，并在接种后第7天被安乐处死。该雪貂在接种后第4天显示出严重的病毒性结膜炎，接着病毒扩散到脑。可能在第3天洗鼻期间病毒转移到眼中并迅速通过神经扩散到脑，造成脑炎。余下的免疫接种的雪貂证明在病毒攻击后前3天活动性降低、体重丧失，并体温升高。这些症状到第5天消失，所有动物迅速恢复。因此，所有被测试的疫苗病毒都保护了雪貂免于A/越南/1203/04的致命攻击。免疫接种降低了上呼吸道中的病毒滴度，并减少了病毒脱落的持续时间。
实施例5重组ΔH5-A/PR/8/34病毒的免疫原性的HI和中和测试 在HI和病毒中和测试中测试免疫接种的雪貂血清抗重组病毒(分别为表3和4)。收集自雪貂的血清用霍乱弧菌受体破坏酶(Denka-Seiken，Tokyo，日本)处理过夜，用56℃热失活30分钟，并用0.5％的鸡红血球(CRBC)悬浮液吸收。如前述，在MDCK细胞中进行标准的HI和病毒中和测试(Palmer等，美国卫生、教育和福利部，免疫学丛书第6册，亚特兰大疾病控制和预防中心，1975；Kida等，Virology 1982，12238)。
4个红血球凝聚单位(HAU)的病毒用于每个HI测试中，而100个50％组织培养感染剂量(TCID50)用于每个中和测试中。用野生型单基因重排列病毒(ΔH5/04，参照病毒)免疫接种的雪貂的血清产生了1∶20的HI滴度。去除了糖基化位点的构建体(ΔH5S155→N；T156→A/04)诱导出1∶10-1∶20的HI滴度。突变的ΔH5HA S120→N/04产生了1∶20至1∶80的HI滴度。相反，用ΔH5S223→N/04免疫接种产生了1∶640的HI滴度，而另一种测试的免疫血清以高HI滴度(1∶160至1∶320)与ΔH5S223→N/04病毒反应。因此，尽管免疫诱导出保护性免疫，但是可检测的抗体水平是不同的。
所有的ΔH5/04病毒都在免疫后产生了高滴度的病毒中和抗体(1∶320至1∶1280)(表4)。在同源和异源中和滴度间没有观察到实质性的差异。因此，识别HA的抗血清间观察到的差异不反映抗体中和病毒的能力。
实施例6重组病毒的反应性 为了进一步评估重组病毒的反应性，我们用HI测试来测试用ΔH5N1/03和A/HK/213/03病毒免疫后得到的超免疫小鼠和鸡血清抗带有改变的HA的重组病毒的作用(表5)。对同源ΔH5N1/03病毒的平均HI滴度是1∶2560。对ΔH5/04的HI滴度是1∶160。抗重组ΔH5S223→N/04病毒的HI滴度至少是抗其他突变的滴度的两倍。
为了获得有关第223位上氨基酸对血清反应性的贡献的其他信息，我们产生了重组病毒，其中H5源自A/HK/213/03，仅带有N223→S点突变(表1a)。该重组ΔH5N223→S/03病毒在鸡和马RBC中具有比ΔH5N1/03病毒更低的HI滴度。为了进一步表征氨基酸223对抗原-抗体识别的影响，我们产生了重组病毒，其含野生型HA和来自A/鸭/新加坡/3/97的突变的S223→N HA(参见表1a)。这些病毒通过HI测试检测针对一组抗H5抗血清和单克隆抗体的能力(表6)。HA中的S223→N替换极大增加了HI滴度(增加了4或更多倍)。可是，该突变不显著改变A/鸭/新加坡/3/97HA的反应性模式，尤其在与单克隆抗体的反应中原先的和突变的HA都不与单克隆抗体HK03-3和CP46反应，并且都以低滴度与CP46反应(表6)。这些结果证明了在HA中的S223→N替换增加了HI测试的灵敏性。
实施例7预计能增加HI测试灵敏性的第二代诊断参照病毒 我们以前在以上实施例3中证明了，通过将H5HA第223位上的氨基酸转变为天冬酰胺，使用鸡红血细胞的HI测试的灵敏性增加了。我们提供了该效应的分子基础是由受体特异性改变造成的证据。灵敏性提高的突变病毒不凝集仅带有α2，3连接键的马红血细胞。因此，导致不能凝集马红血细胞的氨基酸改变是使用鸡红血细胞的HI测试中灵敏性潜力增加的候选物。该观点可适用于所有16种HA亚型，尤其是有2，3特异性的禽A型流感病毒。
反向遗传学技术能产生重组病毒，其在它们的抗原结构中具有次要的变化，但不“优化”识别不同的细胞底物。优选氨基酸(H5的91、130-134、149、151、179、186、190-191、220-225)是突变的，其接近受体结合位点或是受体结合位点的部分。可构建带有遗传工程化的HA的质粒并可通过共转染产生病毒。通过平行使用鸡红血细胞和马红血细胞的HA测试可测试重组病毒。凝集鸡红血细胞但不凝集马红血细胞的候选病毒将是用于在HI测试中的测试候选物。在互补实验中，产生了病毒，其凝集马红血细胞但不凝集鸡红血细胞。带有单氨基变化的候选物的组合可进一步增加灵敏性。预计候选物的评估将导致产生与带有2，3特异性的受体特异反应的诊断参照病毒。
表1b.H5N1流感病毒HA1蛋白中的序列差异
表2.用抗H5单克隆抗体HI分析ΔH5重组病毒
在微滴定板中用0.5％鸡RBC进行HI测试。滴度是抑制由4个红血球凝聚单位(HAU)病毒引起的血凝素的mAb的最低稀释度的倒数。
*针对A/越南/1203/04病毒的抗HA单克隆抗体；
针对A/HK/213/03病毒的抗HA单克隆抗体；
针对A/鸡/宾夕法尼亚/1370/83病毒的抗HA单克隆抗体。
表3.雪貂中A/越南/1203/04ΔH5HA重组病毒的免疫原性.
11周大的流感血清阴性雪貂通过以3周间隔两次肌肉内注射250μl PBS中含7μg HA的灭活、纯化和浓缩的病毒制剂来免疫接种。数据是来自3只雪貂分开提供的HI滴度。HI测试使用0.5％鸡RBC。
表4.病毒接种后雪貂血清的病毒-中和滴度，所述病毒含A/越南/1203/04病毒的修饰的HA
5在MDCK细胞中进行中和测试。滴度是完全能抑制100TCID50病毒的血清最低稀释度的倒数。一致的滴度被下划了线。值是3只雪貂分开提供的中和滴度。
表5.针对2003H5N1抗血清抗突变病毒的的HI测试
在微滴定板中用0.5％鸡RBC进行HI测试(Palmer等，在US Department of Health，Education and Welfare，Immunology series no.6.AtlantaCenters for Disease Control andPrevention，1975)。滴度是抑制由4HAU病毒造成的血凝素的血清最低稀释度的倒数。
本发明不局限于本文所述的特定具体实施方式
的范围内。当然，除了本文所述的那些，通过前面的说明书和附加的图，本发明的各种修饰对所属领域技术人员而言将变得显然。这些修饰要落在所附权利要求的范围内。
进一步理解的是，所有的值是近似的，供描述之用。
本文引用的所有专利和专利申请的全文都纳入本文参考。
权利要求
1.流感病毒血凝素(HA)分子，其在受体结合位点中包含氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在其受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性。
2.权利要求1的流感病毒HA分子，其在对应于H5 HA第223位的位置中包含氨基酸天冬酰胺，其中包含的天冬酰胺导致增加与源自暴露于带有野生型HA分子的流感病毒的动物的抗血清的反应性。
3.权利要求1的流感病毒HA分子，其在对应于H5 HA中第223位的位置中包含氨基酸天冬酰胺，其中所述HA分子不源于人H5分离株A/HK/213/03，并且在第223位中包括的天冬酰胺导致增加与源自暴露于流感病毒的动物的抗血清的反应性。
4.权利要求1的流感病毒HA分子，其中氨基酸替换改变糖基化位点。
5.权利要求1的流感病毒HA分子，其中流感病毒是人A型流感病毒。
6.权利要求5的流感病毒HA分子，其中人A型流感病毒是H5亚型的成员。
7.权利要求5的流感病毒HA分子，其中人A型流感病毒是A/越南/1203/04(H5N1)病毒。
8.权利要求1的流感病毒HA分子，其中人流感病毒是B型流感病毒。
9.权利要求1的流感病毒HA分子，其源自禽流感病毒。
10.重组流感病毒，其包含权利要求1的流感病毒HA分子。
11.用于制备含权利要求1的流感病毒HA分子的病毒的反向遗传学系统。
12.权利要求10的重组流感病毒，其中流感病毒HA分子源自A型流感病毒遗传背景中的H5N1流感病毒。
13.权利要求12的重组流感病毒，其中A型流感病毒是支配株病毒。
14.权利要求10的重组流感病毒，其中病毒在血凝素抑制(HI)测试中用作为诊断参照病毒。
15.血凝素抑制(HI)测试试剂盒，其包含权利要求10的重组流感病毒。
16.制备含权利要求1的HA分子的病毒的方法，该方法包括导入在反向遗传学系统中表达权利要求1的流感病毒HA分子的重组载体。
17.确定流感病毒疫苗在动物中的功效的方法，该方法包括将源自免疫接种的动物的抗血清与在流感病毒疫苗中存在的流感病毒血凝素(HA)分子反应，所述血凝素(HA)分子在受体结合位点包含一个或多个氨基酸替换，使HA分子对于特异针对受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性。
18.权利要求17的方法，其中HA分子源自人H5N1分离株A/HK/213/03，并且在来自H5N1病毒的HA中对应于第223位的位置所包括的天冬酰胺导致增加与源自免疫接种的动物的抗血清的反应性。
19.产生含血凝素(HA)分子的流感病毒的方法，该方法包括培养反向遗传学系统，在该系统中编码HA的DNA通过反向遗传学过程在受体结合位点编码一个或多个氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性。
20.增加血凝素抑制(HI)测试灵敏性的方法，该方法包括将源自免疫接种或感染的动物的抗血清与流感病毒血凝素(HA)分子反应，所述血凝素(HA)分子在受体结合位点中包含一个或多个氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性。
21.权利要求20的方法，其造成血凝素抑制(HI)测试灵敏性至少增加2倍。
22.权利要求20的方法，其造成血凝素抑制(HI)测试灵敏性至少增加4倍。
23.确定动物是否暴露于流感病毒的方法，该方法包括将源自动物的抗血清与诊断参照病毒反应，所述诊断参照病毒源自正被讨论、但包含流感病毒血凝素(HA)分子的流感病毒，所述流感病毒血凝素(HA)分子在受体结合位点中包含一个或多个氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在其受体结合位点中缺乏氨基酸替换而导致增加与抗血清反应性的HA分子的抗体更具抗原性。
24.确定动物是否暴露于流感病毒的方法，该方法包括将源自动物的抗血清与诊断参照病毒反应，所述诊断参照病毒源自所讨论的、但包含流感病毒血凝素(HA)分子的流感病毒，所述流感病毒血凝素(HA)分子在对应于H5HA中第223位的位置中包含氨基酸天冬酰胺，其中包含的天冬酰胺导致增加与源自暴露于带有野生型HA分子的流感病毒的动物的抗血清的反应性，导致增加与抗血清的反应性。
25.确定动物是否暴露于流感病毒的方法，该方法包括将源自动物的抗血清与诊断参照病毒反应，所述诊断参照病毒源自所讨论的、但包含权利要求1的流感病毒HA分子的流感病毒，所述HA分子在对应于H5HA中第223位的位置中包含氨基酸天冬酰胺，其中HA分子不源自人H5分离株A/HK/213/03并且第223位中包含的天冬酰胺导致增加与源自暴露于流感病毒的动物的抗血清的反应性。
26.权利要求17、18、23、24或25之任一的方法，其中动物是雪貂。
27.权利要求17、18、23、24或25之任一的方法，其中动物是人。
28.含血凝素(HA)分子的流感疫苗病毒，所述血凝素(HA)分子在受体结合位点中包含氨基酸替换，使HA分子对于特异针对在受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性，并且其中所述修饰导致增加所述疫苗病毒的免疫原性。
29.分离的核酸，其编码权利要求1的流感病毒HA分子。
30.分离的核酸，其编码权利要求3的流感病毒HA分子。
31.制备权利要求29的核酸的方法，该方法包括将核苷酸序列导入编码受体结合位点中缺乏氨基酸替换的HA分子的核酸中，其导致在HA分子序列中氨基酸替换，使HA分子对于针对缺乏氨基酸替换的HA分子的抗体更具抗原性。
32.权利要求23的方法，其中HA分子在对应于H5 HA中第223位的位置中包含天冬酰胺。
33.权利要求28的方法，其中流感疫苗病毒包含HA分子，所述HA分子在对应于H5 HA中第223位的位置中包含天冬酰胺氨基酸。
34.用作为治疗或预防流感病毒感染的药物的权利要求1至9之任一的流感病毒HA分子。
35.权利要求1至9之任一的流感病毒HA分子在制备治疗流感病毒感染的药物中的用途。
36.重组流感病毒，其包含用作为治疗或预防流感病毒感染的药物的权利要求1至9之任意的流感病毒HA分子。
37.含权利要求1至9之任一的流感病毒HA分子的重组流感病毒在制备治疗流感病毒感染的药物中的用途。
全文摘要
流感病毒血凝素(HA)分子的免疫原性可通过替换HA序列中的氨基酸来增强。替换特定的HA残基，如H5 HA的第223位的天冬酰胺，通过改变受体特异性和/或抗体-抗原结合来增加血凝素抑制(HI)测试的灵敏性。含这种替换的HA分子将用于开发诊断参照病毒并改良流感疫苗。
文档编号C12N5/06GK101283099SQ200680037290
公开日2008年10月8日 申请日期2006年7月28日 优先权日2005年8月4日
发明者埃里克·霍夫曼, 亚历山大·S·利帕托夫, 罗伯特·G·韦伯斯特, 理查德·J·韦比, 埃琳娜·A·戈沃科瓦 申请人:圣祖德儿童研究医院