专利名称：利用炭疽杆菌芽孢外壁在细胞表面展示目的蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及 一 种利用炭疽杆菌(Sac/〃w a"Arac^芽孢外壁蛋白 (exosporium protein)在微生物表面表达目的蛋白的方法。更特殊地涉 及一种如此构建的载体其包含用作细胞表面骨架(anchoring motif)的编 码炭疽杆菌(S"c"/w a^/zrac^芽孢外壁蛋白的bclA基因或其片段，并且 当目的蛋白表达基因在宿主细胞中进行表达时，所述目的蛋白能够以和 BclA或其片段融合的形式在细胞表面进行表达，以及利用该载体在微生 物表面表达目的蛋白的方法。
背景技术：
细菌在生物技术的发展中扮演了重要角色。特别地，由于James Watson和Francis Crick发现了 DNA双螺旋结构，微生物的DNA操作技 术已经被用于生产各种有用材料，并且由此，基于DNA操作技术将微生 物广泛地用于工业应用领域，而有效生产各种有用材料的技术已经随 DNA操作技术得到了发展。近来，生物技术，其从简单的蛋白质生产开 始，已经将其应用拓宽至各个领域。
除了基于生物技术的显著发展而新提出的技术，还有一种基于分子 生物学基础知识和蛋白质分泌及表达技术的细胞表面展示技术。细胞表 面展示为蛋白质或肽与合适的细胞表面骨架相融合以便在革兰氏阳性和 阴性菌、真菌、酵母菌及动物细胞表面进行表达的技术(Lee, S.Y.等, TrendsBiotechnol., 21:4552, 2003)。第一种细胞表面展示技术，其中肽或小蛋白质与丝状噬菌体的pIII融合并被称为表面表达系统，是由George P. Smith在1980年代中期开发的。从此，随着许多微生物分泌机制研究的 开展，细胞表面展示新方法被带入研究热点当中，其中所期望的蛋白在 微生物表面进行稳定表达。
在现有技术中，由于噬菌体表面比细菌表面更简单，因而已经对外 源蛋白在噬菌体表面的表达开展了研究。利用噬菌体的细胞表面被用于 抗体、抗原决定簇、高亲和配基等的筛选，但是其有缺点在于能在噬菌 体表面表达的蛋白质的大小相对有限(Georgious ， G.等，TV"/ 5!'Wec/mo/.,15:29,1997)。因此，作为一种替换，开发了细胞表面展示技 术，其中目的蛋白在微生物表面稳定表达，该技术利用了如细菌或酵母 菌之类微生物表面蛋白。
同时，革兰氏阴性菌具有由内层细胞膜、周质空间及外层细胞膜所 构成的独特膜结构。为了在诸如具有上述膜结构的Eco//之类细菌表面 表达外源蛋白，需要细胞表面骨架，其能够稳定有效地把要表达的外源 蛋白传送到细胞表面。为了利用细菌表面蛋白而在细胞表面表达外源蛋 白，把该外源蛋白与合适的表面蛋白在基因水平上融合以生物合成融合 蛋白，并且所获得的融合蛋白应当通过胞芽孢外壁以便附着到细胞表面 上并维持在其上。为此，应当选择具有下列性质的表面蛋白用作细胞表 面骨架，该性质如下
表面蛋白具有非常有效的分泌信号序列，其有助于外源蛋白通过内 层细胞膜以便将其传送至细胞表面，和有助于外源蛋白稳定附着在外层 细胞膜表面的目标信号，而同时，其能够传送大的外源蛋白并大规模地 稳定表达外源蛋白。直到现在还用于￡.co//的细胞表面骨架为存在于诸 如LamB、 PhoE (Agterberg， M.等，Gewe， 88:37,1990)、 OmpA等外层膜 中的蛋白质。
然而，当采用上述蛋白质时，其优势在于外源蛋白能够被插入到细胞表面的突起环(loop protruding)形式中以便被成功地在细胞表面上进 行表达，但是其缺点在于能够被插入的外源蛋白的大小受到其结构的限 制(Georgiou， G.等，iVW. 5〖Wec/mo/.,15:29,1997)。
同样地，由于所插入外源蛋白的C末端和N末端需要被三维闭合, 如果这两末端是远离的，就需要利用结合肽对这两末端进行基因改造以 便彼此之间相互接近。
当目的蛋白与所选表面骨架融合以便在细胞表面进行表达时，直到 现在，3种通用的融合方法仍被用于细胞表面表达。该方法如下在该方 法中，所要表达的外源蛋白与表面骨架的C末端融合或者该所要表达的 外源蛋白在表面骨架的C末端被除去后直接与该表面骨架融合(去除C 末端的融合)。利用果聚糖蔗糖酶进行生物转化的INP (Jung等，JVw.
16:5142,1999)，外层细胞膜蛋白C (OmpC)表面表达组氨酸 (Xu和Lee，￡"vz>o". M/croWo/., 65:5142,1999)，用于展示脂肪酶 对映选择性(enantioselectivity)反应中的FadL ((Lee等，￡wvz>ow. ^Mfcw^/o/., 70:5074, 2004)禾口 OprF (Lee等，￡"v/ra". Af/cra6/o/., 71:8581,2005)，这些都能够被用于该方法中。
与上述方法相反，有一种方法，其中所要表达的目的蛋白与表面骨 架的N末端融合。诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A 之类的革兰氏阳性菌(Gunneriusson， E.等，S""en'o/, 178:1341， 1996), 金黄色葡萄球菌纤连结合蛋白B (Stasuss, A.等，Mo/. MfcroWo/., 21:491, 1996)，酿脓葡萄球菌(Staphylococcus pyogenes)的丝状M蛋白(Pozzi, G.等，/"/e"./附m朋.，60:1卯2， 1992)都能够用于该方法中。革兰氏阴性 菌，例如，五.co/Z则不能用于本方法中。
以及，三明治融合法，其中细胞表面所要表达的外源蛋白被融合到 用作表面骨架的蛋白质之间。各种蛋白质，例如PhoE(Agterverg，M.等, G謝，88:37, 1990)、 FimH (Pallesen, L., M/cra6油gy， 141:2839, 1995)和PapA (Steidler, L.等，J 5""e〃'o/., 175:7639， 1993)都被用于在￡.co〃 表面表达目的蛋白。但是该方法不能克服外源蛋白无法容易地被融合的 缺点，所表达的外源蛋白被频繁地灭活并且能够被插入的外源蛋白的大 小被限制为60 70个氨基酸(Georgiou, G等，淑,15:29, 1997; Stahl, S.等，7>em& 5〖ofec/mo/" 15:185, 1997)。
如上所述，采用了细菌分泌系统的细胞表面展示在生物技术中有着 广泛的应用，而且其可以由要在细胞表面进行表达的外源蛋白类型所决 定。含有源自病原体的抗原决定簇的细菌疫苗能够被应用在患者身上以 诱导与利用减毒病原菌或病毒的传统疫苗相比更为强壮更持久的免疫应 答(Nguyen, T.N.等，128:89, 1993)。各种肽或抗体的筛选，如果 在细胞表面表达特定Fab或单链抗体以及上述重组活体疫苗，能够简单 地被实施(Francisco, J.A.R.等，胸/.爿cac/. Sc/. USA, 1:10444, 1993)。此外，该技术对诸如通过给动物施加表达特定抗原的细菌所进行 的抗体制备之类的应用而言是很有价值的(Charbit,A.等，Gewe, 70:181, 1988)，用于通过在其表面表达金属吸收蛋白的微生物来去除重金属离子 或处理废水的整细胞吸收剂(Sousa， C.禁 / 5fl"en'o/., 180:2280, 1998)， 以及利用了生物转化用的酶所进行的整细胞生物转化，该酶在细胞表面 稳定表达并被连续使用而不会降低催化活性(Richins, R.筝， 15:984, 1997)。
因此，急需开发用于各种生物技术领域的细胞表面展示技术，尤其 是开发一种可以在细菌表面稳定有效地大规模表达目的蛋白的方法，新 的表面骨架以及利用了该骨架的表面表达载体。
因而，本发明人作出了大量努力来开发表面骨架，其能够在微生物 表面有效表达外源蛋白，把所表达的蛋白传送至细胞表面，并稳定地过 量表达(overexpress)大的外源蛋白，以及利用了该骨架的载体，结果 发现，如果利用源自炭疽杆菌(Bacillusanthracis)的芽孢外壁蛋白BclA作为细胞表面骨架来构建重组表达载体，外源蛋白就可以在转化体的表面 进行有效地过量表达，由此完成了本发明。
发明内容
由此，本发明的目的在于提供一种表面表达载体及用该表面表达载 体转化的微生物，所述表面表达载体含有作为细胞表面骨架的编码炭疽 杆菌fSflC/〃W a"^m^芽孢外壁的6c"基因或其片段和编码目的蛋白的基因。
本发明的另一目的在于提供通过培养所述转化的微生物而在细胞表 面大规模稳定表达目的蛋白的方法。
本发明的另一目的在于提供用于制造蛋白质阵列的方法、制备抗体 的方法、生物转化的方法，该方法的特征在于使用了根据上述方法在表 面表达的目的蛋白，以及采用了生物素与在其表面表达链霉素的转化体 之间相互作用的整细胞生物传感器。
为了实现上述目的， 一方面，本发明提供一种表面表达载体，所述
表面表达载体含有作为细胞表面骨架的编码炭疽杆菌(Sac///^ "w^mc^ 芽孢外壁的^"基因或其片段和编码目的蛋白的基因，其中所述表达载 体被构建成当在宿主细胞中表达编码目的蛋白的基因时在细胞表面以与 BclA或其片段融合的形式所表达的目的蛋白。
本发明，在另一方面，提供通过把表达载体引入细胞所获得的转化
微生物，所述细胞从由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、放线菌、酵母菌 及真菌所构成的组中选取。
本发明，在其它另一方面，提供在细胞表面表达目的蛋白的方法， 该方法包括如下步骤通过培养转化的微生物在细胞表面表达目的蛋白； 以及回收在其表面表达目的蛋白的细胞。
本发明，在其它另一方面，提供一种生物转化方法，该方法的特征在于利用由上述方法所制备的在其表面表达具有酶活性目的蛋白的细 胞。
本发明，在其它另一方面，提供一种制备蛋白质阵列的方法，该方 法的特征在于把由上述方法所制备的在其表面表达目的蛋白的细胞附着 在基质上。
本发明，在其它另一方面，提供用于在脊椎动物中制备抗体的方法， 该方法包括如下步骤(a)通过把上述方法所制备的在其表面表达抗原 的细胞施用于除人以外的脊椎动物来诱导免疫应答；以及(b)回收通过 免疫应答所产生的抗体。
本发明，在其它另一方面，提供用于通过利用脂肪酶对外消旋酯混 合物进行光学拆分来制备诸如手性酯、手性有机酸或手性乙醇之类手性 化合物的方法，该方法的特征在于利用了由上述方法所制得的细胞表面 上表达的脂肪酶。
本发明，在其它另一方面，提供一种整细胞生物传感器，其包括转 化有含编码链霉素的基因和源自炭疽杆菌fSac///^ ""Arac^的芽孢外壁 蛋白BclA的基因的表达载体，所述芽孢外壁蛋白用作细胞表面骨架，而
所述链霉素则用作有效成分。
本发明，在其它另一方面，提供一种改善目的蛋白的方法，该方法
包括如下步骤(a)建立编码目的蛋白的基因突变文库；(b)构建含有 编码目的蛋白的基因突变文库及bclA基因的基因重组体；(C)用该基因 重组体或含有该基因重组体的载体转化宿主细胞，所述宿主细胞选自由 革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、放线菌、酵母菌及真菌所构成的组；(d) 通过培养经转化的宿主细胞在细胞表面表达基因突变文库；(e)对在其 表面表达有改善性质的目的蛋白的细胞进行筛选。
通过下列具体描述以及所述权利要求将清楚地理解本发明的上述和 其它特征及实施方式。
图1显示利用炭疽杆菌fBa"7/w an AracW芽孢外壁BcIA的细胞表面 展示的结构特征。
图2-图4分别为表达载体pTJl-BAN、 pTJl-BANC及pTJl-BAF的
基因图谱。
图5-图7分别为表达载体pTJl-BAN-ScFv-SA、pTJl-BANC-ScFv-SA 以及pTJl-BAF-ScFvSA的基因图谱。
图8为显示了细胞外层膜蛋白在SDS-PAGE凝胶上分析结果电泳图， 该外层膜蛋白分离自转化有表达载体pTJl-BAN-Lipl、 pTJl-BANC-Lipl 及pTJl-BAF-Lipl的重组五.co//。
图9显示转化有表达载体 pTJl-BAN-ScFv-SA 、 pTJl-BANC-ScFv-SA以及pTJl-BAF-ScFv-SA的重组五.co//的流式细胞 分析结果。
图10显示利用流式细胞仪和共聚焦显微镜对转化有表达载体 pTJl-BAF-EGFP的重组五.co//进行分析的结果。
具体实施例方式
一方面，本发明涉及表面表达载体,其含有编码BclA的6c"基因， 编码作为细胞表面骨架或其片段的炭疽杆菌(S""7/w训Ara"》芽孢外壁 蛋白的基因，当在宿主细胞中表达编码目的蛋白的基因时，上述表面表 达载体被构建成该目的蛋白能够在细胞表面通过与BclA或其片段相融 合的形式进行表达，涉及转化有该表达载体的微生物，以及用于在利用 该载体的微生物表面表达目的蛋白的方法。
在本发明中，6c"基因的片段优选为6cM基因序列号1的N末端 和6c"基因中间部分被去除的序列号2的N末端和C末端，以及序列 号- 3在本发明中，所用的启动子优选为tac启动子或任何其它可诱导的启
动子，并且目的蛋白优选为通过去除目的蛋白的一部分氨基酸序列所制 备的蛋白质或者经过位点特异性变异的蛋白质以便于目的蛋白的表达。 在本发明中，用于转化的微生物优选经过变异的微生物，所述变异 为不产生降解所表达的目的蛋白的胞内或胞外蛋白酶，以便于目的蛋
白的表面表达，更优选为大肠埃希氏菌(Eschen'c/n》co^。
在本发明中，目的蛋白优选为从下列组中所选择的一种激素、激 素类似物、酶、酶抑制剂、信号传导蛋白或其片段、抗体或其片段、单 链抗体、结合蛋白、结合域、肽、抗原、粘附蛋白、结构蛋白、调节蛋 白、毒素蛋白、细胞因子、转录因子、凝血因子以及植物防御诱导蛋白 (plant defense-inducing proteins)。目的蛋白优选链霉素而酶则优选脂肪 酶。
为了成功地进行细胞表面展示，本发明人选择BdA，将源自炭疽杆 菌(Baa7/ws朋AmcW的芽孢外壁蛋白作为细胞表面骨架，其具有非常丰 富的分泌信号序列和能够使目的蛋白被稳定地粘着在外层细胞膜表面上 的目标信号，并能够传送大的目的蛋白和大规模稳定表达目的蛋白。此 外，根据本发明的BclA对细胞表面展示和大规模稳定表达目的蛋白以及 对成功的细胞表面展示单个炭疽杆菌^fl"7/w朋Arac^孢子而言是有效 的。
图1为显示利用BclA，炭疽杆菌0ac/〃w a"Arac/^芽孢外壁蛋白 (Ptoc; tac启动子，BA-N; BclA的N末端BA-RD; GXX氨基酸重复 区域，BA-C;重组外源蛋白)的细胞表面展示所得到的特征性结构示意 图。也就说，按照图1所示，在炭疽杆菌^"c/〃w朋Arac^芽孢外壁蛋 白BelA的结构中，不管炭疽杆菌(Bflc〃/w a"/Z^ac/"的种类，N末端和 C末端占据相同的氨基酸序列，3个氨基酸((GPT) ^GDTGTT)重复 显示于蛋白质的中间(Sylvestre等，Mo/. M/craWo/., 45:169， 2002;Sylvestre等，J！ Ba"e"'o/.， 185:1555， 2003)。
BclA为具有由40个氨基酸所构成的N末端胶原类似蛋白和由138 个氨基酸所构成的C末端胶原类似蛋，特别地，不管N末端是否存在特 性分泌信号序列其对于细胞表面展示而言都是有效的(Sylvestre等,Afo/. Af!cra6!W" 45:169, 2002; Sylvestre等，5a"en'o/.， 185:1555， 2003)。
由此，本发明人预测了BclA,炭疽杆菌^^///^0"^^"'^芽孢外壁 蛋白的结构以便利用含整个或部分芽孢外壁蛋白的表面骨架来表达目的 蛋白。
为了获得编码源自炭疽杆菌fBfl"7/"s朋决m"》的芽孢外壁蛋白的 6c"基因，利用de novo合成法通过被Blue Heron Biotechnology公司 (Boteli， WA， USA)所分散的6cL4基因合成了炭疽杆菌^"c///^ ""//irac^ RA3(NCBI登录号CAD56878)的6c"基因(NCBI登录号AJ516945)。 利用PCR(聚合酶链式反应)把DNA片段中长约762bp的五co及I和^al 位点，由此合成，与多克隆位点一起插入到质粒pTAC99A当中(Park和 Lee,胸ec/z"o/. rec/z.,12:815,1998)以便插入目的蛋白基因，由此制得 重组质粒，PTJ1-BA。
在所制备的重组质粒pTJl-BA中，炭疽杆菌^flc///^ fl"ZArac/^芽孢 外壁蛋白BclA通过引入tac启动子而得以表达。对于要在细胞表面表达 的模式蛋白而言，ScFv (肝炎病毒B表面蛋白的单链抗体)与cSA (核 心链霉素)相融合形式的基因被插入到存在于芽孢外壁蛋白C末端的限 制性酶和切割位点中，由此制得重组表达载体 pTJl-BAN-ScFv-SA (图 7 ) 。 pTJl-BANC誦ScFv-SA 以及 pTJl-BAF-ScFv-SA采用与上述相同的方法制得，为了检测所述重复氨基 酸序列，(GPT) L8GDTGTT是从N末端中被去除了，或者N末端和C 末端的融合形式能够作为表面骨架被用于￡.^//表面(图5和图6)。
此外，通过与制备单链抗体和链霉素相同的方法制备了与融合蛋白基因与脂肪酶融合的pTJl-BAN-Lipl和pTJl-BANC-Lipl以及 pTJl-BAF-Lipl 。
所制备的重组表达载体pTJl-BAN-Lipl禾n pTJl-BANC-Lipl或 pTJl-BAF-Lipl被引入到￡.co//、XLl-Blue菌株中进行培养由此所获得转 化体以及表达诱导因子，例如往肉汤培养基中加入IPTG (异丙基-P-硫代 半乳糖苷)以诱导表达，随后取一定量的肉汤培养物以分离外层细胞膜 蛋白，然后利用SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠聚酰胺凝胶电泳)分析所 分离的蛋白。结果，证实所分离的蛋白被成功地引入BclA，在细胞表面 表达的炭疽杆菌(Bacillus anthracis)芽孢外壁蛋白当中，还发现BclA的量， 期望蛋白融合的炭疽杆菌(Bacillus anthracis)芽孢外壁蛋白占整个芽孢外 壁蛋白的30% 45%，表示其速度非常快(图8)。
此外，利用生物素包被的荧光珠通过蛋白质-配体相互作用来检测在 转化了所制备的重组表达载体pT J1 -B AN- S cF v- S A 、 pT J1 -B ANC - S cF v- S A 或pTJl-BAF-ScFv-SA之后，五.co/f的外层细胞膜上所成功表达的链霉素 (目的蛋白)是否具有活性。结构发现，如果细胞表面上表达了与 BclA-ScFv-SA融合的蛋白质，生物素被成功地结合到细胞表面的链霉素 上，由此产生高水平的荧光(图9)。该结果提示所有在外层细胞膜上所 表达的链霉素(目的蛋白)都表达于该细胞的外表面上。特别地，已经 发现约40kDa的重组蛋白，其相对较大，被插入其中以便成功表达于细 胞表面，由此提示该创造性的BclA，炭疽杆菌(Bac///^ aw^rac^)芽孢外 壁蛋白是非常有效的表面骨架。
在本发明中，如果目的蛋白在细胞中或细胞外表达，该目的蛋白基 因可以是一个或者是超过两个的重复基因，或者该超过两个的重复目的 蛋白基因可以是相同的基因也可以是不同的基因，并且该目标基因也可 以是上述任何组合。
本领域技术人员容易理解根据本发明的方法所制备的基因能够独立出现在质粒中或被插入到宿主菌的染色体中。
本领域技术人员也容易理解目的蛋白表达的诱导能够通过能诱导宿 主细胞中内表达的启动子、目的蛋白基因的启动子或其它能够在宿主细 胞中表达的启动子来实现。
同时，根据本发明的方法可以应用于所有蛋白质和用于修饰及表面 表达蛋白质，该蛋白例如是激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号传 导蛋白或其片段、抗体或其片段、单链抗体、结合蛋白、结合域、肽、 抗原、粘附蛋白、结构蛋白、调节蛋白、毒素蛋白、细胞因子、各种调 节因子及其片段。
有多种方法来证明通过上述创造性表达方法在微生物外层细胞膜上 表面表达的目的蛋白存在于细胞表面上。该方法如下；通过把一抗结合 到于微生物外层细胞膜上表面表达的目的蛋白上从而对孢子进行荧光染 色，并且使其与荧光标记的二抗反应以便利用荧光显微镜进行观察或者 利用流式细胞仪进行分析。此处，如果二抗用金标记则能够利用电镜来 观察该目的蛋白。
一种检测酶活性是否降低或荧光显微镜或流式细胞仪信号是否变弱 的方法，该方法基于表面表达的蛋白被外部蛋白酶所降解。
以及一种在目的蛋白为酶的情况下的方法，其利用聚合物材料作为 底物，其中由于测定酶活性时该底物无法在孢子外层表面之间通过，那 么目的蛋白的存在就能够通过测定暴露于细胞表面的酶的酶活性来证 明。
在另一方面，本发明涉及生物转化方法，该方法的特征在于利用了 上述方法所制备的细胞并在其表面表达具有酶活性的目的蛋白。
在其它另一方面，本发明涉及制备手性化合物的方法，例如手性酯、 手性有机酸或手性乙醇，其通过利用脂肪酶对外消旋酯化合物的光学拆 分来实施，该方法的特征在于利用了在根据上述方法所制备的细胞的表
15面表达的脂肪酶。
在其它另一方面，本发明涉及蛋白质阵列制造方法，该方法包括把 细胞附着在基质上，所述细胞通过上述方法制备并且能在其表面表达目 的蛋白。
蛋白质阵列提供通过把各种蛋白，尤其是表面抗体阵列在诸如DNA 芯片或DNA阵列等固体表面上来分析目的蛋白在特定细胞中的表达或 非表达以及表达水平的方法。为了制造蛋白质阵列，制备了所要阵列的 蛋白质，随后固定于固体表面上。由于利用蛋白质阵列的分析程序包括 把与基质上所固定的蛋白质相结合的步骤，以及去除在各种高温、盐浓 度基pH变化条件下基质上未结合蛋白的清洗步骤，因此其需要对蛋白进 行稳定的固定以克服该严苛条件。
然而，在固定于固体表面之前把成千上万的蛋白质基因克隆到表达
载体中、表达并分离蛋白基因的过程要求多个重复操作。因此，该过程
需要以简便的方式实施。
根据本发明的蛋白质阵列制备方法提供以最简单的方式进行上述程
序的方法。根据该创造性方法，上述方法所表达的目的蛋白被分离以固 定在固体表面。至于本发明所述蛋白质阵列的制造过程，其可以使用现 有技术中方法(WO 00/61806; WO 00/54046; US 5, 807,754; EP 0818467; WO 97/42507; US 5,114,674; WO 96/35953)。根据本发明制备的蛋白质阵 列可以应用于检测试剂盒、基因表达分析、蛋白质之间或蛋白质与其它 配体之间以及抗原抗体之间的相互作用、代谢途径分析、新酶或改善的 酶的寻找、组合生物合成以及生物传感器。
能用于本发明的固定基质可以包括玻璃(例如功能基外露的玻璃)、 Si、 Ge、 GaAs、 GaP、 SiO、 SiN4、经修饰的硅硝化纤维、偏二氟乙烯、 聚苯乙烯、聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、尼龙、纤维或其组合物。为了固定 蛋白质所述基质可以与连接分子相连接，并且未固定蛋白质的其它区域优选被封闭。
在其它另一方面，本发明涉及在脊椎动物中制备抗体的方法，该方 法包括步骤(a)通过把上述方法所制备的在其表面表达抗原的细胞施 用于除人以外的脊椎动物来诱导免疫应答；以及(b)回收通过免疫应答 所制备的抗体。
在其它另一方面，本发明涉及一种整细胞生物传感器，其包括转化 有含编码链霉素的基因和编码源自炭疽杆菌fSa"7/w ^&rac^的芽孢外 壁蛋白的Sc"基因的表达载体，所述芽孢外壁蛋白为细胞表面骨架而所 述链霉素表达基因则用作有效成分。在本发明中微生物转化体优选为
在其它另一方面，本发明涉及一种改善目的蛋白的方法，该方法包 括步骤(a)建立编码目的蛋白的基因突变文库；(b)构建含有编码目 的蛋白的基因突变文库及&"基因的基因重组体；(C)用该基因重组体 或含有该基因重组体的载体转化宿主细胞，所述宿主细胞选自由革兰氏 阳性菌、革兰氏阴性菌、放线菌、酵母菌及真菌所构成的组；(d)通过 培养经转化的宿主细胞在细胞表面表达基因突变文库；(e)对在其表面 表达有改善性质的目的蛋白的细胞进行筛选。
在本发明中，筛选步骤优选利用目的蛋白、识别标记在目的蛋白上
的物质的蛋白、与目的蛋白结合的标记配体、或者与目的蛋白特异性结 合的抗体的活性。
在根据本发明的改善目的蛋白的方法中基因文库的构建可以通过使 目的蛋白的野生型基因变异来实现，可以利用DNA改组技术(Stemmer, 淑騰，370:389, 1994) StEP法(Zhao， H.等，舰5o&由o/., 16:258, 1998)、分子育种技术(Shao, Z.等，齒c/e/d油M, 26:681， 1998)、 ITCHY法(Lutz, S.等，Qp/. 5她c/mo/. 11:319, 2000)、易错PCR (Cadwell, R.C.等，PCi MeAo&2:28, 1992)、点突变(Sambrook等，Mo/ecw/dT C7ow'wg .■爿丄a6orafo/^ Mawwa/, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)，但其不限于这些方法。
在根据本发明的改善目的蛋白的方法中，筛选步骤可以通过测定蛋 白质活性或FACS分析来快速地实施(Georgiou, G.., Adv. Protein Chem., 55:293, 2000)。在采用蛋白质活性的情况下，筛选步骤能够通过测定宿 主细胞生长的方法来实施，在该宿主细胞生长过程中蛋白质被表达或者 蛋白质催化颜色反应。此外，在该利用孢子抗性来改善目的蛋白的创造 性方法中，该筛选步骤可以通过利用蛋白质活性或蛋白质结构稳定性来 快速实施。
当采用根据本发明具有上述特性的改善蛋白质的方法时，从野生型 酶中可以快速获得可以生物催化无法发生的化学反应的酶，该化学反应 不能容易地通过传统方法来实现(例如Diels-Alder縮合反应)、具有非 天然的立体选择或区域选择活性的酶、能够在有机溶剂中或有机溶剂的 水溶液中进行催化反应的酶、能够在诸如高压和高温等极端条件下催化 反应的酶，其通过传统方法无法容易地实现。
同样地，用于改善蛋白质的创造性方法可以解决细菌被重新接种到 培养基中，此时为了筛选具有被改善的结合力的抗体突变体而通过pH大 幅度变化或调节碱浓度来进行洗涤时，可解决细菌存活率下降的问题。
同时，既然已经证明为有效诱导蛋白质-配体反应，转化了所构建载 体以表达作为外源蛋白的链霉素的微生物能与生物素相结合，因此本发 明能通过蛋白质-配体相互反应而被应用于生物传感器，其包括转化有所 构建的表达载体的转化体以便该表达载体在细胞表面以链霉素与BclA 相融合的形式进行表达，该融合蛋白被用作有效成分。
此外，在炭疽杆菌(》0"7/^^"^^^^芽孢外壁蛋白BclA已经与绿色 荧光蛋白融合之后利用共聚焦显微镜观察荧光物质在重组五.co//中的表 达(图10)。结果发现绿色荧光蛋白在转化有重组表达载体的Eco/zV7lWM表面成功地进行了表达，与细胞内表达的绿色荧光蛋白不同，其表达与
BdA相融合的绿色荧光蛋白。因此，根据本发明的重组￡.^//能用作利 用蛋白质-配体相互作用的生物传感器和利用细胞表面所表达蛋白质的 荧光传感器。
实施例
本文通过实施例对本发明作进一步具体的描述。然而本领域技术人员 清楚地知道这些实施例仅是阐述性的，本发明的范围并不限于这些实施 例。
特别地，作为外来基因，不仅下列实施例中的链霉素基因而且各种目 的蛋白或肽基因都被引入本发明所述的用于表达这些基因的表达载体 中，pTJl-BAN、 pTJl-BANC、 pTJl-BAF。由此，插入了各种基因的重 组表达载体，pTJl-BAN、 pTJl-BANC、 pTJl-BAF也都应当被考虑在本 发明的范围中。
实施例l:重组表达载体DTJ1-Ba的构建
为了获得炭疽杆菌fBac///^ a"Arac^芽孢外壁BclA基因，合成炭疽 杆菌(Ba"7/"j fl"Ara"》RA3 (NCBI登录号CAD56878)的BclA基因 以进行采用该合成基因作为模板的PCR。该PCR在下列条件下实施94'C 下预变性7分钟，94'C下第二次变性1分钟，55'C下退火1分钟，72'C 下延伸1分钟，，30次循环，最后在2'C下延伸7分钟；引物，序列号 4和序列号5。
序列号4: 5，-GGAATTCATGTCAAATAATAATTATTC-3，
序列号5:
5 ， -CGTCTAGACTCGAGGCTAGCCCCGGGAGCAACTTTTTC AATAA-3' 利用琼脂糖凝胶电泳分离通过PCR所获的770bp的DNA片段，并用两种限制性酶EcoRI和X6d进行消化。同时，利用两种限制性酶EcoRI 和」Gal对含有可诱导且强壮的tac启动子的质粒pTac99A (Park和Lee， Biotechnol. Techn.,12:815,198)进行消化，随后用T4 DNA连接酶进行连 接，然后利用电穿孔转化到￡. //乂1^1-811^中。在含抗生素氨苄青霉素 (100貼/mL)的LB琼脂糖培养基中对该转化菌株进行筛选，由此获得 重组质粒pTJl-BA。
在通过上述描述所制备的重组质粒pTJl-BA中，能够利用强壮的可 诱导的tac启动子对作为表面骨架的芽孢外壁蛋白BclA基因进行表迖。 该重组质粒pTJl-BA的多克隆位点包括限制性酶Xmal和J^oI切割位点， 而将在细胞表面表达的目的蛋白基因则被插入到该切割位点当中。
实施例2:重组载体pTJl-BAN、 dTJ1-BANC、 pTJ1-BAF的构建
被用作细胞表面骨架的炭疽杆菌(Ba"7/w a"^rac/W BclA在N末端 和C末端之间具有重复氨基酸序列，(GPT) lsGDTGTT， (Sylvestre等, Mo/. A//cro6/o/.,45:169,2002)。
2-l:重组表达载体pTJl-BAN的构建
为了检测是否仅有N末端能够被用作细胞表面骨架，把每个细胞表 面骨架进行消化以便它们能够和目的蛋白融合。
为了构建利用BclA基因N末端作为细胞表面骨架的质粒，在下列 条件下实施PCR反应94'C下预变性5分钟，94'C下第二次变性30秒， 56"C下退火30秒，72"C下延伸30秒；循环30次，最后在72'C下延伸7 分钟；引物为实施例1中的序列号4以及序列号6。 序列号6:
5 ，-AGTCTAGACTCGAGGCTAGCCCCGGGGGTAGGAAGGGTAAATGG-3 ， 利用琼脂糖凝胶电泳分离通过PCR所获的90bp的DNA片段，并用 两种限制性酶五coRI和Wal进行消化。同时，利用两种限制性酶五coRI和Z6al对含有可诱导且强壮的tac启动子的质粒pTac99A (Park和Lee， Biotechnol. Techn.,12:815,198)进行消化，随后用T4 DNA连接酶进行连 接，然后利用电穿孔转化到￡.0 //乂1^-81116中。在含抗生素氨苄青霉素 (100pg/mL)的LB琼脂糖培养基中对该转化菌株进行筛选，由此获得 重组质粒pTJl-BAN。
在通过上述描述所制备的重组质粒pTJl-BAN中，能够利用强壮的 可诱导的f"c启动子表达作为表面骨架的芽孢外壁蛋白BclA基因的N末 端。该重组质粒pTJl-BAN的多克隆位点包括限制性酶和Z/zo1切 割位点，而将在细胞表面表达的目的蛋白基因则被插入到该切割位点当 中。图2显示了上述所构建的重组表达载体的基因谱图。
2-2:重组表达载体pTJl-BANC的构建
为了检测是否仅有BclA的N末端和C末端，(GPT) lsGDTGTT被 从中删除，能够被用作细胞表面骨架，把每个细胞表面骨架进行消化以 便它们能够和目的蛋白融合，重复氨基酸序列。
为了检测是否BclA基因的N末端和C末端的融合形式能够被用作 表面骨架，每个表面骨架被设计成能够和目的蛋白进行融合。
为了构建利用BclA基因N末端和C末端作为细胞表面骨架的质粒 而进行了PCR反应。BclA的N末段基因利用实施例1中的引物序列号 4以及序列号7来扩增，而BdA的C末段基因则利用实施例1中的引 物序列号5以及序列号8来扩增。
序列号7:
5 ， -CCTAGTCCGGATGGCCCGGTAGGAAGGGTAAATGGT-3' 序列号8:
5'-ACCATTTACCCTTCCTACCGGGCCATCCGGACTAGG-3, 既然每个这样扩增的BclA的N末端和C末端的DNA都具有重叠的 序列，那就在如下条件下利用引物序列号4和序列号5对它们进行再次扩增94。C下预变性5分钟，94'C下第二次变性45秒，56。C下退火45 秒，72t:下延伸40秒，30次循环；最后在72"C下延伸7分钟。
利用琼脂糖凝胶电泳分离通过PCR所获的560bp的DNA片段，并 用两种限制性酶五coRI和XZ>"I进行消化。同时，利用两种限制性酶EcoRI 和X6al对含有可诱导且强壮的toc启动子的质粒pTac99A (Park和Lee， Biotechnol. Techn.，12:815,198)进行消化，随后用T4 DNA连接酶进行连 接，然后利用电穿孔转化到￡."//乂1^1-811^中。在含抗生素氨苄青霉素 (lOOpg/mL)的LB琼脂糖培养基中对该转化菌株进行筛选，由此获得 重组质粒pTJl-BANC。
在通过上述描述所制备的重组质粒pTJl-BANC中，能够利用强壮的 可诱导的toc启动子来表达作为表面骨架的芽孢外壁蛋白BclA基因的N 末端和C末端的融合基因。该重组质粒pTJl-BANC的多克隆位点包括限 制性酶和切割位点，而将在细胞表面进行表达的目的蛋白基 因则被插入到切割位点当中。按照上述所构建的重组表达载体的基因谱 图显示于图3中。
2-3:重组表达载体pTJl-BAF的构建
为了检测是否BclA的N末端，重复氨基酸序列(GPT) lsGDTGTT， 以及C末端能够被用作细胞表面骨架，把每个细胞表面骨架进行设计成 可以和目的蛋白进行融合。
为了检测BclA基因是否能够用作表面骨架，每个表面骨架被设计成 能够与目的蛋白进行融合。
为了构建把BclA基因用作细胞表面骨架的质粒，在下列条件下通过 PCR扩增BclA基因94T:下预变性5分钟，94。C下第二次变性45秒， 56。C退火45秒，72。C下延伸1分钟，30个循环，最后在72。C下延伸7 分钟；引物为实施例1中的序列号4和序列号5。
利用琼脂糖凝胶电泳分离通过PCR所获的780bp的DNA片段，并
22用两种限制性酶五coRI和Wal进行消化。同时，利用两种限制性酶￡coRI 和Z6fll对含有可诱导且强壮的toc启动子的质粒pTac99A (Park和Lee， 5/o&c/mo/. rec/m., 12:815,198)进行消化，随后用T4 DNA连接酶进行连 接，然后利用电穿孔转化到￡."//乂1^1-81116中。在含抗生素氨苄青霉素 (10(Hig/mL)的LB琼脂糖培养基中对该转化菌株进行筛选，由此获得 重组质粒pTJl-BAF。
在通过上述描述所制备的重组质粒pTJl-BAF中，能够利用强壮且可 诱导的toc启动子表达作为表面骨架的芽孢外壁蛋白BclA基因。该重组 质粒pTJl-BAF的多克隆位点包括限制性酶Xmd和Wol切割位点，而 将在细胞表面表达的目的蛋白基因则被插入到该切割位点当中。图4显 示了上述所构建的重组表达载体的基因谱图。
实施例3:重组表达载体，dTJ1-BAN-ScFv-SA、 dTJ1-BANC-ScFv-SA 以及dTJ1-BAF-ScFv-SA和pTJl-BAN画Lipl 、 pTJl-BANC國Lipl及 pTJl-BAF-Lipl的构建
作为细胞表面表达的模式蛋白，重组表达载体，pTJl-BAN-ScFv-SA、 pTJl-BANC-ScFv-SA以及pTJl-BAF-ScFvSA和pTJl-BAN-Lipl ^ pTJl-BANC-Lipl及pTJl-BAF-Lipl通过利用单链抗体和链霉素及脂肪酶 来构建。
3-1重组表达载体，pTJl-BAN-ScFv-SA、 pTJl-BANC-ScFv-SA以 及pTJl-BAF-ScFv-SA的构建
为了获得单链抗体和链霉素的融合蛋白基因，在下列条件下实施 PCR反应94。C下预变性5分钟，94r下第二次变性30秒，56。C退火 30秒，72'C下延伸1分钟10秒，30次循环；最后在72"C下延伸7分钟；
引物，序列号9和序列号10。
序列号9: 5'-TTTACCCGGGTCGACTGAGGAGTCTGGA-3'序列号10:
5，-CTAGCTAGCCTCGAGTTACGGCTTCACCTTGGT-3， 利用琼脂糖凝胶电泳分离通过PCR所获的1120bp的DNA片段。由 于单链抗体和链霉素融合基因在5'末端具有位点，在3、末端则具 有X/zoI和A^el位点，用％mfll和进行消化。消化的DNA片段被插 入到与实施例2中利用T4 DNA连接酶所制备的pTJl-BAN、pTJl-BANC 及pTJl-BAF的相同位点当中，然后通过电穿孔转化入五.co/ZJM109中。 在含抗生素氨苄青霉素(100|ng/mL)的LB琼脂糖培养基中对该转化菌 株进行筛选，由此获得重组质粒 pTJl-BAN-ScFv-SA 、 pTJl-BANC-ScFv-SA和pTJl-BAF-ScFv-SA (图5-图7)。
3-2:重组表达载体pTJl-BAN-Lipl、 pTJl-BANC-Lipl禾D pTJl-BAF-Lipl的构建
如果利用脂肪酶，利用和制备单链抗体和链霉素融合基因的方法来 构建重组表达载体，pTJl-BAN-Lipl 、 pTJl-BANC-Lipl禾B pTJl-BAF國 Lipl。利用引物序列号ll和序列号12实施PCR。
序列号11: 5'-ATAGCTAGCGCGGCTTCGCGAGCCAAT國3， 序列号12: 5'-TAACAAGCTTTTAAGGCCGCAAACTCGC-3， 利用琼脂糖凝胶电泳分离通过PCR所获的1170bp的DNA片段并用 限制酶A^el和///"c/in。消化的DNA片段被插入到与实施例2中利用 T4DNA连接酶所制备的pTJl-BAN、 pTJl-BANC及pTJl-BAF的相同位 点当中，然后通过电穿孔转化入五.co/ZXLl-Blue中。在含抗生素氨苄青 霉素(100吗/mL)的LB琼脂糖培养基中对该转化菌株进行筛选，由此 获得表达脂肪酶的重组质粒pTJl-BAN-Lipl 、 pTJl-BANC-Lipl和 pTJl-BAF-Lipl。
实施例4: BclA融合蛋白的表达利用SDS-PAGE法分别在转化有通过实施例3所述方法所构建的重 组表达载体pTJl-BAN-Lipl、pTJl-BANC-Lipl和pTJ 1-BAF-Lip 1的co// XL-Blue中检测，融合了模式蛋白的炭疽杆菌(Sfl"7/w fl"^"ac^芽孢外 壁BclA的表达，从芽孢杆菌中获得的脂肪酶。
特别地，为了检测BclA-Lipl融合蛋白的表达，把该重组五.co/Z接种 到含有50mL LB液体培养基的250 mL Erlenmeyer摇瓶中并在37'C进行 培养。既然重组表达载体具有toc启动子，因此通过加入IPTG(异丙基-卩-硫代半乳糖苷)诱导表达。在600nm下光密度(OD)达到0.6时通过加 入1 mMIPTG来进行基因表达诱导。
在诱导4小时后，取3ml肉汤培养物，并分离外层细胞膜蛋白。特 别地，3mL肉汤培养物在4。C下以1,0000rpm离心2分钟以去除上清液， 并用lmLNa2HP04 (pH7.2)缓冲液洗涤一次，4"C下以13，000rpm再次 离心2分钟，然后于0.2ml Na2HP04 (pH7.2)中悬浮。对该悬浮液进行 超声处理以裂解悬浮液中的所有细胞，并在室温下以10,000rpm离心2 分钟，由此获得从中去除了碎片的上清液。为了细胞膜蛋白质分级，上 清液在室温下以13,000rpm离心30分钟，并悬浮于含0.5ml 0.5% (w/v) sarcosylhe和10mMNa2HPO4 (pH7.2)的缓冲液中。该细胞膜蛋白溶液 被允许在37'C下反应30分钟，并在4r下以13,000rpm离心30分钟以 分离不溶相。用10mMNa2HPO4(pH7.2)缓冲液洗涤不溶相并悬浮于50^L PBS中(0.274 MNaCl， 0.041M Na2HP04, 0.047M KH2P04, 0.005MKC1, pH7.4),由此获得分离的外层细胞膜蛋白质样品溶液(PMe"^，,丄.w a/.， G匿，156:1,1995)。
通过上述方法所获得的40pL蛋白质与lOpL SDS-PAGE样品缓冲液 (60mMTris-HCL;25。/。甘油；2%SDS; 14.4mM 2-巯基乙醇;0.1%溴酚蓝), 并且该混合物被允许通过在沸水浴中加热IO分钟来进行反应以便在12% 分离胶中实施SDS-PAGE凝胶电泳。在电泳后，在染色液(0.25g/L考马氏亮蓝R; 40%甲醇；10%乙酸)中浸泡超过2小时并在脱色液(40%乙 醇；70%乙酸)中浸泡两次，每次2小时，通过该方法对凝胶进行了染 色(图8)。
图8中的条带SM (尺寸标记物)为代表蛋白分子量标准(250kDa、 150kDa、 100kDa、 75kDa、 50kDa及37kDa)的尺寸控制组；第一条带 为来自野生型XL1-Blue(不表达BclA-Lipl融合蛋白)的外层细胞膜蛋白 馏分，第二-四条带为来自经IPTG诱导4小时的转化有表达载体 pTJl-BAN-Lipl、 pTJl-BANC-Lipl和pTJl陽BAF-Lipl的co//XLl-Blue 的外层细胞膜蛋白质馏分。
在如图8所示的电泳之后，证明了每种融合蛋白，45kDa的 BAN-Lipl,61kD的BANC-Lipl禾B 66kDa的BAF-Lipl，都在五.co//的外 层细胞膜中进行了表达，这提示43kDa的脂肪酶(Lipl)被成功地插入 芽孢外壁蛋白BclA中并在的外层细胞膜中表达。
此外，对于所述SDS-PAGE结果，用比重计对蛋白质进行定量以确 定其中插入了 Lipl蛋白的外层细胞膜蛋白占外层细胞膜蛋白的比例。此 处的比例为30%-45%，提示表达率很高。
实施例5:含重组表达载体pTJl-BAN-scFv-SA、 pTJl-BANC-ScFv-SA 和pTJl-BAF-ScFv-SA的重组五.o //细胞表面展示
如图9所示，实施FACS分析来检测与BclA融合的目的蛋白是否在 细胞表面表达，其利用了具有实施例3中所构建的pTJl-BAN-scFv-SA、 pTJl-BANC-ScFv-SA及pTJl-BAF-ScFv-SA重组表达载体的重组￡.co//。
利用与实施例4所述的同样条件，对转化有重组表达载体 pTJl-BAN-scFv-SA、 pTJl-BANC-ScFv-SA及pTJl-BAF-ScFv-SA的细胞 进行培养。诱导表达4小时后，lmL的肉汤培养物在4'C下以6000rpm 离心5分钟以除去上清液，并用PBS缓冲液洗涤两次，然后在PBS缓冲液中悬浮。用结合了荧光物质的生物素溶液处理细胞-珠混合液，并允许
在37。C下反应1小时。所得反应溶液在室温下以10,000rpm下离心10分 钟以除去上清液并用PBS缓冲液洗涤3次，然后在PBS缓冲液中悬浮， 然后用 FACS (Fluoresent-Activated Cell Sorter, Beckton Dickinson, Fullerton， Fullerton， CA， USA)(图9)进行分析。该样品通过氦/氖激 光在543nm下激发，图像经580nm过滤器过滤。
在图9中，a为野生型￡.co//.XLl-Blue对照，b为转化有 pTJl-BAN-scFv-SA的co// XL 1-Blue的￡.co//. XL 1-Blue的结果，c为 转化有pTJl-BANC-ScFv-SA的￡.co// XL1-Blue的结果，以及d为转化 有pTJl-BAF-ScFv-SA的￡.co//XL1-Blue的结果。
如图9所示，已经证实三种类型的BclA融合蛋白都在五xo/Z的外层 细胞膜上进行了表达，由此提高了 FACS的荧光密度，其意味着和融合 了 BclA的目的蛋白，炭疽杆菌(Sa"7/w a"Arac^芽孢外壁蛋白成功地在 五.co//的外层细胞膜上进行了表达。
从试验结果中证实了与BclA融合的单链抗体-链霉素成功地在五.co/f 的外层细胞膜上进行了表达。
实施例6:含有重组表达载体dTJ1-BA-EGFP的重组的实时分析
在荧光蛋白之后，EGFP (加强绿色荧光蛋白)被结合到实施例l所 制备的重组表达载体pTJl-BA上，激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM410， Oberkochen， Germany)被用于检测(图10)重组五.co//JM109 (F-ow; T Wc^^(^B-m5Jg"/ cfcm(Z)五3))是否在细胞表面表达。
利用与实施例4所述的同样条件对细胞进行培养，离心收集细胞， 用LB培养基洗涤，转移至不含IPTG的LB培养基中，并培养4小时以 便把绿色荧光蛋白，在表达时仍保留于细胞中传送到细胞表面。结果， 如图10所示，共聚焦激光扫描显微镜和FACS的图谱显示细胞所表达的GFP (没有与BclA融合)的位置与融合了BclA的GFP的位置以及外层 细胞表面所表达的GFP的位置不相同。
工业实用性
如上述所述以及由上所证明的，本发明提供了能够在采用BclA，炭 疽杆菌fB^77/ws a"^rac/^芽孢外壁蛋白作为细胞表面骨架的细胞表面上 有效表达目的蛋白或肽的表达载体，以及转化有该表达载体的微生物和 通过培养经转化微生物而在细胞表面稳定地大规模表达目的蛋白的方 法。
同样地，当利用新开发的表面表达载体在细胞表面上表达外源蛋白 时，其能够有效地应用于表现出比采用减毒病原菌或病毒的传统疫苗具 有更强更持久免疫应答的重组活体疫苗，其中上述更强更持久免疫应答 有赖于所插入的外源基因、筛选各种肽或抗体及消除重金属或处理污水 用的整细胞吸附剂、以及通过在细胞表面稳定表达用于生物转化酶而能 够连续使用却不降低催化活性的整细胞生物转化。
虽然，通过参考具体特征对本发明作了详细描述，但是本领域技术 人员容易理解该描述仅仅是优选实施方式而不限制本发明的范围。由此， 通过所附权利要求及其等同物对本发明的实质性范围作出限定。
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权利要求
1. 一种表面表达载体，其含有作为细胞表面骨架的编码炭疽杆菌芽孢外壁蛋白BclA的BclA基因或其片段以及启动子和编码目的蛋白的基因，其中该表达载体被构建成当编码目的蛋白的基因在宿主中进行表达时该目的蛋白能够以与BclA或其片段融合的形式在细胞表面表达。
2. 根据权利要求1所述的表面表达载体(pTJl-BAN)，其特征 在于，6cL4基因的片段为该&cL4基因序列号1的N末端。
3. 根据权利要求1所述的表面表达载体(pTJl-BANC)，其特征 在于，6cL4基因的片段为通过去除6cM基因中间部分所制得的序列号 2的N末端和C末端。
4. 根据权利要求1所述的表面表达载体(pTJl-BAF)，其特征在 于，6cL4基因的片段为序列号3。
5. 根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，启动子为toc 启动子或任何其它可诱导的启动子。
6. 根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述目的蛋 白为通过去除目的蛋白氨基酸的部分氨基酸序列或者通过实施位点特异 性变异以便于表面表达所制得的蛋白。
7. 通过把权利要求1-6中任一项所述的表达载体引入从由革兰 氏阳性菌、革兰氏阴性菌、放线菌、酵母菌及真菌所构成组中选择的细 胞当中从而获得的转化微生物。
8. 根据权利要求7所述的转化微生物，其特征在于，该微生物 是突变的以致于不产生降解目的蛋白的胞内或胞外蛋白酶，从而便于目 的蛋白的表面表达。
9. 根据权利要求8所述的转化微生物，其特征在于，该微生物是大肠埃希氏菌。
10. —种在细胞表面表达目的蛋白的方法，该方法包括如下步骤 通过培养权利要求7-9中任一项所述的转化微生物来表达目的蛋白；以 及回收在其表面表达有目的蛋白的细胞。
11. 根据权利要求IO所述的方法，其特征在于，该目的蛋白为选 自下列物质所构成组中的任一种激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、 信号传导蛋白或其片段、抗体或其片段、单链抗体、结合蛋白、结合域、 肽、抗原、粘附蛋白、结构蛋白、调节蛋白、毒素蛋白、细胞因子、转 录因子、凝血因子以及植物防御诱导蛋白。
12. 根据权利要求ll所述的方法，其特征在于，该目的蛋白为链 霉素。
13. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述酶为脂肪酶。
14. 一种生物转化方法，该方法的特征在于利用通过权利要求11 所述方法制得的并在其表面表达具有酶活性的目的蛋白的细胞。
15. —种制造蛋白质阵列的方法，该方法的特征在于，通过把由权利要求ll所述方法制备的细胞并在其表面表达具有酶活性的蛋白的细 胞附在基质上。
16. 在脊椎动物中制备抗体的方法，该方法包括(a) 通过把由权利要求11的方法所制备的且在其表面表达抗原的细 胞施用于除人以外的脊椎动物来诱导免疫应答；(b) 回收通过免疫应答所产生的抗体。
17. —种通过利用脂肪酶对外消旋酯混合物进行光学拆分来制备 诸如手性酯、手性有机酸或手性乙醇之类手性化合物的方法，该方法的 特征在于利用了用权利要求13的方法制得的细胞上所表达的脂肪酶。
18. —种整细胞生物传感器，其包括转化有含源自炭疽杆菌芽孢 外壁蛋白的6c"基因和编码链霉素的基因的表达载体，所述芽孢外壁蛋白用作细胞表面骨架，而所述链霉素则用作有效成分。
19. 根据权利要求IO所述的整细胞生物传感器，其特征在于，所 述微生物为大肠埃希氏菌。
20. —种用于改善目的蛋白的方法，该方法包括(a) 建立编码目的蛋白的基因突变文库；(b) 构建含有编码目的蛋白的基因突变文库及6c"基因的基因重组体；(c) 用该基因重组体或含有该基因重组体的载体转化宿主细胞，所述 宿主细胞选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、放线菌、酵母菌及真菌 所构成的组；(d) 通过培养经转化的宿主细胞在细胞表面表达基因突变文库；(e) 对在其表面表达有改善性质的目的蛋白的细胞进行筛选。21.根 据权利要求20所述用于改善目的蛋白的方法，其特征在于，所述筛选步 骤通过利用目的蛋白、识别标记在目的蛋白上的物质的蛋白、与目的蛋 白结合的标记配体、或者与目的蛋白特异性结合的抗体的活性来实施。
全文摘要
本发明涉及利用炭疽杆菌(Bacillus anthracis)芽孢外壁蛋白在微生物表面表达目的蛋白。更特殊地涉及一种如此构建的载体其包含用作细胞表面骨架的编码炭疽杆菌(Bacillus anthracis)芽孢外壁蛋白的bclA基因或其片段，并且当目的蛋白表达基因在宿主细胞中进行表达时，所述目的蛋白能够以和BaclA或其片段融合的形式在细胞表面进行表达，以及利用该载体在微生物表面表达目的蛋白的方法。根据本发明的表达载体能够利用BaclA，作为细胞表面骨架的炭疽杆菌(Bacillus anthracis)芽孢外壁蛋白，在细胞表面有效地表达目的蛋白或肽，而且既然通过对转化有表达载体的微生物进行培养的方法目的蛋白能够在细胞表面大规模稳定表达，由此可能将其有效地用于重组活疫苗、整细胞吸收剂、整细胞生物转化等各种目的。
文档编号C12N15/70GK101426919SQ200680050288
公开日2009年5月6日 申请日期2006年12月29日 优先权日2006年1月2日
发明者朴泰正, 李相烨, 许男守 申请人:韩国科学技术院