专利名称：快速检测食品中芸豆成分的试剂盒及其应用方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂盒，具体涉及应用聚合酶链反应检测食品中芸豆成分的试剂盒及其应用。
背景技术：
众所周知，现今的食品市场中食品质量良莠不齐，一小部分食品生产商为了节约成本、牟取暴利，在食品中掺假、掺杂来欺骗消费者，给食品安全带来了隐患，危害了消费者的利益。然而，目前缺少对掺假食品的鉴别方法，因此，为了防止生产商和销售商生产、销售掺假、掺杂、伪造食品，保证食品质量，有必要寻找一种科学方法来检测食品的成分。
目前国内外常用的食品成分的检测方法中，主要是以核酸为基础的聚合酶链式反应(简称PCR)检测方法。目前PCR已广泛应用于基于核酸的各个研究和临床诊断等领域。该方法(《PCR技术实验指南》(原著第二版)，〔美〕C.W.迪芬巴赫G.S.德弗克斯勒编，种康瞿礼嘉主译，化学工业出版社2006年3月第1版，第1篇PCR导论，第1页)首先根据检测的目的基因序列设计两段(约17～25多个核苷酸)特异性的寡核苷酸链作为反应的引物，它们可和模板的待测DNA两条链上目的基因的两端互补，在含有4种单核苷酸dNTP以及镁离子的反应缓冲液中，在一定的温度条件下，通过DNA聚合酶合成得到目的基因片段。然后通过温度的变化，DNA变性及退火，使前一次的反应产物作为下一次反应得模板DNA，并将这样的反应反复进行，经过25～30个循环，使目的基因片段的扩增倍数达到106。
芸豆(Phaseolus vulgaris L.)，豆科菜豆属菜豆种，是一年生草本植物，又称菜豆、四季豆、时季豆、四月豆、梅豆、联豆、架豆等，人们取其植物的种子一豆作为食品，芸豆也广泛地应用于食品加工业，如生产芸豆罐头、芸豆豆陷、芸豆蜜饯、羊羹和豆沙等。然而食品中是否含有芸豆成分，目前尚未有简单可行的测定方法。因此，目前存在生产商有用芸豆粉冒充莲子粉等，以降低生产食品的成本。为此，有必要研究一种快速检测食品中芸豆成分的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种可快速检测食品中芸豆成分的试剂盒，和该试剂盒的应用方法。
本发明为达到本发明目的，发明人根据芸豆LEA3基因(Genbank入藏号DQ196430)的核苷酸序列，设计并合成了一段特定的DNA序列作为引物，并用该引物成功地扩增出了芸豆及其加工食品中所含有的芸豆DNA。具体地讲，本发明所提供的快速检测食品中芸豆成分的试剂是由DNA提取缓冲液、TaqDNA聚合酶、PCR反应液、上样缓冲液组成，所说的PCR反应液中含有一对引物，其碱基序列为正向引物5’-AGGGATCGTTTGACTCTTCGA-3’，反向引物5’-TGTTCGGTCCCCTAGAACCT-3’。
具体所说的DNA提取缓冲液，是每L溶液中含20mg十六烷基.三甲基.溴化胺(简称CTAB)、100nmol三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(简称Tris·Cl)、20mmol乙二胺四乙酸二钠(简称EDTA)、1.4mol氯化钠(NaCl)，0.1g蛋白酶K；所说的PCR反应液，是每L溶液中含是3mmol氯化镁(MgCl2)，0.4μmol引物，0.4mmol三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)。
所说的上样缓冲液，是每L溶液中含2.5g溴酚蓝、400g蔗糖。
快速检测食品中芸豆成分的方法是包括以下步骤①样品DNA的制备称取样品，加入DNA提取缓冲液，将溶液在65℃下放置30min，后离心，取上清液用氯仿∶异戊醇体积比为24∶1的混合液提取两次，在提取液中加乙醇，得样品DNA的沉淀，再用70％(体积/体积)的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物溶于水中，即得样品DNA。可直接作为PCR反应的模板。
②PCR扩增反应取PCR反应液、Taq DNA聚合酶置于管中，混匀，加入样品DNA，离心后置于扩增仪上进行扩增，反应参数95℃预变性5min后，按95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec程序进行40个循环，最后72℃延伸5min，于4℃结束反应；③产物检测取PCR反应产物，加上样缓冲液，充分混匀后点样，用DNA Marker作为分子量标准，用含溴化己锭(简称EB)染色的2％琼脂糖凝胶电泳1h(3-4V/cm)，结束电泳后，置于紫外灯下观察，出现120bp的DNA特异带的为含芸豆，否则为不含芸豆。
具体的说，优选如下的操作方法①称取样品100mg，加入DNA提取缓冲液1ml，将溶液在65℃下放置30min，后离心取上清液用300mL的氯仿∶异戊醇为24∶1的混合液提取两次，在提取液中加600mL乙醇，得样品DNA沉淀，再用70％(体积/体积)乙醇溶液清洗沉淀物二次，将沉淀物溶于100μL双蒸水中，即得样品DNA，可直接作为PCR反应的模板。
②扩增反应取PCR反应液25μL、Taq DNA聚合酶0.5μL混合于一离心管中，混匀，将反应管标记好，加入处理好的样品DNA 24.5μL，离心后置于扩增仪上进行扩增。反应参数95℃预变性5min后，按95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec程序进行40个循环，最后72℃延伸5min，于4℃结束反应。
③产物检测取PCR反应产物12.5μL，加2.5μL上样缓冲液，充分混匀后点样，用DNA Marker作为分子量标准。用含溴化己锭染色的2％琼脂糖凝胶电泳1h(3-4V/cm)，结束电泳后，将胶置于紫外灯下观察，出现120bp的DNA特异带的为含芸豆，否则为不含芸豆。
以聚合酶链反应(PCR)为基础的DNA分析方法用于检测食品中是否含有芸豆DNA。这是完全可靠的方法，芸豆LEA3基因并不存在于其他农作物中。芸豆LEA3基因DNA序列与其他的DNA序列不同。因此，找出其中特有的一段序列，据此设计并合成引物用于PCR扩增就可快速检测食品中是否含有芸豆成分。
本发明的有益效果1、有高度的特异性。
2、检测速度快、鉴定方便。该技术巧妙地运用了PCR技术的DNA扩增的高效快速和敏感性，使得本方法具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。
3、运用该方法可以有效的检测食品中的芸豆成分，可以弥补当前缺乏检测方法的空白。
图1本发明所提供的方法测定芸豆及其它植物种子基因DNA PCR扩增反应后，在紫外下观察的电泳图谱。
图1中M为DNA Marker 1、2为芸豆样品 3、4为含芸豆成分的月饼馅料样品 5、为莲子样品 6、为绿豆 7、为红豆 8、为大 9、为玉米10、为大米 11、为番茄 12、为小麦 13、为油菜籽 14、为空白对照。
下面结合实施例和附图进一步阐述本发明的技术方案，但本发明的方法应用不仅限于如下实施例。
具体实施例方式
实施例1试剂盒的配制(可供进行50份PCR反应)芸豆LEA3基因片段引物的合成按照本领域公知的常规方法制备引物。在DNA自动合成仪(采用美国PE公司的ABI公司的ABI3949型全自动DNA合成仪)上按照制造商的说明书进行合成。分别合成芸豆LEA3基因的正向引物5’-AGGGATCGTTTGACTCTTCGA-3’；和芸豆LEA3基因的反向引物5’-TGTTCGGTCCCCTAGAACCT-3’。
①配制DNA提取缓冲液50mL分别称取20mg CTAB、0.0121mg Tris·Cl、5.845g EDTA和81.816g NaCl于1L容量瓶中，用水定容、混匀。取50ml，经过120℃、30min，高温消毒灭菌，后加入250μL购制的蛋白酶K；②购制Taq DNA聚合酶25μl共125IU；③配制PCR反应液1250μL称取0.357mg MgCl2，用625μL水溶解，经过120℃、30min，高温消毒灭菌，后分别加入0.5pmol的一对引物和0.5μmol的三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)用灭菌水定容至1250μL；④配制上样缓冲液100μl分别称取2.5g溴酚蓝、400g蔗糖于1L容量瓶中，用水定容、混匀。取100μl溶液。
实施例2本发明所提供的试剂盒在鉴定食品中是否有芸豆成分的应用1、样品制备。
分别将芸豆、莲子、绿豆、红豆、大豆、玉米、大米、小麦和油菜籽，使用经过120℃、30min、高压消毒过的固体粉碎机或研钵粉碎制成粉样。将含芸豆成分的月饼馅料和番茄使用经过120℃、30min、高压消毒过的研钵研制成均匀状的样品。
2、分别称取样品100mg置于2mL离心管中，加入1mL DNA提取缓冲液，将其混匀。
3、将溶液在65℃下放置30min。
4、取出离心12000r/min，5min后，将上清液移至1.5mL离心管中，加入300μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，小心的混合两相。离心12000r/min，5min。
5、将上清液移至1.5mL离心管中，加入300μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，离心12,000r/min，5min。
6、将上清液移至1.5mL离心管中，加2倍体积的无水乙醇，充分混匀，离心12000r/min，5min收集沉淀。
7、用70％乙醇清洗沉淀二次，室温离心8000r/min，1min收集DNA，尽可能除去乙醇。
8、100μL双蒸水溶解DNA沉淀，使DNA完全溶解后，-20℃保存。
9、紫外分光光度法检测DNA的纯度和含量在石英比色皿中加入50μL按10倍稀释的DNA样品(5μLDNA样品加水45μl混匀)，分别测定DNA样品在260nm和280nm处的紫外光吸收值，并计算A260/A280值。A260/A280应介于1.7～1.8之间，低于1.7则表明制备物中存留显著蛋白质，此时可重复上述2-8步；大于1.8则表明DNA样品中有RNA，此时应加入RNA酶，并重复2-8步。计算DNA浓度10×A260(μg/μL)。
10、扩增反应取PCR反应液350μL、Taq DNA聚合酶7μL混合于一离心管中，使其混匀，将反应管标记好后，按25.5μL分装到14支反应管。向空白对照管中加入24.5μL水，向对应反应管各加入24.5μL样品DNA(反应体系为50μL)，离心后置于扩增仪上进行扩增。反应参数95℃预变性5min后，按95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec程序进行40个循环，最后72℃延伸5min，于4℃结束反应。
11、产物检测①2％琼脂糖凝胶的制备准确称取0.16g琼脂糖溶入80mL的1×TAE(0.04mol/L Tris-HCl，0.02mol/L NaAC，2mmol/L EDTA Ph8.0)中，置微波炉上加热并不时摇动至完全熔化，室温冷至50-60℃，加1μL的10mg/mL EB立即摇匀，迅速倒入已用灭过菌的防水胶带封好口的电泳槽中，室温下放置30min以上，拨出梳子。
②样品的制备在点样纸上点上2.5μL上样缓冲液和12.5μL PCR反应液，充分混匀，并用DNA Marker作为分子量标准。
③电泳将凝胶浸入电泳缓冲液中，点样后，接上电源，3V/cm，电泳1h。
④观察结果将凝胶置于紫外灯下观察，1、2、3、4样品出现特异带，为含芸豆成分，其他6～14样品为不含芸豆。结果如附图1所示。
权利要求
1.一种快速检测食品中芸豆成分的试剂盒，其特征在于试剂盒是由DNA提取缓冲液、Taq DNA聚合酶、PCR反应液、上样缓冲液组成，所说的PCR反应液中含有一对引物，其碱基序列为正向引物5’-AGGGATCGTTTGACTCTTCGA-3’，反向引物5’-TGTTCGGTCCCCTAGAACCT-3’。
2.根据权利要求1所说的快速检测食品中芸豆成分的试剂盒，其特征在于所说的DNA提取缓冲液，每L溶液中含20mg十六烷基.三甲基.溴化胺、100nmol三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、20mmol乙二胺四乙酸二钠、1.4mol氯化钠，0.1g蛋白酶K；所说的PCR反应液，每L溶液中含是3mmol氯化镁，0.4μmol引物，0.4mmol的三磷酸脱氧核苷酸；所说的上样缓冲液，每L溶液中含2.5g溴酚蓝、400g蔗糖。
3.一种如权利要求1所说的试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤①样品DNA的制备称取样品，加入DNA提取缓冲液，将溶液在65℃下放置30min，后离心，取上清液用氯仿∶异戊醇体积比为24∶1的混合液提取，在提取液中加乙醇，得样品DNA的沉淀，再用70％的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶介，即得样品DNA；②PCR扩增反应取PCR反应液、Taq DNA聚合酶置于管中，混匀，加入样品DNA，离心后置于扩增仪上进行扩增，反应参数95℃预变性5min后，按95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec程序进行40个循环，最后72℃延伸5min，于4℃结束反应；③产物检测取PCR反应产物，加上样缓冲液，充分混匀后点样，用DNA Marker作为分子量标准，用含溴化已锭染色的2％琼脂糖凝胶电泳，结束电泳，置于紫外灯下观察，出现120bp的DNA特异带的为含芸豆，否则为不含芸豆。
4.根据权利要求3所说的试剂盒的使用方法，其特征在于①称取样品100mg，加入DNA提取缓冲液1ml，将溶液在65℃下放置30min，后离心取上清液用300mL的氯仿∶异戊醇体积比为24∶1的混合液提取两次，在提取液中加600mL乙醇，得样品DNA的沉淀，再用70％的乙醇溶液洗沉淀物二次，将沉淀物溶于100μL双蒸水中，即得样品DNA；②扩增反应取PCR反应液25μL、Taq DNA聚合酶0.5μL混合于一离心管中，混匀，将反应管标记好，加入处理好的样品DNA 24.5μL，离心后置于扩增仪上进行扩增；③产物检测取PCR反应产物12.5μL，加2.5μL上样缓冲液，充分混匀后点样。
全文摘要
快速检测食品中芸豆成分的试剂盒及其应用方法，涉及生物领域，具体涉及应用聚合酶链反应检测食品中芸豆成分的试剂盒及其应用。它是由DNA提取缓冲液、Taq DNA聚合酶、PCR反应液、上样缓冲液组成，所说的PCR反应液中含有一对引物，碱基序列为正向引物5’－AGGGATCGTTTGACTCTTCGA－3’，反向引物5’－TGTTCGGTCCCCTAGAACCT－3’。检测方法包括①样品DNA的制备，②PCR扩增反应，③产物检测反应产物，加上样缓冲液，充分混匀后点样，用DNA Marker作为分子量标准，用含溴化己锭染色的2％琼脂糖凝胶电泳1h(3－4V/cm)，结束后，置紫外灯下观察，出现120bp的DNA特异带的为含芸豆，否则为不含芸豆。本发明的有益效果有高度的特异性；检测速度快、鉴定方便；弥补当前检测方法的空白。
文档编号C12Q1/68GK101016567SQ20071002692
公开日2007年8月15日 申请日期2007年2月14日 优先权日2007年2月14日
发明者邓鸿铃, 吴玉銮, 郭新东, 覃芳芳, 吴岳德 申请人:广州市产品质量监督检验所