专利名称：色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌的制作方法
技术领域：
本发明属于生物发酵工程领域，涉及一种氨基酸合成代谢途径加强的基因工程菌。
背景技术：
L-色氨酸(tryptophan)，又名β-吲哚-α-氨基丙酸，属于芳香族氨基酸。L-色氨酸在人和动物的生长发育、新陈代谢中起重要作用。目前，L-色氨酸作为原料广泛应用于加工配制饲料、保健食品、配方膳、氨基酸片剂和氨基酸注射液等。
L-色氨酸最早生产时主要依赖于蛋白质水解和化学合成，以后又出现了发酵法和酶法生产工艺，但是，上述方法存在着工艺繁琐、成本高或产量不能满足大规模工业化生产需求等问题，使国际氨基酸市场上L-色氨酸价格长期居高不下。随着基因工程技术方法的产生和发展，为构建高产氨基酸基因工程菌提供了新的机遇，尤其是近年来第三代基因工程技术(即代谢途径工程技术)的出现更进一步推动了氨基酸基因工程菌研究的发展。1979年，前苏联首先成功地利用体外构建重组质粒的基因工程方法选育了高产苏氨酸生产菌，满足了工业化生产苏氨酸的要求，开创了氨基酸发酵工业的新纪元。自上世纪80年代中期以来，用体外重组技术的方法构建氨基酸生产菌株的研究在国外广泛开展，并取得了不少进展。目前，国内尚没有采用第三代基因工程技术研究选育色氨酸基因工程菌的专利申请。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体的重组质粒。
本发明的第二个目的是提供一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌。
本发明的第三个目的是提供一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌。
本发明的第四个目的是提供一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌的应用。
本发明的技术方案概述如下一种含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体的重组质粒，用下述方法制成采用pET22b(+)单质粒多基因串联表达的策略，将色氨酸合成酶基因trpBA与磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体M3serA基因串联，得重组质粒pET-T7 promotor-M3serA-T7promotor-trpBA-T7 terminator，命名为M3BAT-I。
一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌，用下述方法获得以λDE3噬菌体侵染宿主菌Escherichisa coli 491，使溶源化后的命名为DE3-491的细菌的染色体上含有一拷贝由lacUV5控制的T7 RNA聚合酶基因，将一种含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体的重组质粒M3BAT-I转入感受态DE3-491后，成为一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌，命名为M3BAT-I+DE3-491。
一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌，用下述方法获得(1)选取tnaA基因上下游侧翼序列片段与卡那霉素抗性基因kanr，连接构建串联基因盒pET22b-tnaA5′-kanr-tnaA3′，并将线性化片段tnaA5′-kanr-tnaA3′通过Red同源重组系统替换掉命名为M3BAT-I+DE3-491的一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌染色体上的tnaA基因，导致该基因正常功能的丧失，得到色氨酸酶缺陷株，命名为M3BAT-I+DE3-491ΔT。
一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌的应用，包括下述步骤将命名为M3BAT-I+DE3-491ΔT的敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌按质量百分含量为3％-7％比例加入M63培养基中，37℃培养至OD600达到1.0后，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养，培养50-54小时。
一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌，以IPTG诱导表达，经SDS-PAGE分析，M3BAT-I在DE3-491可表达44kD、37kD、29kD蛋白(图2)，分别相当于色氨酸合成酶β亚基、磷酸甘油酸脱氢酶M3突变体、色氨酸合成酶α亚基。酶活性分析表明，色氨酸合成酶的活性分别比含空载体的对照菌株提高了3倍左右，磷酸甘油酸脱氢酶总活性提高了约4倍。一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌培养后，培养上清液色氨酸含量由原来的2mg/L提高到99mg/L。
图1为本发明一种含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体的重组质粒(M3BAT-I)构建流程图。
图2为含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体的重组质粒(M3serA与trpBA串联质粒)在DE3-491中的表达。(1.蛋白质分子量标准；2.DE3-491/M3BAT-II；3.DE3-491/M3BAT-I；4.DE3-491/pET22b(+)。
图3为含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体的重组质粒(M3serA与trpBA串联质粒)表达后相对酶活性比较。(系列1表示色氨酸合成酶活性；系列2表示磷酸甘油酸脱氢酶酶活性，1pET22b(+)；2、3其它串联质粒；4M3BAT-I串联质粒)图4为一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌PCR鉴定结果。(1.MarkerIII；2.突变后的基因组扩增片断；3.突变前的基因组扩增片断.)图5为tnaA基因敲除后的部分序列测定。
图6为改造前氨基酸分析，Trp含量很低。
图7为改造后氨基酸分析，Trp含量升高。
具体实施例方式
本发明采用一种大肠杆菌(Escherichisa coli 491，购自美国典型菌种保藏中心)为原始菌株，采用第三代基因工程的方法，通过对其色氨酸代谢途径的改造，提高了其色氨酸合成能力。
在大肠杆菌芳香族氨基酸代谢途径中，色氨酸合成酶(EC4.2.1.20)是一具有α2β2亚基结构的异质四聚体，β、α两个亚基分别由trpB和trpA基因编码，该酶能以吲哚和L-丝氨酸为底物酶促合成L-色氨酸。将trpBA基因与serA基因突变体(M3serA基因)串联在表达载体pET22b(+)中，实现了2个基因分别在各自启动子下的共表达，并选取编码色氨酸酶的tnaA基因上下游侧翼序列片段与卡那霉素抗性基因kanr，连接构建串联基因盒，采用Red同源重组系统替换掉tnaA基因，从而达到加强色氨酸代谢流和色氨酸积累的目的。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1一种含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体的重组质粒，是用下述方法制成采用pET22b(+)单质粒多基因串联表达的策略，将色氨酸合成酶基因trpBA基因与磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体M3serA基因串联，得重组质粒pET-T7 promotor-M3serA-T7promotor-trpBA-T7 terminator，命名为M3BAT-I，构建流程见图1。
有关serA基因突变体(M3serA基因)构建方法已经发表于《中国生物化学与分子生物学报》2006年第10期806～810页。
有关trpBA基因克隆方法已经发表于《生物技术通讯》2006年第1期12～14页。
实施例2一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌，是用下述方法获得以λDE3噬菌体侵染宿主菌Escherichisa coli 491，使溶源化后的命名为DE3-491的细菌的染色体上含有一拷贝由lacUV5控制的T7 RNA聚合酶基因，将实施例1制成的一种含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体的重组质粒M3BAT-I转入感受态DE3-491后，成为命名为M3BAT-I+DE3-491的一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌。以IPTG诱导表达，经SDS-PAGE分析，M3BAT-I在DE3-491可表达44kD、37kD、29kD蛋白(图2)，分别相当于色氨酸合成酶β亚基、磷酸甘油酸脱氢酶M3突变体、色氨酸合成酶α亚基。酶活性分析表明，色氨酸合成酶的活性比含空载体的对照菌株提高了3倍左右，磷酸甘油酸脱氢酶总活性分别提高了约4.0倍(图3)。
实施例3一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌，是用下述方法获得(1)选取tnaA基因上下游侧翼序列片段与卡那霉素抗性基因kanr，连接构建串联基因盒pET22b-tnaA5′-kanr-tnaA3′，并将线性化片段tnaA5′-kanr-tnaA3′通过Red同源重组系统替换掉一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌(M3BAT-I+DE3-491)染色体上的tnaA基因，导致该基因正常功能的丧失，得到色氨酸酶缺陷株，命名为M3BAT-I+DE3-491ΔT。
PCR扩增(图4)和序列测定(图5)证实tnaA基因已被成功敲除。
实施例4一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌的应用，包括下述步骤将敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌(M3BAT-I+DE3-491ΔT)按质量百分含量为5％(也可以选用3％或7％)比例加入M63培养基中，37℃培养至OD600达到1.0后，加入IPTG诱导培养，培养52小时(也可以培养50小时或54小时)，取发酵液用氨基酸自动分析仪分析L-色氨酸含量，结果发现，发酵液中的色氨酸含量达99mg/L，而原始菌培养后发酵液中的色氨酸含量为2mg/L。(见图6、图7)5×M63盐的配制方法(1L)(NH4)2SO410g，KH2PO468g，FeSO4·7H2O 2.5mg。用KOH调PH为7.0。
M63培养基配制方法临用前用无菌水将5×M63盐稀释成1×培养基，并在每升加入以下无菌溶液1mol/L MgSO4·7H2O 1ml，20％葡萄糖10ml，0.5％维生素B10.1ml。
权利要求
1.一种含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体的重组质粒，其特征是用下述方法制成采用pET22b(+)单质粒多基因串联表达的策略，将色氨酸合成酶基因trpBA与磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体M3serA基因串联，得重组质粒pET-T7promotor-M3serA-T7promotor-trpBA-T7terminator，命名为M3BAT-I。
2.一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌，其特征是用下述方法获得以λDE3噬菌体侵染宿主菌Escherichisa coli 491，使溶源化后的命名为DE3-491的细菌的染色体上含有一拷贝由lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，将权利要求1的一种含有色氨酸合成酶基因和磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体的重组质粒M3BAT-I转入感受态DE3-491后，成为一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌，命名为M3BAT-I+DE3-491。
3.一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌，其特征是用下述方法获得(1)选取tnaA基因上下游侧翼序列片段与卡那霉素抗性基因kanr，连接构建串联基因盒pET22b-tnaA5′-kanr-tnaA3′，并将线性化片段tnaA5′-kanr-tnaA3′通过Red同源重组系统替换掉权利要求2的命名为M3BAT-I+DE3-491的一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌染色体上的tnaA基因，导致该基因正常功能的丧失，得到色氨酸酶缺陷株，命名为M3BAT-I+DE3-491ΔT。
4.一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌的应用，其特征是包括下述步骤将权利要求3的敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌按质量百分含量为3％-7％比例加入M63培养基中，37℃培养至OD600达到1.0后，加入异丙基硫代半乳糖苷诱导培养，培养50-54小时。
全文摘要
本发明公开了一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌、该菌中含有的重组质粒、一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌及应用，重组质粒制法是采用pET22b(+)单质粒多基因串联表达的策略，将色氨酸合成酶基因trpBA与磷酸甘油酸脱氢酶基因突变体M3serA基因串联，得M3BAT－I，一种色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌，以IPTG诱导表达，经SDS－PAGE分析，可表达色氨酸合成酶β亚基、磷酸甘油酸脱氢酶M3突变体、色氨酸合成酶α亚基。一种敲除tnaA基因的色氨酸合成代谢途径加强的基因工程菌培养后，培养上清液色氨酸含量由原来的2mg/L提高到99mg/L。
文档编号C12N15/53GK101050469SQ20071005696
公开日2007年10月10日 申请日期2007年3月21日 优先权日2007年3月21日
发明者郭长江, 徐琪寿, 张绪梅, 刘云, 吴健全, 韦京豫, 杨继军 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所