专利名称：一种l－色氨酸的新合成方法
技术领域：
本发明涉及一种氨基酸的合成方法，尤其涉及一种L-色氨酸的新合成方法；属于生物医药领域。
背景技术：
L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，为白色或略带黄色叶片状结晶或粉末，水中溶解度1.14g(25℃)，溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解。微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。它是人体和动物生命活动中必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料等方面。在生物体内，从-色氨酸出发可合成5-羟基色胺等激素以及色素、生物碱、辅酶、植物激素等生理活性物质，可预防和治疗糙皮病，同时具有消除精神紧张、改善睡眠效果等功效。色氨酸代谢失凋会引起糖尿病和神经错乱，因此在医学上被用作氨基酸注射液和复合氨基酸制剂。
现有合成L-色氨酸主要有一化学合成法，其主要的合成过程为采用苯肼和乙酰氨基丙二酸二乙酯合成乙酰基色氨酸然后通过光拆分、水解得L-色氨酸；采用化学合成工艺比较繁琐，成本高，污染较重；二发酵法，其主要的合成过程为以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用优良的色氨酸生产菌种来生产L-色氨酸粗成品，再通过；离心和树脂分离，重结晶得到L-色氨酸，采用微生物直接发酵周期太长，达不到工业化生产的要求；三酶法，以吲哚和L-丝氨酸为底物，利用微生物中色氨酸生物合成酶系的催化功能生产色氨酸，酶法能够利用化工合成的前体物为原料，既充分发挥了有机合成技术的优势，又具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少、精制操作容易的优点，但是底物L-丝氨酸成本太高，难以实现工业化生产。
中国药科大学韦平和、吴梧桐等(《以L-半胱氨酸和吲哚酶法合成L-色氨酸》，文章编号1005-8915(2000)04-0197-03)介绍了用色氨酸酶基因工程菌WW-4催化L-半胱氨酸和吲哚合成L-色氨酸，虽然在80ml反应液(L-半胱氨酸0.75g，吲哚0.75g)37℃反应48h，可积累L-色氨酸1.18g。L-半胱氨酸转化率为93.2％，吲哚转化率为90.1％。产品总回收率达70％，所得晶体在熔点、旋光性和红外吸收光谱等方面与标准品完全一致；但是采用该方法在反应过程中L-半胱氨酸易被氧化成L-胱氨酸；而且不易分离纯化反应后的吲哚、L-半胱氨酸和L-色氨酸，因此该文献所涉及的制备方法只处于实验室制备阶段，无法实现L-色氨酸的工业化生产。
发明内容
本发明针对现有的化学合成L-色氨酸工艺繁琐，成本高，污染较重的缺陷，提供一种工艺简单、成本低，易工业化，基本无污染的L-色氨酸的新合成方法；本发明还针对现有的微生物发酵合成L-色氨酸周期太长，达不到工业化生产的要求的缺陷，提供一种生产周期短，能够达到工业化生产要求的L-色氨酸的新合成方法；本发明还针对现有的酶法生产L-色氨酸成本太高、底物易被氧化，不易分离纯化，难以实现工业化生产的缺陷，提供一种成本低、能够进行大规模工业化生产的L-色氨酸的新合成方法。
本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的一种L-色氨酸的新合成方法，该方法包括以下步骤A、底物转化在反应釜加入底物吲哚和L-半胱氨酸盐，加入色氨酸酶，在温度25～35℃，PH值7.0～8.5，负压或控制氧分压为0.01～0.03Mpa的条件下转化为L-色氨酸转化液；B、超滤膜纯化将上述转化后的L-色氨酸转化液在温度25～35℃，进口压力为0.4～0.8Mpa，出口压力为0.1～0.3Mpa的条件下通过超滤膜纯化；C、离子交换树脂吸附、洗脱将上述经过超滤膜纯化的渗透液调至PH值为4.5～5.5，然后通过离子交换树脂将L-色氨酸粗成品交换至树脂上，然后用0.8～1.5mol/L的盐酸溶液洗脱2～5遍；D、纳滤膜浓缩将上述经过盐酸洗脱后的L-色氨酸粗成品在温度25～35℃，进口压力为0.4～0.8Mpa，出口压力为0.1～0.3Mpa的条件下通过纳滤膜浓缩；浓缩后得到L-色氨酸成品。
本发明的底物转化步骤中采用L-半胱氨酸盐代替了L-半胱氨酸，由于L-半胱氨酸盐原料成本低，而且难以被氧化，易于保存，从而易实现工业化生产，现有技术为了保持反应过程中的离子、PH等工艺条件，常常加入添加辅酶因子磷酸吡哆醛并在磷酸钾缓冲液中反应，但是不仅增加了成本，而且由磷酸钾缓冲液带来的盐分提取比较困难，而本发明无需添加辅酶因子磷酸吡哆醛而且不需要磷酸钾缓冲液，这样不仅大大可以减少成本，而且减少磷酸钾缓冲液带来的盐分，降低产品提取难度，更易工业化生产。
本发明的色氨酸酶可以由市售的微生物(如，大肠杆菌、湿菌体、色氨酸基因工程菌ww-4等)产生的色氨酸酶或色氨酸合成酶；现有技术一般在PH值8.8和37℃的条件下反应，这样在生产上较难控制，而本发明在温度25～35℃，PH值7.0～8.5的条件下反应，这样的工艺条件比较容易控制，更易工业化生产，此外本发明的底物在负压或或控制氧分压为0.01～0.03Mpa的条件下进行转化，这样可以防止L-半胱氨酸被氧化成L-胱氨酸，提高底物转化化率，降低产品提取难度，提高产品质量。
本发明采用了在生产上可行性较强的先进的超滤膜技术代替离心机纯化转化液中的物质，并用纳滤膜代替升温减压浓缩，这样降低了L-色氨酸产品在高温下分解率，并且能够同时除盐，提高了L-色氨酸产品收率，降低了能耗，另外，经过本发明的超滤膜纯化、离子交换树脂吸附、洗脱，纳滤膜浓缩可以一次性获得合格的产品，无需重结晶等繁琐工艺。
在上述的L-色氨酸的新合成方法中，步骤A中所述的吲哚和L-半胱氨酸盐的重量比为1∶1.1～1.4，所述的色氨酸酶的用量为底物重量百分比的3％～8％。现有技术中底物转化反应中是以L-半胱氨酸过量反应，过量的L-半胱氨酸易被氧化生成L-胱氨酸，由于L-胱氨酸和L-色氨酸混合在一起不仅增大了最终产品L-色氨酸的提取难度，而且还会导致L-色氨酸质量下降，而本工艺发明采用吲哚过量反应，可以有效的防止L-半胱氨酸被氧化生成L-胱氨酸，降低最终产品L-色氨酸提取难度，提高产品质量。
在上述的L-色氨酸的新合成方法中，步骤A中所述的L-半胱氨酸盐为L-半胱氨酸盐酸盐。本发明采用L-半胱氨酸盐酸盐不仅降低了原料成本，并且比L-半胱氨酸比L-半胱氨酸较难被氧化，更易保存，更易工业化。
在上述的L-色氨酸的新合成方法中，步骤A中采用惰性气体或氮气保护条件下保持氧分压为0.01-0.03MPa，采用惰性气体或氮气保护，优选氮气，可以防止L-半胱氨酸被氧化，提高底物转化化率，降低产品提取难度。
本发明步骤B中超滤膜的进口压力为0.4～0.8Mpa，出口压力为0.1～0.3Mpa；作为优选，进口压力为0.6Mpa，出口压力为0.2Mpa。采用该压力可以提高膜通量，压力太高对膜的损害较大，压力太低膜的通量又会降低。
作为优选，步骤B中所述的超滤膜的膜孔径为20000-30000道尔顿。本发明采用超滤膜纯化，并将超滤膜的膜孔径控制在20000-30000道尔顿，能够去除绝大多数大分子量的蛋白质，而且不存在任何物理、化学反应，所以能够提高产品的收率；孔径太大，蛋白的去除率会下降，而孔径太小，又会降低膜通量，增大膜面积和运行时间，提高了设备成本和运行成本。
作为优选，步骤C中将上述经过超滤膜纯化的渗透液调至PH值为5.0，然后通过离子交换树脂将L-色氨酸粗成品交换至树脂上，然后用1mol/L的盐酸溶液洗脱3遍。由于大多数杂质不会与树脂进行交换，所以本发明采用离子交换树脂将L-色氨酸粗成品交换至树脂上，并在洗脱过程中采用分阶段收集产品，从而提高了产品质量。
本发明步骤D中纳滤膜的进口压力为0.4～0.8Mpa，出口压力为0.1～0.3Mpa；作为优选，所述的进口压力为0.6Mpa，出口压力为0.2Mpa。采用该压力可以提高膜通量，压力太高对膜的损害较大，压力太低膜的通量又会降低。
作为优选，步骤D中所述的纳滤膜的膜孔径为100-150道尔顿。本发明采用纳滤膜浓缩，并将纳滤膜的膜孔径控制在100-150道尔顿，这样盐和水能够通过纳滤膜，而L-色氨酸不能通过，除去大多数盐，而且不存在任何物理、化学反应，所以能够提高产品的收率。如果纳滤膜的孔径太大L-色氨酸会和盐同时透过，导致产品收率降低，孔径太小，盐又很难透过，导致除盐效率降低。
在上述的L-色氨酸的新合成方法中，该方法还包括步骤E、离心、烘干将步骤D中经过纳滤膜浓缩的L-色氨酸在转速为800rpm～1500rpm的条件下离心1～5分钟后，在温度为60～90℃，压力为-0.05～-0.15Mpa的条件下烘干后得到L-色氨酸成品。
纵上所述，本发明的L-色氨酸的新合成方法具有以下优点本发明的L-色氨酸的新合成方法操作简单、生产周期短、成本低、基本无污染，适合大规模的工业化生产；利用本发明的方法制备的L-色氨酸收率高、产品呈白色、片状并具有光泽，没有异味。
具体实施例方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明；但本发明并不限于这些实施例。
实施例1用电子天平(上海精密科学仪器有限公司制造)称量底物吲哚6.3g、L-半胱氨酸盐酸盐8.6g，60mg湿菌体(浙江普洛医药科技有限公司制造)加入到装有1000g去离子水的反应釜，然后通过恒温磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂制造)不断搅拌后，在温度25℃，用酸度计(上海精密科学仪器有限公司制造)控制PH值为8.5，通过SHZ-DC(III)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂制造)控制负压为-0.06MPa的水溶液条件下转化为L-色氨酸转化液；将上述转化后的L-色氨酸转化液转移至超滤膜储槽中，在温度25℃，进口压力为0.4Mpa，出口压力为0.1Mpa的条件下通过膜孔径为20000道尔顿的超滤膜(厦门三达膜技术有限公司制造)纯化；纯化后L-色氨酸粗成品的收率为98％，将上述经过超滤膜纯化的渗透液用0.8mol/L的盐酸调至PH值为5.5，然后通过离子交换树脂(上海华震科技贸易公司制造)将L-色氨酸粗成品交换至树脂上，然后用0.8mol/L的盐酸溶液分阶段洗脱5遍；洗脱后L-色氨酸收率为90％，将上述经过盐酸洗脱后的L-色氨酸溶液在温度25℃，进口压力为0.4Mpa，出口压力为0.1Mpa的条件下通过膜孔径为150道尔顿的纳滤膜(厦门三达膜技术有限公司制造)浓缩；浓缩后L-色氨酸粗成品的收率为98％，经过纳滤膜浓缩的L-色氨酸在转速为800rpm的离心机中离心10分钟后，通过控制选片真空泵(浙江黄岩求精真空泵厂制造)，在压力为-0.1MPa，温度为80℃的条件下在真空干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)烘干，4小时后得到L-色氨酸成品8.1g)。经观察实施例1制备的L-色氨酸呈白色、片状并具有光泽，没有异味，经HPLC分析，实施例1制备的L-色氨酸含量为98.5％。
实施例2用电子天平(上海精密科学仪器有限公司制造)称量底物吲哚6.3g、L-半胱氨酸盐酸盐8.6g、60mg湿菌体(浙江普洛医药科技有限公司制造)加入到装有1000g去离子水的反应釜，然后通过恒温磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂制造)不断搅拌后，在温度30℃，用酸度计(上海精密科学仪器有限公司制造)控制PH值为8.0通过采用氮气保护条件下保持氧分压为0.02MPa的水溶液条件下转化为L-色氨酸转化液；将上述转化后的L-色氨酸转化液转移至超滤膜储槽中，在温度30℃，进口压力为0.6Mpa，出口压力为0.2Mpa的条件下通过膜孔径为25000道尔顿的超滤膜(厦门三达膜技术有限公司制造)纯化；纯化后L-色氨酸粗成品的收率为97.8％，将上述经过超滤膜纯化的渗透液用1.0mol/L的盐酸调至pH值为5.0，然后通过离子交换树脂(上海华震科技贸易公司制造)将L-色氨酸粗成品交换至树脂上，然后用1.0mol/L的盐酸溶液分阶段洗脱3遍；洗脱后L-色氨酸收率为91％，将上述经过盐酸洗脱后的L-色氨酸粗成品在温度30℃，进口压力为0.6Mpa，出口压力为0.2Mpa的条件下通过膜孔径为150道尔顿的纳滤膜(厦门三达膜技术有限公司制造)浓缩；浓缩后L-色氨酸粗成品的收率为98.1％，经过纳滤膜浓缩的L-色氨酸在转速为1000rpm的离心机中离心7分钟后，通过控制选片真空泵(浙江黄岩求精真空泵厂制造)，在压力为-0.1MPa，温度为80℃的条件下在真空干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)烘干，4小时后得到L-色氨酸成品8.2g)。经观察实施例1制备的L-色氨酸呈白色、片状并具有光泽，没有异味，经HPLC分析，实施例2制备的L-色氨酸含量为98.2％。
实施例3用电子天平(上海精密科学仪器有限公司制造)称量底物吲哚6.3g、L-半胱氨酸盐酸盐8.6g、60mg湿菌体(浙江普洛医药科技有限公司制造)加入到装有1000g去离子水的反应釜，然后通过恒温磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂制造)不断搅拌后，在温度35℃，用酸度计(上海精密科学仪器有限公司制造)控制PH值为8.5通过采用氩气保护条件下保持氧分压为0.02MPa的水溶液条件下转化为L-色氨酸转化液；将上述转化后的L-色氨酸转化液转移至超滤膜储槽中，在温度35℃，进口压力为0.8Mpa，出口压力为0.3Mpa的条件下通过膜孔径为20000道尔顿的超滤膜(厦门三达膜技术有限公司制造)纯化；纯化后L-色氨酸粗成品的收率为98％，将上述经过超滤膜纯化的渗透液用1.5mol/L的盐酸调至PH值为4.5，然后通过离子交换树脂(上海华震科技贸易公司制造)将L-色氨酸粗成品交换至树脂上，然后用1.5mol/L的盐酸溶液分阶段洗脱2遍；洗脱后L-色氨酸收率为90％，将上述经过盐酸洗脱后的L-色氨酸粗成品在温度35℃，进口压力为0.8Mpa，出口压力为0.3Mpa的条件下通过膜孔径为150道尔顿的纳滤膜(厦门三达膜技术有限公司制造)浓缩；浓缩后L-色氨酸粗成品的收率为98％，经过纳滤膜浓缩的L-色氨酸在转速为1500rpm的离心机中离心4分钟后，通过控制选片真空泵(浙江黄岩求精真空泵厂制造)，在压力为-0.1MPa，温度为80℃的条件下在真空干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)烘干，4小时后得到L-色氨酸成品8.2g。经观察实施例1制备的L-色氨酸呈白色、片状并具有光泽，没有异味，经HPLC分析，实施例3制备的L-色氨酸含量为99.1％。
权利要求
1.一种L-色氨酸的新合成方法，该方法包括以下步骤A、底物转化在反应釜加入底物吲哚和L-半胱氨酸盐，加入色氨酸酶，在温度25～35℃，PH值7.0～8.5，负压或控制氧分压为0.01～0.03Mpa的条件下转化为L-色氨酸转化液；B、超滤膜纯化将上述转化后的L-色氨酸转化液在温度25～35℃，进口压力为0.4～0.8Mpa，出口压力为0.1～0.3Mpa的条件下通过超滤膜纯化；C、离子交换树脂吸附、洗脱将上述经过超滤膜纯化的渗透液调至PH值为4.5～5.5，然后通过离子交换树脂将L-色氨酸粗成品交换至树脂上，然后用0.8～1.5mol/L的盐酸溶液洗脱2～5遍；D、纳滤膜浓缩将上述经过盐酸洗脱后的L-色氨酸粗成品在温度25～35℃，进口压力为0.4～0.8Mpa，出口压力为0.1～0.3Mpa的条件下通过纳滤膜浓缩；浓缩后得到L-色氨酸成品。
2.根据权利要求1所述的一种L-色氨酸的新合成方法，其特征在于步骤A中所述的吲哚和L-半胱氨酸盐的重量比为1∶1.1～1.4，所述的色氨酸酶的用量为底物重量百分比的3％～8％。
3.根据权利要求1所述的一种L-色氨酸的新合成方法，其特征在于步骤A中所述的L-半胱氨酸盐为L-半胱氨酸盐酸盐。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种L-色氨酸的新合成方法，其特征在于步骤A中采用惰性气体或氮气保护条件下保持氧分压为0.01-0.03MPa。
5.根据权利要求1所述的一种L-色氨酸的新合成方法，其特征在于步骤B中所述的进口压力为0.6Mpa，出口压力为0.2Mpa。
6.根据权利要求1或5所述的一种L-色氨酸的新合成方法，其特征在于步骤B中所述的超滤膜的膜孔径为20000-30000道尔顿。
7.根据权利要求1所述的一种L-色氨酸的新合成方法，其特征在于步骤C中将上述经过超滤膜纯化的渗透液调至PH值为5.0，然后通过离子交换树脂将L-色氨酸粗成品交换至树脂上，然后用1mol/L的盐酸溶液洗脱3遍。
8.根据权利要求1所述的一种L-色氨酸的新合成方法，其特征在于步骤D中所述的进口压力为0.6Mpa，出口压力为0.2Mpa。
9.根据权利要求1或8所述的一种L-色氨酸的新合成方法，其特征在于步骤D中所述的纳滤膜的膜孔径为100-150道尔顿。
10.根据权利要求1所述的一种L-色氨酸的新合成方法，其特征在于该方法还包括步骤E、离心、烘干将步骤D中经过纳滤膜浓缩的L-色氨酸在转速为800rpm～1500rpm的条件下离心1～5分钟后，在温度为60～90℃，压力为-0.05～-0.15Mpa的条件下烘干后得到L-色氨酸成品。
全文摘要
本发明涉及一种L－色氨酸的新合成方法，该方法包括以下步骤A.底物转化；B.超滤膜纯化；C.离子交换树脂吸附、洗脱；D.纳滤膜浓缩，本发明L－色氨酸的新合成方法操作简单、生产周期短、成本低、基本无污染，适合大规模的工业化生产；制备的L－色氨酸收率高、产品呈白色、片状并具有光泽，没有异味。
文档编号C12P13/00GK101033479SQ200710068130
公开日2007年9月12日 申请日期2007年4月19日 优先权日2007年4月19日
发明者杜坚全, 刘益荣, 何俊勇, 朱黎君, 金子波, 杨胜君 申请人:横店集团家园化工有限公司