专利名称：基于电压依赖性阴离子通道筛选污染物和药物的方法、用途的制作方法
技术领域：
本发明属于环境医药生物技术领域，涉及电压依赖性阴离子通道及其用途，尤其是利用含有电压依赖 性阴离子通道的工程菌筛选环境污染物以及作用在电压依赖性阴离子通道的药物先到分子。
背景技术：
电压依赖性阴离子通道(Voltage-dependent anion channel, VDAC)，也称为线粒体穿孔蛋白(mitochondrial porin),是广泛分布于哺乳动物细胞线粒体外膜上的一种蛋白，亦存在于植物、动物、真菌、原生生物中。 VDAC是一种高度保守的线粒体外膜蛋白，含有283个左右的氨基酸残基，但在各种生物中的数量有差异。 粗糙脉孢菌只有一种VDAC，酵母存在两种VDAC, —种是由通道构成的，而另一种是非通道构型的。小 鼠拥有三种异构体VDAC1、 VDAC2和VDAC3，每种分子大约30kDa。除了几种与膜通透性密切相关 的亲脂性化合物，如分子氧、乙醛、短链脂肪酸等之外，所有代谢物出入线粒体均需要通过线粒体外膜上 的VDAC。 VDAC参与调控细胞生存和死亡。支撑生命基本功能。其活性可能受到Bcl-2调控。抗凋亡蛋 白Bcl-xL可以与VDAC相互作用，形成二聚体或者三聚体。每种VDAC均在脂质双分子层形成由跨膜的 a螺旋和13个跨膜的p折叠构成的桶状结构。这个(3桶围成一个内径2.5-3nm的水性通道，通道在开启状 态可允许大小在5kDa以下的非电解质类物质通过。a螺旋的作用可能是调节孔的大小，其动态变化控制 VDAC通道的关闭和开启。VDAC是一种离子选择性和电压依赖性兼具的通道。VDAC的闭合非常有效的 控制了有机阴离子的移动，包括呼吸的底物、肌酸磷酸盐、ATP、 ADP以及Pi。 一旦VDAC关闭，将会 阻止呼吸作用的底物供应，防止氧化磷酸化中ADP和Pi形成ATP。 VDAC参与能量代谢的主要方式是影 响ATP、 ADP在细胞质与线粒体之间的转运。ATP、 ADP的转运必须通过ANT / VDAC转运蛋白复合体 (ANT-adenine nucleotide translocator)， ATP在线粒体内是通过呼吸作用合成的，首先合成好的ATP通过ANT 穿过线粒体内膜，然后通过与VDAC作用跨过线粒体外膜，最后进入细胞质释放能量，最终形成ADP和 Pi，为生命活动提供能量。与之相反的过程，ADP通过转运蛋白复合体依次跨过线粒体外膜、内膜，最终 进入线粒体，与前一过程构成一个大的循环。VDAC作为线粒体外膜上的重要蛋白，对于调节细胞能量代 谢、维持胞内外钙平衡及调控细胞的凋亡均有十分重要的作用。
VDAC可以作为药物开发的靶标。纤维蛋白原plasminogenkringle5的受体也是VDAC。 VDAC1也具 有NADH铁氰化化物还原酶(NADH(-ferricyanide) reductase)活性，负责维持细胞氧化还原电势。VDAC2 调控促凋亡的分子BAK的活性，通过与其特异性结合，并维持其单体无活性构像，沟通线粒体生理和核 心凋亡途径。内皮NO合成酶(endothelialNO synthase, eNOS)也与VDAC相互作用。NO等可以破坏该相 互作用。VDAC还与dynein轻链相互作用。这也证明了 VDAC参与了膜运输。HIV的病毒蛋白(Viral protein R， Vpr)促进凋亡，这也通过与VDAC相互作用。
VDAC在好氧代谢中发挥功能。包括HIV,乙肝病毒和流感病毒等传染病的致病菌的分子都能够与 VDAC相互作用，通过这种相互作用调控宿主细胞的功能,尤其是凋亡。乙肝病毒的HBX蛋白通过与VDAC 相互作用，改变线粒体膜电势，进一步参与肝损伤。细菌的孔蛋白porin，如Neisseriaporin在致病菌感染 宿主细胞过程中，可以被转位到宿主细胞的线粒体上，并且具有类似宿主线粒体VDAC的功能，依赖电压 和核苷酸的结合，调控线粒体的凋亡。阻断Neisseria porin在宿主细胞内的运输，可以抑制致病菌导致的 凋亡。流感病毒(influenza virus)的促凋亡蛋白PB1-F2可以特异性与VDAC相互作用，下调宿主的免疫 应答功能。Sc叩hthalmus Maximus Rhabdovirus (SMRV)感染可以诱导鱼表达VDAC。感染的病毒可以通过 与VDAC相互作用，抑制不利于自己繁殖的宿主细胞的凋亡。
鉴于VDAC的功能多样，而且非常重要。VDAC是异多聚体。其发挥作用需要核心组分和调控因子。 因此有必要开发其调控因子类似物。同时，鉴于该分子可以灵敏显示环境中代谢物的种类和浓度变化。因 此，可以将其作为环境污染物的指示剂。
发明目的
本发明的目的在于提供，1. 一种重组表达电压依赖性阴离子通道的工程菌；2.利用表达电压依赖性阴 离子通道的工程菌作为环境污染检测体系；3.利用含有电压依赖性阴离子通道的工程菌作为药物耙标研发 新的药物的模型。
技术方案和
发明内容
采用本领域技术人员熟知的技术，从人类基因组扩增电压依赖性阴离子通道基因，在粟酒裂殖酵母或 者酿酒酵母等等适宜的宿主表达，构建含有电压依赖性阴离子通道的工程菌。 实现上述目的的基本技术路线为
总体技术方案是克隆包括提取细胞株如U937等的基因组，利用合适的载体和限制性内切酶片段，构 建转化载体，将基因组DNA克隆到合适的酵母宿主细胞。
1. 基因模板提取按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法提取人细胞株如U937等的基因组 DNA。
2. 工程菌的构建按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法，将基因组DNA反转录，克隆到 适当的载体，转化适当的宿主菌，通过一定的选择标记，收集获得的工程菌。
3. 功能基因的筛选按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、完全可以从商业途径获得的载体、 限制性内切酶和方法，将目标基因克隆到载体，转化宿主细胞，筛选转化子。从基因组表达文库筛选相应 的转化子，并进一步验证。
4. 利用含有功能基因的重组菌，进行功能基因抑制剂或激活剂以及环境污染物的筛选。
发明效果
利用本技术方案涉及的方法，得到了 1. 一种重组表达电压依赖性阴离子通道的工程菌；2.利用表达电 压依赖性阴离子通道的工程菌作为环境污染检测体系；3.利用含有电压依赖性阴离子通道的工程菌作为药 物耙标研发新的药物的模型。
具体实施方式
1材料与方法
l.l材料
大肠杆菌DH5a，大肠杆菌BL21及表达载体PET32 (含有IPTG诱导的启动子)为本实验室保存。 限制性内切酶，TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，PCR反应液，dNTP等购自TakaRa公司。胶回收试剂盒 购自bioertechnology公司。其他试剂为国产分析纯。 1.2细胞株基因组DNA的提取和反转录
采用本领域一般技术熟练人员熟知的技术路线和试剂、方法提取和反转录目标基因。 1.3引物的设计与合成
根据www.ncbi.nlm.nih.gov基因序列数据库中提供的序列数据(登陆号GeneID: 334582 GeneID: 83532 GeneID: 688752GenelD: 367185),设计了恰当的引物，在上、下游引物5-'端分别引入EcoRI、 HindIII 酶切位点和保护碱基(带下划线的是酶切位点)，以便于酶切和克隆。引物由上海英骏生物工程有限公司合 成。
1.4VDAC基因的PCR扩增
以细胞株基因组DNA为模板。反应体系为25uL，基因组DNA2HL， dNTP混合物2uL， DNAT叫酶(5U/uL) 0.5 n L，上下游引物各1.5 u L， 10xPCR buffer(含mg+)2.5 u L， ddH20 15 u L。扩增条件为95。C预变性5min, 95'C变性lmin, 58'C退火lmin, 72'C延伸2.5min，循环30次，扩增结束后72'C延伸I0min， 4'C保存。用1.0% 的琼脂糖凝胶电泳分析实验结果，并将各管产物合并后用酚-氯仿抽提纯化，并通过1.0%的琼脂糖凝胶电 泳检测结果。
1.5大肠杆菌大肠杆菌DH5a和大肠杆菌BL21感受态细胞的制备
用CaC12法制备感受态细胞。(参考文献) 1.6构建表达VDAC的重组质粒pET32-VDAC
用EcoR I和Hind m分别对PCR产物和pET32质粒进行置于37。C水浴中进行双酶切，用1.0%的琼脂糖凝胶进 行胶回收，回收后用T4DNA连接酶16'C过夜连接，将重组的克隆载体转化到ExoliDH5a感受态细胞中， 随机挑取几个克隆振荡培养几小时进行菌落PCR得到阳性克隆并用碱裂解法提取重组质粒。然后对重组质 粒进行PCR扩增检测和酶切检测。PCR扩增条带与目的条带基本一致。对重组质粒进行测序(序列由上海 英骏生物工程有限公司测定)。
1.7利用含有VDAC的工程菌筛选环境污染物或者调控其活性的药物先导物分子
将工程菌培养在合适的培养基如YEPD (商业途径可以购买获得)中，添加环境污染物，或者待测化合物 库，根据细胞形态的变化与否，以及细胞功能的变化，如对色素的吸收或者染料等的摄取，判断，污染物
的种类和含量。
权利要求
1.一种重组表达电压依赖性阴离子通道的工程菌，其特征是含有电压依赖性阴离子通道编码基因。
2. —种利用表达电压依赖性阴离子通道的工程菌作为环境污染检测体系，其特征是含有重组表达电压依赖 性阴离子通道的工程菌。
3. —种利用含有电压依赖性阴离子通道的工程菌作为药物靶标研发新的药物的方法，其特征是含有电压依 赖性阴离子通道的工程菌。
4. 根据权利要求2和3所述的工程菌，其特征是酵母，包括酿酒酵母、粟酒裂殖酵母或克鲁维酵母等。
全文摘要
本发明属于环境医药生物技术领域，涉及一种基于电压依赖性阴离子通道检测环境污染物和筛选药物先导物的方法及其用途，尤其是利用含有电压依赖性阴离子通道的工程菌筛选环境污染物以及作用在电压依赖性阴离子通道的药物先到分子。
文档编号C12N1/19GK101186883SQ20071009317
公开日2008年5月28日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者磊 冀, 廖国建, 谢建平, 黄玉明 申请人:西南大学