专利名称：高密度脂蛋白胆固醇的测定方法
技术领域：
本发明涉及测定试样中的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的方法。众所周知，高密度脂蛋白胆固醇的血中含量是预测动脉硬化疾病发病的有用指标。
背景技术：
存在于血液中的脂质，除了游离脂肪酸与白蛋白结合之外，还会结合到脂蛋白的结构中，并以乳糜微粒(CHM)、超低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)等形式存在，尤其是其中的胆固醇分布在VLDL、LDL、HDL中。HDL是由动脉硬化所引起的心脏疾病的预防因子，因此，通过对高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)进行测定，以代替测定高密度脂蛋白(HDL)，这在临床上具有重要的意义。作为现有的HDL胆固醇的测定方法，超离心法、电泳法、沉淀法是广为人知的。
超离心法的分离操作需要较长的时间，且仪器本身价格昂贵，不能指望进行廉价的测试等，不适合日常检查；电泳法会由于电泳支持介质的不同而导致分离能的不同，由于使用条件或使用检测试剂的不同而产生差异等，而且在定量方面也存在问题等。因此，作为现在的日常检查，广泛使用沉淀法。
沉淀法是一种通过使用聚阴离子与2价金属离子的组合等作为沉淀试剂使CHM、LDL、VLDL沉淀，并使用化学试剂或者酶测定残留在上清液中的HDL中的胆固醇即HDL-胆固醇的方法。作为沉淀试剂，广泛使用根据中井继彦所著《HDL-代谢·测定·临床(HDL-Metabolism，AssayMethods and Clinnical Application)》(中外医学社，1986年)、各种文献·教材的自1960年代以来周知的硫酸多糖类-碱土类金属离子或除碱土类以外的2价金属离子的组合体系、无机聚阴离子盐类、聚乙二醇等。作为沉淀试剂的具体实例，包括肝素-钙系试剂、硫酸葡聚糖-镁系试剂、磷钨酸-镁系试剂等。
在这些沉淀法中，包括将血清与沉淀试剂混合，放置一定时间，在约3000转/分钟下进行离心分离，然后定量分离上清液部分，进行化学反应或者酶反应，对HDL-胆固醇进行定量的方法。
在沉淀法中，也存在沉淀试剂的问题和分离操作所引起的问题等。因此，作为用于提高沉淀效率的沉淀剂的改进，在特开昭55-78254号公报、特开昭55-93065号公报、特开昭61-263467号公报、特开昭62-19768号公报、特公平1-39553号公报等中记载了各种方法。
另外，现有的沉淀法的重要不足在于，在甘油三酯较多的试剂的情形中，在离心分离之后，沉淀物会部分浮游。因此，必须进行离心条件的调整等，这是个大问题。另外，在使用磷钨酸盐镁离子的方法中，存在由于溶液的pH导致沉淀不均的问题。因此，存在必须对pH进行严格的调整等各种问题。
另外，在对离心分离液的上清液进行分离时，特别是在液量较少的情况下，难以通过目视判断沉淀物的边界范围，所以在再现性、精度上产生问题、或者产生个体差异，因而定量分析精度有时会降低。因此要求改善这些伴随离心操作产生的缺点。
近年来，无需这些烦琐的操作、且可以用于自动分析装置中的直接法得到了迅速普及。例如，在特开平8-131197号公报中，公开了通过使用硫酸化环糊精作为凝集化剂，在与除HDL之外的脂蛋白充分反应后，使其与经聚氧乙二醇修饰的酶发生作用，测定HDL中的胆固醇的方法。在WO98/26090号公报中，公开了在第一工序中使用触酶消除掉除HDL以外的脂蛋白，在第二工序中，使用对HDL具有特异性作用的活化剂测定HDL-C的方法。另外，在特开平9-96637号公报中，公开了首先使除HDL以外的脂蛋白的抗体发生作用，接着溶解HDL，从而测定HDL中的胆固醇的方法。
但是，为了抑制除了HDL以外的脂蛋白所产生的反应，必须使用经PEG修饰的酶或抗体等昂贵的试剂类。
在干式化学(dry chemistry)领域，沉淀法也是主流，但近年来，开发了使用了直接法的干式新试验片，该方法记载在专利第3686326号公报中。在特开2005-137360号公报中，记载了使用来源于皱落假丝酵母(Candida Rugosa)的脂肪酶来提高选择性。但是，在全部的试样中，均不能完全除去来自除HDL以外的脂蛋白中的胆固醇。
中井继彦著，《HDL-代谢·测定·临床(HDL-Metabolism，Assay Method and Clinnical Application)》(中外医学社，1986年)[专利文献1]特开昭55-78254号公报[专利文献2]特开昭55-93065号公报[专利文献3]特开昭61-263467号公报[专利文献4]特开昭62-19768号公报[专利文献5]特公平1-39553号公报[专利文献6]特开平8-131197号公报[专利文献7]WO98/26090A[专利文献8]特开平9-96637号公报[专利文献9]专利第3686326号[专利文献10]特开2005-137360号公报发明内容本发明所要解决的问题在于，提供一种使用廉价材料，简便、迅速且特异性地测定检测试样中HDL-C的方法，HDL-C检测用试剂盒，以及HDL-C检测用干式分析元件。
本发明人等为解决上述问题进行了积极的研究，结果发现，通过使用来源于Schizophyllum commune(裂殖菌)或者来源于pseudomonas sp.(假单胞菌种)的胆固醇酯酶、以及来源于pseudomonas sp.的胆固醇氧化酶作为检测HDL-C时的酶，从而能有效地选择性地测定HDL中的胆固醇。本发明是基于上述发现而完成的发明。
根据本发明，提供了一种HDL-C的测定方法，其特征在于是体液试样中的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的测定方法，通过使用来源于Schizophyllum commune或者来源于pseudomonas sp.的胆固醇酯酶、以及来源于pseudomonas sp的胆固醇氧化酶，使得由HDL-C生成过氧化氢，从而选择性地测定HDL-C。
优选使用能优先溶解高密度脂蛋白(HDL)的表面活性剂。
优先溶解高密度脂蛋白的表面活性剂优选为聚氧乙烯亚烷基苯基醚、或者聚氧乙烯亚烷基三苯甲基苯基醚。
聚氧乙烯亚烷基苯基醚优选为聚氧乙烯苯乙烯基苯基醚，聚氧乙烯亚烷基三苯甲基苯基醚优选为聚氧乙烯三苯甲基苯基醚。
聚氧乙烯苯乙烯基苯基醚优选为聚氧乙烯单或二或三苯乙烯基苯基醚。
优选使用能够抑制除高密度脂蛋白(HDL)以外的脂蛋白溶解的表面活性剂、以及能够凝集除HDL以外的脂蛋白的凝集剂。
能够抑制除HDL以外的脂蛋白溶解的表面活性剂优选为聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、烷基苯磺酸盐、或聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物。
能够凝集除HDL以外的脂蛋白的凝集剂优选为磷钨酸或其盐与2价金属离子、硫酸葡聚糖与2价金属离子、肝素与2价金属离子、或聚氧乙烯。
优选在利用胆固醇酯酶以及胆固醇氧化酶由HDL-C所生成的过氧化氢中，使所生成的过氧化氢与过氧化物酶和发色体作用进行发色反应，从而测定HDL-C。
作为发色体，优选使用4-氨基安替比林或其衍生物、以及与上述4-氨基安替比林或其衍生物偶联的Trinder试剂。
优选使用在防渗水性的载体上至少具有粘合层和多孔性展开层的干式分析元件测定HDL-C。
根据本发明的另一个方面，提供了一种至少包含来源于Schizophyllumcommune或者来源于pseudomonas sp.的胆固醇酯酶、以及来源于pseudomonas sp.的胆固醇氧化酶的HDL-C检测用试剂盒。
根据本发明的另一个方面，提供了一种HLD-C检测用干式分析元件，其特征在于在防渗水性的载体上至少具有粘合层和多孔性展开层的干式分析元件，在防渗水性载体上的层中包含来源于Schizophyllumcommune或者来源于pseudomonas sp.的胆固醇酯酶、以及来源于pseudomonas sp.的胆固醇氧化酶。
根据本发明的HDL-C的测定方法，能够简便迅速、且选择性地测定检测试样中的HDL-C。
图1表示使用本发明的酶的溶液体系的测定例(实施例1)的结果。
图2表示使用其他来源的胆固醇酯酶时的溶液体系的测定例(比较例1)的结果。
图3表示使用其他来源的胆固醇氧化酶时的溶液体系的测定例(比较例2)的结果。
图4表示使用其他来源的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶时的溶液体系的测定例(比较例3)的结果。
图5表示基于使用了本发明的酶的干式分析元件的测定例(实施例2)的结果。
图6表示针对本发明的方法和利用磷钨酸的差示法的多检测样本相关性的分析结果。
图7表示基于使用了其他来源的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的干式分析元件的测定例(比较例4)的结果。
图8表示基于使用了本发明的酶的干式分析元件的测定例(实施例3、ペグノ一ル005)的结果。
图9表示基于使用了本发明的酶的干式分析元件的测定例(实施例3、Pionin D-6512)的结果。
图10表示基于使用了本发明的酶的干式分析元件的测定例(实施例3、Emulgen A90)的结果。
图11表示基于使用了本发明的酶的干式分析元件的测定例(实施例3、NoigenEA-157)的结果。
图12表示基于使用了本发明的酶的干式分析元件的测定例(实施例3、Sorpol T20)的结果。
具体实施例方式
下面，针对本发明的实施方式进行详细说明。
本发明的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的测定方法，其特征在于通过使用来源于Schizophyllum commune或者来源于pseudomonas sp.的胆固醇酯酶、以及来源于pseudomonas sp的胆固醇氧化酶，使得由HDL-C生成过氧化氢，选择性地测定HDL-C。
在本发明中，能够测定体液试样中的HDL-C。作为体液，可以使用血液或者尿液等。作为体液试样，可以直接使用血液或者尿，也可以使用进行适当前处理的试样。
下面，针对本发明的方法中使用的试剂进行说明。
作为本发明中使用的酶，是胆固醇酯酶、以及胆固醇氧化酶。作为胆固醇酯酶，使用来源于Schizophyllum commune或者来源于pseudomonas sp.的胆固醇酯酶，特别优选来源于Schizophyllum commune的胆固醇酯酶。另外，作为胆固醇氧化酶，使用来源于pseudomonas sp的胆固醇氧化酶。本发明所使用的酶可以是来自各种微生物的酶，也可以是通过已知方法制造的重组体。
作为来源于Schizophyllum commune的胆固醇酯酶，可以举出东洋纺公司制造的COE-302，作为来源于pseudomonas sp的胆固醇酯酶，可以举出东洋纺公司制造的COE-311、LPL-312、LPL-314、旭化成公司制造的CEN等。另外，来源于pseudomonas sp的胆固醇氧化酶可以举出Kikkoman公司制造的CHO-PEL或CHO-PEWL等。
在本发明中，优选使用优先溶解HDL的表面活性剂。作为优先溶解HDL的表面活性剂，可以使用聚氧乙烯亚烷基苯基醚(通式1)、以及聚氧乙烯亚烷基三苯甲基苯基醚(通式2)。
通式(1)[化2]
(通式2)作为上述通式的Y，可以举出氢原子、卤素原子、烷基、烯基、苯基、杂环基、羟基、烷基氧基、苯基氧基、氨基、烷基氨基、氰基、羰基、羰基氧基、烷基氧基羰基等。作为R，可以举出氢原子、碳原子数为1～8的烷基，并且在同一分子内可以相同，也可以不同。p表示2～6，m表示0～20，n表示5～100。
(通式3)(通式3)的苯乙烯基加成摩尔数z为1～5，优选为z＝1～3的聚氧乙烯单、二或三苯乙烯基苯基醚。
特别优选的(通式1)组合是苯乙烯基(通式3)、聚氧亚烷基加成摩尔数m＝0的聚氧乙烯苯乙烯基苯基醚。聚氧乙烯加成摩尔数的平均值n优选为5～100，更优选为n＝5～50，特别优选为n＝10～50。
也可以是n的数非单一且具有一定范围的混合物。例如，作为聚氧乙烯二苯乙烯基苯基醚的市售产品，可以举出Noigen(ノイゲン)EA-157(第一工业制药公司制造)，并且形成聚氧乙烯加成摩尔数平均值为17、且具有n＝约5～约30的范围的混合物。
特别优选的(通式2)为聚氧亚烷基加成摩尔数m＝0的聚氧乙烯三苯甲基苯基醚。聚氧乙烯加成摩尔数的平均值n优选为5～100，更优选为n＝5～50，特别优选为n＝10～50。也可以是n的数非单一且具有一定范围的混合物。例如，作为聚氧乙烯三苯甲基苯基醚的市售产品，可以举出Emulgen(エマルゲン)B66(花王公司制造)，并且形成聚氧乙烯加成摩尔数平均值为16、且具有n＝约5～约30的范围的混合物。
作为这样的表面活性剂市售产品的实例，作为聚氧乙烯单苯乙烯基苯基醚，可以列举出Pionin(パイオニン)D-6512(竹本油脂公司制造)，作为聚氧乙烯二苯乙烯基苯基醚，除了Noigen EA-157之外，还可以举出Emulgen A90(花王公司制造)，作为聚氧乙烯三苯乙烯基苯基醚，可以举出Sorpol(ソルポ一ル)T-20(东邦化学工业公司制造)、Newcol(二ユ一コ一ル)2609(日本乳化剂公司制造)，作为聚氧乙烯三苯甲基苯基醚，除了Emulgen B66之外，还可以举出ペグノ一ル005(商品名)(东邦化学工业公司制造)等。
这些表面活性剂，可以单独使用，也可以以混合物的形式使用。
在本发明中，可以使用抑制除HDL以外的脂蛋白溶解的表面活性剂。作为抑制除HDL以外的脂蛋白溶解的表面活性剂，可以举出选自聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、烷基苯磺酸盐、以及聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物的表面活性剂。作为聚氧乙烯烷基醚硫酸盐，可以举出エマ一ル20C(商品名)(花王公司制造)等，作为聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物，可以举出Pluronic(プルロニツク)系列(旭电化公司制造)等。
在本发明中，可以使用凝集除HDL以外的脂蛋白的凝集剂。作为凝集脂蛋白的凝集剂，可以使用根据中井继彦所著的《HDL-代谢·测定·临床(HDL-Metabolism，Assay Methods and Clinnical Application)》(中外医学社，1986年)、各种文献·教材自1960年代以来已知的硫酸多糖类-碱土金属离子或者除碱土类以外的2价金属离子的组合体系、无机聚阴离子盐类、聚乙二醇等。
在这些沉淀试剂中，作为硫酸多糖类-金属离子的组合体系，优选《Journal of Laboratory and Clinical Medicine》第82卷第473页以后(1973年)所记载的硫酸葡聚糖-钙(2+)离子复合物；《J.Lipid Res.》第11卷第583～595页(1970年)、《Clin，Chem.》第24卷931～933页(1978年)等记载的硫酸葡聚糖-镁(2+)离子复合物；《J.Lipid Res》第11卷第583～595页(1970年)、《Manual of Lipid Operations.Lipid ResearchClinics Program Volume I》，Pub.No.(NIH)75～628(1978年)等所记载的肝素、肝素钠-锰离子的组合；特开昭55-51359所记载的肝素-钙离子-镍(2+)离子的组合等沉淀试剂。作为无机聚阴离子类沉淀试剂，优选《J.Lipid Res.》第11卷第583～595页(1970年)、《Clin，Chem.》第23卷882～884页(1977年)、《Clin，Chem.》第25卷939～942页(1979年)、US4226713A、特公昭63-27659号公报(US4215993A)、特开平01-39553(US4251519A)等记载的磷钨酸(盐)-镁(2+)离子的组合。更优选硫酸葡聚糖和镁离子。
在本发明中，除了这些试剂之外，作为用于检测胆固醇的试剂，可以使用已知的酶试剂、发色体、以及pH缓冲剂。
具体来说，作为酶，是过氧化物酶，作为发色体，是4-氨基安替比林(4-AA)以及通过供氢性偶联而发色的酚性或者苯胺性的Trinder试剂。作为Trinder试剂，优选是苯胺性试剂的同仁研究所制造的ADPS、ALPS、TOPS、ADOS、DAOS、HDAOS、MAOS、TOOS等。
作为pH缓冲剂的实例，有碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或《Biochemistry》第5卷(2号)467～477页(1966年)所记载的Good的pH缓冲剂等。这些pH缓冲剂可以参照《蛋白质·酶的基础实验法》(堀尾武一等著，南江堂，1981年)、《Biochemistry》第5卷等文献的记载来选择。
上述缓冲剂的pH值，可以根据所用的酶的指示pH值来决定，优选调整至pH 5.0～8.0。更优选调整至pH 6.0～7.0。
接着，针对测定系统为溶液时本发明的测定方法进行说明。作为试剂溶液的组成，优选包含如下(1)～(6)的组成的溶液。
(1)来源于Schizophyllum commune或者来源于pseudomonas sp.的胆固醇酯酶(2)来源于pseudomonas sp.的胆固醇氧化酶(3)优先溶解HDL的表面活性剂(4)过氧化物酶(5)发色体(4-AA和Trinder试剂)(6)pH缓冲剂在约20℃～约45℃的范围内的恒定温度下、优选在约30℃～约40℃范围内的恒定温度下，将1～1000u L、优选100～500μL的将这些试剂调整至最佳浓度的试剂液体预培育1～10分钟。向其中加入0.5～50μL、优选1～20μL的溶液试样。一边在恒定温度下进行培育，一边测定与发色体的发色对应的波长的随时间变化。可以使用预先制作的校正曲线，通过比色测定法的原理求出检测试样中的被检测物质量。
作为必要的酶量，优选在0.2～20U/mL的范围内使用胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶的任一种酶。更优选在1～10U/ml下使用。
当测定系统为溶液时，作为使用的表面活性剂，可以仅是优先溶解高密度脂蛋白(HDL)的表面活性剂。作为表面活性剂的浓度，优选使用0.01～5％的浓度。更优选为0.1～1％的浓度。
下面，针对测定系统为干试剂的干式分析元件的结构进行说明。干式分析元件的结构为在防渗水性的载体上具有至少1层粘合层以及多孔性的展开层。
上述多孔性层可以是纤维质，也可以是非纤维质，由于能够发挥作为液体试样展开层的功能，因此优选为具有液体计量作用的层。液体计量作用是指在层的面方向上，每单位面积以基本恒定量的比例扩散点滴施加在层表面上的液体试样，且基本上不会使其中所包含的成分发生偏析。在展开层中，为了调节展开面积、展开速度等，可以包含特开昭60-222770、特开昭63-219397、特开昭62-182652所记载的亲水性高分子或表面活性剂。
纤维性的多孔层优选为以特开昭55-164356号公报、特开昭57-66359号公报、特开昭60-222769号公报等为代表的聚酯纤维。作为非纤维性多孔层，优选为聚磺酸等有机高分子。
粘合层具有粘合上述防渗水性载体、以及上述多孔层的功能，因此可以使用明胶及它们的衍生物(例如，邻苯二甲酸化明胶)、纤维素衍生物(例如，羟丙基纤维素)、琼脂糖、丙烯酰胺聚合物、甲基丙烯酰胺聚合物、丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺与各种乙烯性单体的共聚物等亲水性聚合物。
可以使用已知的方法均匀涂布包含亲水性聚合物的水溶液，涂布方法可以使用已知的方法。在涂布时，可以适当选用浸渍涂布法、挤压涂布法、刮涂法、漏斗(ホツパ一)涂布法、帘式涂布法等。
可以在粘合层上涂布多孔层，但优选层叠作为预编织物所提供的布帛或者多孔膜。层叠的方法如特开昭55-164356所述，预先用水同样地使包含亲水性聚合物的粘合剂层的表面湿润，然后通过在它上面覆盖布帛或多孔性膜并轻轻施加基本相同的压力，使其粘合的方法进行粘合。粘合层的厚度优选为0.5～50μm，更优选为1～20μm。
作为透光性载体的材料，优选聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚苯乙烯、三乙酸纤维素等纤维素醚类。为了使亲水性层的吸水层、检测层、基本上无孔性的试剂层等牢固地粘合在载体上，通常在支持体上设置下涂层，或实施亲水化处理。对支持体的厚度并没有特别的限制，优选为10～1000μm，更优选为300～800μm。当为具有透光性的载体时，最终的检测可以是在载体一侧，也可以在多孔层一侧，在非透光性的情形中，从多孔层一侧进行检测。
接着，针对在本发明的测定方法中所用的干式分析元件中所使用的胆固醇测定用试剂组合物与产生光学变化的试剂组合物进行说明。
试剂组合物可以包含在第1多孔性层中，也可以包含在粘合层和多孔性层两者中，可以全部或者大部分包含在任一个层中，或者包含在除粘合层和多孔性层之外的层中。
在HDL-C检测用干式分析元件中，优选每1平米使用0.1～20kU的来源于Schizophyllum commune或者来源于pseudomonas sp.的胆固醇酯酶、来源于pseudomonas sp的胆固醇氧化酶的任一种酶，更优选每1平米使用0.5～10kU。
上述2种表面活性剂(即，优先溶解HDL的表面活性剂、以及抑制除HDL以外的脂蛋白溶解的表面活性剂)优选每1平米均提供0.2～20g，更优选提供1～10g。其中，优先溶解HDL的表面活性剂与抑制除HDL以外的脂蛋白溶解的表面活性剂的量的比优选为9/1～5/5。更优选使用8/2～6/4的比例。
凝集除HDL以外的脂蛋白的凝集剂优选为硫酸葡聚糖(Mw＝5000000)与镁离子，每1平米优选使用0.05～10g的硫酸葡聚糖、每1平米优选使用0.01～20g的氯化镁六水合物。更优选使用0.1～5g/m2的硫酸葡聚糖、0.5～10g/m2的氯化镁六水合物。
对于上述过氧化物酶，对其来源并没有特别限制，优选来源于西洋山萮菜。作为使用量，优选为1～100kU/m2，更优选为10～50kU/m2。
作为上述发色体，优选通过与4-氨基安替比林(4-AA)偶联来发色的上述试剂的组合，特别优选使用DAOS。就所用发色体的量而言，4-AA和氢供应性偶联剂均优选使用0.1～10g/m2。更优选使用0.3～5g/m2。
在用于检测HLD-C的干式分析元件的其他药剂组合物中，根据需要，可以含有稳定剂、pH缓冲剂、交联剂(硬膜剂或硬化剂)、表面活性剂、聚合物等。可以包含在本发明的干式分析元件的粘合剂层或者多孔性层中。
上述缓冲剂的pH值可以根据所用酶的指示pH值来决定，优选调整至pH5.0～8.0。更优选调整至pH6.0～7.0。
本发明的干式分析元件例如可以剪裁成一边为例如约5mm～约30mm的正方形或者大致相同尺寸的圆形等的小片，并收纳在特公昭57-283331号公报(对应于US4169751A)、实开昭56-142454号公报(对应US4387990A)、特开昭57-63452号公报、实开昭58-32350号公报、特表昭58-501144号公报(对应WO083/00391A)等记载的载片框中用作化学分析载片，从制造、包装、运输、保存、测定操作等的观点出发，其是优选的。根据使用目的，可以以长带状被盒子或者暗盒收纳而使用，或者将小片收纳在具有开口的容器中使用，或者将小片粘贴或者收纳在开口卡中使用，或者直接使用剪裁的小片，等等。
本发明的干式分析元件在多孔性液体试样展开层上滴加了例如在约2μL～约30μL、优选4μL～15μL范围的水性液体试样。在约20℃～约45℃的范围的恒定温度下、优选在约30℃～约40℃的范围内的恒定温度下对该滴加后的干式分析元件进行1～10分钟的培育。可以从透光性载体一侧干式分析元件内的发色或者变色进行反射测光，使用预先制成的校正曲线通过比色测定法的原理求出检测试样中被检测物质的量。
测定操作可以通过特公昭60-125543号公报、特开昭60-220862号公报、特开昭61-294367号公报、特开昭58-161867号公报(对应US4424191A)等所记载的化学分析装置，以非常容易的操作进行高精度的定量分析。另外，根据目的或必要精度，也可以通过目视判定发色的程度，进行半定量测定。
本发明的干式分析元件在进行分析之前可以在干燥状态下储存·保管，因此不必即时制备试剂，另外，由于通常在干燥状态下试剂稳定性高，因而与必须即时制备试剂溶液的所谓溶液法相比，在简便性、巡视性方面更出色。另外，作为在微量的液体试样中能够迅速进行高精度检查的检查方法也是优良的。
下面通过实施例对本发明进行进一步具体的说明，但是本发明并不受到实施例的限制。
实施例实施例1使用本发明的酶的溶液系统的测定实施例调制如下所示的组成的试剂溶液。
MES缓冲液(pH 7.0) 700mmol/L胆固醇酯酶(来源于Schizophyllum commune)4.5U/mL胆固醇氧化酶(来源于pseudomonas sp.)2.8U/mL过氧化物酶 4.8U/mL4-氨基安替比林(和光纯药公司制造) 4.0mmol/LDAOS(同仁研究所制造) 4.0mmol/LEmulgen B66(花王公司制造) 0.62mg/mL以将HDL、LDL的精制产品调整为胆固醇浓度100mg/dL得到的试样、以及7％的HSA水溶液作为检测样本。在37℃下将245μL的上述试剂液体预培育3分钟，向其中加入5μL的上述检测样本，测定600nm的发色情况。结果如图1所示，根据上述方法，HDL在大约5分钟内完全发色，LDL几乎没有变化。
比较例1使用其他来源的胆固醇酯酶的情形使用与实施例1相同的配方配置试剂，不同仅在于使用下述来源的胆固醇酯酶。
胆固醇酯酶(来源于Chromobacterium viscosum 4.5U/mL(粘稠色杆菌))使用与实施例1相同的检测样本进行测定。
结果如图2所示，对HDL，对LDL的灵敏度均较小，且特异性也较低。
比较例2使用其他来源的胆固醇氧化酶的情形使用与实施例1相同的配方配置试剂，不同仅在于使用下述来源的胆固醇氧化酶。
胆固醇氧化酶(来源于Microorganism(微生物))2.8U/mL使用与实施例1相同的检测样本进行测定。
结果如图3所示，对HDL，对LDL的灵敏度均较小，且特异性也较低。
比较例3使用其他来源的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的情形使用与实施例1相同的配方配置试剂，不同仅在于使用下述来源的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶。
胆固醇酯酶(来源于Chromobacterium viscosum) 4.5U/mL胆固醇氧化酶(来源于Microorganism) 2.8U/mL使用与实施例1相同的检测样本进行测定。
结果如图4所示，对HDL，对LDL的灵敏度均较小，且特异性也较低。
实施例2使用本发明的酶的干式分析元件在下面涂布了明胶的180μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯无色透明平滑膜上涂布明胶水溶液并干燥，并使干燥后的厚度达到14μm。接着，在上述薄膜上以约30g/m2的施加量在向个面加水使其湿润，然后轻轻施加压力层叠以36号规格编织相当于50旦尼尔的聚酯纺丝而成的经编织布料，并干燥。接着，在上述布料上涂布下述组成的水溶液，并干燥。
MES缓冲液(pH 6.6) 18g/m2胆固醇酯酶(来源于Schizophyllum commune)1.9kU/m2胆固醇氧化酶(来源于pseudomonas sp.)1.2kU/m2过氧化物酶 31kU/m24-氨基安替比林(和光纯药公司制造) 0.4g/m2
DAOS(同仁研究所制造) 0.4g/m2Emulgen B66(花王公司制造)2.0g/m2Pluronic F-88(旭电化公司制造)1.3g/m2硫酸葡聚糖(5000000)(和光纯药公司制造)0.7g/m2氯化镁六水合物(和光纯药公司制造) 4.6g/m2以将HDL、LDL的精制产品调整为胆固醇浓度100mg/dL得到的试样、以及7％的HSA水溶液作为检测样本。在上述干式分析元件上滴加10μL的检测样本，然后在37℃下预培育6分钟。测定此时600nm的发色情况。结果如图5所示，根据上述方法，HDL在大约5分钟内完全发色，LDL的OD几乎没有变化。
针对25个健康人，针对本发明的方法与使用磷钨酸的差示法，分析多检测样本的相关性。结果如图6所示，本发明与基准方法相比，可以得到良好的相关。
比较例4通过与实施例2相同的方法制造干式分析元件，不同仅在于使用下述来源的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶。
胆固醇酯酶(来源于Chromobacterium viscosum)1.9U/m2胆固醇氧化酶(来源于Microorganism) 1.2U/m2使用与实施例2相同的检测样本，通过相同方法进行测定。
结果如图7所示，通过上述方法制造的分析元件对HDL的反应性、以及对LDL的反应性都较低，并且HDL也没有特异性。
实施例3使用本发明的酶的干式分析元件(2)除了将实施例2的Emulgen B66改变为ペグノ一ル005(商品名)(东邦化学工业公司制造)、Pionin D-6512(竹本油脂公司制造)、Emulgen A90(花王公司制造)、Noigen EA-157(第一工业制药公司制造)、Sorpol T-20(东邦化学工业公司制造)之外，通过相同方法制造干式分析元件。
以将HDL、LDL的精制产品调整为胆固醇浓度100mg/dL得到的试样、以及7％的HSA水溶液作为检测样本。在上述干式分析元件上滴加10μL的检测样本，然后在37℃下预培育6分钟。测定此时600nm的发色情况。结果如图8～12所示，根据上述方法，HDL在大约5分钟内完全发色，LDL的OD几乎没有变化。
权利要求
1.一种HDL-C的测定方法，其特征在于是体液试样中的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的测定方法，通过使用来源于Schizophyllum commune或者来源于pseudomonas sp.的胆固醇酯酶、以及来源于pseudomonas sp.的胆固醇氧化酶，使得由HDL-C生成过氧化氢，从而选择性地测定HDL-C。
2.根据权利要求1所述的HDL-C的测定方法，其中，使用能优先溶解高密度脂蛋白(HDL)的表面活性剂。
3.根据权利要求2所述的HDL-C的测定方法，其中，优先溶解HDL的表面活性剂为聚氧乙烯亚烷基苯基醚、或者聚氧乙烯亚烷基三苯甲基苯基醚。
4.根据权利要求3所述的HDL-C的测定方法，其中，聚氧乙烯亚烷基苯基醚为聚氧乙烯苯乙烯基苯基醚，聚氧乙烯亚烷基三苯甲基苯基醚为聚氧乙烯三苯甲基苯基醚。
5.根据权利要求4所述的HDL-C的测定方法，其中，聚氧乙烯苯乙烯基苯基醚为聚氧乙烯单、二或三苯乙烯基苯基醚。
6.根据权利要求1～5任一项所述的HDL-C的测定方法，其中，使用能够抑制除高密度脂蛋白(HDL)以外的脂蛋白溶解的表面活性剂、以及能够凝集除HDL以外的脂蛋白的凝集剂。
7.根据权利要求6所述的HDL-C的测定方法，其中，能够抑制除HDL以外的脂蛋白溶解的表面活性剂为聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、烷基苯磺酸盐、或者聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物。
8.根据权利要求6或7所述的HDL-C的测定方法，其中，能够凝集除HDL以外的脂蛋白的凝集剂为磷钨酸或其盐与2价金属离子、硫酸葡聚糖与2价金属离子、肝素与2价金属离子、或者聚氧乙烯。
9.根据权利要求1～8任一项所述的HDL-C的测定方法，其中，利用胆固醇酯酶以及胆固醇氧化酶由HDL-C生成过氧化氢，使所生成的过氧化氢与过氧化物酶与发色体作用进行发色反应，从而测定HDL-C。
10.根据权利要求9所述的HDL-C的测定方法，其中，作为发色体，使用4-氨基安替比林或其衍生物、以及与上述4-氨基安替比林或其衍生物偶联的Trinder试剂。
11.根据权利要求1～10任一项所述的HDL-C的测定方法，其中，使用在防渗水性的载体上至少具有粘合层和多孔性展开层的干式分析元件测定HDL-C。
12.一种HDL-C检测用试剂盒，其至少包含来源于Schizophyllumcommune或者来源于pseudomonas sp.的胆固醇酯酶、以及来源于pseudomonas sp.的胆固醇氧化酶。
13.一种HLD-C检测用干式分析元件，其是在防渗水性的载体上至少具有粘合层和多孔性展开层的干式分析元件，其特征在于在防渗水性载体上的层中包含来源于Schizophyllum commune或者来源于pseudomonas sp.的胆固醇酯酶、以及来源于pseudomonas sp.的胆固醇氧化酶。
全文摘要
本发明提供一种使用廉价材料，简便、迅速且特异性地测定检测样本中HDL－C的方法，HDL－C检测用试剂盒、HDL－C检测用干式分析元件。本发明涉及一种体液试样中的高密度脂蛋白胆固醇(HDL－C)的测定方法，其特征在于通过使用来源于Schizophyllum commune或者来源于pseudomonas sp.的胆固醇酯酶、以及来源于pseudomonas sp的胆固醇氧化酶，使得由HDL－C生成过氧化氢，从而选择性地测定HDL－C。
文档编号C12R1/01GK101078729SQ20071012928
公开日2007年11月28日 申请日期2007年5月8日 优先权日2006年5月10日
发明者阿部义彦, 升田喜士, 猪股弘子 申请人:富士胶片株式会社