专利名称：一种玉米品种真伪快捷鉴定方法
技术领域：
本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种玉米品种真伪快捷鉴定方法， 具体而言是一种利用SSR分子标记进行玉米品种真伪快速鉴定的方法。
背景技术：
植物新品种知识产权保护是鼓励品种培育人不断培育新的品种(系)或杂 交种的积极性的有力措施。发展高区分力的鉴定玉米材料技术对玉米的真伪鉴 定乃至新品种注册、产权登记保护等都是十分必要的。
理想的品种鉴定技术不但要准确、可靠，还要简单、快速、经济，这是品 种鉴定实现产业化的前提。传统的同工酶和蛋白电泳技术形态鉴定方法，产生 的多态性有限，且对亲缘关系较近及遗传基础复杂的材料难以鉴别。SSR分子标 记是近年来发展起来的建立在PCR基础上的新型DNA指纹技术。SSR标记的等位 基冈变异来源于基因组DNA复制时的滑动、不对称交换等原因引起的重复序列 的变化，因而表现出高度的多态性。同时，该遗传标记具有直接以DNA表现、 标记数量多、遗传稳定、不受环境影响等优点，再加上检测快捷，简便，稳定， 成为玉米品种鉴定的首选方法。
根据SSR分子标记建立的玉米指纹图谱库可直接对市面上出现的疑似亲本 品种，做真伪鉴定。另外，玉米籽粒的果皮是全部继承母本遗传信息的F1代组 织，分离并提取果皮基因组DNA，利用SSR分子标记技术即可获得杂交种的亲本 母本信息及相应的父本信息，因此可判断该品种在选育过程中是否使用了已中
请保护的品种，使品种所有权人的合法利益得到有效维护。
利用SSR对玉米品种进行真实性鉴定，国内外有报道，如中国专利 200310117180. 3及20061006573. 4，但现有技术操作过程繁琐、费时，针对此
3问题，本发明人重新筛选了引物，采用优化了 TouchDown PCR程序及DNA提取 方法。发展了一套适合的分子标记，建立了一种玉米品种真伪快速鉴定方法， 可用于主要商业用自交系的品种鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快捷、操作简单的玉米品种真伪鉴定方法。
为实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案
本发明提供了 一种玉米品种真伪鉴定方法，该方法采用单粒干种子的胚提
取待检样品的基因组DNA; PCR扩增中使用了如下20对核心引物bnlgl866， phi001, bnlgl017， umcl042， phi029, bnlgl108， bnlg2162， umc2188， bnlgl006, bnlg602， umcl023， phi031， umcl406， bnlgl792， bnlgl131， d叩ssrl4, umcl636， bnlgl129， phi041， umcl291。
其中，用单粒干种子的胚提取待检样品的基因组DNA方法如下取干种子 的2/3胚放入离心管中，加入150 u L 0. lmol/L NaOH，沸水中放置5min，冷至 室温后加入150uL 1XTE (pH 2.0)缓冲液，吸打混匀后4。C放置。
本发明使用上述的20对核心引物，在体外扩增多态性特征谱带时采用 TouchDown PCR程序。
PCR扩增在普通PCR仪上进行即可，TouchDown PCR程序可采用其它程 序，但为快速达到本发明目的，本发明优选的TouchDown PCR程序如下94 °C 预变性5 min, 94 °C 1 min， 67°C 50 S、每个循环降低1. 5 °C ， 72 °C延伸 lmin6个循环；然后，94 °C变性1 min， 58 °C退火45 s， 72 °C延伸45min ， 共30个循环；72 °C 10 rain。
本发明的玉米品种真伪鉴定方法有如下优点
1、在提取待检样品基因组DNA的方法时，采用了单粒干种子的提取方法。 与常规的叶片提取方法相比，该方法省去了材料发芽的时间，历时短，操作步 骤简单，方便快捷，而且所提基因组质量高且稳定，特别适宜大量样品的材料 鉴定(一小时内能完成IOO粒种子的DNA提取)。
42、 PCR扩增采用的是优化的TouchDown PCR程序。
其中，PCR程序中所用的20对引物是发明人在大量实验的基础上筛选得出， 这些引物多态性丰富，带型稳定，均匀分布在染色体的IO条染色体上，而且特 征谱带大小均匀分布在50—400bp之间。
另外，利用SSR检测其多态性，采用touch-down PCR技术，可避免各个引 物都要调PCR反应参数Z设计引物时无需按照统一的条件设计，无需考虑引物 的TM值差异，方便快楗，设计成本大大降低。
通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说 明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
具体实施例方式
实施例l鉴定市面上正在热销的玉米杂交种M的母本是否为已申请保护的自交 系N
鉴定操作流程如下
(1) DNA提取 样品M基因组DNA的提取
试材为干种子，仅需要一粒干种子即可。千种子的胚提取如下取千种子 的2/ 3胚放入0. 5ml离心管中，加入150 u L 0. lmol/L Na0H沸水中放置5min， 冷至室温后加入150" L 1XTE(pH 2. O)缓冲液，吸打混匀后4'C放置备用；
样品M果皮DNA组织的提取
① 先取杂交种M种子20粒，用纯水洗净，再用无菌水洗一遍，浸泡于1.0 %的氢氧化钠溶液中约20 min取出，然后用纯净水冲洗子粒3 5遍；用 镊子小心剥离每粒种子的果皮，再将果皮用无菌水洗两遍，晾干。液氮研碎， 收集于1.5 mL EP管中；
② 果皮DNA提取。在装有果皮样的EP管中先加入氯仿500 txL浸泡10 min，后放入离心机中12， 000 rpm/ min 10min ，离心后再加入预热约60°C SDS 提取液500u L ( 100 mM Tris-- HCI , 100 mM EDTA pH 8. 0 , 500 mM NaCl ,
51.5% SDS )，离心10 min。离心结束后，上清液加入500 u L预冷的无水乙 醇，静置30 min，观察会看到EP管溶液中上部有略微发白色分散微小团状物 析出，用剪去了枪尖的lmL枪头将静置管中的中上部溶液缓慢移入另一新离心 管中，12,000 rpm/ min 10min。最后收集沉淀用70 %的酒精清洗两次，自然 吹千，然后用50 uL TE溶解备用。 自交系N基因组DNA的提取
试材为干种子，仅需要一粒干种子即可。干种子的胚提取如下取干种子 的2/ 3胚放入0. 5ml离心管中，加入150uL 0. lmol/L NaOH沸水中放置5min， 冷至室温后加入150pL 1XTE(pH 2.0)缓冲液，吸打混匀后4'C放置备用。
(2) 引物合成
合成如下20对核心引物bnlgl866， phi001， bnlgl017，咖cl042， phi029， bnlgl108， bnlg2162， umc2188， bnlgl006, bnlg602， umcl023， phi031， umcl406， bnlgl792， bnlgl131， dupssrl4， umcl636，bnlgl129，phi041， umcl291。 本实施例由北京奥科生物技术公司合成，每管引物为4.0 0D。
(3) PCR扩增
PCR扩增用1一20对引物分别以样品M基因组DNA，样品M果皮DNA，自 交系N基因组为模板分别同时进行PCR扩增，产物分别命名为la， lb， lc; 2a， 2b， 2c,以此类推。20uL体系中含1XTaqDNA聚合酶缓冲液(含Mg、)、 0. 2誦ol/L dNTP、 1 pmol/uL上下游引物，100 ng DNA模板。
采用touch-down PCR程序94 °C预变性5min ， 94 。Clmin, 67°C 50S、 每个循环降低1.5 °C ， 72 °C延伸lmin 6个循环；然后，94 °C变性lmin， 58 °C退火45s , 72 °C延伸45min ，共30个循环。72 °C 10 min。
PCR扩增在普通PCR仪上进行即可，本实施例使用了 MyCycler Bio—Rad
6(4)电泳检测PCR产物
PCR产物中加入4uL 6X loading buffer ,在4% SFR (AMRESCO)凝胶上 电泳，点样顺序为DNA Marker la, lb， lc, 2a, 2b, 2c,以此类推。EB(溴 化乙锭)染色，在紫外灯下检测带型。
结果分析20对引物扩出的多态性条带完全相同；说明杂交种M的母本是 已申请保护的自交系N。
实施例2鉴定某公司正在使用的亲本自交系P是否为已申请保护的自交系Q 鉴定操作流程如下 (1) DNA提取 样品P， Q基因组DNA的提取
试材为干种子，仅需要一粒干种子即可。千种子的胚提取如下取干种子 的2/ 3胚放入0. 5ml离心管中，加入150 w L 0. lmol/L NaOH沸水中放置5min， 冷至室温后加入150yL 1XTE(pH 2.0)缓冲液，吸打混匀后4'C放置备用。 (2)引物合成
合成如下20对核心引物bnlgl866， phi001, bnlgl017， umcl042， phi029， bnlgl108， bnlg2162, umc2188， bnlgl006， bnlg602，咖cl023， phi031， umcl406， bnlgl792， bnlgl131, dupssrl4,匿1636，bnlgl129，phi041， uracl291。 本实施例由北京奥科生物技术公司合成，每管引物为4.0 0D。 (3) PCR扩增
用l一20对引物分别以样品P基闲组DNA、样品Q基因组DNA为模板同时 进行PCR扩增，产物分别命名为la，lb; 2a， 2b，以此类推。20uL体系中含1 XTaq DNA聚合酶缓冲液(含Mg2+)、 0. 2誦ol/L dNTP、 1 prao1/y L上下游引物，
7100 ng DNA模板。
采用touch-down PCR程序94 °C预变性5min ， 94 °C lmin, 67°C 50S、 每个循环降低1.5 °C ， 72 °C延伸lmin 6个循环，然后，94 °C变性lrain, 58 °C退火45s ， 72 °C延伸45min ，共30个循环，72 °C 10 min。
PCR扩增在普通PCR仪上进行即可，本实施例使用的是MJ Research, USA, PCR仪。
(4)电泳检测PCR产物
PCR产物中加入4uL 6X loading buffer , 4% SFR (AMRESC0)凝胶上电 泳，点样顺序为DNA Marker, la， lb， 2a， 2b,以此类推。EB(溴化乙锭)染 色，在紫外灯下检测带型。
结果分析la, lb; 3a, 3b; 17a, 17b多态性条带不同；说明样品P不是己 屮请保护的自交系Q。
8
权利要求
1、一种玉米品种真伪鉴定方法，其特征在于采用单粒干种子的胚提取待检样品的基因组DNA；PCR扩增程序中使用了如下20对核心引物bnlg1866，phi001，bnlg1017，umc1042，phi029，bnlg1108，bnlg2162，umc2188，bnlg1006，bnlg602，umc1023，phi031，umc1406，bnlg1792，bnlg1131，dupssr14，umc1636，bnlg1129，phi041，umc1291。
2、 根据权利要求1所述的玉米品种真伪鉴定方法，其特征在于用单粒千 种子的胚提取待检样品的基因组DNA方法如下取千种子的2/3胚放入离心管 中，加入150 y L 0. lmol/L NaOH，沸水中放置5rain，冷至室温后加入150y L 1 XTE (pH 2.0)缓冲液，吸打混匀后4'C放置。
3、 根据权利要求1所述的玉米品种真伪鉴定方法，其特征在于所述的PCR 扩增程序为TouchDown PCR程序。
4、根据权利要求3所述的玉米品种真伪鉴定方法，其特征在于所述的TouchDown PCR程序如下94 °C预变性5 min， 94 °C 1 min， 67°C 50 S、每个循环降 低1. 5 °C ， 72 °C延伸1 min 6个循环；然后，94 °C变性1 min， 58 °C退 火45 s， 72 °C延伸45min ，共30个循环；72 °C 10 min。
全文摘要
本发明涉及一种玉米品种真伪快捷鉴定方法，该方法中采用单粒干种子的胚提取待检样品的基因组DNA，省时且所提基因组质量高而稳定；使用了20对SSR分子标记核心引物，这些引物多态性丰富，带型稳定，均匀分布在染色体的10条染色体上；该方法还采用了优化的TouchDown PCR扩增程序。本发明的玉米品种真伪鉴定方法引物设计成本低，操作简单、省时，可方便、快速的对玉米品种的真实性进行鉴定，特别适宜大量样品的材料鉴定。
文档编号C12Q1/68GK101469347SQ200710304458
公开日2009年7月1日 申请日期2007年12月28日 优先权日2007年12月28日
发明者刘玲霞, 荣 孔, 张红伟, 李明源, 王晓娜, 云 莫, 谭振波 申请人:北京金色农华种业科技有限公司