专利名称：家蚕滞育品种的低温催青转基因方法
技术领域：
本发明涉及生物技术、生物工程领域，特别是涉及一种家蚕滞育品种的低温催青转基 因方法。
背景技术：
转基因技术是现代生物学研究中的一项重要的技术，在功能基因研究、生物新产品开 发、生物素材创新、现代遗传育种等方面发挥着重要的作用。
家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目昆虫模式生物。随着家蚕基因组测序工作的完成，利 用高效稳定的技术大规模地研究重要基因的功能成为家蚕功能基因组时代的重要课题，同 时，家蚕是理想的"昆虫工厂"，利用现代基因工程技术开发丝腺生物反应器具有巨大的 市场前景。而家蚕转基因技术是探索家蚕生长发育奥秘、拓展蚕业产业链、促进科技成果 实用化的有利武器。
自2000年日本科学家报道首次成功培育转基因家蚕以来，国内外已陆续报道转基因家 蚕成功的消息。但是迄今为止的报道中，所有转基因实验都是利用家蚕多化性品系的非滞 育卵，主要是因为多化性家蚕品种所产的卵为生种卵，其不需要任何的人工处理便能够在 适当的温湿度下连续发育直至孵化，这个特点极大地方便了转基因实验中的操作控制和转 基因后的进一步实验研究。但这些多化性家蚕品系与滞育性的生产上的家蚕实用品种比 较，具有丝量少，丝质差等经济性状差的特点。故利用多化性家蚕品种作为转基因的材料
具有以下两个方面的明显缺陷①多化性家蚕品种经济性状差，利用转基因所创造的附加
性状在产量和质量上都无法达到直接推广应用的标准，以多化性蚕种为原始材料的转基因 品系只能作为育种原始材料，作为某一相关优良性状的原始载体的角色运用于漫长而艰辛 的传统育种之中。②多化性家蚕品种不具有滞育期，对其继代维持只能依靠连续的饲养繁 殖，这样需要浪费大量的人力和物力对获得的转基因家蚕品系进行维持和继代，同时也大 大增加了获得的转基因家蚕品种资源丢失的风险。因此，利用多化性家蚕品种不但不利于 进行大规模的转基因实验，而且很难使研究成果快速转化到生产实际中去。
家蚕滞育品种为一化或二化性品系，在产卵以后便进入一个比较漫长的滞育期，这样 极有利于它们维持和继代。另外生产上的实用家蚕品系几乎都是滞育品系，多为一化或二 化性品系。如利用普通的家蚕滞育品系进行转基因研究可以克服多化性家蚕品种转基因研
究中所述的第二个缺陷，而利用生产上的实用家蚕滞育品系原种进行转基因研究则可以克 服多化性家蚕品种转基因研究中所述的所有缺陷。因此，家蚕滞育品种的转基因研究具有 极为重要理论和实际意义。生产实际中，滞育卵一般在产卵后约16-20小时左右利用常规 的即时浸酸法能有效解除它们的滞育。而目前最有效的家蚕转基因显微注射时间是在产卵 后3-6小时，因为转基因操作后卵上会上留下注射小孔，如果在注射后利用常规的即时浸 酸法会导致盐酸渗入蚕卵内，从而致死，根本无法实现家蚕滞育品种的转基因研究。因此， 家蚕滞育品种卵的滞育，给转基因操作带来很大的限制。
到目前为止，滞育性家蚕品种的转基因技术在国内外还未见报道，更没有一种成熟可 靠的方法实现家蚕滞育品种的转基因，因此，探索家蚕滞育品种的转基因的方法，是简化 家蚕转基因技术、加速科技成果实用化的迫切要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种家蚕滞育品种的转基因蚕的制作路线方法。该路线方法利 用特殊的催青条件改变家蚕滞育品种下一代蚕卵的化性，使特殊的催青条件下获得的当代 家蚕滞育品种蚕蛾交配，产下非滞育的下一代蚕卵，最后参照非滞育家蚕卵胚胎显微注射 的转基因方法进行转基因，从而巧妙地突破家蚕滞育品种转基因技术的障碍并有效制作转
基因蚕。
本发明首次系统地调査了低温催青对家蚕滞育品种下一代蚕卵化性的改变，并获得了 通过低温催青使家蚕滞育品种产下非滞育的下一代蚕卵的条件，并将这项技术与家蚕胚胎 显微注射技术，荧光检测与分子生物操作技术相结合，巧妙地突破了家蚕滞育品种转基因 技术的瓶颈，建立了一种可靠的家蚕滞育品种的转基因技术路线方法。
本发明家蚕滞育品种的低温催青转基因方法，依次通过以下步骤实现
(l)将家蚕滞育品种的蚕卵通过人工孵化处理后，置于15。C恒温、相对湿度75%的环 境中催青至孵化，孵化的蚁蚕在常规条件下进行饲养；
(2) 在25。C的种茧保护温度下收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25'C、弱光的条件下交配 4h后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上，在黑暗的环境中产卵，每间隔lh收集一次 蚕卵，并将收集的蚕卵置于25'C的环境中保护；
(3) 将蚕卵连同蚕连纸片用自来水冲洗以后，于蒸馏水中浸泡2-3min，而后用镊子将 蚕卵转移至用75%酒精消毒的载玻片上，并按照蚕卵腹面向右的标准将其排列整齐，排列 好的蚕卵置于35-37%的甲醛蒸气中消毒5min;
(5)以收集时间开始记时，于收集后3h-6h用显微注射仪将10-15nl、总浓度400ng/ul
的转座载体质粒从蚕卵腹面中央注入已经消毒的蚕卵中，并用无毒的胶水封闭卵壳注射留 下的小孔；
(
6)将注射完成的蚕卵在35-37y。的甲醛蒸气中消毒5min后，置于25'C、相对湿度85% 以上的湿度条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代(GO)的蚕蛾进行 自交或回交，获得G1代蚕卵，扫描G1代蚕卵获得转基因个体；最后，获得的转基因个 体正常词养、传代，即完成家蚕滞育品种的转基因蚕的制作。
h表示小时，min表示分钟。
本发明的优点是-
本发明关于家蚕滞育品种的转基因蚕的制作方法，首次利用低温催青使家蚕滞育品种 产下的蚕卵为非滞育卵，然后参照非滞育卵转基因家蚕显微注射的制作方法，从而巧妙地 突破了家蚕滞育品种的转基因技术的瓶颈。本发明的优点是，利用上述技术路线，可以有 效地实现家蚕滞育品种转基因。而利用家蚕滞育品种创造的转基因蚕品系，可以克服多化 性品系转基因家蚕的所有缺点，其具有以下的明显优势①家蚕滞育品种，尤其是生产上 采用的实用性品种，各种经济性状都比较良好，外源或内源的转基因目标性状也非常优良， 在利用这些家蚕品种作为生物反应器时，其目的产物的产量与质量远远超过多化性品系的 转基因家蚕；②现今蚕业生产中所采用的蚕品种多为滞育性的一化或二化性品种，在利用 转基因技术创造新的遗传素材或品种资源时，直接采用生产中普遍使用的实用性家蚕滞育 品种作为原始材料，可以避免漫长而烦琐的育种过程，直接利用转基因技术创造出各种性 状优良的新的特殊家蚕品种，大大的缩短了育种的周期，也节约了大量的人力和物力；③
滞育性家蚕在自然条件下一年繁殖一个或两个世代以后便自动进入一个漫长的滞育期，要 保存其品种资源只需要在一年内进行一次或两次的饲养和简单的蚕种管理即可，对其生产
和管理可以根据计划的需要人为地进行调节，而且实用性家蚕品种的各项性状通过长期育 种的选择，都比较稳定，所以利用这些家蚕滞育品种作为家蚕转基因研究的材料，可以简 化资源保存的工作，降低品种资源丢失的风险，增强转基因工作的计划性，使转基因工作 与实际生产更加紧密地结合。④家蚕滞育品种，特别是生产上的实用滞育品种一般个体较 大，其蚕卵也远大于一般的多化性家蚕品种，抗逆性强，具有耐注射的特性。此外，家蚕 滞育品种的蚕卵一般具有一层着色的浆膜，可以降低荧光检测时激发光对胚胎的伤害，这 些特点都降低了家蚕转基因操作的难度，有助于转基因的成功。所以本发明还具有适合广 泛而有效地推广的优点。
具体实施方式
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实施例1:
利用家蚕滞育品种"大造"作为原始材料，将正常饲养所得的蚕卵在常规的人工孵化
处理后全程置于15'C恒温、相对湿度75%的环境中催青至孵化，孵化的蚁蚕在正常条件下
进行饲养，将当代的蚕蛾如前述方法进行自交，获得下一代非滞育蚕卵，这些蚕卵于产下
后3h，用Eppendorf显微注射仪，将10-15nl、总浓度400ng/ul的带有神经和眼睛特异 启动子启动的红色荧光蛋白标记的piggyBac载体和辅助载体，共同注射进入601粒蚕卵 中，用无毒胶水封住注射口，并经35。/。的甲酵蒸气中消毒5min以后，置于25'C、相对湿 度85%的高湿度环境中催青孵化，将孵化的350头GO代蚁蚕用人工饲料收集饲养至化蛾， 获得的301头GO代蚕蛾，通过自交或回交共获得157蛾圈Gl代蚕卵，用01ympu^电动 宏观荧光显微镜观察筛选了 64蛾圈Gl代蚕卵并获得29个阳性蛾圈，共获得182头家蚕 滞育品种"大造"的转基因蚕，转化效率为45.31%。
实施例2:
利用家蚕滞育品种"大造"作为原始材料，将正常饲养所得的蚕卵在常规的人工孵化 处理后先置于25。C恒温、相对湿度85%条件下催青5天，然后置于15'C恒温、相对湿度 75%的环境中催青至孵化，孵化的蚁蚕在正常条件下进行饲养，将当代的蚕蛾如前述方法 进行自交，获得下一代非滞育蚕卵，这些蚕卵于产下后4h，用E卯endorf显微注射仪，将 10-15nl、总浓度400ng/ul的带有神经和眼睛特异启动子启动的红色荧光蛋白标记的 PiggyBac重组转座载体和辅助载体，共同注射进入596粒蚕卵中，用无毒胶水封住注射口 ， 并经37%的甲醛蒸气中消毒5min以后，置于25'C、相对湿度90%的高湿度环境中催青孵化， 将孵化的297头GO代蚁蚕用人工饲料收集饲养至化蛾，获得的268头GO代蚕蛾通过自交 或回交共获得119蛾圈Gl代蚕卵，用01y即us⑧电动宏观荧光显微镜观察筛选了 51蛾圈 Gl代蚕卵并获得12个阳性蛾圈，共获得34头家蚕滞育品种"大造"的转基因蚕，转化效 率为23. 53%。
实施例3:
利用家蚕滞育品种"夏芳"作为原始材料，将正常饲养所得的蚕卵在常规的人工孵化 处理后先置于25。C恒温、相对湿度85%条件下催青6天，然后置于15。C恒温、相对湿度 75%的环境中催青至孵化，孵化的蚁蚕在正常条件下进行饲养，将当代的蚕蛾如前述方法 进行自交，获得下一代非滞育蚕卵，这些蚕卵于产下后6h，用E卯endorf显微注射仪，将 10-15nl、总浓度400ng/ul的带有神经和眼睛特异启动子启动的红色荧光蛋白标记的 piggyBac重组转座载体和辅助载体，共同注射进入810粒蚕卵中，用无毒胶水封住注射口 ，并经36%的甲酸蒸气中消毒5min以后，置于25°C、相对湿度95%的高湿度环境中催青孵化， 将孵化的605头G0代蚁蚕用人工词料收集饲养至化蛾，获得的439头GO代蚕蛾通过自交 或回交共获得146蛾圈Gl代蚕卵，用01ympu^电动宏观荧光显微镜观察筛选了 100蛾圈 Gl代蚕卵并获得16个阳性蛾圈，共获得59头家蚕滞育品种"夏芳"的转基因蚕，转化效 率为16%。
实施例4:
利用家蚕滞育品种"洞/庭"作为原始材料，将正常饲养所得的蚕卵在常规的人工孵 化处理后全程置于15'C恒温、相对湿度75%的环境中催青至孵化，孵化的蚁蚕在正常条件 下进行饲养，将当代的蚕蛾如前述方法进行自交，获得下一代非滞育蚕卵，这些蚕卵于产 下后5h，用Eppendorf显微注射仪，将10-15nl、总浓度400ng/ul的带有神经和眼睛特 异启动子启动的红色荧光蛋白标记的piggyBac转座载体和辅助载体，共同注射进入714 粒蚕卵中，用无毒胶水封住注射口，并经36y。的甲醛蒸气中消毒5min以后，置于25'C、 相对湿度95%的高湿度环境中催青孵化，将孵化的356头G0代蚁蚕用人工词料收集饲养至 化蛾，获得的238头G0代蚕蛾通过自交或回交共获得92蛾圈G1代蚕卵，用0171^113 电 动宏观荧光显微镜观察筛选了 27蛾圈Gl代蚕卵并获得8个阳性蛾圈，共获得102头家蚕 滞育品种"洞/庭"的转基因蚕，转化效率为29.62%。
权利要求
1、一种家蚕滞育品种的低温催青转基因方法，其特征在于依次通过下列步骤实现(1)将家蚕滞育品种的蚕卵通过人工孵化处理后，置于15℃恒温、相对湿度75％的环境中催青至孵化，孵化的蚁蚕在常规条件下进行饲养；(2)在25℃的种茧保护温度下收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25℃、弱光的条件下交配4h后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上，在黑暗的环境中产卵，每间隔1h收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25℃的环境中保护；(3)将蚕卵连同蚕连纸片用自来水冲洗以后，于蒸馏水中浸泡2-3min，而后用镊子将蚕卵转移至用75％酒精消毒的载玻片上，并按照蚕卵腹面向右的标准将其排列整齐，排列好的蚕卵置于35-37％的甲醛蒸气中消毒5min；(5)以收集时间开始记时，于收集后3h-6h用显微注射仪将10-15nl、总浓度400ng/ul的转座载体质粒从蚕卵腹面中央注入已经消毒的蚕卵中，并用无毒的胶水封闭卵壳注射留下的小孔；(6)将注射完成的蚕卵在35-37％的甲醛蒸气中消毒5min后，置于25℃、相对湿度85％以上的湿度条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代(G0)的蚕蛾进行自交或回交，获得G1代蚕卵，扫描G1代蚕卵获得转基因个体；最后，获得的转基因个体正常饲养、传代，即完成家蚕滞育品种的转基因蚕的制作。h表示小时，min表示分钟。
全文摘要
一种家蚕滞育品种的低温催青转基因方法。用特殊的催青条件改变家蚕滞育品种下一代蚕卵的化性，使特殊的催青条件下获得的当代家蚕滞育品种蚕蛾交配，产下非滞育的下一代蚕卵，最后参照非滞育家蚕卵胚胎显微注射的转基因方法进行转基因，从而巧妙地突破家蚕滞育品种转基因技术的障碍并有效制作转基因蚕。该方法直接采用生产中普遍使用的实用性家蚕滞育品种作为原始材料，可以避免漫长而烦琐的育种过程，直接利用转基因技术创造出各种性状优良的新的特殊家蚕品种，可大大缩短育种的周期，节约大量的人力和物力。
文档编号C12N15/85GK101195833SQ20071030390
公开日2008年6月11日 申请日期2007年12月21日 优先权日2007年12月21日
发明者向仲怀, 夏庆友, 徐汉福, 赵爱春, 成 鲁 申请人:西南大学;重庆拓桑生物科技有限公司