确定先兆子痫风险的方法

专利名称：：确定先兆子痫风险的方法确定先兆子痫风险的方法发明领域本发明涉及用于鉴定可指示发展先兆子痫(preeclampsia)风险的PP13突变变体的筛选方法。发明背景称为先兆子痫(PE)的妊娠障碍是一种不期望的妊娠并发症，发生于所有孕妇的5-7%，并且是妊娠期间引起母体死亡的第二常见原因(在美国占妊娠相关的母体死亡率的18%)。该疾病源自附随临床症状的胎盘形成和对胎盘的血/氧/营养供应受损导致的胎盘机能不全。先兆子痫被定义为先前血压正常的妇女妊娠20周后形成的新发作的高血压，间隔4-6小时(在某些情况下间隔4-72小时)的两次测量>90/140mmHg(收缩/舒张，至少一个)，并结合在先前尿中没有蛋白或有痕量蛋白的历史的妇女中确定的以试纸>2+或以24小时尿收集>300mg/dL的蛋白尿。所有先兆子痫孕妇中的大约50%通过剖腹产分娩，而与之相比，在整个人群中仅有15-18%的孕妇采用剖腹产。在妊娠期间经历先兆子痫障碍的妇女因此发展心血管疾病的风险会增加9倍，从而缩短她们的预期寿命(lifeexpectancy)。尽管孕妇中发展PE的比例在发展中国家更高，但是在美国的数字仍然高(5-7%)。严重的先兆子痫被定义为其中高血压为>160/110mmHg(收缩/舒张，至少一次)，且以试纸>3+或以24小时内尿收集>3gr/dL的蛋白尿的先兆子痫。在极端状态，先兆子痫可变成子痫(eclampsia)，这是伴有危及母亲生命的痉挛、中风和昏迷的紧急状态。所以，发展严重先兆子痫的妇女在48小时内分娩以取出胎盘并挽救母亲的生命。早期先兆子痫是如上定义的严重先兆子痫的一种形式，其中该疾病的严重度需要在期限前分娩(<妊娠37周)。通常，该疾病形式伴有子宫中胎儿生长受限(IUGR)，这将危害不仅母亲生命还有胎儿的生命。根据NICHD，早期先兆子痫占所有PE病例的20-25%，这意味着每100名孕妇中有l-2名，其中的15%将在经历了应激的待产期后在34周前分娩，即婴儿非常早产。分^^免出现越早，婴儿的并发症越严重，同时具有婴儿的出生体重低和内脏器官发育不完全，包括失明、运动和认知障碍以及终身的医学失能，以及增加的后来发展高血压、心血管疾病和糖尿病的风险。在34妊娠周(GW)前分娩的病例的10%是最严重的，是造成大多数死亡病例的原因，而且出生的婴儿如果存活，则需要在新生儿重症监护病房看护6-8周。根据NICHD，对于这部分病例，早期检测对于其生命救助能力和防止早产是关键的。仅有的治疗先兆子痫的现行办法是使母亲分娩，但是当这样的分娩过早发生时，由于出生体重较低、运动和认知功能障碍，出现各种各样的新生儿损害，且非常严重的情况是生产中或产后死亡。已经开展了许多研究以在早期试图并鉴定发展先兆子痫的风险。该疾病通常在妊娠的末三月爆发，但在胎盘中潜在的病理过程发展很早。因此在怀孕之前或妊娠期间早期检测发展先兆子痫的风险可提供预防该疾病或緩和症状严重度的手段。1)早期检测使得通过密切监视妇女控制风险成为可能。对处于高风险中的妇女有效地增加监视符合美国产科和妇科学会的指南("ACOG指南，，)，对高风险病例增加的监视明显改善了结果。已显示，由于密切监视和使参与的孕妇接受教育及了解项目相结合，妊娠管理计划(PregnancyManagementPrograms)节约了花费。益处包括与全国平均值1.96%相比，由于早期PE(<34周)的出生下降，仅占所有分娩的0.6%;与全国基准2.3%相比，早产减少至所有分娩的0.9%;并且与全国平均值2.9%相比，由于先兆子痫的低出生体重为1.3%。密切监视允许孕妇能在分娩前到达三级医疗中心，这在社区诊所和乡村基础健康服务部门是一个非常重大的问题。其它益处是赢得实施治疗和给予药物(例如能促进胎儿器官成熟的产前皮质类固醇)的时间。密切监视使得在某些病例中延长妊娠持续时间成为可能，以降低早产新生的严重度。2)早期检测使得能够在更长的时间内通过应用各种推定药剂开发药物干预策略成为可能，所述药剂被认为作用于胎盘以防止/减少所述风险。虽然对于治疗来说没有黄金标准，但是大量的候选药物已经显现出希望，包括低剂量阿司匹林、低分子量肝素、抗氧化剂如维生素C和E以及^J臾镁等。在所有的这些研究中，不是所有处于风险中的妇女都能从治疗干预中获益。而在一些病例中有迹象显示干预开始得太晚，在其它病例中没有明显的证据表明应用的药物是不正确的还是没有以适当的时间或剂量施用。目前的研究显示，有必要从目前可得的推定的药物目录(以及在今后适当时候将成为可用的药物)中定制对每名妇女最适合的药物千预和继续监测治疗的有效性。3)对于基于家族史或此前的妊娠史易患先兆子痫的患者，尤其是因为先兆子痫失去过婴儿的患者，妊娠前检测对于妊娠计划和采取如上所述的预防措施来说可为最重要的。对于参与体外受精项目的妇女，检测先兆子痫的事先风险增加对于管理植入和选择将没有先兆子痫风险增加的植入体可为有益的。胎盘蛋白13(PP13)是15-16,000Mw的蛋白，其可以从人类胎盘组织纯化或通过美国专利第6,548,306号(Admon等人)描述的重组技术制备，所述专利的内容通过引用并入本文。PP13的氨基酸和DNA序列示于图5，且氨基酸序列示于图8A。如美国专利第5,195,366号(Silberman)中所述，纯化的PP13用来开发用于检测一些妊娠相关障碍的测定，所述障碍例如子宫内生长限制(IUGR)、先兆子痫和早产，所述专利的内容通过引用并入本文。通过使用标记的PP13和抗PP13多克隆抗血清，开发了放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。对PP13基因LGALS13的分析揭示其基本结构为包括3个内含子和4个外显子，表现出与半乳凝集素家族具有高度的序列同源性，所述半乳凝集素家族为一组与糖残基具有高度亲和性的蛋白，这在植入中格外重要(Than,N.G等人(1999)Placenta20:703-710;Than等人(2004)Eur.JBiochem.271(6):1065-1078)。实际上，通过免疫组织化学发现PP13在胎盘形成中很重要。美国专利第6,790,625号公开了针对PP13的单克隆抗体和能在妊娠早期阶段测定母体血清PP13的固相免疫测定，所述专利的内容通过引用并入本文。事实上，Nicolaides等人(2006)爿wove/a//raac/jto/raf-/77>we,"erw/fraTOwm/(在妊娠前三个月联合血清PP-13和多普勒超声筛选早期先兆子痫的新方法)UltrasoundinObstetricsandGynecology,27(1)第13-17页，以及其他人已经使用了基于该专利开发的ELISA试剂盒以非常高的准确度显示在妊娠前三个月较低的PP13对应于先兆子痫风险的增加。WO04/021012公开了一种基于包括PP13水平的多种因素的妊娠并发症诊断方法，所述专利的内容通过引用并入本文。Stolk,M.等人(2006)HypertensioninPregnancy(妊娠中的高血压),Abstractsfromthe15thWorldConferenceoftheIntl.Soc.fortheStudyofHyper,inPreg.(妊娠中的高血压研究国际协会第15届世界会议摘要)，第25巻(增刊1)P029描述了人类半乳凝集素/月台盘蛋白13基因LGALS13中的核苷酸序列变化，所述文献的内容通过引用并入本文。Sammar,M.等人(2007)裤c/"gD崩腳—/柳/e滅"gtoMos/We尸w6ybmw//"cewto/rafe/w"/"/^eec/a附/w/a(先兆子痫中RNA剪接和DNA多态性导致胎盘蛋白13的两种更短亚形式)，AmericanCollegeofObstetricandGynecologyConference,4苗述了PP13基因的缺少夕卜显子-2的剪接变体，所述文献的内容通过引用并入本文。发明概述本发明的一个目的是提供确定孕妇发展先兆子痫的风险的方法。在本发明一个方面，提供了确定胎儿的母亲在妊娠期间发展兆子痫的风险的方法，该方法包括(a)提供来自与胎儿有亲缘关系的个体的、含有PP13基因的基因组DNA样品；(b)分析该DNA的PP13基因中一种或多种突变的存在；并(c)基于该突变的存在确定所述母亲的风险。如众所周知的，为PP13主要来源的胎盘的基因型源自胎儿的基因型。因此，为了确定是否因为胎盘基因组的PP13基因中存在突变而存在风险，确定父母或胎儿同胞(sibling)的基因型或进行单倍型构建和分析、研究传递模式、研究传递模式(母亲到婴儿)、鉴定印记证据、和其它遗传分析方法是足够的。因此，本发明方法中与胎儿有亲缘关系的个体可选自以下一种或多种0)胎儿的母亲，或她的母亲或父亲；(b)胎儿的父亲，或他的母亲或父亲；(c)胎儿的同胞或胎儿父亲的同胞或胎儿母亲的同胞(尽管阴性结果不是决定性的)；(d)所述母亲的妊娠胎盘或双胎妊娠的胎盘或此前妊娠的胎盘；和(e)胎儿自身。从以上应理解的是，基因组DNA样品可在母亲怀孕前提供从而使得能够怀孕前咨询、以及在母亲妊娠期间提供。PP13基因可使用本领域标准方法分析，诸如从全血提取DNA并通过PCR扩增，随后以MultiphorSSCP/异源双链体分析或其它相关技术筛选。预期PP13基因中的突变将影响孕妇中PP13的表型，即它不是沉默突变。例如，可影响下述PP13参^t的一种或多种(a)在女人身体物质中测量的PP13的表达水平；(b)与所表达的氨基酸序列相关的表达准确度，如可添加、缺失、重复或取代一个或多个氨基酸；(c)翻译后加工，如糖基化、磷酸化、甲基化等；(d)运输，如PP13在胎盘环境诸如内体中再定位；(e)与植入、母体动脉调节、与胞外基质中的糖残基结合、胎盘中钙代谢、溶血磷脂酶(lysoph叩holipase)活性、释放磷脂或提高前列腺素相关的功能缺失；和(f)与以上有关的功能获得。基因组突变的实例可包括外显子或内含子中的移码突变；LGALS13基因的启动子或任何其它调节元件中能够影响其表达水平、结构、加工、运输或活性的任何突变，由包括使用基本的荧光素酶(Luciperase)报告基因来测定启动子变体的转录活性的多种方法评价；能够损害LGALS13的功能或其在染色体19上的位置或关于PP13的全染色体功能的任何可扩展的重复突变；内含子区(intronicregion)中能够影响随后RNA剪接或其它事件的任何延伸；导致杂合性(heterozigocity)丢失(LOP)和遗传模式改变的任何突变；能够导致脆性基因区的重复突变或其它截短的突变；倒位、易位或其它效应的染色体突变；在外显子或内含子水平的单核香酸点突变(SNIPS);通过甲基化方式对基因的全局调节，以及涉及倒位、易位等的突变。突变的类型可用于不仅确定该妇女是否处于发展先兆子痫的风险，还确定她处于发展哪种类型的先兆子痫的风险。例如，开始发展早发型先兆子痫的妇女中发现的一种移码突变称为222delT/L74W。该突变体的DNA序列(SEQ.ID.NO:ll)显示于图7。在该突变中，缺失bp#222(=T)，从而将氨基酸#74从L改变为W。该突变造成产生101氨基酸的末端改变和截短的PP13分子，如图8C所示(SEQ.ID.NO:1)。因此，222delT/L74W类型的移码突变的存在指示发展早发型先兆子痫的风险增加。以类似方式，中还包括鉴定LGALS13基因的能够调节从DNA经由RNA成为功能/功能障碍蛋白的诱导、表达和下游步骤的任何调节区(包括启动子)。可根据本发明方法开发算法(algorithim)以基于突变的存在确定母亲发展先兆子痫的风险。例如，如果父母双方对PP13基因中特定突变是纯合的，胎儿有100%的概率也将具有该突变，并且可确定母亲将发展基于突变特征的特定类型先兆子痫的风险。在另一情形，如果父母双方对PP13基因中特定突变是杂合的，胎儿有25%的概率将具有该突变，可确定母亲将发展基于突变特征的特定类型先兆子痫的风险。算法还可考虑到影响分析的任何特定传递方式或印记。在本发明另一方面，提供了确定孕妇发展先兆子痫的风险的方法，其包括(a)提供来自母亲身体物质的PP13分子样品；(b)确定PP13分子的结构；并(c)基于PP13分子的结构确定孕妇的风险。身体物质的非限制性实例包括母血、母唾液、母尿、羊水、脐带血、绒毛膜绒毛和胎盘组织。在本发明该方面的一个实施方案，该PP13分子是PP13蛋白，且所述PP13分子的结构是所述PP13分子的分子大小或氨基酸序列。该PP13蛋白的结构可例如免疫学地或通过蛋白质化学确定，如本领域技术人员熟知的。例如，针对天然野生型PP13和/或具体突变的PP13蛋白的特异性抗体可分别用于确定天然PP13和/或突变的PP13的存在。在本发明该方面的另一实施方案，所述PP13分子是PP13的mRNA或与其对应的cDNA，且所述PP13分子的结构是PP13的mRNA或与其对应的cDNA的序列。mRNA或cDNA的序列可使用本领域标准方法诸如PCR扩增确定。在本发明该方面的另一实施方案，LGLAS13DNA、cDNA或RNA中的多态性用于a.以下述的所有类型覆盖指定的微芯片SNIPS同种型、移码突变、微卫星或足迹或活化的/沉默的启动子或RNA剪接，或任何其它形式的突变，诸如上文详述的那些；b.与如上文详述的患者组织或体液反应；c.通过荧光、比色分析、镧系或任何其它检测和/或扩增的可见方法检测突变的存在和性质，和d.信号加工和解释的软件。如同本发明的前一方面，妇女发展先兆子痫的风险将取决于突变的PP]3分子的特征。例如，如果发现突变的PP13分子是移码突变的结果，这可被视作指示发展先兆子痫的风险，且在某些情形，指示发展特定类型先兆子痫的风险。以上述222delT/L74W突变为例，确定mRNA具有这种缺失可^C视作指示发展早发型先兆子痫的风险。如以下将描述的，本发明的发明人已经成功地分离了上述突变的基因编码的PP13-衍生多肽。而且，已经显示针对天然、野生型PP13的特异性单克隆抗体不识别突变的PP13多肽。因此，可制备针对突变的PP13特异性的抗体，并且所述抗体可用于鉴定突变的分子以确定发展早发型先兆子痫的风险。PP13分子中可能突变的另一实例是由于可变剪接的突变。PP13基因由被三个内含子连接的四个外显子组成。在转录天然PP13分子时，切除内含子并连续地剪接外显子以得到编码139氨基酸的PP13蛋白的mRNA，如图5所示(SEQ.ID.NO:6)。然而，在可变剪接位点的剪接可造成编码长度不同于天然长度的PP13蛋白的RNA剪接变体。这种突变的一个实例是AEX-2剪接变体，其中缺失大部分外显子2和小部分外显子3，如可见于图6的(SEQ.ID.NO:2)。这造成109个氨基酸而不是139个的蛋白(图6、图8B)。这种剪接变体通过筛选源自开始发展晚发型先兆子痫的妇女的cDNA文库而获得。因此，确定AEX-2剪接变体的存在可指示发展晚发型先兆子痫的风险增加。在本发明的进一步方面，提供突变的PP13蛋白变体。产生变体的突变可为各种类型并包括移码突变、点突变、染色体突变和由于可变剪接的突变。在本发明该方面的一实施方案，排除一种或多种如下突变(a)a-98C/A取代[rs3764843];(b)IVS2-22(AJG)[rs2233706];(c)IVS2-36(A/G);(d)222delT/L74W;和(e)AEX-2。在本发明该方面的另一实施方案，所述变体选自IVS2-36(A/G)、222delT/L74W(SEQ.ID.NO:l)或AEX-2(SEQ.ID.NO:2)组成的组。在本发明该方面中还包括特异性结合变体的抗体、编码变体的核酸序列和包括这些序列的载体。在本发明的又进一步方面，提供纯化可溶形式的突变的PP13蛋白变体的方法，该方法包4舌(a)在宿主细胞中表达所述PP13变体；(b)破坏所述宿主细胞并将所述细胞内含物离心；(c)在含有高浓度变性剂的緩冲液中重悬离心的沉淀；(d)将重悬的沉淀上样到能够结合PP13的亲合柱上；(e)以变性剂的梯度洗涤所述亲合柱；并(f)从所述柱洗脱可溶形式的PP13。众所周知，在细菌宿主中表达外源蛋白通常造成所表达的蛋白在"包涵体"中以不可溶形式产生。这阻碍了产生可用的可溶形式的期望蛋白。对于表达PP13的各种蛋白变体也是这样。本发明人目前已经发现了纯化变体以获得可溶蛋白的方法。尽管该方法使用尿素来示例，但是可使用其它蛋白变性剂诸如盐酸胍。本发明的其它方面包括使用RNA工具，包括但不限于限制性片段长度多态性(RFLP)、短发夹(sh)RNA或小千扰(si)RNA或(mi)RNA,作为调节活性的表达或方式或对后代的可转移性的过程的手段，或使用能够使得PP13自身或关于先兆子痫的谱系多样化的任何其它方式，如成功地应用于体外受精或体外诊断或活体或体外预后或治疗的。本发明的进一步方面包括用于本发明方法的诊断试剂盒。这种试剂盒可包括a.用于确定妇女发展先兆子痫的风险的方法的试剂盒，其包括针对PP13天然基因和/或其突变序列的特异性基因组序列的DNA探针。b.用于确定妇女发展先兆子痫的风险的方法的试剂盒，其包括针对PP13天然序列和/或其突变序列的抗体。c.用于确定妇女发展先兆子痫的风险的方法的试剂盒，其包括针对PP13天然mRNA和/或其突变序列的特异性序列的RNA探针。d.用于确定妇女发展先兆子痫的风险的方法的试剂盒，其包括针对PP13cDNA和/或其突变序列的特异性序列的DNA探针。e.用于确定妇女发展先兆子痫的风险的方法的试剂盒，其包括包含PP13cDNA或RNA和/或其突变序列的特异性序列的DNA或RNA芯片。根据本发明，LGALS13基因可由一种或多种如下分析方法表征(a)生物信息学i)启动子预测子ii)系统发生保守性/足迹法iii)多态性谱(SNP、微卫星等)Cb)遗传突变筛选i)种族频率ii)单倍型构建和分析iii)早期妊娠丢失(如POC)频率-(影响存活力)(c)传递研究i)研究传递方式(母亲到婴儿)ii)印记^正据(d)甲基化研究i)研究对基因的全局调节(e)表征所选的LGALS13序列变体(f)模板的全基因组表征(g)延伸所研究的内含子区(h)搜寻外显子2的LOH，如果可获得多态性标记如微卫星(i)开发等位基因特异性测定以"分型(type)"222delT变体(j)研究使用PTT以鉴定222delT变体和任何其它可能的截短变体(k)研究哪种方法最适于表征外显子3中的序列变体[可能的基因转变事件](1)RNA提取和制备(m)克隆到pGEM-TEasy载体(Promega)i)PCR和凝胶纯化ii)A-加尾iii)连接iv)准备感受态细胞v)转化vi)选择克隆vii)微量制备(Mi叩rep)(n)pGL2-基础荧光素酶报告基因(pGL2-BasicLuciferaser印orter)(以测定启动子变体的转录活性)i)载体制备(消化、纯化、脱磷酸、连接)ii)转化iii)大量制备(o)将使用FuGene6作为转染试剂研究代表变体和野生型等位基因的构建体[以焚光素酶寺艮告基因载体]的改变的转录活性。(p)培养细胞(q)转染的细胞在被收集并以荧光比色方法分析荧光素酶活性之前将经受外来刺激[如可变的雌激素水平、暂时缺氧等]。(r)自动测序(证实克隆、曱基化状态等)(s)定量研究将包括分析外显子变体(通过微基因系统(mini-genesystem)),而实时PCR将用于研究四种鉴定的内含子序列变体是否影响基因剪接。(t)统计分析本发明的其它方面将从以下详述变得明显。为了理解本发明并知道在实践中如何实施本发明，现在将通过仅非限制性实例的方式参考附图描述优选的实施方案，其中图1是示例说明突变的PP13分子如何可源自PP13基因的示意图2是示例说明如何可通过克隆并在大肠杆菌中表达从突变的cDNA制备PP13蛋白的示意图3是SDS-PAGE凝胶的照片，显示PP13的天然和突变的变体产生的条带；图4A、4B和4C是抗体结合作为针对PP13的天然和突变的变体的抗体稀释液的函数的图，使用特异性抗PP13抗体(4A和4B)或对照抗组氨酸抗体(4C);图5显示天然重组PP13(rPP13)的DNA(SEQ.ID.NO:3&4)和氨基酸(SEQ.ID.NO:5-8)序列；图6显示AEX-2PP13剪接变体的DNA(SEQ.ID.NO:9&10)和氨基酸(SEQ.ID.NO:2)序列；图7显示222delT/L74W突变的DNA序列(SEQ.ID.NO:11)。T缺失发生在标下划线的核苷酸之间；图8A、8B和8C分别显示天然rPP13(SEQ.1D.N0:6)、AEX-2PP13变体(SEQ.ID.NO:2)和222delT/L74W变体(SEQ.ID.NO:l)的氨基酸序歹'J。后一种变体(varient)中的缺失导致移码，这在至终止密码子(#)的末端区(下划线的)产生28个新氨基酸；和图9A、9B.9C、9D和9E显示对80个早期(胎龄(GAK34周)的先兆子痫(preeclamsia)病例和~100个对照组成的南非初孕妇组群的多态性分析。(9A)多态性频率分析；(9B)外显子3.1SSCP/异源双链体(hetroduplex)的凝胶；(9C)delT222Z-电泳图谱；(9D)delT与野生型比对；和(9E)不同突变体相对于野生型基因的相对位置。3个新Ser;3个Cys缺失&2个新的；除去E"CHO结合位点。示例性实施方案的详述1.克隆、表达和纯化222delT/L74W和AEX-2PP13变体(图2)A.对222delT/L74W突变变体的聚合酶链式反应(PCR)基于对PP13基因的多态性分析和与多态性发生和发展先兆子痫的相关性，PP13野生型的序列(图5)用作模板以通过PCR技术产生222delT7L74W(本文也称为截短的)序列。设计具有如下序列的两条引物有义引物CGAATCCATGTCTTCTTTACCCGTGC(SEQ.ID.NO:12)和反义引物TAAGTCGAGCTCCATCCATATCCCAAACTCAC(SEQ.ID.NO:13)。将BamHI和SacT限制性位点序列分别引入有义和反义引物。两种引物由Sigma-Genosys合成。为了扩增截短的PP13DNA序列，1ng野生型PP13DNA(在质粒中)用作模板。0.1-1nM上述特异性引物、1UPfuDNA聚合酶(Promega)、200dNTP混合物和PfuDNA聚合酶X10緩冲液。以如下高温循环进行PCR:94°C2min，94°C30sec,60°C30sec和72°C1min，持续35个循环。在72。C进行最终延伸4min,且由琼脂糖凝胶分析并揭示288bp的预期大小的PCR产物储存在4'C直到使用。B.AEX-2变体的PCR筛选源自先兆子痫胎盘的cDNA文库揭示PP13的外显子-2缺失的(本文也称为剪接的)序列(缺失30个氨基酸)。基于所述缺失的PP13变体的核普酸序列分析，设计在全长DNA侧翼的一组引物。设计具有如下序列的两条引物有义引物5'-CGATACGGATCCATGTCTTCTTTACCCGTGC-3'(SEQ.ID.NO:14)和反义引物5'-TAAGTCGAGCTCATTGCAGACACACACTGAGG-3'(SEQ.ID.NO:15)。两种引物由Sigma-Genosys合成。为了扩增缺失的AEX-2PP13DNA序列，1ng缺失的PP13DNA用作模板，0.1-1^M上述特异性引物、1UPfuDNA聚合酶(Promega)、200jxMdNTP混合物和PfuDNA聚合酶X10緩沖液。以如下高温循环进行PCR:94°C2min，94°C30sec,55°C30sec和72°C1min，持续35个循环。在72。C进行最终延伸步骤4min，且由琼脂糖凝胶分析并揭示338bp的预期大小的PCR产物储存在-2(TC直到使用。将所得的PCR片段插入pUC57-T克隆载体(T-克隆试剂盒M212MBIFermentase)且包含插入片段的克隆净皮选择并通过在WeizmannInstitute,Rehovot,Israel的BiologicalServices自动DNA测序而测序。2.克隆截短的和剪接形式的DNA到表达载体中。A-连接在连接之前，使用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化截短的和剪接的PP13DNA的PCR产物。以分别在NEBufferBamHI和NEBufferSacI中的BamHI和SacI(各20U,NewEnglandBiolabs-NEB)消化纯化的PP13DNA产物(l〖ig)和表达载体pQE30(0.5叱，Qiagen)。使用100U的T4连接酶(NEB)和T4连接酶I1冲液，使用3:1、1:1和1:3的插入片段载体比在22。C连接消化的PCR产物DNA与50ng消化的pQE-302hr。B國转化将连接混合物转化进M15(pREP4)细胞(Qiagen),且将lOpl连接混合物加入冰中的100pi感受态M15(pREP4)细胞10min，随后转移到42。C水浴50sec。热激后，将混合物再置于水上2min，并将卯0plLB培养基加入转化反应，在37。C孵育60min,同时以大约225rpm摇动。将10-100pl的细胞铺板到包含100pg/ml氨千青霉素(Sigma)和25吗/ml卡那霉素(Sigma)的LB琼脂平板，在37。C过夜。C-筛选阳性菌落挑出平板上生长的20个单菌落并在包含氨节青霉素(IOOng/ml)和卡那霉素(昭/ml)的2mlLB培养基中在37。C培养过夜，同时以大约225rpm摇动。以WizardPlusSVminiprepsDNA纯化系统(Promega)从各菌落培养物纯化质粒DNA。PP13DNA插入片段的存在通过如下PCR检测PCR反应(20pi体积)包括1ngDNA模板、0.1-1截短的PP13和剪接的变体各自的特异性引物和10ml的x2PCR预混物(readymixforPCR,Bio-LabLtd)。PCR条件如上详述的。在1.5%琼脂糖上分离PCR产物，并在LAS-3000成像系统(Fuji)中显现DNA条带。根据PCR产物的计算大小选择可能的阳性克隆(4)。通过在多学科实验室单位(multi-disciplinarylaboratoriesunit,RappaportInstituteofMedicalScience—Technion,Haifa)进行测序确定各克隆的最终DNA序列。3.表达截短的和剪接的PP13基于证实的序列分析，选择一个阳性克隆来表达蛋白并接种到20ml包含氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养基中在37。C过夜，伴随摇动。以1:50在包含抗生素的LB培养基中混合培养物，并在37。C生长直到达到OD600为0.6。以lmM异丙基-b-D-硫代半乳糖吡喃糖苷-IPTG诱导蛋白表达3hr。通过在4°C以4000gx20min离心收集细菌细胞。在-80。C储存细胞沉淀直到使用。通过SDS-PAGE分析测试小份以确定重组蛋白的分子量。4.纯化截短的和剪"l妄的PP13基于SDS-PAGE分析，重组的截短的PP13被定位以被捕获在包涵体中。用于获得可溶多肽的方法如下。将细胞沉淀重悬于包含20mMTris-HCl、pH8、150mMNaCl、5mM咪唑和蛋白酶抑制剂(Roche)、10%甘油的裂解緩沖液中，并与0.2mg/ml溶菌酶(Sigma)在4。C培养1hr。通过在水上200W超声处理6x10sec而破坏细胞，或可替代地通过在'J、细胞French破碎仪(minicellFrenchpress，Thermo)中施加1000PSi压力而破坏细胞。丢弃可溶蛋白且将包含包涵体的沉淀(0.75gr)重悬于结合緩冲液(20mMTris-HCl、pH8.0、300mMNaCl、5mM咪唑、6M尿素、PMSF、Complete(蛋白酶抑制剂，Roche)、1mMDTT和10%甘油)。在室温培养1hr后，通过在20,000g离心20min(SS34转子，Sorval-RC)丟弃不可溶蛋白。将可溶级分通过0.45孔径的滤器过滤并与1ml预平衡的Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)在RT混合1hr。结合的重组截短的PP13的再折叠使用逐步线性6-0M尿素梯度在柱上进行。首先以10ml洗涤緩沖液(20mMTris-HCl、pH8.0、300mMNaCl、20mM咪唑、6M尿素、PMSF、Complete,1mMDTT和10%甘油)洗涤Ni-NTA琼脂糖柱，随后以10ml再折叠緩冲液(包含4、2、1、0.5和0M尿素的洗涤緩沖液)洗涤柱。以5ml洗脱緩沖液(20mMTris-HCl、pH8.0、300mMNaCl、0.5M咪唑、PMSF、Complete,1mMDTT和10%甘油)洗脱结合的重组PP13。将重组截短的PP13蛋白对TBS(20mMTris-HCl、pH-8、150mMNaCl)透析并以等体积的于TBS中的60%甘油稀释，储存在-80。C直到^f吏用。通过Bradford测定确定蛋白浓度并储存在-2(TC用于进一步分析。5.表征重组的截短的和剪接的PP13变体A.SDS國PAGE在5%P-巯基乙醇存在下，将重组的截短的和剪接的PP13变体(l-5吗)重悬于样品缓沖液中并在95。C煮沸5min。将蛋白上样到15%SDS-PAGE并通过施加120伏大约2hr而分离。为了使蛋白条带可见，以H20洗涤凝胶min并以GelCode试剂(Pierce)染色1hr。通过多次以H20洗涤除去染色试剂痕迹直到染色的PP13达到足够清楚。通过在相同凝胶上平行地分离的分子量标准蛋白确定PP13蛋白变体的近似分子大小，并与基于其氨基酸组成计算的蛋白分子大小比较。凝胶显示于图3。可见，天然、野生型PP13具有最高的分子大小(大约16-17kDa)，随后是剪接的(大约14-15kDa)和截短的(大约12-13kDa)变体。B.酶联免疫测定(ELISA)ELISA检测用于检测抗PP13单克隆抗体对截短的重组PP13的识别。简言之，在37。C将微量滴定板的孔以l-10吗/ml的重组野生型、截短的和剪接的PP13包被2hr,随后以碳酸盐緩冲液中"/o牛血清白蛋白-BSA封闭自由结合位点lhr。包被的蛋白与如下单克隆抗体的系列稀释物在4°C孵育过夜克隆27-2-3、215-28-3和534-16和抗组氨酸(anti-Histidine)(对照)。以包含0.05°/。Tween-20的磷酸盐緩冲盐水洗去未结合的抗体。随后使用轭合于HRP的山羊抗小鼠IgG检测结合的抗体且TMB用作HRP的底物。以ELISA读板器在650nm测量所得的酶解产物的光密度。30min后终止反应且重新测量在450nm相对于在650nm的光密度。结果显示于图4A、4B和4C。可见，尽管野生型PP13与特异性抗PP13抗体反应，但是截短的和剪接的变体不反应(图4A&4B)。所有PP13蛋白与对照抗组氨酸抗体反应(图4C)。这可提供对在妊娠前三个月期间，具有先兆子痫(preclampsia)高风险的妇女在其身体物质中具有PP13的低测量值的观察结果的解释。C.点杂交分析将野生型、截短的和剪接的PP13吸附于硝酸纤维素膜(Biorad)且以Tris緩沖盐水pH8.0(TBS)中的5%奶粉封闭自由结合位点1hr。膜与抗PP13单克隆抗体(克隆27-2-3、215-28-3和534-16)在37。C培养2hr且以TBS-tween20洗去游离的抗体。为了检测结合的抗PP13抗体，将轭合于HRP酶的山羊抗小鼠IgG的第二抗体加至膜并在室温(RT)培养90min,随后通过如上述的洗涤而丟弃游离的过量抗体。增强型化学发光(Chemiluminescene)(ECL)试剂用作HRP的底物且使用LAS3000成像系统(Fuji)显现、捕获并分析信号。D.222deltT7L74W突变以下是鉴定和分析222deltT/L74W突变的描述，参见图9A-9E。用于PCR的内含子寡核苷酸引物组设计为在四个LGALS-13基因外显子的每一个以及5'和3'非翻译区的短部分的侧翼。对每个产生的扩增子进行MultiphorSSCP/异源双链体分析(图9B)。通过自动测序且适当时通过限制酶分析进一步表征构象变体。在初孕妇患者的小组中(11<20)将内含子变体基因分型。鉴定的缺失在更大组群(n〉80)的发展了早期(GA〈34周)先兆子痫的初孕妇患者、她们的婴儿、和包括健康母亲和无关的新生婴儿的100个体的匹配的对照组中进一步表征。分析结果概述于下表(图9A)。表1:南非初孕妇组群的多态性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在该组群中鉴定了四种序列变体。大多数的先兆子痫患者的PP13基因中携带1-2个突变。其中，与截短的PP13相关的222deltT/L74W突变发现于6y。的先兆子痫(5。/。杂合体(hetro)和1%纯合体，与之相比对照中1%),且其婴儿的8%(与之相比对照中4%),推断比对照的更高比例的早期(GA<34周)先兆子痫，和推断的父亲对传递给新生儿的途径的贡献。外显子2和3之间的点突变对于形成外显子2中剪接的变体(突变IVS2-22A>G和IVS2-36A〉G))可为关键的，仅在先兆子痫病例中(分别和28%)并仅以杂合形式出现，且也以略高的频率在新生儿中检测到(分别19%和37%)。在先兆子痫患者、其婴儿的外显子-3中检测到缺失(T)移码突变(222deltT/L74W)且在一些病例中推断了父亲的贡献。预测该突变产生新的28或27C末端区，其比野生型PP13短38或37个氨基酸。突变体外显子3.1SSCP/异源双链体在凝胶中对野生型电泳(图9B)。使用电泳图语(图9C)分析突变体delT222A。Lgalsl3wt与Lgalsl3delT的M酸序列的比对显示于图9D。delT移码产生新的27AA末端区(下划线)，其比野生型肽短37AA。图9E显示不同突变体相对于野生型基因的相对位置。权利要求1.一种确定胎儿的母亲在妊娠期间发展先兆子痫的风险的方法，该方法包括(a)提供与胎儿有亲缘关系的个体的基因组DNA样品；(b)分析所述DNA的PP13基因中一种或多种突变的存在；并(c)基于所述突变的存在确定母亲的所述风险。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述与胎儿有亲缘关系的个体选自以下(a)胎儿的母亲，或她的母亲或父亲；(b)胎儿的父亲，或他的母亲或父亲；(c)胎儿的同胞或胎儿父亲的同胞或胎儿母亲的同胞；(d)母亲的妊娠胎盘或双胎妊娠的胎盘或此前妊娠的胎盘；和(e)胎儿。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述PP13基因中的突变影响下述PP13参数的一种或多种(a)表达水平；(b)氨基酸序列；(c)翻i奪后加工；(d)运输；(e)功能缺失；和(f)功能获得。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述PP13基因中的突变选自以下(a)移码突变；(b)染色体突变；(c)点突变；和(d)RNA剪接。5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中移码突变的存在指示发展早发型先兆子痫的风险。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述移码突变是222delT/L74W。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因组DNA样品在母亲妊娠之前提供。8.根据权利要求1所迷的方法，其中所述基因组DNA样品在母亲妊娠期间提供。9.一种确定孕妇发展先兆子痫的风险的方法，其包括(a)提供来自母亲身体物质的PP13分子样品；(b)确定PP13分子的结构；并(c)基于PP13分子的结构确定孕妇的所述风险。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述身体物质选自母血、母唾液、母尿、羊水、脐带血、绒毛膜绒毛和胎盘组织。11.根据权利要求9所述的方法，其中所述PP13分子是PP13蛋白，且所述PP13分子的结构是所述PP13分子的分子大小或氛基酸序列。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述PP13的结构是免疫学地或通过蛋白质化学确定的。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述免疫学确定是通过使用针对PP13和/或突变的PP13的特异性抗体进行的。14.根据权利要求9所述的方法，其中所述PP13分子是PP13的mRNA或与其对应的cDNA,且所述PP13分子的结构是PP13的mRNA或与其对应的cDNA的序列。15.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(c)中，移码突变导致的截短PP13的存在指示发展早发型先兆子痫的风险。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述移码突变是222delT/L74W。17.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(c)中，可变剪接导致的剪接变体PP13的存在指示发展晚发型先兆子痫的风险。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述剪接变体是AEX-2。19.一种突变的PP13蛋白变体。20.根据权利要求19所述的PP13变体，其中所述突变选自以下(a)移码突变；(b)点突变；和(c)由于可变剪接的突变。21.根据权利要求20所述的PP13变体，条件是排除以下突变的一种或多种(a)C/A取代[rs3764843];(b)IVS2-22(A/G)[rs2233706];(c)IVS2-36(A/G);(d)222delT/L74W;和(e)AEX-2。22.根据权利要求20所述的PP13变体，其中所述变体选自IVS2-36(A/G)、222delT/L74W(SEQ.ID.NO:l)或AEX-2(SEQ.ID.NO:2)组成的组。23.—种纯化可溶形式的突变的PP13蛋白变体的方法，该方法包括(a)在宿主细胞中表达所述PP13变体；(b)破坏所述宿主细胞并将细胞内含物离心；(c)在含有高浓度变性剂的緩冲液中重悬离心的沉淀；(d)将重悬的沉淀上样到能够结合PP13的亲合柱上；(e)以一定梯度的所述变性剂洗涤所述亲合柱；并(f)从所述柱洗脱可溶形式的PP13。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述变性剂是尿素。25.—种用于确定妇女发展先兆子痫的风险的方法的试剂盒，所述试剂盒包括针对PP13天然基因和/或其突变序列的特异性基因组序列的DNA探针。26.—种用于确定妇女发展先兆子痫的风险的方法的试剂盒，所述试剂盒包括针对PP13天然序列和/或其突变序列的抗体。27.—种用于确定妇女发展先兆子痫的风险的方法的试剂盒，所述试剂盒包括针对PP13天然mRNA和/或其突变序列的特异性序列的RNA探针。28.—种用于确定妇女发展先兆子痫的风险的方法的试剂盒，所述试剂盒包括针对PP13cDNA和/或其突变序列的特异性序列的DNA探针。29.—种用于确定妇女发展先兆子痫的风险的方法的试剂盒，所述试剂盒包括包含PP13cDNA或RNA和/或其突变序列的特异性序列的DNA或RNA芯片。全文摘要一种用于确定胎儿的母亲在妊娠期间发展先兆子痫的风险的方法，所述方法包括(a)提供与胎儿有亲缘关系的个体的基因组DNA样品；(b)分析该DNA的PP13基因中一种或多种突变的存在；并(c)基于该突变的存在确定母亲的风险。还公开了突变的PP13蛋白变体，和用于本发明方法中的试剂盒，所述试剂盒包括针对PP13天然基因和/或其突变序列的特定基因组序列的DNA探针。文档编号C12Q1/68GK101627131SQ200780052052公开日2010年1月13日申请日期2007年10月25日优先权日2007年2月1日发明者H·梅里,玛瑞·塞玛尔,雷纳特·希尔曼申请人:诊断技术有限公司