组合的复合糖库及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：组合的复合糖库及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
和背景本发明涉及组合的复合糖库和它们的制备方法和应用。更具体地，涉及在固相支持体上通过逐级酶促合成法制备的此糖库，涉及由此提供复合糖结构的组合阵列。按照本发明合成的组合的复合糖库可以在多种途径中加以开发，包括但不限于(i)复合糖药物的鉴定；(ii)与复合糖相关的受体或蛋白作为药物治疗的新的潜在的与糖相关的靶的鉴定；(iii)生物活性复合糖的鉴定；(iv)作为药物疗法的潜在新靶标的特异性复合结构糖单元的鉴定；(v)已知复合糖结构的活性位点的鉴定；(vi)复合糖结构中新的糖标记的鉴定；和(vii)形成的对癌症相关性糖表位或其它疾病相关性糖抗原的抗体的发现。
药物发现现代药物研究和开发担当起了利用现代化学将传统医学转化为药物的发现和分离的任务。从二十世纪五十年代开始，药物发现集中在用多种动物模型测试大量候选化合物，以努力鉴定出药学活性化合物。所以，新候选药物的发现要求筛选多种来源的化合物的潜在治疗活性。这些来源包括，例如，用于寻找新治疗活性的已知化合物和药物，发酵肉汤和从植物或海洋生物排泄和/或提取的化合物等(Granellin，1992)。
在二十世纪七十至八十年代，生物化学、分子生物学、细胞生物学和结构(和动能)生物学领域中的进展使人们更好地了解到导致各种疾病恶化和进展的生物化学和分子学过程。由此开发出基于蛋白质的初级筛选试验，其代替了在动物模型中筛选候选药物的繁琐且耗时的方法(Nicholls，1991)。
此外，X射线结晶学和计算机化学的发展阐明了调节分子识别的自然过程和受体及其配体之间的相互作用，由此开发出了被称作“合理药物设计(rational drug design)”的方法(Hendrickson，1991)。
由于了解了肽和蛋白质的三维结构，并且具备了通过在分子模型化和物理上利用分子克隆技术操纵此类结构的能力，研究人员能够开发出新的候选药物。
不幸的是，由于需要非常高水平的技术人员以及专用和复杂的设备，“合理药物设计”无法给科研人员提供他们所希望的药物设计(Jacobs，1994)。
因此，在二十世纪九十年代早期，主导性的生物工程和药物学坚定转向机器人学和自动化，尝试补充“合理药物设计”方法。自动化确保了药物发现的“鸟枪式”方法，能够针对希望的生物活性快速筛选成千上万的化合物。新方法包括(i)组合体(combinatorics)，作为新化合物的来源；(ii)基因组，作为新靶向的来源；和(iii)高通量筛选(HTS)，作为交叉筛选不同化合物/靶标的一种方法。因此，“鸟枪式”途径允许科研人员忽略现有方法中有关的技术障碍，而把精力集中在关键问题上，例如“要做什么”或“产生正性结果需要多少多样性”(Hogan Jr.，1997)。
组合库在新候选药物的研究中，研究人员注意到业已经广泛筛选的天然化合物的补体，其分子上带有在自然状态下未被发现的新的和多样化的基团。所以，新合成出包含核酸或氨基酸序列的新化合物的组合库并且筛选潜在的候选药物。
此类新化合物或新靶标的组合库可以分为三个主要种类。
第一种涉及基质或平台，在它们的上面显示和/或构建所述库(Blondelle，1996)。因此，组合库可以被提供(i)在化学固相支持体的表面上，例如微粒、珠粒或扁平平台；(ii)通过生物来源(如细菌或嗜菌体)表现；和(iii)含在溶液内。此外，多种由计算机生成的组合分子的三维结构可以通过计算机计算法筛选(Gaasterland，1998)。
组合库可以进一步按照库中所表示的分子的类型来分类，其可以包括(i)小化学分子类；(ii)核酸(DNA、RNA等)类；(iii)肽类或蛋白类；和(iv)糖类。
组合库的第三种涉及合成化合物或靶标所用的方法，这些合成一般通过下列方法完成(i)就地化学合成(Borman，1996)；(ii)利用分子克隆的体内合成(Kenan，1994)；(iii)通过纯化酶或从微生物的提取物体外生物合成(Michels，1998)；和(iv)利用专用计算机计算法in silico(Sansom，1997)。
由任何上述合成方法代表的组合库可以进一步通过下列方法特征化(i)裂分(split)或平行模式的合成(ii)分子大小和复杂度；(iii)筛选技术；和(iv)制备/筛选中自动化的等级。
在分混合成方法中，譬如，在微粒或珠粒的表面上合成的组合库被划分为数个组，其中唯一的第一合成建筑块(building block)被连结在珠粒上。随后，将这数个组的珠粒混合并且分离形成独特多样性的新组，再加入下面的建筑块，重复上述过程直至获得所需的复杂度。在平行合成法中，分别在溶液中或固定在基质上合成组合库的各个化合物，对于库的各种化合物而言需要唯一和独立的合成方式。
组合库中分子的复杂度取决于初级建筑块的多样性及其可能的联合形式。此外，若干附加参数也可以测定组合库的复杂度。这些参数包括(i)最终合成产物的分子大小(例如，低聚物或化学小分子)；(ii)各合成步骤中所产生的价键的数目(例如，一次一个键或有时的数个特定价键)；(iii)所用不同合成步骤的数目；和(iv)最终产物的结构复杂度(例如直链或支链分子)。
用组合库技术可以合成若干类型的初级分子，包括但不限于，核酸和氨基酸和糖。由于其固有单键种类的复杂度，合成核酸和氨基酸组合库一般只需要一类合成反应。另一方面，由于其固有价键种类的复杂度，合成复合糖组合库需要多种不同的合成反应。
所以，核酸和氨基酸的简单化和重复使如此组成的组合库的合成方法相对简化。另一方面，由于低聚糖在结构上更为复杂，所以难以合成复合糖的组合库。因此，迄今为止合成的复合糖组合库具有非常低的复杂度，并且一般包括由不超过三种建筑块构成的复合糖分子。
核酸和氨基酸组合库的进展迫使应用能够利用此类库的独特性质的筛选技术，从而可以完成对多样化库的快速筛选。
譬如，为了识别“探针”和库组分之间的特性性相互作用，可以构建一种库使每一个组分的身份和定位已知或在合成阶段进行控制。这样的库被称作可编址库。利用照相平版法可以产生光定向-空间可编址、可平行合成的肽或低聚核苷酸库(Ramsay，1997)。此外，带有微流系统的封闭反应室微装配阵列可用于“芯片上实验室(Lab on achip)”的低聚核苷酸或化学可编址库的合成(U.S.专利Nos.5,643,738；5,681,484；和5,585,069，它们在此引入作为参考)。利用此类可编址技术能够在合成中测定库组分的性质和定位。
相比之下，采用“一珠一分子”方法合成的库，其多样性通过“分与混”合成法产生，此类库可以利用和可检测部分(如荧光分子或酶)相结合的探针来筛选，从而可以鉴定出与标记探针相互作应的珠粒，分离并且分析其组成(Schullek，1997)。
由于此类筛选方法耗时，所以开发出标记库途径，它主要用于通过分混法产生的库。为了加速分析分离出的感兴趣的分子，标记库方法联合库成员合成与标记的标准建筑块的平行正交合成(Janda，1994；Chabala，1995)或射频标记记忆设计(Borman，1996)。
为了筛选大的阵列，将机器人和小型化设备应用在高通量筛选(HTS)试验中。以往，HTS试验基本上是大规模(upscaled)的实验室试验。因此，根据被筛选分子的多样性，相对简化的试验对HTS的适应包括液相处理的微型化和自动化，由此可以比较迅速地筛选出大量独立的分子。目前，对于HTS开发并实施了更多的集成方法。这些方法称作“超级技术”(UT，Sittampalam，1997)或“新技术”(NT，Burbaum，1997)。此类HTS方法学介于分混合成法或平行合成法之间变化。在分混合成法中，微粒经过用鉴定试剂预处理既可用于合成也可用于筛选(Stinson，1998)。改进的平行合成法需要另外的支持基质小型化(Cargill，1997)。例如，如果每年用200种探针试验106种化合物，这可转化为2×108个试验。如果这些试验分别采用100μL的孔体积，每孔中含有分子量约500g/mol的待测化合物10μL粗略估计需要2百万个96孔的微量滴定平板，20,000L的每种靶标溶液和100克的各种化合物。
所以，人们提出使支持基质小型化的新技术。此类技术分为开放和密闭式容器形式。开放容器技术保持了标准96孔平板的兼容性并且遵循N＝n2×96的几何级数，其中N是孔的数目，和n是描述线性阵列的可能填充密度的整数，按照这种推理，微升容量限度和合适填充密度之间的平衡点是利用具有1536个孔容量为1-2μl的孔的平板来获得。
较大阵列的筛选需要进一步减小孔容量至纳升量，其进一步迫使采用密闭容器形式以防止蒸发。利用由半导体工艺开创的装配技术，可以实施纳升反应容量的合成和分析，由此一个四平方英寸的硅片可以支持105个独立合成和生物鉴定反应(Cheng，1998)。
现在，化学合成的有机小分子如核酸(DNA、RNA和反义RNA)、肽和肽的生物模拟物(如类胨和半类胨等)的组合库的制备方法在所属领域中建成，这些技术业已在上述大多种类和分支(divisions)(参见表1)中得到证实。
表1组合库的分类
表1(续)
图标符号+可利用；-不能利用尽管糖在性质及其在许多生物过程中的重要作用上多种多样，但还未证实高度多样化和复杂的糖库(Borman，1996)。此外，虽然糖苷键产物的固相化学合成已经在约30年之前提出(Frechest，1971，1972；Guthrie，1971)，糖组合库的化学合成仅仅在近年来才加以验证，并且由于化学合成的限制(下文将作详细描述)，此类库构成相当简单的可溶性非标记三糖组分阵列。
Hindsgaul及其同事证明用“随机糖基化”化学方法合成库，其包括将保护的糖基供体与含有3-5个自由羟基的糖受体偶联，生成6-8个不同糖产物的混合物(Kanie，1995)。按照这种方法，在糖基化步骤之后，脱去保护基，随后经反相色谱将起始单糖建筑块与偶联产物分离。
Boons及其同事报导了更加直接的化学合成途径。为了能够形成区域专一性的糖苷键，他们合成了10种各自含有一个游离羟基的保护的二糖接纳体。每种保护的接纳体分别和糖基供体反应生成32种确定的二糖。随后混合二糖产物，采用脱保护过程，并将混合物划分为4个亚组。各亚组进而与不同的供体反应得到4个库，各个库包含64种三糖。最后，用冗长的大小排阻色谱的方法分离产物(Boons，1996)。
组合糖库在固相支持体上的化学合成业已由Kahne及其同事(Liang，1996)验证。U.S.专利No.5,700,916在此方面涉及了由1300种标记二-和三糖组成的糖库。这种库是利用分混法通过将12种不同的糖基供体偶联在6种不同的聚合物键合的接纳体上合成的，其中采用糖基化方法以端基异构亚砜作为糖基供体掺混。
若干其它研究组也描述了制备组合糖库的化学方法(Rademann，1996；Rodebaugh，1997；Liang 1997，Kahne的综述，1997；Arya，1997，WO 97/34623；WO 97/35202；WO 98/08799；WO 98/40410；和美国专利5,780,603)。上述方法公开了化学方法制备的糖库，其中糖组分经糖苷键连结在非糖部分，或者低结构复杂度的糖组分，例如均匀多价长链或具有0-1个分支的双四糖。
最近，已经证明合成的低聚糖模拟物能够用酰胺键代替糖苷键，由此形成“碳类胨(carbopeptoids)”(Nicolaou，1995)和“糖苷酸(glycotide)”(McDevitt，1996)，或用磷酸二酯键代替糖苷键，由此形成“碳核苷酸(carbonucleotide)”(Nicolaou，1995)尽管这些糖模拟物比以前合成的糖更复杂，但其复杂程度远不如天然存在的复合糖。(例如，参见


图1)。
Wong及其同事(Wong，1998)通过化学方法合成了具有四种不同的可选择性脱除保护基的核心建筑块，生成具有4个正交糖苷键的五糖模拟物。
虽然利用不同的化学方法合成了具有有限复杂度的糖库，但迄今没有制备过具有类似于天然复合糖的高等级的结构复杂度的复合糖组合库(例如高度支化结构)。此外，现有技术从未建议或探讨过利用能够快速筛选库组分的可编址平行合成方法来合成此类库。
这可能归因于化学合成方法仍然受到经典选择性保护/脱保护策略的局限的事实，致使合成分子的长度是其复杂度的主要贡献者(Grout，1998)。根据计算，包括所有可能的直链或支链的六聚低聚糖异构体，需要1012种以上的不同结构形式(Laine，1994)。通过化学合成方法、利用选择性保护-脱保护基团合成这样的阵列是不切实际的。在此类方法中，端基异构体混合物的形成是无法避免的，而端基异构体混合物的形成无法或终止直接糖特异性链的形成，因此不可能控制在合成过程中产生的此类端基异构中心的形成。
为了合成具有高级复杂度和多样性的复合糖组合库，人们必须寻找其它非化学的合成方法。
酶是高准确性的生物催化剂，其普遍应用在有机化合物的合成中。因此，酶可以用在糖合成方法中，其避免了上述现有技术中化学合成方法所固有的局限性。糖苷键的酶促合成法具有高度的立体-和区域选择性，所以，将酶应用于复合糖的合成中废除了对保护的单体的需求，并且消除了掺混此类保护的建筑块所固有的问题(Grout，1998)。
自然界在糖苷键的体内生物合成中利用4种类型的酶(参见下表2)。基本通用分类是按照Leloir氏途径(Leloir，1971)和非Leloir氏途径划分这些酶。Leloir氏途径的酶在哺乳动物体系中负责绝大多数N-和O-联糖蛋白和其它糖缀合物的生物合成。N联途径包括多萜醇焦磷酰基低聚糖中间体于内质网中在甘露糖基和N-乙酰基葡糖基转移酶作用下的起始生物合成。这种低聚糖结构进一步糖基化，随后在低聚糖转移酶作用下转化为生长肽链的天冬酰胺残基(Kornfeld，1985)。在转运到高尔基氏体(GA)之前，在糖苷酶作用下脱除葡萄糖和一些甘露糖残基，显露出核心五糖。此后，在称作O联糖基化的过程中通过糖基转移酶向GA中添加附加的单糖，其在GA中开始经糖苷键向丝氨酸或苏氨酸添加单糖并且通过顺序添加的单糖继续下去(Kornfeld，1985)。Leloir途径的糖基转移酶仅仅利用8种核苷糖作为单糖供体用于合成大部分的低聚糖(参见下表3)。表2用于体外合成配糖键的酶的类型
表3Leloir途径的糖基转移酶
非Leloir途径利用附加单糖，例如阴离子或硫酸化糖，其在哺乳动物细胞中也可以发现。但微生物、植物和无脊椎动物还存在其它附加单糖的非常多样化的联合，这些单糖是上述途径不曾利用的(例如鼠李糖和阿拉伯糖；参见下表4)(Oths，1990；Mengling，1998)。
表4仅存在于微生物和植物中的单糖(Gleeson，1998)
主要提出了两种策略用于低聚糖的体外酶催化合成。按照第一种策略，在可逆性水解反应中使用糖苷酶或糖基水解酶(WO 87/05936；WO 98/40512；and U.S.Pat.No.5,532,147，Nilsson，1988 and1996；Watt，1997)，按照第二种策略，糖基转移酶用于顺序合成法(Hunez，1980；Toone，1989)。由于第二种策略表现出高收率和高立体-和区域选择特异性，它被认为是优选途径(David，1991；Wong，1992)。第二种策略已在现有技术中广泛探讨(参见，例如Grout，1998；Watt，1997；Ichikawa，1997；Wong，1996；U.S.Pat.No.5,583,042；和WO 96/32492)，它被利用来合成非常窄幅度的低聚糖分子，大小在2至5个单元，该合成采用8个Liloir单糖物种中的7个，只生成0-1个支化键。
自然界中，联合利用全部四种酶(参见上表2)制备复合阵列的低聚糖。另一方面，有关体外糖苷键合成的联合酶促方法的报导十分有限。
此类方法可以联合使用糖苷酶和糖基转移酶(β-半乳糖苷酶和(2，6)-唾液酸转移酶)制备窄幅的低聚糖产物(Herrmann，1993；Nilsson 1988)。另外，转糖苷酶也可以与上述酶合用(例如克室锥虫产生的转唾液酸酶，Schenkman，1991)。利用磷酸化酶将糖1-磷酸供体转化成2-酮基-糖也早在1950年间公开(Hassid，1950)，但这种策略没有被进一步实行。
复合糖在固相支持体上的酶促合成首先在二十世纪八十年代由Zehavi等提出(1983 and 1984)。Zehavi及其同事将一个糖基单元连结在4-羟甲基-3-硝基苯甲酸酯上生成不耐光连接体。这种糖连接体与氨基官能化水相容性载体通过酰胺键偶联，例如聚丙烯酰胺-凝胶聚合物或聚乙烯醇(Zehavi，1984)。聚合物键合的糖苷随后用1，4-半乳糖基转移酶半乳糖苷化。
通过合用化学合成步骤和酶促糖链延伸步骤，实行了Lewis X糖肽抗原的固相化学-酶促合成(Halcomb，1994；Seitz，1997)，以及唾液酸化十一糖-天冬酰胺偶联物的合成，其中α-2，6唾液酰残基在酶作用下添加到化学合成的十糖上(Unverzagt，1996)。此外，唾液酸化Lewis X抗原的酶促合成也已经在活化二氧化硅载体上完成(Schuster，1994)。通过三个重复性糖基化步骤使4个附加糖单元位于肽上，从而生成较高收率的这种糖肽。据报导糖肽的合成经过聚乙二醇-聚丙烯酰胺共聚物固相支持体的酶促糖基化也具有良好的收率(Meldal，1994)。
迄今为止，新的糖衍生药物的发现仍然远远滞后于其它种类的分子，例如蛋白质。这种滞后主要归咎于可用于制备多样化和复杂化糖类物质的有效且综合的方法的不实用性。由于复合糖难以合成并难以分析，利用现有技术的方法无法完成这样的任务。
尽管存在这些限制，糖药物化学和生物化学的三个方面得到了广泛研究(i)对细菌细胞壁的生物合成的特异性干扰(Mengling，1998)；(ii)对恶性肿瘤的独特标记(Orntoft，1995；Kobata，1998)；和(iii)在细胞和细胞间的通讯、细胞粘附、细胞感染和细胞分化中参与细胞表面低聚糖标记(Simon，1996)。
糖的药物化学和生物化学的这些方面是利用化学上合成的复合糖物质进行研究。已经证明合成的复合糖是开发糖治疗领域中的重要工具，但化学合成方法及其制备的多样性组合库所固有的局限性阻碍了在这个领域中的显著进步。
譬如，CarbBank数据库(复合糖结构数据库-CCSD)包括48,956条记录(22,048个独特结构)，其来自公开的文献并由GeorgiaUniversity project-Complex Carbohydrate Research Center(CCRC)汇编。在图2中这些糖按照复杂度分组。58％以上的条目为支化分子结构，其事实上不可能利用目前的化学合成方法来合成。图3是一个直方图，以百分比表示在CarbBank数据库中发现的复合糖中所存在的糖残基数量的分布。虽然数据库中全部复合糖中的44％具有6种或更多的残基，但此类复合糖的化学和酶促合成不曾被广泛实践，特别是在库的背景中。
当人们希望构建此类实体的组合库，需要平行合成大批量的复合糖时会进一步遇到困难。所以，利用现有化学合成方法来合成可编址复合糖实体的组合阵列成为首要的挑战。
所以，普遍认识到需要并且非常有利获得合成和筛选大量结构复杂性和多样性的复合糖组合库的方法。
发明概述按照本发明的一个方面提供一种组合的复合糖库，其含有多数可编址复合糖结构。
按照本发明的另一方面提供一种制备可编址组合的复合糖库的方法，该方法包括步骤(a)提供具有多个位置的固相支持体；和(b)酶促合成多数的复合糖结构，多数的复合糖结构的每种结构连结在多个位置中的至少一个可编址位置，由此生成可编址组合的复合糖库.
按照本发明下述优选实施方案中的其它特征，每种可编址复合糖结构连结在固相支持体上。
按照所述优选实施方案中的其它特征，每种可编址复合糖结构与固相支持体的连结通过连接体实行。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述连接体包括至少两个邻接共价键。
按照所述优选实施方案的中的其它特征，所述连接体选自氨基酸、肽、非糖基化蛋白、脂质、神经酰胺、多萜醇磷酸酯、环糊精、低聚糖、单糖、烷基链和核酸。
按照所述优选实施方案中的其它特征，该连接体的长度至少为20埃(埃)。
按照所述优选实施方案中的其它特征，所述固相支持体选自可编址微粒、可编址珠粒和扁平平台。
按照所述优选实施方案中的其它特征，所述扁平平台选自微量滴定平板、薄膜和嵌片(chip)。
按照所述优选实施方案中的其它特征，所述微量滴定平板是补充有微流体系的封闭反应室的可编址微装配阵列。反应室的密度优选为4-25/平方厘米，各自具有50-1000纳升的容量。
按照所述优选实施方案中的其它特征，该固相支持体为嵌片，而且其中多种可编址复合糖的不同复合糖结构以斑片排列，这些斑片中心和中心的间距不超过2.25mm。
按照所述优选实施方案中的其它特征，该固相支持体是选自下列组成的物质与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯、聚乙二醇-聚苯乙烯嵌段共聚物、聚酰胺。聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、二氧化硅、石英、塑料和纤维素。
按照所述优选实施方案中的其它特征，多数可编址复合糖结构的至少一种包含至少两个一种类型的邻接糖单元。
按照所述优选实施方案的其它特征，多数的可编址复合糖结构的至少一种包含至少一个分支。
按照所述优选实施方案中的其它特征，至少一个分支的至少一种形成相同的核心和分支糖单元。
按照所述优选实施方案中的其它特征，多数可编址复合糖结构的至少一个含有至少5个糖单元。
按照所述优选实施方案中的其它特征，多数的可编址复合糖结构是一个包含非天然复合糖的代表。
按照所述优选实施方案中的其它特征，多数的可编址复合糖结构是包含天然复合糖的代表。
按照所述优选实施方案中的其它特征，所述天然复合糖来自人体来源。
按照所述优选实施方案中的其它特征，所述人体来源选自组织、细胞和体液。
按照所述优选实施方案中的其它特征，多数的可编址复合糖结构是至少一个天然复合糖的结构域的代表。
按照本发明的另一方面提供一种鉴定能够结合实体的复合糖的方法，该方法包括步骤(a)制备可编址组合的复合糖库，通过(i)提供具有多种位置的固相支持体；和(ii)酶促合成多种复合糖结构，多种复合糖结构的每种结构连结在多种位置的至少一个编址位置，由此制备可编址组合的复合糖库；和(b)用实体筛选可编址组合的复合糖库，鉴定出能够结合实体的复合糖。
按照本发明下列优选实施方案中的其它特征，所述实体是生物活性物质的候选物，该方法适合于鉴定是生物活性物质的候选物的靶标的复合糖。
按照所述优选实施方案中的其它特征，该实体是能够结合特异性天然复合糖的配体，而且其中可编址组合的复合糖库是特异性天然复合糖的结构域的代表，该方法适于鉴定结合配体的结构域的特异性结构域。
按照所述优选实施方案中的其它特征，该实体是潜在药物。
按照本发明的另一方面提供一种诊断以自身或非自身复合糖结构为特征且诱导其对抗抗体的疾病的方法，该方法包括步骤(a)制备代表自身或非自身复合糖的可编址组合的复合糖库，通过(i)提供具有多个位置的固相支持体；和(ii)酶促合成多种复合糖结构，多种复合糖结构的每种结构结合在多个位置的至少一个编址位置，由此制备可编址组合的复合糖库；和(b)可编址组合的复合糖库与得自患者的抗体反应，该患者被怀疑患有所述疾病，由此产生结合抗体的位置的图式，由此通过将该图式与健康个体所特有的已知图式对比，获取对该疾病的诊断。
本发明成功地利用组合的复合糖库及其制备和筛选方法克服了现有构型的缺点。
附图简述本发明在此仅以举例的方式参考附图进行描述，其中
图1是具有5种不同种类和三个支化点的14个单糖单元的复合糖的公式。这种可以通过本发明的方法来实现的复杂度是所属领域中任何已知的化学或酶促合成方法都无法实现的。
该图显示了单糖类型的名称、端基异构体(反应中心)和价键种类，以及支化点。
图2表示有关CCSD数据库的复合糖记录中支化发生率的统计学研究。CCSD数据库包含48,956条记录，其来源于公开的文献并且由Georgia University Project-Complex Carbohydrate ResearchCenter-CCRC汇编。饼图的各个部分以百分率表示数据库的复合糖中存在的分支的数量(0-26)。利用CarbBank 3.2.009进行统计学分析。
图3是一个直方图，以百分比表示在CarbBank数据库中发现的复合糖中所存在的糖残基数量的分布。虽然数据库中全部复合糖中的44％具有6种或更多的残基，但此类复合糖的化学和酶促合成不曾被广泛实践，特别是在库的背景中。
图4是一个表，表示
图1的复合糖结构的逐级酶促合成。在各步骤中，列出了酶促反应(ER)(详见表7)并且加入的单糖单元用灰色背景表示，“S”代表固相支持体，其上固定了复合糖并且发生合成反应。
图5描述GlcNAc与氰尿酰氯活化的Covalink NH的共价固定化，该固定化构成本发明所述复合糖库合成的第一步。
图6描述GlcNAc和NHS/EDC活化Covalink NH的共价固定化，该固定化构成本发明所述复合糖库合成的第一步。
图7a描述WGA与偶联在Covalink NH平板上的PNP-GlcNAc在氰尿酰氯活化的存在或不存在下的结合作用；这种结合作用通过WGA偶联的过氧化物酶来显示，在实施例部分将作进一步说明。
图7b是描述不同封阻方法对于WGA与偶联在Covalink NH上的GlcNAc-COOH的结合作用的影响的图示；这种结合作用通过WGA偶联的过氧化物酶来显示，在实施例部分将作进一步说明。
图7c是描述WGA和偶联在氰尿酰氯活化Covalink NH上的GlcNAc的结合的图示；这种结合作用通过WGA偶联的FITC显示，在实施例部分将作进一步说明。
图8a是描述WGA结合涂层在Maxisorb平板的BSA-GlcNAc的图示；这种结合作用通过WGA偶联的过氧化物酶来显示，在实施例部分将作进一步说明。
图8b是一个图式，描述图8a中的结合作用作为所用洗涤步骤的次数的函数。
图8c是描述利用ECorA凝集素结合验证β-D-半乳糖向平板固定的苯基-p-D-GlcNAc(22个原子连接体)的转移。
图9描述合成固定在平板上的由表17中所述结构构成的库所需要的步骤，给出了微量滴定平板的组合、各步中进行的酶促反应和凝集素/抗体结合试验。
图10a描述了在用α，β1，4半乳糖基转移酶反应混合物(D7)(实线)培育之后或对照反应(虚线)之后RCA120的结合作用。
图10b描述了用α1，3半乳糖基转移酶反应混合物(D3)(实线)培育之后或对照反应(虚线)之后BS-1的结合作用。
图10c描述了用α1，3岩藻糖基转移酶VI反应混合物(B2)(实线)培育之后或对照反应(虚线)之后TGP-1的结合作用。
图10d描述了用α2，6唾液酸转移酶反应混合物(A2)(实线)培育之后或对照反应(虚线)之后TML的结合作用。
图10e描述了用α2，3唾液酸转移酶反应混合物(A3)(实线)培育之后或对照反应(虚线)之后TML的结合作用。
图10f描述了用岩藻糖基转移酶VI反应混合物(B2)(实线)培育之后或对照反应(虚线)之后抗唾液酰基Lewis X小鼠IgM的结合作用。
图11描述了库(参见库2)合成的各步骤中进行的酶促反应，凝集素结合试验用来验证不同酶促步骤的效率。
图12描述了在用β1，4半乳糖基转移酶反应混合物(D7)培育后在不同时间点RCA120与Maxisorb平板键合的BSA-GlcNAc的结合作用。
优选实施方案的描述本发明涉及组合的复合糖库及其合成方法，其可以用于(i)复合糖药物的鉴定；(ii)复合糖相关性受体或蛋白作为药物治疗的新的潜在糖相关靶标的鉴定；(iii)生物活性复合糖的鉴定；(iv)作为药物疗法的潜在新靶标的特异性复合结构糖单元的鉴定；(v)已知复合糖结构的活性位点的鉴定；(vi)复合糖结构中新的糖标记的鉴定；和(vii)对癌症相关性糖标记或其它疾病相关性糖抗原形成的抗体的鉴定。
参考附图和所附的描述可以更好地理解按照本发明所述组合的复合糖库的原理和操作及其合成方法。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明不局限于在下面的描述或附图举例中提出的组分的构建和排列的具体描述。本发明能够以多种途径实施或进行其它实施方案。另外，应理解在此所用的说法和术语目的在于说明而不受限定。
合成复合糖库的酶按照本发明复合糖组合库的酶促合成是利用糖基转移酶、糖苷酶和转糖苷酶实现的。这些酶可以从不同来源利用下面所述的不同策略来获得。
由天然来源的酶目前，业已广泛表征了200种以上不同种类的对大量底物和供体有效的糖基转移酶、转糖苷酶和糖苷酶。发现这些酶存在于哺乳动物细胞、植物细胞、无脊椎动物细胞和微生物中，(参见Palcic，1994 and Nilsson，1996，其在此全文引入作为参考)。
重组酶许多糖基转移酶和转糖苷酶的编码序列已经被克隆，并且由此表征了各种重组酶编码的接纳体底物的特异性。下表5列出了一些克隆的糖基转移酶及其各自的接纳体底物特异性。利用标准重组DNA技术可以制备出足够量的已克隆编码序列的酶。由于这些酶中的大多数需要对官能度进行转录后修饰，所以表达适宜在昆虫细胞培养物中进行(Toki，1997；Tan，1995)。此外，在催化结构域已表征的可溶性酶的情况中，可以只对域序列完成表达，条件是保持其催化活性和全酶的底物特异性(Vries，1997)。可溶性糖基转移酶的其它可能表达体系还包括哺乳动物组织培养物产生的分泌物(参见，例如U.S.5,032,519，其在此全文引入作为参考)。
表5克隆糖基转移酶及其接纳体的部分目录
表5(续)
鉴定和克隆新的酶的方法除了目前可利用的天然和重组糖基转移酶以外，可以进行新糖基转移酶的鉴定和分离。适用于复合糖库合成的糖基转移酶可以从细胞类中鉴定和分离出来，其具有一般通过这些预期糖基转移酶合成的复合糖结构。具有固定接纳体作为配体的亲和色谱技术为所属领域熟知并且确保所需糖基转移酶的简单一步式分离(这方面参见U.S.Pat.No.5,288,637，其在此引入作为参考)。糖基转移酶一旦被鉴定并分离，可以部分测序并且由此克隆编码基因。克隆糖基转移酶基因的技术已经建立，现有技术评述了克隆糖基转移酶基因的的许多实施例和策略(参见，例如Schachter，1994和WO 95/02683，其在此引入作为参考)。
另一种新糖基转移酶序列的可能性来源存在于DNA和蛋白数据库中。由于新的DNA和蛋白序列数据的迅速积累，序列对比技术可以用来鉴定新的糖基转移酶。例如，从动物、酵母、植物和细菌鉴定了110种特殊cDNA和基因，其蛋白产物含有UDP糖基转移酶基因总科的特有“特征序列”(Mackenzie，1997)。利用这些特征序列或基序，所属领域技术人员可以筛选新糖基转移酶的有关数据库。例如，利用序列同源性对比从包皮垢分支杆菌得到的阿糖转移酶基因，在结核分支杆菌的完全测序基因组中鉴定出三种新的阿糖转移酶基因(Cole，1998)。
利用通过直接演化修饰的酶在某些复合糖的合成中也可以采用具有修饰的亲和力或改变的底物供体或接纳体特异性的酶。例如，在合成由以同一区域特异性取向相连的相同重复单糖单元组成的复合糖结构的合成中，例如D-man-α(1，2)-D-Man-α(1，2)-D-man-α(1，2)-R，需要采用α-1，2甘露糖转移酶和对α-1，2甘露糖具有特异性的接纳体。在GDP-甘露糖的存在下利用天然酶和固定在固相支持体上的D-man-α(1，2)-R，应得到未控制的聚合反应，其产生低聚甘露糖的长聚合链，[D-Man-α(1，2)]n-R。为了合成具有指定数量的甘露糖单元的低聚甘露糖(上述实例中的三种)，需要一种控制分步方法。利用修饰的糖基供体以及具有修饰供体特异性的特定糖基转移酶可以获得控制非预期聚合反应的能力。这种修饰酶，用来把修饰的GDP-Man增加到固定的接纳体D-manα(1，2)-R上。随后GDP-Man的甘露糖苷部分的修饰作用将防止下一甘露糖部分的添加，因为对于这种甘露糖苷转移酶的接纳体是D-man-α(1，2)-R而不受D-(修饰的man)-α(1，2)-D-man-α(1，2)-R。该反应之后，洗涤去任何过量的修饰供体和酶，除去修饰基团，由此能够连续重复相同酶促步骤。连续进行这种控制过程直至将预期数量的甘露糖分子装配成为新的糖。所以，修饰基团可以是连结在供体除1位之外任何位置时的化学基团。此后，通过酶促或化学反应选择性地脱去修饰基团，由此释放修饰基团同时不损害复合糖分子。
表6列出了一些目前可利用的糖修饰基团，按照其脱除方法进行分类(Kunz，1997，其全文及其中引用的文献在此引入作为参考)。附加单糖也可以用作修饰基团，因此利用不影响现存复合糖结构的特异性糖苷酶可以将它们脱除(Peieto，1995)。
表6按照其裂解方式分类的可利用糖修饰基团(Kunz and Schultz，1997；和其中引入的参考文献)
所以，具有修饰供体和/或接纳体特异性的酶可以利用直接演化途径制备。随着蛋白工程领域中的最新进展，公开了许多通过直接演化法获得的具有改造特异性的酶的实例(这个领域可以参见Kuchner，1997；Harris，1998，其在此引入作为参考)。通过基因或编码酶基因的区域定向或位点定向诱变的随机顺序产生获得酶特异性的直接演化，随后选择或筛选表现出预期特异性和活性的克隆。譬如，Moore及其同事进行了7个循环的DNA改组来改变对-硝基苄基酯酶对新抗生素底物的底物特异性(Moore，1996)。Zhang及其同事从半乳糖苷酶通过DNA改组进行了岩藻糖苷酶的直接演化(Zhang，1997)。Shan及其同事改组了非天然核苷酸对鲁斯氏肉瘤病毒酪氨酸激酶的特异性(Shan，1997)。Paulson及其同事完成了唾液酸转移酶S-唾液酰基序的突变，改变了供体和接纳体底物的动力学(Datta，1998)。
组合的复合糖库的平行可编址酶促合成下面的部分一步步描述按照本发明教导的组合的复合糖库的酶促制备方法。
酶促组合的复合糖库设计根据本发明，酶促组合的复合糖库设计包括，按照其拟想的应用测定特异性库中包括的复合糖组分。
复合糖组成的测定包含在(？)。
譬如，为了利用本发明的酶促组合的复合糖库来鉴定发挥靶向药物作用的复合糖，所述库的复合糖成员优选是存在于人体细胞中的复合糖的衍生物或修饰物。用由其它来源衍生的其它分子，如特定的人体细胞或其病原体，筛选此类库，可以确保鉴定出新的复合糖，它们能够充当这些分子的受体，在体内用作病原体受体，或参与细胞和细胞之间的识别过程。
同样地，为了利用本发明的酶促组合的复合糖库来鉴定潜在药物，优选按照类似于或相同于人体细胞中所存在的天然复合糖来合成库的复合糖成员。利用由不同天然和合成来源衍生的候选药物筛选此类库，确保了与一种或多种库的复合糖结构结合的候选药物的鉴定。
按照本发明的另一特异性库包含专门用于鉴定候选新药的复合糖。在这种情况中，产生了最大复合糖多样性的库，这种多样性表现出自然界中不曾发现过的复合糖结构。此后，筛选此类库对于病原体或病原体衍生分子的潜在结合作用。另外，筛选此类库对其它致病分子的潜在结合作用。
为了识别已知复合糖中的活性位点结构域，按照本发明制备出表现该复合糖的全部可能性结构域的库。对此类库的结合作用或生物活性的筛选使人们能够鉴定出已知复合糖的活性位点结构域。
为了检测对抗例如癌相关性糖表位(标记)、器官移植相关性糖标记或其它血清中的糖标记所产生的抗体，制备并筛选糖标记的特定联合形式的复合糖库。例如，一个特异性库可以表现数种癌症的糖标记。随后用由人体血清衍生的抗体筛选此类库，鉴定出对一种或多种上述糖标记抗体的存在。
为了描绘与例如癌症或器官移植有关的糖标记，制备并筛选糖成员特定联合的复合糖库，糖成员一般是与此类病症有关的糖标记的结构变型。
其它专用于其它用途的酶促组合的复合糖库也属于本发明最广义的范围内。
酶组件(EM)的建造EM的建造包括对必要酶促反应(ER)、糖基供体和接纳体以及合成库的各种复合糖所需要酶进行评估。EM的建造还包括必要ER的优化和加工开发并且考虑反应的时间、温度和反应物浓度。EM的构建进一步包括确定每个EM所采用的ER的特定次序。
为了保证所采用的合成反应，要为指定库的各个复合糖组分确定酶促反应(ER)的特定顺序。对于直链非分支结构的复合糖，ER的顺序是以分步形式按照这种直链非分支结构的单糖序列的顺序。对于具有分支结构和/或以直链装配排列的重复单糖单元的复合糖，应利用特殊的EM设计独特的合成方法。
下面的实施例提供了选择特定ER的合理性，为特殊复合糖的合成提供专用EM。
图1描述了最终的复合糖结构，并且图4和表7描述了设计方法。按照本发明，可以为指定库存在中的各个复合糖设计EM。下文将作详细说明，在按本发明建库时，当实际中完成了各种EM可以认为有效。
表7包括其给体、接受体和索引的ERs的部分目录
表7(续)
进行
图1所示复合糖合成中的第一步，如图4所示，将第一结构单元GalNAc通过适当的连接体连结在固相支持体(S)上，该连接体将下文中作进一步描述。
图1所示复合糖合成中的第二步(D5，详情参见表7和图4)包括用β(1，3)-半乳糖基转移酶(E.C.2.4.1.112)将Gal从UDP-Gal转移至GalNAc-S。
图1中所示复合糖合成中的第三步(H1，详情参见表7和图4)包括利用β(1，3)N-乙酰基葡糖胺转移酶(E.C.2.4.1.146)将乙酰基葡糖胺从UDP-GlcNAc转移到Gal-β(1，3)-GalNAc-S。
随后，把半乳糖单元而不是岩藻糖单元添加到接纳体上(参见图4)，因为酶β(1，3)-岩藻糖转移酶(E.C.2.4.1.152)对于接纳体Gal-β(1，4)-GlcNAc-R而不是裸露GlcNac具有特异性。
所以，在
图1所示复合糖合成中的第四步中(D7，详情参见表7和图4)，利用酶β(1，4)半乳糖基转移酶(E.C.2.4.1.38)把半乳糖添加到GlcNAc-R上。
经过上述第四合成步骤之后，合成过程被复杂化，因为半乳糖单元分支为两个触角(分枝)。由于这些触角的结构在支化点处等同，但其非还原端不同，所以同时形成两个触角的同一部分的相同分步合成过程将不能保证各触角特定还原端的后继合成。因此，各触角的两个特定部分的合成以各自的分步方式进行。在任何情况中，在所给的实施例中，首先合成β(1，3)支链，因为该触角需要岩藻糖化。如果合成方法是从其它支链开始，就无法实现预期支链的直接岩藻糖化。
所以，在
图1所示复合糖合成中的第五步(H3，详情参见表7和图4)是利用β(1，3)N-乙酰基葡糖胺转移酶(E.C.2.4.1.149)把乙酰基葡糖胺从UDP-GlcNAc转移到Gal-β(1，4)-GlcNAc-R。
在
图1所示复合糖合成中的第六步中(D7，详情参见表7和图4)，利用β(1，4)半乳糖基转移酶(E.C.2.4.1.38)把半乳糖残基添加到GlcNAc-R。
在
图1所示复合糖合成中的第七步中(D3，详情参见表7和图4)，利用α(1，3)半乳糖基转移酶(E.C.2.4.1.151)把附加的半乳糖残基添加到Gal-α(1，4)-GlcNAc-R。
在
图1所示复合糖合成中的第八步中(H14，详情参见表7和图4)，利用β(1，6)N-乙酰基葡糖胺转移酶在Gal[GlcNAc-β(1，3)]β(1，4)-GlcNAc-R接纳体底物上分支化。
图1所示复合糖合成中的第九步(B2，详情参见表7和图4)涉及四个GlcNAc单体中的两个并且利用α(1，3)岩藻糖转移酶(E.C.2.4.1.152)完成将岩藻糖转移至Gal-β(1，4)-GlcNAc-R。
图1所示复合糖合成中的第十步(D7，详情参见表7和图4)进一步用β(1，4)半乳糖转移酶(E.C.2.4.1.38)在GlcNAc-R接纳体底物上完成第二触角的延伸。
在
图1复合糖合成中的第十一步中(A3，详情参见表7和图4)中，利用α(2，3)唾液酸转移酶(E.C.2.4.99.6)将唾液酸单体以α(1，6)取向附加在触角的Gal-α(1，4)GlcNAc-R。
图1所示复合糖合成中第十二步(A6，详情参见表7和图4)进一步利用(2，8)唾液酸转移酶(E.C.2.4.99.8)完成这个触角的延伸，由此在NeuAC-α(2，3)-Gal-R底物接纳体上附加另一个NeuAC单元。
这个触角的进一步延伸需要利用对NeuAC-α(2，8)-NeuAC-R底物接纳体具有特异性的(2，8)聚唾液酸转移酶。不幸的是，利用此类酶的酶促反应将导致多个唾液酸单体的不可控聚合反应而不是预期的单一唾液酸单体的附加。在各个ER步骤中单一唾液酸单体的可控附加必须采用具有修饰供体特异性的酶。所以，代替CMP-NeuAC用作供体底物，这种修饰的酶在聚糖末端掺杂修饰基团。该修饰基团的存在防止了不需要的多个唾液酸单体的聚合，因为这种酶无法将唾液酸附加在接纳体NeuAC(修饰)-α(2，8)-NeuAC-R上。在ER的最后步骤中脱去修饰基团。
所以，在
图1所示复合糖合成中的最后步骤中(A7，详情参见表7和图4)，修饰酶α(2，8)聚唾液酸转移酶与修饰的供体CMP-NeuAC和接纳体NeuAC(修饰)-α(2，8)-NeuAC-R合用，由此生成
图1所示的复合糖。
下表8概述了
图1所示复合糖的合成步骤，如图4所示。表8
为提供预期ER的ER选择是利用考虑复合糖结构和可利用的ER的计算机算法产生的。此类算法可以很容易地由所属领域普通技术人员根据多种可利用糖基转移酶糖苷酶和转糖基酶的供体-接纳体特异性来编程。
自动化合成和筛选按照本发明组合的复合糖库的建造中所采用的EM利用自动化技术实现了键合在固相支持体上的组合的复合糖库的制备。按照本发明的优选实施方案，利用自动化技术也可以实现筛选，鉴定出与感兴趣探针交叉反应的生物活性复合糖。
特定库的每一种复合糖的不同结构特征需要大批特殊合成方案。所以，本发明所述的库适宜于由平行合成法产生，其中优先考虑保证执行最少数量的步骤。例如，机器人系统容许来自试剂容器的试剂的平行可编址分配。在这样的情况中，最低数量的步骤意味着各个试剂容器以最少的次数选派。因此，应考虑合成步骤的顺序，保证通过以最低次数选派各个试剂容器来完成库的全部复合糖的合成。所属领域普通技术人员可以很容易开发出专用算法，设计出满足上述要求的自动库的合成方案。事实上，已经为低聚核苷酸(Pease，1994)和肽(Fodor，1991)在微片上的平行可编址合成开发出了类似算法(它们在此全文引入作为参考)。
在过去的数年中已经广泛开发了能够自动高通量平行可编址的合成技术。可以控制并且同时可以进行多种不同的固相合成方案的自动合成仪现在可以购得(Rivero，1997)。这些技术按照合成所采用的固相底物的种类、试剂引入和除去的方法以及反应室的设计来划分。
能够自动高通量固相平行合成的技术可以按照本发明应用。此类技术包括，例如(i)开放式反应器系统(例如常规微量滴定平板)；(ii)密闭反应器系统或半密闭反应器系统(例如lab-on-chip)；(iii)反应封闭系统(reaction block systems)；(iv)在聚合物针上合成；(v)在聚合物薄片上合成；和(vi)在微嵌片上合成。有关这些技术和系统的全面评述参见Cargil，1997，其在此全文引入作为参考。
固相支持体按照本发明这些库优选在固相支持体上合成。所以，第一个建筑块为与支持体结合提供适当的官能团。适用的结合基团包括羟基、羰基、羧基、胺、卤化物、硫醇、酯、硼酸酯、甲硅烷氧基、氮杂、氧代、环氧乙烯或任何不饱和基团。
若干种固相基质支持体非常适合制备生产本发明的糖库，例如但不限于，用二乙烯基苯交联的聚苯乙烯(Merrifield，1963)、聚乙二醇-聚苯乙烯嵌段共聚物(PEG-PS，Bayer，1991)、聚酰胺(Dryland，1986)、聚丙烯酰胺(Ashardy，1979)、聚甲基丙烯酰胺(Hsiau，1997)和纤维素(Frank，1988)。通过标准半导体加工工艺生产的微装配的基于硅的阵列(Fodor，1991；Sosnowski，1997；Cheng，1998，U.S.Pat.Nos.5,643,738；5,681,484；and 5,585,069)也可以用作固相支持体。
在固相支持体上连接第一个糖建筑块第一个糖建筑块优选经过一个原子(例如固相官能团)或连接体以共价方式连接在固相基质上。连接体的一般特性包括具有能够连接固相支持体和起始建筑块的双官能团，并由此确定结构(Atherton，1989)。由于酶对固定糖的可接近性非常重要，所以连接体长度和柔性是高收率的关键。所以，按照本发明适于合成的连接体可以包括，例如氨基酸、肽、非糖基化蛋白质、脂质、脂质A、神经酰胺、多萜醇磷酸酯、环糊精、低聚糖、单糖、烷基链、核酸或其它间隔分子。这些连接体可以可裂解或不可裂解的，并且可以由简单、复合、环状或分支的实体组成。
库排列按照本发明库组分的优选排列采取在固相支持体上以各种几何形式和设计合成的阵列，例如二维阵列、多层阵列、三维阵列(例如堆积微量滴定)，和在球形圆盘或锥形上表现的阵列。另外，库组成可以连结在反应室(开放或密闭)中的聚合物珠粒上并且排列在二维或三维支持体上。按照本发明可以采用任何能够易化EM收集的自动可编址操作的排列。优选关注库的复合糖的空间分布以确保多数相似糖之间距离最短，由此保证自动合成过程的效率。微流体系可以并且优选被采用(U.S.Pat.Nos.5,643,738；5,681,484；和5,585,069)。
自动库筛选所属领域常用的多种筛选技术和方法可以应用来筛选本发明的复合糖库。有关综述可以参见Broach，1996和Burbaum，1997，其在此全文引入作为参考。所以，适合结合或生物活性的高通量筛选技术可以基于(i)放射性检测方法；(ii)荧光检测方法；(iii)以ELISA为基础的检测方法；和(iv)利用报道基因基于细胞的试验体系。
可以检测与指定库的复合糖相结合的放射性标记探针，例如通过闪烁接近测定法(SPA，Cook，1996)。SPA的主要优点在于(i)不需要除去游离放射标记分子；和(ii)易于自动化。还可以采用其它方法，例如荧光法，或者利用荧光标记的键合分子的直接荧光检测，或者例如采用均匀时间分辨荧光(Homogenous Time-ResolvedFluorescence)(HTRF，Mathis，1995)或荧光偏振测定(PFA)技术(Checovich，1995)。上述后面的技术的主要优点在于能够利用“混合并测量”的方案，无需增加其它复杂步骤。此外，许多酶联免疫吸附法(ELISA)检测法也可以用于本发明。
按照本发明库的各种复合糖的生物活性和结合能力可以利用基于细胞的试验体系来评估。人们深入研究了适合高通量筛选的基于细胞的试验体系，并且介绍了选择适当筛选体系的准则(Rose，1996)。利用哺乳动物和昆虫细胞以及酵母和细菌细胞的试验体系业已被详尽公开(Broach，1996；Rose，1996；Suto，1997)。
一种最常用来检测细胞内表达的分子和能够结合此类细胞的配体之间的相互作用的方法是采用报道基因。这包括将将具有报道基因的编码序列的靶向基因的转录控制因子剪接到载体中，将该载体引入适当的细胞系，从而建立对靶向的调制有响应的检测体系，在这种情况中采用来源于可编址库的复合糖。报道基因的普通实例是酶，例如碱性磷酸酶、氯霉素乙酰转移酶、萤火虫和细菌的荧光素酶和β-半乳糖苷酶。利用比色、化学发光和生物发光检测法可以检测出这些酶的低水平活性。还可以采用非酶报道基因例如绿色、红移和蓝色荧光蛋白(Phillips，1997)。
所以，按照本发明的一个方面提供一种组合的复合糖库。按照本发明组合的复合糖库包括多种的可编址复合糖结构。
按照本发明的另一方面提供一种制备可编址组合的复合糖库的方法。按照本发明通过酶促合成多种的复合糖结构实施该方法，其各自连结在固相支持体的多种位置的至少一个可编址位置，得到可编址组合的复合糖库。
在本说明书和后面的权利要求书部分中所用的术语“可编址”和“编址的”是指定位和同一性。所以，按照本发明库的复合糖结构的定位和同一性(组成)预先已知并且因此可以编址糖结构。应理解短语“复合糖结构”是指多数复合糖分子均具有相同结构并且位于固相支持体上的特定和可编址位置上。
按照本发明库的可编址复合糖结构优选经连接体(间隔基)连接在固相支持体上。按照本发明优选实施方案连接体包括至少两个连接共价键，并且长度至少为20埃。适用的连接体包括，但不限于氨基酸、肽、非糖基化蛋白、脂质、神经酰胺、多萜醇磷酸酯、环糊精、低聚糖、单糖、烷基链和核酸(例如低聚核苷酸)。
按照本发明库的复合糖结构所连结的固相支持体包括可编址微粒或珠粒，或扁平平台。可编址微粒或珠粒排列在例如微量滴定平板的孔中。另外，微量滴定平板、薄膜或嵌片(例如聚硅氧烷嵌片)按照本发明可以用作扁平平台固相支持体。
按照本发明目前的优选实施方案，固相支持体为嵌片，并且多种可编址复合糖结构的不同复合糖结构在嵌片的表面上形成彼此间隔(中心之间)不超过2.25mm的斑片，因此提供了密度为至少为每平方厘米20个不同可编址的复合糖结构。
制备固相支持体的物质可以是，例如用二乙烯基苯交联的聚苯乙烯、聚乙二醇-聚苯乙烯嵌段共聚物、聚酰胺、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、纤维素、玻璃、石英、塑料或二氧化硅。
按照本发明的优选实施方案，本发明库的多种可编址复合糖结构的至少一种、优选至少三种、更优选至少10种、更优选至少100种、更优选至少1000种包含至少2、3、4或至少5个或更多的单一种类的连接糖单元。上述此类结构由于不受控聚合反应难以进一步详述和决定。
按照本发明的另一优选实施方案，本发明库的多种可编址复合糖结构的至少一种、优选至少三种、更优选至少十种、更优选至少100种、更优选至少1000种包含至少1、2、3、4或至少5个或更多的支链。
按照本发明的另一优选实施方案，至少1、2、3或至少4个支链形成相同核心和分支的糖单元。上述此类结构的进一步详述和决定比较困难，尤其是如果连结到各支链上的触角与糖单元组合物不同时。
按照所述优选实施方案中的其它特征，多种可编址复合糖结构的至少一种、优选至少三种、更优选至少十种、更优选至少100种、更优选至少1000种包含至少4个、优选至少5个、更优选至少7个、更优选至少9个、更优选至少10个、更优选至少12个、更优选至少15、20、25或至少30个、更优选至少50或更多个糖单元。
根据其预期用途，如下文所述，本发明库的多种可编址复合糖结构可以是含有非天然或天然复合糖的代表，例如衍生自人体来源，如人类的组织、细胞或体液。另外，可编址复合糖结构的多元性可以是至少一种天然复合糖的结构域(片段)的代表。如下所述，这样的库可以用来鉴定天然复合糖的活性位点。
按照本发明的另一方面，提供一种鉴定能够结合实体的复合糖的方法。按照本发明的这个方面，该方法是通过提供任一本发明所述实施方案的可编址组合的复合糖库并且用实体筛选该可编址组合的复合糖库，鉴定出能够结合该实体的复合糖。
如下文所例举的，任何实体都可以用来筛选本发明的可编址组合的复合糖库。例如，所述实体可以是生物活性物质的候选物，例如由天然或合成来源衍生的候选药物。在这种情况中，按照本发明的这个方面，该方法可以用来鉴定出是该生物活性物质的候选物目标的复合糖。另外，所述实体可以是结合特异性天然复合糖的配体。在这种情况中，可编址组合的复合糖库可以是该特异性天然复合糖的结构域的代表，而该方法此时可以用来鉴定出结构域中与该配体结合的特异性结构域，由此鉴定出天然复合糖的活性位点。
按照本发明的另一方面，提供一种诊断以自身或非自身复合糖结构和抗体的诱导为特征的疾病的方法。按照本发明的这个方面，该方法利用在此所述的任何库合成方法提供代表自身和/或非自身复合糖的可编址组合复合糖库。可编址组合的复合糖库此后与从被怀疑患有所述疾病的患者获得的抗体反应，由此产生结合抗体的位置的图式，通过将该图式与健康个体特有的已知图式比较，诊断出该疾病。
与产生或引入自身和/或非自身复合糖结构有关的已知疾病包括，但不限于，肿瘤发生、转移、妊娠、血管疾病、心脏病、神经变性疾病、自身免疫性疾病和器官移植。神经变性疾病包括但不限于帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、基底神经节变性疾病、运动神经元疾病、羊迟发性病毒感染(Scrapie)、海绵状脑病和Creutzfeldt-Jakob氏病、不育症、变应性、胚胎发生、细胞编程性死亡和神经变性疾病。
下面是一些在筛选通过本发明方法所产生的特异性库时采用的策略。
所以，为了鉴定复合糖受体、有关蛋白质、凝集素和/或靶向药物，由人体细胞产生的已知复合糖结构和由还原作图产生的新糖结构组成的酶促组合复合糖阵列用多种标记探针进行了筛选，所述探针来源于例如标记的人体组织匀浆、标记受体、由EST保藏标本编码的标记蛋白质、标记的重组蛋白质、噬菌体显示库，由人体组织、病原体或溶液获得的标记细胞，该溶液含有从人体组织来源或致病细胞获得的标记蛋白分子的混合物。此类筛选的目的在于鉴定由上述来源获得的、特定地结合库的复合糖的标记分子。分离和定性之后，这些分子可以进一步作为药物治疗潜在的候选物或药物治疗的靶进行试验。这些策略也可用于鉴定与库的特定复合糖组分相结合的新受体、凝集素或任何蛋白质或分子。
为了鉴定出结合特定复合糖的先导化合物，可以针对不同组的标记分子筛选酶促组合物的复合糖库，这些库由人体细胞的已知复合糖结构或新的糖结构组成，其中新的糖结构是由正常和/或致病细胞或病原体的还原作图产生。这种筛选的目的在于更清楚地了解复合糖在发现它们的细胞中或细胞上与其各自配体之间的特定相互作用。被分离和定性的配体随后可以用作重要生物活性的调制剂，例如细胞和细胞之间的通讯、细胞识别、细胞发育和肿瘤细胞转移。
为了鉴定出新的生物活性复合糖，按照本发明，制备由多种阵列的复合糖结构组成的复合糖库，包括自然界中未发现的结构。然后用基于细胞的试验体系，或用规定的人体或微生物标记的靶分子(如凝集素或受体)，筛选该复合糖库。这样的筛选能够鉴定出新的基于复合糖的候选药物。另外，这样的筛选能够鉴定出与疾病相关的复合糖。这些疾病相关性复合糖可以用来诱导其抗体，此后用抗体鉴定和分离锚泊该疾病相关性复合糖的糖蛋白，由此鉴定出与该疾病有关的新蛋白质和基因。
为了鉴定出已知或新的复合糖的活性位点，按照本发明，制备包含这种特定复合糖的全部可能结构域片段的库。因此，此后可以用标记受体筛选这些结构域片段，所述受体正常结合包含此类结构域的复合糖。由此获得各结构域片段的结合特异性，从而能够分离特定复合糖引发该结合活性的结构域片段，即活性位点。这个目的可以在多个充分定性的复合糖-受体对并列中完成。
本发明还能够图示患者血清中发现的抗其自身或非自身糖标记的抗体。因此，按照本发明，合成含有多种阵列的存在于患者血清中的糖标记的复合糖库。随后，对由该患者获得的血清抗体的标记库筛选这个库，所得产生抗体的性能可以用作癌症和器官移植相容性的预诊断工具。
特定阵列的糖抗原也可以用来鉴定新的与癌症、心血管疾病或器官移植有关的糖标记。按照本发明用得自不同群体的标记血清抗体筛选此类糖抗原阵列。可以把患病个体的抗体性能与健康群体的性能进行比较。这种对比提供了抗体的独特性能，其与对该病症的免疫应答有关，由此，特定的复合糖与该性能独特的抗体反应，产生该特定疾病的诊断标记。
本发明的其它目的、优点和新的特征在考察下列实施例以后对于所属领域普通技术人员来说变得更加清楚，这些实施例不起限定作用。另外，在上文中描述并且在下面的权利要求书部分请求保护的本发明的多种实施方案和方面分别得到下列实施例的实验支持。
实施例下列的实施例现供参考，这些实施例结合上面的说明书，以非限定方式举例说明本发明。
下列实施例详细描述了利用一组特别选择的酶合成的复合糖的结构。通常，在此所用的名称和下文中的生化试验方法是所属领域中熟知和常用的。所以，应理解所属领域普通技术人员很容易实施下面的合成方法。
鉴于发现糖蛋白的糖残基在控制细胞功能和细胞识别中发挥重要作用，病理学状态下糖功能的研究已经提出某些复合糖成为肿瘤特异性标记的任务(Orntoft，1995)。蛋白糖基化中的巨大变化几乎发生在各种癌中(Hakomori，1989)，其常常反映出生物合成途径中的变化。
譬如，封阻糖基化生物合成途径会导致结构的超量产生，这些结构在正常细胞中通常发现少量。此外，糖基化途径的改变可能导致其它途径的利用，也就是说，导致新复合糖结构的形成，正常情况下在细胞中或细胞上不存在这些新复合糖结构。细胞中糖基化途径的这种调节通常可以归因于糖基转移酶的活性。
不同肿瘤组织的糖蛋白的改变了的糖结构被认为是肿瘤细胞异常行为的基础，所述行为包括肿瘤细胞转移和侵入健康组织(Kobata，1998)。
肿瘤标记对于恶性细胞的诊断和治疗非常重要。蛋白标记可以是由肿瘤细胞呈现的任何特定表位，例如肽、糖肽、糖脂或其任何联合形式。利用单克隆抗体可以特异性地鉴定出这些独特的表位，所以此类独特的糖基化模式作为癌症免疫疗法和诊断的潜在肿瘤标记已经并正在继续得到深入研究(Ronin，1998)。
本发明使肿瘤标记不但能够在免疫疗法或诊断学中应用，也可以在药物治疗中作为潜在的靶。至此，含有肿瘤特异性复合糖(TSCC)和正常糖结构的组合阵列能够通过鉴定那些与肿瘤病症有关的复合糖结构特异性和专一性地结合的分子分离出新的候选药物。
实施例1肺癌是一种几乎流行的疾病。在1990年记录了约157000个新病例引起142000人死亡(Faber，1991)。非小细胞肺癌(NSCLC)型的鳞状肺癌(SLC)占全部肺癌的约35％。它与吸烟有密切关系，被诊断的大多为男性。鳞状癌起源于肺的中央和肺门区并且当在外周位置发现时可能成穴。它被分为重度和恶性形式的癌症。虽然区别很小，SLC显示与膜结合糖蛋白和粘蛋白样分子有关的独特复合糖抗原，其在循环系统中释放并且用作血清标记(Martensson，1988)。
下表描述了合成复合糖库所必需的组分和酶组件(EM)，该库可用于筛选和分离特异性结合SLC标记的化合物、蛋白质或其它分子。此类分子可以作为潜在的新候选药物或用于防止鳞状肺癌迁移的药物。
表9-10表示释放至循环系统中的SLC糖链的异常结构的复合糖(标记的A1、A2、A3、A8、A9和A10)，由此类SLC糖链衍生的所有可能片段(分别通过al、a2、a3、a8、a8和al0与A1、A2、A3、A8、A9和A10连结)，正常血液抗原(标记的A4、A5、A6、A7、A11和A12)和所有可能的由其衍生的正常血液抗原片段(分别通过a4、a5、a6、a7、al1和al2与A4、A5、A6、A7、A11和A12连结)。
表9 表10
表10(续) *α-L-rucp-(1+4)-β-D-GlcpNAc-(1+3)-β-D-Galp-(1+4)-β-D-GlcpNAc-(1+3)-β-D-Galp-(1+4)-D-Gle表10(续) 表10(续) 表10(续) 表10(续) 表10(续) 表10(续)
表11包括合成表9-10中所述复合糖集合所需的EM的列表。表11
表11(续)
表11(续)
表11(续)
表11(续)
实施例2人绒毛膜促性腺激素(hCG)是一种由胎盘的滋养层细胞产生的糖蛋白激素。在从多种滋养层疾病的患者采集的血液和尿样中可以检测到高水平的hCG。所以，尿和血清的hCG水平已经作为有效标记用于滋养层疾病的诊断和预后，并且成为妊娠的标记。由妊娠妇女尿中提纯的hCG所释放的复合糖与由患有滋养层疾病的患者采集的尿提纯的那些复合糖的对比研究揭示出，由后者提纯的hCG的糖链存在若干变化(Mizuochi，1983；Endo，1987)，表12-14表示合成用于筛选和分离特异性结合异常hCG标记及其亚片段的分子的复合糖库所需要的组分和EM。表12～13列出了掺杂在hCG特定阵列中的复合糖结构。此类结构包括恶性滋养层疾病中存在于此类hCG中表示的异常糖链(标为B5、B6、B7和B8)，恶性滋养层疾病中存在于此类hCG的所有可能片段化糖链(分别通过b5、b6、b7和b8与B5、B6、B7和B8连结)，通常在妊娠妇女尿中存在的hCG内发现的正常糖链(标为B1、B2、B3和B4)及其全部可能片段(分别通过b1、b2、b3和b4与B1、B2、B3和B4相连)。表14表示合成表12-13的复合糖所需要的EM集合。表12
表13
表13(续) 表13(续) 表13(续)
表14包括合成表12-13中所述复合糖集合所需的EM的列表。表14
表14(续)
表14(续)
实施例3在本世纪的后半叶中，业已证实许多细菌、真菌和植物多糖具有抗病毒、抗凝集、抗血栓、抗心血管和抗肿瘤活性(Witczak，1997)。还发现，通用结构模式适用于所有的这些复合糖。这些复合糖的多数包括一个或两个重复的单糖单元，其通过一种或两种糖苷键相连并且被恒定长度的分支点修饰。
表15概括了此类独特结构的部分实例。表15
粘度研究和X射线分析揭示，可能螺旋和三螺旋结构产生上述活性(Misaki，1997)。然而，进一步的研究证实，由这些复合糖的不完全水解衍生的片段也具有某些治疗活性(Misaki，1980)。
因此，本发明可以用来筛选包含由上述复合糖衍生的短低聚物的组合低聚糖库。例如，所述片段可以包含一个或两个通过一种或两种糖苷键彼此相连的重复单糖单元。当需要时，此类片段也可以含有适当分支。多糖的这种组合阵列可以用来分离新的抗病毒、抗凝集、抗血栓形成、抗心血管和抗肿瘤剂。
实施例4下面的实施例表示包括β(1，3)D-葡萄糖和β(1，6)葡萄糖支链的合成复合糖。所示各个低聚体含有7个单体。应理解包含2至30个或更多单元组成的低聚体也可以通过在此所述的本发明方法合成。 实施例5下面的实施例表示由β(1，3)D-葡萄糖单元的主链和α(1，5)-阿糖支链组成的合成复合糖，所述支链位于主链上任何所需的位置。如下所示的每个低聚体含有12个单体。应理解由2至40或更多单元组成的低聚体也可以通过本发明的方法合成。
实施例6下面的实施例表示由在3位带有分支或第二硫酸酯单元的α(1，2)连接的α-L-岩藻糖或α-L-岩藻糖-4-硫酸酯组成的合成复合糖。如下所示的每个低聚体包含6个糖单体。应理解由2至20或更多单元组成的低聚体也可以通过本发明的方法合成。 实施例7下面的实施例代表由(1，3)-连接的α-D-甘露糖或在2和/或6位硫酸化的α-D-甘露糖组成并且包含β(1，2)木糖残根的合成复合糖。如下所示的每个低聚体包含5个糖单体。应理解由3-20或更多单元组成的低聚体也可以通过本发明的方法合成。 实施例8下面的实施例表示由α(1，5)D-阿糖和α(1，2)D-甘露糖单元组成的合成复合糖，所述甘露糖单元带有α-D-阿糖单元的核心，该核心与α-D-阿糖在2位相连或与α-D-甘露糖单元在任意位置相连。如下所示的每个低聚体包含9个糖单体。应理解由2至70或更多单元组成的低聚体也可以通过本发明的方法合成。1α-D-Manp-(1+2)-α-D-Manp-(1+2)-β-D-Araf-(1+2)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Manp-(1+2)-α-D-Manp-(1+5)-α-D-Araf2α-D-Manp-(1+2)-α-D-Manp-(1+2)-β-D-Araf-(1+2)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+2)-α-D-Manp-(1+5)-α-D-Araf...nα-D-Manp-(1+2)-α-D-Manp-(1+2)-β-D-Araf-(1+2)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf-(1+5)-α-D-Araf实施例9下面的实施例表示由α-1，5-D-阿糖和连结在单核心β-D-阿糖单元上的α-1，2-D-甘露糖单元组成的合成复合糖，β-D-阿糖单元与α-D-阿糖单元在2位或与α-D-甘露糖单元在任意位置相连。该复合糖还包含分支的β-D-阿糖，其位于3位。支链触角包括一个核心β-D-阿糖单元作为主要低聚体，该单元与α-D-阿糖单元在2位或与α-D-甘露糖单元在任意位置相连。如下所示的每个低聚体包含14个糖单元。应理解由2至70或更多单元组成的低聚体也可以通过本发明的方法制备。 复合糖库的合成下面的实施例详细描述了证明本发明所教导的复合糖库的顺序酶促合成的实验。
材料和方法下文所用的缩写BSA-牛血清白蛋白；GlcNAc-N-乙酰基葡糖胺；PNP-GlcNAc-p-硝基苯基-N-乙酰基-β-D-GlcNAc；GlcNAc-COOH-2-(2-羧乙基硫基)-乙基2-β-D-GlcNAc；NHS-N-羟基琥珀酰亚胺；EDC-1-乙基-3-(3二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺；O.D.-光密度；WGA-小麦胚凝集素；RCA120-由蓖麻获得的凝集素；BS-I-得自Bandeiraea Simplicifolia的凝集素；TGP-得自Tereagonolobuspurpuras的凝集素；TML-得自mobilensis三毛滴虫的凝集素；ECorA-得自龙芽菜的凝集素；FITC-荧光素异硫氰酸酯。
通用材料PBS-0.1M磷酸盐缓冲液pH7.5，0.15M NaCl(SigmaS-7653)；TBS-50mM Tris/HCl pH7.5(Sigma T-6791)，0.15M NaCl；TBST-TBS，0.05％吐温20(Sigma P-9416)；高离子强度洗涤缓冲液-PBS，2M NaCl，60mM MgSO4，0.05％吐温20。过氧化物酶底物溶液通过在水中混合邻亚苯基二胺二盐酸盐，0.4mg/ml，过氧化氢脲，0.4mg/ml，磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，0.05M(由SIGMA FAST过氧化物酶底物试剂盒P-9187制备)制成。Covalink NH购自NUNC(Cat.No.478042)。光密度和荧光用多标记计数器VICTOR2(Wallac OY，Finland)测量。所有微量滴定平板的培育是在受控振荡速度和温度下利用购自Anthos Thermostar Shaker/Incubator，Rosys Anthos GmbH SalzburgAustria(Cat.No.8850001)的微量滴定平板培养箱进行。
通用酶促反应混合物和条件(ER)D7100μl的50mM MOPS(SIGMA M-9027)、10mg/ml BSA(SIGMAA-7030)、20mM MnCl2(SIGMA M-9522)、0.5mg/ml UDP-Gal(Calbiochem670111)和20毫单位/ml的重组β1，4-半乳糖转移酶(Calbiochem345650)在pH7.4下加入到微量滴定平板的各孔中，平板在50RPM、37℃下振荡4小时。培育后，移出反应混合物，孔用200μl的TBST冲洗三次，最后一次冲洗包括浸泡15分钟。用TBS 0.2％NaN3(SigmaS-8032)代替TBST，将平板储藏在4℃下以备后继的酶促反应。
A2100μl的50mM MOPS(SIGMA M-9027)、l0mg/ml BSA(SIGMAA-7030)、0.5mg/ml CMP-NeuAC(Calbiochem 233263)和5毫单位/ml的重组α2，3(N)-唾液酸转移酶(Calbiochem 566218)在pH7.4下加入到微量滴定平板的各孔中，平板在50RPM、37℃下振荡4小时。培育后，移出反应混合物，孔用200μl的TBST冲洗三次，最后一次冲洗包括浸泡15分钟。用TBS 0.2％NaN3(Sigma S-8032)代替TBST，将平板储藏在4℃下以备后继的酶促反应。
B2100μl的50mM MOPS(SIGMA M-9027)、10mg/ml BSA(SIGMAA-7030)、20mM MnCl2(SIGMA M-9522)、0.5mg/ml GDP-Fuc(Calbiochem371443)和5毫单位/ml的重组α1，3-岩藻糖转移酶(Calbiochem344323)在pH7.2下加入到微量滴定平板的各孔中，平板在50RPM、37℃下振荡4小时。培育后，移出反应混合物，孔用200μl的TBST冲洗三次，最后一次冲洗包括浸泡15分钟。用TBS 0.2％NaN3(SigmaS-8032)代替TBST，将平板储藏在4℃下以备后继的酶促反应。
D3100μl的100mM二甲基胂酸钠缓冲液(SIGMA C-4945)、10mg/ml BSA(SIGMA A-7030)、20mM MnCl2(SIGMA M-9522)、0.5mg/mlUDP-Gal(Calbiochem 670111)和5毫单位/ml的重组α1，3-半乳糖转移酶(Calbiochem 345648)在pH6.5下加入到微量滴定平板的各孔中，平板在50RPM、37℃下振荡4小时。培育后，移出反应混合物，孔用200μl的TBST冲洗三次，最后一次冲洗包括浸泡15分钟。用TBS 0.2％NaN3(Sigma S-8032)代替TBST，将平板储藏在4℃下以备后继的酶促反应。
A3100μl的50mM二甲基胂酸钠缓冲液(SIGMA C-4945)、10mg/ml BSA(SIGMA A-7030)、0.5mM CMP-NeuAC(Calbiochem 233263)和5毫单位/ml的重组α2，6-(N)-唾液酸转移酶(Calbiochem 566222)在pH6.0下加入到微量滴定平板的各孔中，平板在50RPM、37℃下振荡4小时。培育后，移出反应混合物，孔用200μl的TBST冲洗三次，最后一次冲洗包括浸泡15分钟。用TBS 0.2％NaN3(Sigma S-8032)代替TBST，将平板储藏在4℃下以备后继的酶促反应。
H3100μl的50mM二甲胂酸钠缓冲液(SIGMA C-4945)、20mMMnCl2(SIGMA M-9522)、10mg/ml BSA(SIGMA A-7030)、5％二甲基亚砜、0.5mM UDP-GlcNAc(Calbiochem 670107)、0.75mmol三磷酸腺苷和5毫单位/ml的重组β1，3 N乙酰基葡糖胺转移酶(按照Zhou等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.96 pp.406-411所述方法制备)在pH7.0下加入到微量滴定平板的各孔中，平板在50RPM、37℃下振荡10小时。培育后，移出反应混合物，孔用200μl的TBST冲洗三次，最后一次冲洗包括浸泡15分钟。用TBS 0.2％NaN3(SigmaS-8032)代替TBST，将平板储藏在4℃下以备后继的酶促反应。
当酶促反应在含有共价偶联单糖的Covalink NH平板中进行时，反应混合物的BSA被省略，洗涤步骤用高离子强度缓冲液代替TBST进行。
凝集素/抗体结合试验WGA取100μl 5μg/ml的与过氧化物酶偶联的WGA凝集素(SIGMAL-3892，150个过氧化物酶单位/mg蛋白)加入微孔滴定平板中，在25℃下于含有1％BSA和分别10mM的MnCl2和CaCl2的TBS中培养1小时，孔用200μl TBST洗涤三次，最后一次包括浸泡15分钟。为了检测过氧化物酶标记的WGA，加入100μl的新制过氧化物酶底物溶液，1小时后(在450nm下)测定溶液的O.D.。
RCA120取100μl 10μg/ml的与过氧化物酶偶联的RCA120凝集素(SIGMA L-2758，11个过氧化物酶单位/mg蛋白质)加入微孔滴定平板中，在25℃下于含有1％BSA和分别10mM的MnCl2和CaCl2的TBS中培养1小时，孔用200μl TBST洗涤三次，最后一次包括浸泡15分钟。加入100μl的新制过氧化物酶底物溶液，1小时后(在450nm下)测定溶液的0.D.。
TGP取100μl 20μg/ml的与过氧化物酶偶联的TGP凝集素(SIGMAL-1508，10个过氧化物酶单位/mg蛋白质)加入微孔滴定平板中，在25℃下于含有1％BSA和分别10mM的MnCl2和CaCl2的TBS中培养1小时，孔用200μl TBST洗涤三次，最后一次包括浸泡15分钟。加入100μl的新制过氧化物酶底物溶液，1小时后(在450nm下)测定溶液的O.D.。
BS-I取100μl 20μg/ml的与生物素偶联的BS-I(SIGMA L-3759)加入微孔滴定平板中，在25℃下于含有1％BSA和分别10mM的MnCl2和CaCl2的TBS中培养1小时，孔用200μl TBST洗涤三次，最后一次包括浸泡15分钟，随后将100μl的含有1％BSA和5μg/ml与过氧化物酶偶联的抗生物素蛋白(SIGMA A-3151，40个过氧化物酶单位/mg蛋白)的TBS加入微孔滴定平板中，在25℃下培养1小时。孔用200μlTBST洗涤三次，最后一次包括浸泡15分钟。加入100μl的新制过氧化物酶底物溶液，1小时后(在450nm下)测定溶液的O.D.。
TML取100μl 20μg/ml的与生物素偶联的TML(Calbiochem431803)加入微孔滴定平板中，在25℃下于含有1％BSA的TBS中培养1小时，孔用200μl TBST洗涤三次，最后一次包括浸泡15分钟，随后将100μl的含有1％BSA和5μg/ml与过氧化物酶偶联的抗生物素蛋白(SIGMA A-3151，40个过氧化物酶单位/mg蛋白)的TBS加入微孔滴定平板中，在25℃下培养1小时。孔用200μl TBST洗涤三次，最后一次包括浸泡15分钟。加入100μl的新制过氧化物酶底物溶液，1小时后(在450nm下)测定溶液的O.D.。
抗唾液酸Lewis X取100μl 10μg/ml的得自小鼠的抗唾液酸Lewis X IgM(Calbiochem 565953)加入微量滴定平板中，在25℃下于含有1％BSA的TBS中培养1小时。孔用200μl TBST洗涤三次，最后一次包括浸泡15分钟，随后，将含有1％BSA和100μl 5μg/ml与生物素偶联的山羊抗小鼠IgM(SIGMA b-9265)加入微量滴定平板中并在25℃下培养1小时。孔用200μl TBST洗涤三次，最后一次包括浸泡15分钟，随后用100ml的含有1％BSA和5μg/ml与过氧化物酶偶联的抗生物素蛋白(SIGMA A-3151，40个过氧化物酶单位/mg蛋白)的TBS在25℃下培养1小时。孔用200μl TBST洗涤三次，最后一次包括浸泡15分钟。加入100μl的新制过氧化物酶底物溶液，1小时后(在450nm下)测定溶液的O.D.。
EcorA取100μl 20μg/ml的与生物素偶联的ECorA(SIGMA L-0893)加入微量滴定平板中，在25℃下于含有1％BSA和分别10mM的MnCl2和CaCl2的TBS中培养1小时，孔用200μl TBST洗涤三次，最后一次包括浸泡15分钟，随后，将100μl的含有1％BSA和5μg/ml与过氧化物酶偶联的抗生物素蛋白(SIGMA A-3151，40个过氧化物酶单位/mg蛋白)的TBS加入微孔滴定平板中，在25℃下培养1小时。孔用200μl TBST洗涤三次，最后一次包括浸泡15分钟。加入100μl的新制过氧化物酶底物溶液，1小时后(在450nm下)测定溶液的O.D.。
当上述结合试验在共价偶联单糖接纳体上进行时，例如使用Covalink NH平板，用TBST代替TBS培养液，并且用高离子强度缓冲液代替TBST进行洗涤步骤。
实施例10接纳体的固定—第一步减少本发明实施将单糖接纳体固定在微量滴定平板上的若干方法是完善的。单糖接纳体通过连接体结合在微量滴定平板表面上，并且利用凝集素或直接抗合成复合糖的抗体测定结合效率，如上文所述。
第一个单糖接纳体结构单元的平板固定通过以下方法进行(i)令新糖蛋白BSA-GlcNAc(β-D-GlcNAc偶联至BSA)吸附在微量滴定平板表面；或(ii)利用适当连接体共价固定。采用氰尿酰氯活化(图5)或NHS/EDC活化(图6)CovaLink NH进行上述共价固定。氰尿酰氯活化的应用能够在各个延伸循环中使连接体延长约1.5纳米。按照凝集素结合试验、利用偶联至过氧化物酶或FITC的WGA凝集素测定固定单糖(GlcNAc)的存在。用比色法或荧光信号检测法定量结合作用，如图7a-c所示。
材料和方法和BAS偶联的GlcNAc在Maxisorb平板上的吸附含有0-3000ng的BSA-GlcNAc(按照MoRsigny等.，Biol.Cell，51，187 1984所述方法制备)的0.1M Na2CO3pH9.6溶液等分为100μl等份试样，将该试样加入Maxisorb微量滴定平板(NUNC Cat.No.469914)的孔中，平板在4℃下培养16小时。培养后，除去溶液，将200μl的含有1％BSA的0.1M Na2CO3pH9.6加入各孔，平板继续培养2小时，以便封阻蛋白(例如酶或凝集素)对孔表面的非特异性结合。封阻后，BSA-GlcNAc溶液被TBS缓冲液/0.2％NaN3/BSA 1％代替，并且将平板储藏在4℃。
按照上文所述过氧化物酶偶联WGA检验BSA-GlcNAc的吸附。
结果一个66kDa BSA分子的表面积(约50nm2)被约25个GlcNAc基团覆盖。在用BSA-GlcNAc完全覆盖的Maxisorb表面上，相邻GlcNAc基团之间的平均距离约为1.0nm并且凝集素的糖识别位点的直径约为2nm。所以，为了防止相邻的键合凝集素之间或键合凝集素和其它单糖之间的空间干扰，固定单糖的密度应不超过1014/cm2。鉴于这种情况，固定的单糖构成键合蛋白分子的一部分，其直径约为5nm，单糖基团位于距平板表面上方约5纳米，因此可以在糖基转移酶的作用下为酶促反应利用。图8a表示结合在Maxisorb微量滴定平板上的BSA-GlcNAc的饱和曲线。
BSA-GlcNAc结合之后，用TBST冲洗以平板除去非特异性结合的凝集素，TBST这是一种含有中等离子强度洗涤剂(0.15M NaCl)的缓冲液。该洗涤步骤不会除去键合的BSA，由此能够按顺序进行酶促反应。如图8b所示，这种键合的BSA在经历12次彻底洗涤循环后保持稳定。经过每个洗涤步骤之后，利用上述WGA凝集素结合试验测定BSA-GlcNAc(200ng/孔开始)的量。
GlcNAc共价固定到Covalink NH，以及在每个后继延伸循环中用13个附加原子对Covalink NH的延伸如图5所示。氰尿酸介导的WGA固定到β-D-GlcNAc(利用一个延伸循环)或NHS/EDC活化的CovaLink NH的结合结果如图7a-b所示。Covalink NH表面上氨基的密度为1014/cm2，并且GlcNAc基团之间的平均距离为1nm，这个距离足以结合凝集素。与反应混合物D7(1，4半乳糖转移酶，如图8c所示)培养后，利用上述ECorA凝集素结合试验检验β-D-半乳糖向平板苯基-β-D-GlcNAc(22个原子的连接体)的转移作用。没检测到β-D-半乳糖向平板固定的β-D-GlcNAc(具有20原子连接体的NHS/EDC活化平板)的转移作用。这可能是归因于连接体长度的不同。
上述共价固定法能够在后继洗涤步骤中使用离子强度非常高的缓冲液(例如，6M胍HCl或100mM NaOH)，由此能够准确“就地”验证该方法所采用的各个酶促步骤。
非特异性键合分子的脱除对于正确的库合成非常关键。由于糖基转移酶是其外表面上存在复合糖的糖蛋白，所以酶的非特异性吸附作用可能干扰合成，或在合成中造成错误。凝集素和抗体也是糖蛋白，因此其非特异性结合可能导致错误的结构预报。酶促反应中常用的标准封阻剂是脱脂奶。由于脱脂奶含有多种糖偶联蛋白，所以它不适合复合糖的酶促合成。取而代之的是，按照本发明进行的合成反应利用BSA作为封阻剂，因为它未糖基化。如图7b所示，化学封阻剂干扰凝集素结合，用BSA封阻使凝集素能够特异性结合，同时基本上减少非特异性结合。在实践中认识到，因为氰尿酰氯活化的氨基在水中自发水解，当用这种平板偶联方法时无需进一步封阻。
实施例11库的合成高产率对于反复性固相酶促合成非常关键。由于糖基转移酶催化糖基从活化的磷酸化核苷酸糖供体转移到适当的接纳体，核苷酸糖的磷酸二酯能量键的降解是不可逆的。因此，所述合成反应的完成在理论上不存在障碍。适宜地，反应的核苷酸糖浓度应比酶对供体的Km值高10至20倍，其范围为数mmol至数百mmol。在一个含有约100μl溶液的微量滴定平板孔中，酶促反应利用0.2纳摩尔的孔结合糖基。因此，等于或高于1mmol的核苷酸糖浓度足以。
材料和方法NHS/EDC活化和β-D-GlcNAc的偶联将50μl等份的2-(2-羧乙基硫基)-乙基2-β-D-GlcNAc(NNI SS-01-003)溶液分配在CovaLinkNH条上，并将这些条带在含有50μl溶液的孔中培养，该溶液含有3mg/ml的1-乙基-3-(3二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)(SigmaE-7750)和3mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(Sigma H-7377)。将孔密封，平板在50RPM、37℃下振摇24小时。孔用蒸馏水冲洗3次，孔内未反应的氨基在300ml含有甲醇/乙酸酐/水(分别为85/10/5V/V/V)的溶液中封阻。用蒸馏水冲洗4次后，将平板风干，用PBS中含有1％BSA的封阻溶液培养12小时。
氰尿酰氯的活化搅拌下，将含有48mg溶于3ml丙酮中的氰尿酰氯(Aldrich，Cat.No.C95501)溶液加到45ml 0.1M的磷酸盐缓冲液中。将该溶液的试样(200μl)快速2分钟内加入到Covalink NH平板的各孔中。令平板在室温下培养5分钟，随后丢弃溶液，平板用双蒸水洗涤3次，在50℃下干燥30分钟。
氨基连接体的延伸循环将100μl的1，8-二氨基3，6(MERCK818116)溶液(3ml，存在于50ml的0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)中)或1，8-二氨基辛烷(ALDRICH D2，240-1)溶液(100mg/ml 0.1M碳酸盐缓冲液pH9.6)加到氰尿酰氯活化平板的各孔中。将孔密封，并将平板在25℃下培养12小时。培养后，孔用水洗涤4次，按照上述方法用氰尿酰氯活化平板。重复1，8-二氨基-3，6-二氧杂辛烷的延伸循环直至获得预期的连接体长度。
β-D-GlcNAc(第一单糖建筑糖)的偶联将GlcNAc单糖分子连接到如上所述的活化平板上。利用下面的方法完成连接把在0.1M碳酸钠中含有60mg/ml联二亚硫酸钠的溶液加入平板的B-H排的各个孔内。将200μl等份溶于6ml双蒸水中且用3ml 0.1M碳酸钠(pH9.6)滴定至pH7.5的、含有20mg对硝基苯基-N-乙酰基-β-D-GlcNAc(Calbiochem Cat.No.487052)和200mg联二亚硫酸钠(FlukaCat.No.71700)的第二溶液从A至H排连续稀释两倍。将孔密封，在室温下下培养过夜。培养后，孔用双蒸水洗涤4次，再用甲醇(200μl/孔)洗涤3次，第三次洗涤包括在室温下浸泡15分钟。丢弃甲醇，风干平板，保存在4℃下。
WGA与关价偶联的β-D-GlcNAc的结合通过偶联过氧化物酶或荧光素-异硫氰酸酯(FITC)的WGA结合检验共价键合的β-D-GlcNAc的存在。检测按照下面的方法进行将100μl在TBST中制得的5μg/ml过氧化物酶(SIGMA L-3892，150过氧化物酶单位/mg蛋白)或偶联FITC的WGA(SIGMA L-4895)在各孔内于25℃下培养1小时，所述TBST含有10mM的MnCl2和10mM的CaCl2。孔用200μl高离子强度的洗涤液洗涤3次，并且末次洗涤包括浸泡15分钟。为了显象过氧化物酶标记的WGA，加入100μl的新制过氧化物酶底物溶液，1小时后在450nm下测定O.D.。激发(485nm)与键合在β-D-GlcNAc-白色Covalink NH条(NUNC 453690)上的偶联FITC的WGA并且测定由其发射的荧光(520nm)。
β1，4半乳糖向共价连接的β-D-GlcNAc的转移将100μl的50mMMOPS pH7.4(SIGMA M-9027)、0.2％Triton CF 32(Sigma)、20mMMnCl2(SIGMA M-9522)、0.5mg/ml UDP-Gal(Calbiochem 670111)和20毫单位/ml的重组β1，4-半乳糖转移酶(Calbiochem 345650)加入到与β-D-GlcNAc偶联的平板的各孔中。平板在50RPM、37℃下振摇12小时。培养后，除去反应混合物，孔用200μl的高离子强度缓冲液洗涤三次，末次洗涤包括15分钟的浸泡。β1，4-半乳糖的转移按照下列方法利用生物素偶联凝集素(Erythourina corallodenronECorA)检测将一等份在TBST中制成的含有20μg/ml与生物素偶联的ECorA(SIGMA L-0893，5摩尔的生物素/mol蛋白)试样加入各孔中，TBST含有10mM MnCl2和10mM CaCl2，平板在25℃下培养1小时。孔用200μl的高离子强度缓冲液洗涤三次，末次洗涤包括浸泡15分钟。用100ml和过氧化物酶偶联的抗生物素蛋白(5μg/ml，在TBST中)培养后，孔用200μl的高离子强度缓冲液洗涤三次，末次洗涤包括浸泡15分钟。为了检测结合作用，加入新制的过氧化物酶底物溶液，1小时后在450nm下测定O.D.。
β1，4半乳糖转移酶(D7)在固相中的动力学测定除了3.9毫单位/ml β1，4-半乳糖转移酶以外采用对D7所述的酶促反应混合物。固相由用3μg/孔的BSA-GlcNAc涂布的Maxisorb平板组成。以10分钟的间隔将酶混合物加入各孔中。随后用TBST洗涤孔3次，按照上述方法测定RCA120的结合。
结果实施本发明获得的结果表明，固相反应比液相反应慢。如
图12所示，半乳糖在0.5mU的β-1，4-半乳糖转移酶作用下酶促转移到0.5纳摩尔的键合GlcNAc需要约1小时完成，相比之下，相同的反应在溶液中反应需要1分钟。所以，为了获得最高收率，0.5毫单位的各种酶分别使用3-4小时。
由核苷酸糖分解生成的磷酸核苷酸(UDP、CMP、GDP)是这些酶促反应的副产物。已观察到这些副产物抑制糖转移酶的活性。所以，为降低释放的磷酸核苷酸加入磷酸酶可以极大提高了固相反应的速率。
连接体长度、复合糖的柔性、糖基的固定和位阻也是影响合成效率的重要因素。如本研究的部分试验所揭示的，可以有效利用新生糖蛋白涂层的Maxisorb表面固定第一单糖，实现糖基转移酶的酶促反应并避免位阻问题。基于氰尿酸和对-硝基苯基的延伸共价连接体能够将第一单糖偶联在2-8纳米的连接体上，由此在第一单糖与表面共价键合时避免位阻，实现糖基转移酶酶促反应。
实施例12库1图9描述了合成固定在平板上由表17所示结构组成的库要求的酶促步骤，给出微量滴定平板的组成，各个步骤进行的酶促反应和凝集素/抗体结合试验。各个酶促步骤与不含有附加核苷酸糖的对照条带对比验证。
按照本发明开发的方法在各条带中进行不同系列的酶促反应(详情见上文)。下表详细描述了为构建这种库所采用的各种反应和组分。表16概括了合成第一库所用的酶促反应。表17描述了酶组件(EM的，在实施例1-9中进一步描述)，形成的复合糖结构和对每条带进行的凝集素/抗体结合试验，同时表18描述用来检验每一酶促步骤后所形成的复合糖结构的凝集素/抗体结合试验。
表16合成第一库所用的酶促反应(供体、接纳体和编号)
表17EMs表
表18凝集素/抗体结合试验
结果
图10a-f描述了在各条带上各个酶促反应之后进行的凝集素/抗体结合试验。RCA120的结合作用的增强(
图10a)表明β-D-半乳糖向GlcNAc的转移和稳定β-1，4糖苷键的形成。BS-I结合的提高验证了第二酶促条带的效率(
图10b)，它是α-D-半乳糖向Galβ-1，4GlcNAc转移和其中稳定α-1，3-糖苷键形成的指标。TGP结合的升高(
图10c)是α-L-岩藻糖向Galβ-1，4 GlcNAc转移和其中稳定的α-1，3-糖苷键形成的指标。由该反应生成的支链低聚糖苷是Lewis X抗原。如
图10d-e所示，YML结合的提高表明α-D-NeuAC向Galβ-1，4 GlcNAc的转移，其中形成稳定α-2，6-2，3糖苷键。抗唾液酸Lewis X IgM结合的提高(
图10f)表明α-L-岩藻糖向NeuACα-2，3 Gal β-1，4 GlcNAc的转移形成稳定的α-1，3糖苷，并且生成由四种不同单糖组成的唾液酸Lewis X抗原。
实施例13库2下列库举例说明了本发明合成方法合成不同长度的聚N-乙酰基乳糖胺II型链的能力。
图11描述了微量滴定平板的组成、各步骤中进行的酶促反应和可以用来确定各酶促步骤的效率的凝集素结合试验。对比不含有附加核苷酸糖的对照条带检验每个酶促步骤。各条带经历不同系列的酶促反应(酶组件-EM)，其按照本发明开发的方法进行。
表19描述了按照本发明的教导用于合成聚N-乙酰基乳糖胺库的酶促反应混合物和条件(详情如上文所述)。表20描述了酶组件(EM)和复合糖结构。在如上所述的每一酶促步骤之后进行RCA120结合试验，以评价半乳糖(RCA120结合)或GlcNAc(RCA120结合的消失)向延伸的聚N-乙酰基乳糖胺化酰亚胺(N-acetyllaetoseaminide)链的增加。
表19用来合成聚N-乙酰基乳糖胺化酰亚胺库的酶促反应表(供体、接纳体和编号)
表20EM表
实施例14库3下面的库举例说明本发明的合成方法合成不同链长和修饰的聚N-乙酰基乳糖胺II型链的能力。该库包括带有两个支链的低聚糖结构。第一单糖经BSA键合在表面。表21描述了合成所用的酶促反应，同时表22描述了所用的酶组件(EM)和由此形成的复合糖结构。为了验证顺序酶促合成的精确度，利用蛋白酶释放结合孔的低聚糖并且用HPLC进行分析，甲基化分析或MALD-TOF-MS(Rudd，P.M.Dwek，R.A.(1997)Current Opinion in biotechnology 8 488-497)。
表21库3的合成中所用的酶促反应
表22EM表
所以，本发明提供了有效和精确的用于固相合成支链或非支链结构复合糖的方法。
虽然本发明已经结合具体实施方案进行了描述，但显然，许多替代、修饰和变化对于所属领域技术人员而言是显而易见的。因此，所附权利要求的实质和广义范围包括全部这些替代、修饰和变化。
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权利要求
1.组合复合糖库，其中包含许多可编址的复合糖结构。
2.权利要求1的组合复合糖库，其中每一个所述可编址的复合糖结构都连接到固体载体上。
3.权利要求2的组合复合糖库，其中每一个所述可编址的复合糖结构与固体载体的结合通过连接体完成的。
4.权利要求3的组合复合糖库，其中所述连接体包括至少两个邻近的共价键。
5.权利要求3的组合复合糖库，其中所述连接体选自氨基酸，肽，非糖基化的蛋白，类脂，神经酰胺，磷酸多帖醇，环糊精，寡糖，单糖，烷基链和核酸。
6.权利要求3的组合复合糖库，其中所述连接体的长度至少20埃。
7.权利要求2的组合复合糖库，其中所述固体载体选自可编址的微粒，可编址的珠，可编址的多嵌段(muiti-block)和平台。
8.权利要求7的组合复合糖库，其中所述平台选自微量滴定板，膜和小片。
9.权利要求8的组合复合糖库，其中所述微量滴定板是可编址的封闭反应室的微装配阵列，封闭反应室附加有微流系统。
10.权利要求9的组合复合糖库，其中所述封闭反应室的排列密度为每平方厘米4-25个。
11.权利要求9的组合复合糖库，其中所述每个封闭反应室的体积为50-1000纳升。
12.权利要求2的组合复合糖库，其中所述固体载体是小片，而且所述大量的可编址复合糖结构的不同复合糖结构相互之间的排列间隔从中心到中心的距离不大于2.25mm。
13.权利要求2的组合复合糖库，其中所述固体载体选自用二乙烯基苯交联的聚苯乙烯，聚乙二醇-聚苯乙烯嵌段共聚物，聚酰胺，聚丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺，硅石，玻璃，石英，塑料和纤维素。
14.权利要求1的组合复合糖库，其中至少一种所述的大量可编址的复合糖结构包括至少两个邻近的单一种类的糖单元。
15.权利要求1的组合复合糖库，其中至少一种所述的大量可编址的复合糖结构包括至少一个支链。
16.权利要求15的组合复合糖库，其中至少一种所述的至少一个支链由相同的核心和支链糖单元构成。
17.权利要求1的组合复合糖库，其中至少一种所述的大量可编址的复合糖结构包括至少4个糖单元。
18.权利要求1的组合复合糖库，其中至少一种所述的大量可编址的复合糖结构包括至少5个糖单元。
19.权利要求1的组合复合糖库，其中至少一种所述的大量可编址的复合糖结构包括至少6个糖单元。
20.权利要求1的组合复合糖库，其中至少一种所述的大量可编址的复合糖结构包括至少7个糖单元。
21.权利要求1的组合复合糖库，其中所述的大量可编址的复合糖结构是包括非天然复合糖的代表。
22.权利要求1的组合复合糖库，其中所述的大量可编址的复合糖结构是包括天然复合糖代表。
23.权利要求22的组合复合糖库，其中所述天然复合糖来自于人类来源。
24.权利要求23的组合复合糖库，其中所述人类来源选自组织，细胞和体液。
25.权利要求1的组合复合糖库，其中所述的大量可编址复合糖结构是至少一种天然复合糖域的代表。
26.权利要求25的组合复合糖库，其中所述至少一种天然复合糖来自于人类来源。
27.制备可编址的组合复合糖库的方法，该方法包括下列步骤(a)提供一个具有大量位置的固体载体；和(b)酶催化合成大量的复合糖结构，每个所述大量的复合糖结构与至少一个所述大量位置的编址位置相结合，从而产生可编址的组合复合糖库。
28.权利要求27的方法，其中每一个所述大量的复合糖结构与所述固体载体的结合通过连接体实现。
29.权利要求28的方法，其中所述连接体包括至少两个邻近的共价键。
30.权利要求28的方法，其中所述连接体选自氨基酸，肽，非糖基化的蛋白，类脂，神经酰胺，磷酸多帖醇，环糊精，寡糖，单糖，烷基链和核酸。
31.权利要求28的方法，其中所述连接体的长度至少为20埃。
32.权利要求27的方法，其中所述固体载体选自可编址的微粒，可编址的珠和平台。
33.权利要求32的方法，其中所述平台选自微量滴定板，膜和小片。
34.权利要求27的方法，其中所述固体载体是小片，而且所述大量位置的邻近位置彼此之间的距离不大于2.25mm。
35.权利要求33的方法，其中所述微量滴定板是可编址的封闭反应室的微装配阵列，封闭反应室附加有微流系统。
36.权利要求35的方法，其中所述封闭反应室的排列密度为每平方厘米4-25个。
37.权利要求35的方法，其中所述每个封闭反应室的体积为50-1000纳升。
38.权利要求27的方法，其中所述固体载体选自用二乙烯基苯交联的聚苯乙烯，聚乙二醇-聚苯乙烯嵌段共聚物，聚酰胺，聚丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺，硅石，玻璃，石英，塑料和纤维素。
39.权利要求27的方法，其中至少一种所述的大量复合糖结构包括至少两个邻近的单一种类的糖单元。
40.权利要求27的方法，其中至少一种所述的大量复合糖结构包括至少一个支链。
41.权利要求40的方法，其中至少一种所述至少一个支链由相同的核心和支链糖单元构成。
42.权利要求27的方法，其中至少一种所述的大量复合糖结构包括至少4个糖单元。
43.权利要求27的方法，其中至少一种所述的大量复合糖结构包括至少5个糖单元。
44.权利要求27的方法，其中至少一种所述的大量复合糖结构包括至少6个糖单元。
45.权利要求27的方法，其中至少一种所述的大量复合糖结构包括至少7个糖单元。
46.权利要求27的方法，其中所述的大量复合糖结构是包括非天然复合糖的代表。
47.权利要求27的方法，其中所述的大量复合糖结构是包括天然复合糖的代表。
48.权利要求47的方法，其中所述天然复合糖类与选自下列的疾病有关肿瘤发生，转移，妊娠，血管疾病，心脏病，神经变性疾病，自身免疫疾病，不育症，变应性，胚胎发生，细胞编程性死亡，神经变性疾病和器官移植。
49.权利要求47的方法，其中所述天然复合糖来自于人类来源。
50.权利要求49的方法，其中所述人类来源选自组织，细胞和体液。
51.权利要求27的方法，其中所述的大量复合糖结构是至少一种天然复合糖域的代表。
52.权利要求51的方法，其中所述至少一种天然复合糖来自于人类来源。
53.鉴定能够结合实体的复合糖的方法，该方法包括下列步骤(a)通过以下步骤制备可编址的组合复合糖库(i)提供具有大量位置的固体载体；和(ii)酶催化合成大量的复合糖结构，每个所述的大量复合糖结构与至少一个所述大量位置的编址的位置相结合，从而产生可编址组合复合糖库；和(b)使用用于鉴定能够结合实体的复合糖的实体筛选所述可编址的组合复合糖库。
54.权利要求53的方法，其中所述实体选自由EST库编码的蛋白，和天然提取的蛋白。
55.权利要求53的方法，其中实体是生物活性物质的候选物，该方法用于鉴定为所述生物活性物质的候选物的靶的复合糖。
56.权利要求53的方法，其中实体是已知能结合特定的天然复合糖的配体，而且其中所述可编址的组合复合糖库是所述特异天然复合糖域的代表，该方法用于鉴定结合所述配体的所述域的特异性域。
57.用自身或非自身复合糖结构诊断疾病和诱发所抗的抗体的方法，该方法包括以下步骤(a)通过以下步骤制备代表自身或非自身复合糖结构的可编址的组合复合糖库(i)提供一个具有大量位置的固体载体；和(ii)酶催化合成大量的复合糖结构，每个所述的大量复合糖结构与至少一个所述大量位置的编址的位置相结合，从而产生可编址组合复合糖库；和(b)所述可编址的组合复合糖库与来自于疑有疾病的患者的抗体反应，从而产生所述抗体与所述位置结合的模式，将该模式与表征健康个体的已知模式进行比较，可得到所述疾病的诊断结果。
全文摘要
本发明提供组合的复合糖库并且包括大量可编址复合糖结构。
文档编号C12P19/00GK1357108SQ00806346
公开日2002年7月3日 申请日期2000年2月17日 优先权日1999年2月17日
发明者A·杜克勒, N·多坦 申请人:格里科麦德斯有限公司