专利名称：α－琼脂糖酶及其生产方法
技术领域：
本发明涉及α-琼脂糖酶及其生产方法。具体来说，本发明涉及可用于生产具有琼脂糖各种生理活性、聚合程度低的琼脂寡糖的α-琼脂糖酶和生产α-琼脂糖酶的方法以及α-琼脂糖酶的用途。本发明还涉及具有α-琼脂糖酶活性的多肽以及编码所述多肽的基因。具体来说，本发明涉及α-琼脂糖酶的氨基酸序列以及编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述α-琼脂糖酶可用于生产具有琼脂糖各种生理活性、聚合程度低的琼脂寡糖。而且，本发明涉及应用基因工程生产具有α-琼脂糖酶活性的多肽的方法。此外，本发明涉及采用具有α-琼脂糖酶活性的多肽生产琼脂寡糖的方法。
背景技术：
琼脂糖是琼脂的主要成分。琼脂糖是一种多糖，它具有其中D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖通过α-1，3-键和β-1，4键交替连接在一起的结构。人们必须使琼脂糖降解为小分子，以便由琼脂产生寡糖。已知化学降解琼脂糖的方法和酶消化降解琼脂糖的方法用于此目的。在化学降解法中，可使用酸水解琼脂糖。在这种情况下，主要裂解α-1，3键。已知两种酶可消化琼脂糖，一种是β-琼脂糖酶，它裂解琼脂糖中的β-1，4键，另一种是α-琼脂糖酶，它裂解琼脂糖中的α-1，3键。
裂解琼脂糖的β-1，4键获得的寡糖称为新琼脂寡糖。新琼脂寡糖在其还原末端具有D-半乳糖，而其聚合程度表现为偶数。另一方面，裂解琼脂糖α-1，3键获得的寡糖称为琼脂寡糖。琼脂寡糖在其还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖，而其聚合程度表现为偶数。最近证实在其还原末端含有3，6-脱水-L-半乳糖的琼脂寡糖具有生理活性，例如诱导细胞凋亡活性、抑癌活性、各种抗氧化活性、免疫调节活性、抗过敏活性、抗炎活性以及抑制α-糖苷酶活性(WO99/24447、日本专利申请号11-11646)。鉴于其生理活性，所以可提供含有琼脂寡糖作为其活性成分的药用组合物和功能食品或饮料。
在化学降解琼脂糖的方法中，难以控制所产生的寡糖的大小。尤其是难以选择性产生聚合程度低的小分子寡糖(例如T.Tokunaga等，Bioscience & Industry，49734(1991))。如果使用β-琼脂糖酶，则因为该酶只裂解β-1，4键而只能获得没有上述生理活性的新琼脂寡糖。
预期通过采用具有裂解α-1，3键活性的α-琼脂糖酶产生具有生理活性的琼脂寡糖。已知的α-琼脂糖酶包括革兰氏阴性海洋细菌株GJ1B产生的酶(Carbohydrate Research，66207-212(1978)；该菌株在European Journal of Biochemistry，214599-607(1993)中称为异单胞菌属(Alteromonas)琼脂裂解菌株GJ1B)和弧菌属(Vibrio)细菌(JP-A 7-322878；JT0107-L4株)产生的酶。然而，采用异单胞菌属琼脂裂解菌株GJ1B产生的α-琼脂糖酶不能产生具有显著生理活性的琼脂二糖，因为所述酶不能消化己糖或较短的寡糖。此外，弧菌属细菌产生的α-琼脂糖酶不能用来利用琼脂糖作为原料产生琼脂寡糖，因为该酶只对己糖和较短的寡糖具有活性，而对琼脂糖根本没有作用。
如上所述，现有技术关于产生在其还原末端含有3，6-脱水-L-半乳糖而且具有各种生理活性的小分子琼脂寡糖(例如琼脂二糖和琼脂四糖)存在各种问题。
发明目的本发明主要目的是提供可用于有效产生小分子琼脂寡糖的具有α-琼脂糖酶活性的多肽、所述多肽的氨基酸序列、编码所述多肽的基因、产生所述多肽的方法以及产生所述小分子琼脂寡糖的方法。发明概述由于存在上述各种问题，所以本发明人进行了深入研究，以便获得裂解琼脂糖的α-1，3键而且产生具有显著生理活性的琼脂寡糖的酶。因此，本发明人成功发现了产生具有适用于此目的的特性的酶的两个微生物菌株。分离这两种微生物产生的酶，并阐明其物理化学特性以及酶学特性。此外，本发明人成功分离了所述酶的基因，而且找到了通过采用所述基因的基因工程容易地产生具有α-琼脂糖酶活性的多肽的方法，因此而完成了本发明。
本发明概述如下。本发明的第一方面涉及具有以下物理化学特性的新型α-琼脂糖酶(1)作用水解3，6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖之间的α-1，3键；(2)底物特异性作用于琼脂糖、琼脂己糖和较琼脂己糖更长的琼脂寡糖，但是对琼脂四糖没有作用；(3)最适温度在55％或更低温度下呈现其酶活性；以及(4)热稳定性于48℃处理30秒后保留其20％或更高活性。
这样的α-琼脂糖酶中的典型酶例如为它包含SEQ ID NO14的氨基酸序列第177号氨基酸至第925号氨基酸的749个残基组成的氨基酸序列，或者在749个残基组成的所述氨基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；或者例如为这样的酶它包含SEQ ID NO15氨基酸序列第184号氨基酸至第950号氨基酸的767个残基组成的氨基酸序列，或者在767个残基组成的所述氨基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
本发明的第二方面涉及编码具有α-琼脂糖酶活性的多肽的基因，该基因编码第一方面的α-琼脂糖酶。这类基因中的典型基因例如为它包含SEQ ID NO12核苷酸序列第529号碱基至2775号碱基的2473个碱基组成的核苷酸序列，或在2473个碱基组成的所述核苷酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一个或多个碱基的核苷酸序列；或者例如为这样的基因它包含SEQ ID NO13核苷酸序列第550号碱基至2850号碱基的2301个碱基组成的核苷酸序列，或者在2301个碱基组成的所述核苷酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一个或多个碱基的核苷酸序列。
本发明的第三方面涉及在严格条件下可与所述第二方面的基因杂交而且编码第一方面的α-琼脂糖酶的基因。
本发明的第四方面涉及包含所述第二或第三方面的基因的重组DNA分子。
本发明的第五方面涉及含有所述第四方面的重组DNA分子的转化体。
本发明的第六方面涉及一种产生具有α-琼脂糖酶活性的多肽的方法，包括培养能够产生α-琼脂糖酶的微生物(例如属于微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)或微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)所属的微生物属的微生物)，以及从所述培养物中收集所述第一方面的α-琼脂糖酶。微生物TKR1-7AGα和TKR4-3AGα于1999年1月26日(最初保藏日期)根据布达佩斯条约分别以保藏号FERM BP-6990和FERMBP-6991保藏于日本国际贸易和工业部工业科技局的国立生命科学和人体技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)。
本发明的第七方面涉及一种产生具有α-琼脂糖酶活性的多肽的方法，包括培养所述第五方面的转化体以及从所述培养物中收集所述第一方面的α-琼脂糖酶。
本发明的第八方面涉及一种产生琼脂寡糖的方法，包括用所述第一方面的α-琼脂糖酶消化琼脂糖以及从所获得消化物中收集琼脂寡糖。
附图简述
图1图示本发明的α-琼脂糖酶对琼脂己糖的消化作用。
图2图示本发明的α-琼脂糖酶对琼脂己糖的消化作用。
发明详述本发明使用的寡糖是指2个或2个以上以及10个或10个以下的单糖组成的糖。琼脂寡糖是指具有通过α-1，3键以及β-1，4键交替将D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖连接在一起的结构而且在其还原末端含有3，6-脱水-L-半乳糖的寡糖。多糖是指除单糖和寡糖以外的糖。
本发明的α-琼脂糖酶是一种水解3，6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖之间的α-1，3键的酶。它既可作用于多糖如琼脂糖又可作用于寡糖如琼脂己糖。本发明的酶不是特定限制的酶，只要它们具有这样的特性。其实例包括海洋微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)或TKR4-3AGα(FERM BP-6991)产生的α-琼脂糖酶。
微生物TKR1-7AGα产生的琼脂糖酶1-7和微生物TKR4-3AGα产生的琼脂糖酶4-3是水解多糖和寡糖中的3，6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖之间的α-1，3键的酶。这些酶作用于琼脂糖、琼脂己糖和比琼脂己糖更大琼脂寡糖以及新琼脂己糖和比新琼脂己糖更大的新琼脂寡糖。
以下描述检测上述两种酶的活性的方法以及这两种酶的物理化学特性和酶学特性。
(1)检测酶活性的方法如下检测本发明的α-琼脂糖酶的活性采用琼脂糖作为底物进行酶反应，然后定量产生的琼脂四糖。具体来说，在此用于检测纯化的酶制剂的活性以及纯化过程中的酶的活性的酶活性检测方法如下制备在10mM tris盐酸盐(pH 7.0)、10mM氯化钙和10mM氯化钠中含有浓度为0.2％的琼脂糖(Takara Shuzo，编号5003)的溶液。将作为底物的180μl该溶液与20μl酶溶液混合。使混合物于42℃反应30-120分钟、优选60分钟，然后于60℃加热1分钟终止反应。使30μl所述反应混合物过TSK凝胶α-2500柱(内径7.8mm；长度300mm；Tosoh，编号18339)。采用70％乙腈溶液作洗脱液、流速为0.8ml/min，在保留时间约26分钟洗脱出一个峰。定量在所述峰的酶反应产生的琼脂四糖。一个单位(1U)定义为在10分钟内产生1微摩尔琼脂四糖的酶量。
(2)最适pH使酶作用于采用醋酸盐缓冲液(pH 4.5)、苹果酸盐缓冲液(pH5.5)、醋酸盐缓冲液(pH 6.0，6.5)或tris盐酸盐缓冲液(pH 7.0，7.5，8.8)制备的反应混合物中的底物琼脂糖。结果证实，琼脂糖酶1-7和琼脂糖酶4-3分别在中性至弱酸性条件下和弱碱性至弱酸性条件下显示其消化琼脂糖的活性。
(3)最适温度本发明的酶在55℃或更低温度下呈现其酶活性。在30-48℃温度范围具有高活性，而在约37-42℃下具有最大活性。
(4)热稳定性测量在48℃、50℃或60℃处理30秒钟后保留的酶制剂活性。结果琼脂糖酶1-7于48℃处理后保留其25％活性，而琼脂糖酶4-3于50℃处理后保留其22％活性。
(5)分子量根据采用10-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定，鉴定琼脂糖酶1-7的分子量约95,000。
采用甘油密度梯度平衡密度梯度离心和SDS-PAGE测定琼脂糖酶4-3的分子量。结果测得琼脂糖酶4-3的分子量为约85,000。
(6)用Edman降解法测定氨基酸序列采用Edman降解法测得的琼脂糖酶1-7和琼脂糖酶4-3的N-末端氨基酸序列分别为Asp-Thr-Leu-Ser-Val-Glu-Ala-Glu-Met-Phe和Gly-Asp-Ile-Val-Ile-Glu-Leu-Glu-Asp-Phe-Asp-Ala-Thr-Gly-Thr-Thr-GLy-Arg-Val-Ala。琼脂糖酶1-7和琼脂糖酶4-3的N-末端氨基酸序列分别示于SEQ ID NO1和2。
如下所述，分离编码琼脂糖酶1-7的基因和编码琼脂糖酶4-3的基因。此外，测得这些基因编码的氨基酸序列。琼脂糖酶1-7基因和琼脂糖酶4-3基因编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO14和15。SEQ ID NO14氨基酸序列的第177号至第925号氨基酸的749个氨基酸组成的多肽和SEQ ID NO15氨基酸序列的第184号至第950号氨基酸的767个氨基酸组成的多肽二者均具有本发明的α-琼脂糖酶活性。
可以从通过培养微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)或微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)获得的培养物纯化本发明的α-琼脂糖酶。从海水分离同化琼脂的细菌TKR1-7AGα和TKR4-3AGα。它们具有以下微生物特性。
微生物特性(1)形态学制备100ml人工海水(产品名称Jamarine S；JamarineLaboratory)。在其中加入0.3g蛋白胨(DIFCO，编号0123-17-3)和0.02g酵母提取物(DIFCO，编号0127-17-9)。用3M碳酸钠将pH调节至8.0。把获得的混合物转移到500ml锥形瓶中。向其中加入0.1g琼脂(Nacalai Tesque，编号010-28)。用高压灭菌器灭菌后，将一种上述微生物接种到所述混合物中，于25℃、120rpm培养过夜。生长于所述培养基中的TKR1-7AGα和TKR4-3AGα细胞是杆菌并可运动。
(2)生长制备100ml人工海水(产品名称Jamarine S；JamarineLaboratory)。在其中加入0.3g蛋白胨和0.02g酵母提取物。用3M碳酸钠将pH调节至8.0。向其中加入1.5g琼脂(Nacalai Tesque，编号010-28)。用高压灭菌器灭菌混合物以制备平板。将上述微生物接种到所述平板上，证实(a)它们于23-30℃生长良好；和
(b)随着所述细菌细胞的生长使所述琼脂凝胶液化。
制备100ml人工海水(产品名称Jamarine S；JamarineLaboratory)。在其中加入0.3g蛋白胨和0.02g酵母提取物。用3M碳酸钠将pH调节至不同pH。把获得的混合物转移到500ml锥形瓶中。向其中加入0.1g琼脂。用高压灭菌器灭菌后，将一种上述微生物接种到所述混合物中。然后证实(c)它们于pH 7.0-8.5生长良好。
TKR1-7AGα和TKR4-3AGα于1999年1月26日(最初保藏日期)根据布达佩斯条约分别以保藏号FERM BP-6990和FERM BP-6991保藏于日本国际贸易和工业部工业科技局的国立生命科学和人体技术研究所。
通过分析其核苷酸序列已知为每种微生物菌株特异性的16S核糖体RNA的基因的编码核苷酸序列，可获得关于每种上述微生物的分类学定位的信息。具体来说，从微生物菌株TKR1-7AGα和TKR4-3AGα提取染色体DNA。采用可用于扩增所述基因的一个区或其部分的引物进行PCR。测定所扩增的DNA片段的核苷酸序列。对所测定的序列利用GenBank数据库进行同源性检索。然后可知道与所述区的核苷酸序列相似的微生物，即分类学上密切相关的微生物。
按照Bulletin of Japanese Society of Microbial Ecology，1031-42(1995)所述的方法，扩增从微生物TKR1-7AGα和TKR4-3AGα的16S核糖体RNA基因获得的DNA片段。将所述文献描述的引物27f和1492r用于所述PCR(引物27f和1492r的核苷酸序列示于SEQ ID NO16和17)。分析所获得的扩增DNA片段的核苷酸序列。结果发现了以下微生物，各微生物的上述区与一种产生本发明的α-琼脂糖酶的微生物的同源性约95％TKR1-7AGα科尔韦尔氏菌属(Colwellia)样细菌；TKR4-3AGα海洋嗜冷菌IC079。
含有每种所述微生物可利用的氮源、无机物质等以及作为碳源的琼脂、琼脂糖等的培养基可用作培养所述微生物的培养基。可使用市售琼脂和琼脂糖。氮源实例包括肉膏、酵母提取物、酪蛋白水解产物、胰蛋白胨、蛋白胨等。优选使用酵母提取物和蛋白胨。这样的氮源也可以用作除琼脂或琼脂糖外的碳源。此外，作为盐类可联合使用以下物质氯化钠、柠檬酸铁、氯化镁、硫酸钠、氯化钙、氯化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、溴化钾、氯化锶、硼酸钠、硅酸钠、氟化钠、硝酸铵、磷酸氢二钠等。
特别优选使用通过在人工海水Jamarine S组成的培养基中加入蛋白胨、酵母提取物和琼脂或琼脂糖制备的培养基。优选加入琼脂或琼脂糖的浓度为0.1-2.0％。通过适当改变琼脂或琼脂糖的浓度可制备固体或液体培养基。使用浓度为0.1-0.3％的液体培养基优选用于产生酶，而使用浓度为1.2-2.0％的固体培养基优选用于保藏细胞。如果低熔点琼脂糖用于液体培养基，则可以0.1-1.0％浓度使用。
尽管培养条件或多或少取决于培养基的组成，但是培养温度为23-30℃、优选25℃，培养基的pH为7.0-8.5、优选7.2-8.2，而培养时间为12-48小时、优选24-36小时。
如上所述培养期间产生的本发明的α-琼脂糖酶分泌出所述细胞。然后在培养后通过离心、过滤等去除细胞，获得培养物上清液。
采用真空浓缩或超滤可浓缩获得的培养物上清液，以制备液体酶。或者，可通过冷冻干燥、喷雾干燥等使所述培养物上清液转变为粉型酶，以制备粗酶制剂。采用常规纯化方法例如用硫酸铵盐析或溶剂沉淀，可部分纯化本发明的α-琼脂糖酶。而且，采用已知的纯化方法例如组合柱层析(例如阴离子交换柱和凝胶过滤柱)可获得电泳产生一条带的纯化酶制剂。
通过使由此获得的培养物或不同纯化程度的本发明α琼脂糖酶与红海藻中含的多糖如琼脂或琼脂糖作为底物进行反应，可产生琼脂寡糖例如琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂己糖。
琼脂糖为具有交替通过α-1，3键和β-1，4键使D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖连接在一起的结构的多糖。β-琼脂糖酶是水解琼脂糖β-1，4键的酶。该酶作用产生的在其还原末端具有D-半乳糖的寡糖称为新琼脂寡糖，它不具有生理活性，例如用琼脂寡糖观测到的生理活性。如果使用裂解琼脂糖α-1，3键的α-琼脂糖酶，则可产生在其还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖的琼脂寡糖。异单胞菌属琼脂裂解菌株GJ1B和一种弧菌属细菌(菌株JT0107-L4)产生的两种酶已知为α-琼脂糖酶。然而，异单胞菌属琼脂裂解菌株GJ1B产生的α-琼脂糖酶不能作用于琼脂己糖或更短的寡糖，而弧菌属细菌产生的α-琼脂糖酶不能消化琼脂糖。因此，不能采用已知α-琼脂糖酶有效由琼脂糖原料产生琼脂二糖或琼脂四糖。
根据上述物理化学特性可知，本发明的α-琼脂糖酶是作用于琼脂糖、琼脂己糖和比琼脂己糖更长的琼脂寡糖的酶。因此，它作用于琼脂糖产生琼脂寡糖。而且，它可裂解因为所述作用产生的琼脂己糖中一个α-1，3键。换句话说，通过使本发明的α-琼脂糖酶可作用于琼脂糖，可获得琼脂二糖和琼脂四糖，琼脂二糖和琼脂四糖是按照常规方法几乎不能大量产生的二糖和四糖。
已知的α-琼脂糖酶和本发明的α-琼脂糖酶的底物特异性示于表1。在表1中，符号+和-分别表示所述酶能够和不能够消化所述底物。表1
本发明的α-琼脂糖酶作用于琼脂己糖产生琼脂二糖和琼脂四糖。
采用本发明的α-琼脂糖酶产生的琼脂寡糖含有琼脂二糖和琼脂四糖。所述琼脂寡糖可含有琼脂己糖或比琼脂己糖更长的琼脂寡糖，前提是其存在不干扰所述使用目的。琼脂、琼脂糖或琼脂或琼脂糖产生的琼脂寡糖可用作采用本发明的α-琼脂糖酶产生琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂己糖的原料。用于所述α-琼脂糖酶作用的条件不特别限制，前提是所述酶在所用的条件下具有活性。例如，在中性至弱酸性条件下可优选使琼脂糖酶1-7发挥作用，在弱碱性至弱酸性条件下可优选使琼脂糖酶4-3发挥作用，而在37-42℃时可使所述酶二者发挥作用。所述反应混合物的组成不特别限制，前提是它适用于所述酶的作用。
如上所述，采用本发明的α-琼脂糖酶产生的寡糖主要是己糖或聚合程度低的更短寡糖。但是，可通过适当选择所述反应条件等任选产生不同聚合程度的寡糖。也可以通过分离和纯化由此获得的寡糖，分别获得琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂己糖。
本发明的α-琼脂糖酶基因是编码具有上述α-琼脂糖酶活性的多肽的基因。因此，它是指包含编码具有α-琼脂糖酶活性的多肽的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。本发明的α-琼脂糖酶基因的实例包括包含编码微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)产生的琼脂糖酶1-7的核苷酸序列的基因和包含微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)产生的琼脂糖酶4-3的核苷酸序列的基因。编码琼脂糖酶1-7和琼脂糖酶4-3的基因例如为具有编码SEQ ID NO14中的第177号氨基酸至第925号氨基酸的749个氨基酸残基组成的多肽的核苷酸序列的基因和具有编码SEQ ID NO15中的第184号氨基酸至第950号氨基酸的767个氨基酸残基组成的多肽的核苷酸序列的基因。
本发明的α-琼脂糖酶基因还包括包含编码多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽具有在上述氨基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列，而且具有α-琼脂糖酶活性。
此外，本发明的基因包括具有SEQ ID NO12第529号碱基至2775号碱基的22473个碱基组成的核苷酸序列的基因和具有SEQ ID NO13第550号碱基至2850号碱基的2247个碱基组成的核苷酸序列的基因。本发明的基因还包括包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列具有在上述核苷酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一个或多个碱基的核苷酸序列，而且编码具有α-琼脂糖酶活性的多肽。
此外，本发明的基因包括包含在严格条件下与上述基因杂交而且编码具有α-琼脂糖酶活性的核苷酸序列的核酸。可照例如T.Maniatis等(编辑)，Molecular CloningA Laboratory Manual第二版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory所述的方法进行杂交。严格条件例如为在含6×SSC(1×SSC0.15 M NaCl、0.015柠檬酸钠，pH 7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt’s和100mg/ml鲱鱼精子DNA的溶液中于65℃下与探针温育过夜。
例如可如下克隆本发明的α-琼脂糖酶基因。
用产生α-琼脂糖酶的微生物制备基因组DNA。可按照一种合适的已知方法制备所述基因组DNA。例如，组合使用诸如溶菌酶处理、蛋白酶处理、RNA酶处理、酚处理和乙醇沉淀的已知方法可制备基因组DNA。由此获得的基因组DNA用合适的已知方法例如超声处理或限制酶消化降解。按照常规方法将获得的DNA片段掺入载体(例如质粒载体)中，以构建重组DNA分子。然后将重组DNA分子导入合适的宿主(例如大肠杆菌)中获得转化体。根据常规方法所用的载体和宿主例如Molecular CloningA Laboratory Manual第二版中所述的载体和宿主，可适当选择构建重组DNA分子、转化等的方法。因此获得含有α-琼脂糖酶基因的转化体的基因组文库。
其次，筛选基因组文库，以选择具有α-琼脂糖酶基因的转化体。筛选方法的实例如下(1)利用α-琼脂糖酶活性的表达作为指标的筛选使基因组文库生长于琼脂板上。具有α-琼脂糖酶基因的转化体表达具有α-琼脂糖酶活性的多肽。所述多肽通过其α-琼脂糖酶活性作用溶解琼脂凝胶。因此选择溶解琼脂板中的的琼脂凝胶的菌落或菌斑。
(2)利用抗体的筛选如上所述制备α-琼脂糖酶的部分纯化的粗酶制剂或纯化的酶制剂。采用所述酶制剂作抗原，按照常规方法制备抗α-琼脂糖酶的抗体。
使基因组文库生长于平板上。将生长的菌落或菌斑转移到尼龙或硝酸纤维素滤膜上。表达的重组蛋白与所述菌落或菌斑一起转移到所述滤膜上。使滤膜上的重组蛋白与抗α-琼脂糖酶抗体反应，以鉴定与抗体反应的克隆。
按照已知方法可鉴定与所述抗体反应的克隆，例如使结合过氧化物酶的二抗与已经与所述抗α-琼脂糖酶抗体反应的滤膜反应，使滤膜与显色底物反应，然后检测产生的颜色。
如果将使掺入所述载体的DNA中的基因高效表达的表达载体用于构建用于上述方法(1)或(2)的基因组文库，则能够容易地选择具有目的基因的转化体。
(3)利用DNA探针杂交的筛选使基因组文库生长于平板上。将生长的菌落或菌斑转移到尼龙或硝酸纤维素滤膜上。通过变性使DNA固定在所述滤膜上。按照常规方法使所述滤膜上的DNA杂交到标记探针上，以鉴定与所述探针杂交的克隆。
用于该筛选的探针包括根据上述α-琼脂糖酶的氨基酸序列信息制备的寡核苷酸、根据另一种氨基酸序列信息制备的寡核苷酸以及采用根据这种氨基酸序列信息制备的引物扩增的PCR片段。用于所述探针的标记的实例包括但不限于放射性同位素标记、荧光标记、地高辛标记和生物素标记。
如下制备的富集具有α-琼脂糖酶基因的转化体的基因组文库可用作用于所述筛选的基因组文库。
由产生α-琼脂糖酶的微生物制备基因组DNA，用合适的限制酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳分离，然后按照常规方法将其印迹到尼龙或硝酸纤维素滤膜上。按照常规方法使滤膜上的DNA与上述标记的探针杂交，以检测与所述探针杂交的DNA片段。从所述琼脂糖凝胶提取并纯化对应于所述信号的DNA片段。
按照常规方法将由此获得的DNA片段掺入载体(例如质粒载体)中，以构建重组DNA分子。然后将重组DNA分子导入合适的宿主(例如大肠杆菌)中获得转化体。根据常规方法例如Molecular CloningALaboratory Manual第二版中所述方法，可选择适用于所用载体的转化方法。因此获得富集含有α-琼脂糖酶基因的转化体的基因组文库。
采用这样的基因组文库可更有效地进行筛选。
(4)利用PCR的体外克隆通过筛选如上所述的方法(1)至(3)的转化体，克隆目的基因。利用PCR可体外进行克隆，而不必利用转化体。
由产生α-琼脂糖酶的微生物制备基因组DNA。通过合适的已知方法例如超声处理或用限制酶消化降解基因组DNA。按照常规方法使接头连接到由此获得的DNA片段。
采用根据α-琼脂糖酶的氨基酸序列信息制备的寡核苷酸和与所述接头杂交的寡核苷酸作为引物以及用所述基因组文库作模板，进行PCR。按照常规方法使获得的扩增产物掺入载体(例如质粒载体)中。
按照已知方法可测定上述(1)至(3)获得的含有α-琼脂糖酶基因的转化体中的α-琼脂糖酶基因的核苷酸序列以及上述(4)获得的含有α-琼脂糖酶基因的重组DNA分子的核苷酸序列。如果所述克隆不编码完整的α-琼脂糖酶多肽，则通过重复步骤揭示所述α-琼脂糖酶的完整读框，所述步骤包括根据已确定的核苷酸序列制备新探针，并用所述探针筛选基因组文库以获得新的克隆。例如根据由此获得的信息可制备包含编码α-琼脂糖酶的完整读框的克隆。
通过将上述获得的编码α-琼脂糖酶的基因与合适的表达载体连接在一起，经基因工程可大量产生具有α-琼脂糖酶活性的多肽。
以下简述获得琼脂糖酶1-7基因的方法。
用溶菌酶裂解通过培养TKR1-7AG获得的细胞，然后使其去除蛋白，乙醇沉淀等获得基因组DNA。用限制酶BamHI部分消化基因组DNA。将获得的DNA片段插入质粒载体(氨苄青霉素抗性)中，以构建质粒文库。使用质粒文库转化大肠杆菌。使转化体在含1.5％(w/v)琼脂和50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长，并于37℃培养5天。培养后，分离观测到周围琼脂分解的菌落，将其接种到含氨苄青霉素的LB培养基中并培养。测定由所述细胞制备的粗提取物的α-琼脂糖酶活性。按照常规方法由观测到α-琼脂糖酶活性的转化体提取质粒DNA。测得插入质粒DNA的DNA长度约8kb。该重组质粒命名为pAA1。用所述质粒转化的大肠杆菌命名并表示为大肠杆菌JM109/pAA1，于1999年5月26日(最初保藏日期)根据布达佩斯条约以保藏号FERM BP-6992保藏于日本国际贸易和工业部工业科技局的国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)。
对插入质粒pAA1的DNA片段的核苷酸序列进行分析显示，它含有作为编码α-琼脂糖酶的一个区的编码925个氨基酸组成的多肽的读框(ORF)。所述读框的核苷酸序列和所述读框编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO12和14。因此，SEQ ID NO14的氨基酸序列是本发明琼脂糖酶的一个实例。比较该氨基酸序列与以前测定的琼脂糖酶1-7的N-末端氨基酸序列(P1)表明，琼脂糖酶1-7是SEQ ID NO14氨基酸序列第28号氨基酸至第925号氨基酸的氨基酸序列组成的多肽，而且所述氨基酸序列由SEQ ID NO12核苷酸序列第82号碱基至2778号碱基(包括终止密码子)的核苷酸序列编码。认为SEQ ID NO14氨基酸序列的氨基酸1-27组成的氨基酸序列是信号序列。而且，具有SEQID NO14氨基酸序列第177号氨基酸至第925号氨基酸的749个氨基酸残基组成的氨基酸序列的多肽也具有本发明的α-琼脂糖酶的一种活性。
以下简述获得α-琼脂糖酶4-3基因的方法。根据SEQ ID NO2表示的琼脂糖酶4-3的N-末端氨基酸序列(P2)制备混合的引物3和4。混合的引物3和4的序列分别示于SEQ ID NO6和7。
如以上关于α-琼脂糖酶1-7所述，由TKR4-3AGα制备的染色体DNA用限制酶BamHI完全消化。使BamHI接头连接到消化的DNA末端。采用获得的DNA作为模板以及采用LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)所附的混合的引物3和引物Cl进行PCR。
其次，采用第一PCR如此获得产物作为模板以及LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)所附的混合的引物4和引物C2进行PCR。结果观测到约2kb的扩增产物。该DNA片段命名为4-3N。
分析所扩增片段的末端区的核苷酸序列。根据对应于所述琼脂糖酶N-末端部分的编码区的核苷酸序列，制备其核苷酸序列分别示于SEQ ID NO8和9的引物5和6。同样，根据对应于所述琼脂糖酶C末端部分的核苷酸序列，制备其核苷酸序列分别示于SEQ ID NO10和11的引物7和8。
当如上所述对4-3N进行PCR时，例外的是使用引物5和6代替混合的引物3和4，获得约1.0kb的DNA片段，称为4-3UN。同样，当用引物7和8进行PCR时，获得约2.0kb的DNA片段，称为4-3C。尽管考虑了以前确定的4-3N的核苷酸序列，但是对片段4-3UN和4-3C进行核苷酸序列分析显示，编码951个氨基酸组成的多肽的读框。所述读框的核苷酸序列和所述读框核苷酸序列编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO13和15。在R-3UN中，发现了编码氨基酸序列P2的核苷酸序列(编码183个氨基酸的上游核苷酸序列)以及另一个上游SD样序列。
所以，SEQ ID NO15氨基酸序列为本发明琼脂糖酶的一个实例。比较此氨基酸序列与前面鉴定的琼脂糖酶4-3的N-末端氨基酸序列表明，琼脂糖酶4-3为SEQ ID NO15氨基酸序列第184号氨基酸至第951号氨基酸的氨基酸序列组成的多肽，而所述氨基酸序列由SEQ ID NO13核苷酸序列的第550号至第2856号(包括终止密码子)的核苷酸序列编码。
如上所述获得的琼脂糖酶1-7和琼脂糖酶4-3的氨基酸序列和编码这些酶的基因的核苷酸序列与β-琼脂糖酶的氨基酸序列和编码所述酶的基因的核苷酸序列没有同源性，其中β-琼脂糖酶是以不同于本发明琼脂糖酶的方式裂解琼脂糖的已知琼脂糖消化酶。因此，认为这些序列是绝对新的。
通过将编码本发明α-琼脂糖酶的基因(例如编码琼脂糖酶1-7或琼脂糖酶4-3的基因)连接到合适载体上，能够构建重组DNA分子。而且，通过将重组DNA分子导入合适宿主中可制备转化体。用通过培养所述转化体获得的培养物生产本发明的α-琼脂糖酶。所以，采用所述转化体有可能大量生产本发明的α-琼脂糖酶(例如琼脂糖酶1-7或琼脂糖酶4-3)。
按照已知方法在编码α-琼脂糖酶的基因中导入一种突变，可产生突变的α-琼脂糖酶。可使用的导入突变的方法实例包括但不限于寡核苷酸双琥珀法(Hashimoto-Gotoh，T.等，Gene，152271-275(1995))、缺口双链体法(Kramer，W.等，Nucl.Acids Res.，129441(1984)；Kramer，W.等，Methods in Enzymology，154350(1987))和Kunkel法(Kunkel，T.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488(1985)；Kunkel，T.A.，Methodsin Enzymology，154367(1987))。
通过表达编码其中在需要表达的α-琼脂糖酶的N-末端加入信号序列的多肽的基因，可使目的α-琼脂糖酶分泌出转化体。所述信号序列不限于具体某一种，例如SEQ ID NO14的第1-27号氨基酸代表的琼脂糖酶1-7的信号序列。该信号序列由SEQ ID NO12的第1-81号碱基的核苷酸序列编码。
可用于构建所述重组DNA分子的载体的实例包括但不限于质粒载体、嗜菌体载体和病毒载体。根据使用所述重组DNA的目的可选择合适的载体。如果构建重组DNA分子是为了产生α-琼脂糖酶，则优选含有启动子和/或其它用于表达控制的区段的载体。这类质粒载体的实例包括但不限于pKF19k、pT7BlueT和pET16b。可用于制备转化体的宿主包括但不限于诸如细菌、酵母和丝状真菌的微生物以及哺乳动物、鱼、昆虫等的培养细胞。使用采用适用于所述宿主的载体构建的重组DNA分子，制备转化体。
下面简述通过基因工程产生琼脂糖酶1-7的方法。
采用编码α-琼脂糖酶1-7基因的质粒pAA1作为模板，通过PCR扩增含有编码多肽的核苷酸序列的DNA片段，所述多肽具有例如从SEQ ID NO14第28或177号氨基酸开始的氨基酸序列，以便构建其中所扩增的片段插入合适质粒载体(例如pKF19k(Takara Shuzo)、pT7BlueT(Takara Shuzo)或pET16b(Takara Shuzo))中的质粒。用合适液体培养基培养用这种质粒转化的大肠杆菌(例如大肠杆菌JM109或BL21(DE3)pLysS)。必要时，采用IPTG等进行诱导。表达插入所述质粒的DNA片段编码的多肽。单位体积培养物内转化体表达的α-琼脂糖酶活性通常高于TKR1-7AGα培养物观测到的活性。
对于琼脂糖酶4-3，在用所述微生物TKR4-3α的染色体DNA作为模板，通过PCR扩增含有编码例如具有从SEQ ID NO15的第184号氨基酸开始的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的DNA片段后，如以上关于琼脂糖酶1-7所述，可用基因工程制备编码所述α-琼脂糖酶的转化体。获得的转化体表达α-琼脂糖酶活性，而且单位体积培养物的活性高于TKR4-3AGα培养物观测到的活性。
采用常规纯化方法例如用硫酸铵盐析或溶剂沉淀，能够部分纯化用如上所述的基因工程产生的本发明α-琼脂糖酶。此外，利用已知纯化方法例如组合柱层析(例如阴离子交换柱和凝胶过滤柱)能够获得电泳时产生单一带的纯化酶制剂。
使如此获得的不同纯度的本发明重组α-琼脂糖酶与作为底物的红海藻含有的多糖如琼脂或琼脂糖反应，可产生诸如琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂己糖的琼脂寡糖。
实施例以下实施例更详细地阐明本发明，而不是用来限制本发明范围。
实施例1用TKR1-7AGα产生α-琼脂糖酶纯化本发明的α-琼脂糖酶后，如下检测酶活性用琼脂糖L03(Takara Shuzo，编号5003)作底物进行酶反应，然后采用高效液相色谱定量产生的琼脂四糖。下文更详细介绍该方法。
制备在10mM tris盐酸盐(pH 7.0)、10mM氯化钙和10mM氯化钠中含有琼脂糖L03浓度为0.2％的溶液。使180μl该溶液与20μl酶溶液混合。使该混合物于42℃反应30-120分钟、优选60分钟，然后于60℃加热1分钟终止反应。将30μl反应混合物过TSK凝胶α-2500柱(内径7.8mm；长度300mm；Tosoh，编号18339)。利用70℃乙腈溶液作洗脱液、流速0.8ml/分钟，在保留时间约26分钟洗脱出一个峰。定量在所述峰中酶反应产生的琼脂四糖。1单位(U)本发明α-琼脂糖酶定义为10分钟产生1微摩尔琼脂四糖的酶量。
制备100ml人工海水(产品名称Jamarine S；JamarineLaboratory)。分别以0.3％和0.02％浓度向其中加入蛋白胨(DIFCO，编号0123-17-3)和酵母提取物(DIFCO，编号0127-17-9)。然后用3M碳酸钠将pH调节至8.0。把获得的混合物转移到500ml锥形瓶中。向其中加入0.1g琼脂(Nacalai Tesque，编号010-28)。用高压灭菌器灭菌后，将微生物TKR1-7AGα接种到所述混合物中，于25℃、120rpm培养过夜。获得的培养物用作预培养物。
如下进行主培养。以51小型发酵罐制备31上述培养基，用高压灭菌器灭菌。将30ml预培养物接种到所述培养基中，于25℃、250rpm培养24小时。然后以8,000×g离心培养物20分钟收集约31去除细胞的上清液。
于4℃或4℃以下进行以下步骤。
将所述上清液置于透析膜(Sanko Junyaku，编号UC-36-32-100)，并将其浸入约500g聚乙二醇2个夜晚进行浓缩，直到其中的溶液体积约100ml为止，然后用缓冲液A(20mM tris-盐酸盐(pH 7.0)、10mM氯化钙、10mM氯化钠)透析脱盐。将透析液上样到用缓冲液A平衡的装填30ml强阴离子交换树脂Super Q(Tosoh，编号17227)的柱上。用10mM-150mM氯化钙的线性梯度(总洗脱体积600ml)洗脱吸附的α琼脂糖酶。收集于50mM-100mM氯化钙浓度洗脱的约60ml具有α-琼脂糖酶活性的流分。
用缓冲液B(10mM tris-盐酸盐(pH 7.0)、10mM氯化钙、10mM氯化钠)透析该流分，使其脱盐，然后加样到装填20ml Super Q的柱(2cm×6.3mm)上。在这种情况下，用10mM-1.0M氯化钠线性梯度(总洗脱体积200ml)洗脱所吸附的酶。于约0.5M氯化钠洗脱获得40ml具有α-琼脂糖酶活性的流分。用缓冲液B透析该流分，然后使其过装填10ml DEAE-TOYOPEARL(Tosoh，编号007473)的柱(0.8cm×5.7mm)。用10mM-150mM氯化钙线性梯度(总洗脱体积100ml)收集约20ml具有α-琼脂糖酶活性的流分。
然后用离心超滤膜Centriprep-10(Amicon，编号4304)使所述流分浓缩至约1ml。利用以缓冲液B平衡的装填Sephadex G-100(Pharmacia，编号17-0060-01)的柱(0.8cm×60mm)，使浓缩液进行凝胶过滤，获得约15ml具有α-琼脂糖酶活性的流分。使该流分过5ml QAE-TOYOPEARL(Tosoh，编号14026)的柱(0.8cm×10mm)，利用10mM-150mM氯化钙线性梯度(总洗脱体积100ml)洗脱获得约4ml的α-琼脂糖酶流分。
经SDS-PAGE分析如此获得的α-琼脂糖酶流分揭示，目的酶几乎纯化至均一，其分子量约95,000。如此获得的纯化α-琼脂糖酶制剂的总活性为45U。该流分在以下的实验中用作琼脂糖酶1-7。
实施例2用TKR4-3AGα产生α-琼脂糖酶如在上文实施例1中关于微生物TKR1-7AGα所述，培养微生物TKR4-3AGα，以获得约31培养物上清液。
将培养物上清液置于透析膜(Sanko Junyaku，编号UC-36-32-100)，并将其浸入约500g聚乙二醇2个夜晚进行浓缩，直到其中的溶液体积约300ml为止，然后用缓冲液C(10mM tris-盐酸盐(pH 7.0)、10mM氯化钙、50mM氯化钠)透析。将约三分之二的透析液上样到用缓冲液C平衡的装填30mlSuper Q的柱(2cm×9.5mm)上。用10mM-80mM氯化钙线性梯度(总洗脱体积400ml)洗脱吸附的α琼脂糖酶。收集于40mM-50mM氯化钙浓度洗脱的约40ml具有α-琼脂糖酶活性的流分用Centriprep-10浓缩该流分，并用缓冲液B稀释脱盐，然后加样到装填10ml DEAE-TOYOPEARL的柱(1.5cm×5.7mm)。用10mM-100mM氯化钙线性梯度(总洗脱体积100ml)洗脱吸附的酶。于约45mM氯化钙浓度洗脱获得9ml具有α琼脂糖酶活性的流分。用Centriprep-30(Amicon，编号4306)浓缩该流分，并用缓冲液B稀释5倍，然后将其过用缓冲液B平衡的装填2ml QAE-TOYOPEARL的柱(0.8cm×4cm)。用10mM-120mM氯化钙线性梯度(总洗脱体积40ml)收集吸附于所述柱上的α琼脂糖酶的流分。
经SDS-PAGE分析如此获得的α-琼脂糖酶流分揭示，所述α-琼脂糖酶几乎纯化至均一。获得的所述α-琼脂糖酶总活性为1.53U。该流分在以下的实验中用作琼脂糖酶4-3。
实施例3检测酶的各种特性(1)底物特异性和作用制备10μl反应缓冲液(10mM tris-盐酸盐(pH 7.0)、10mM氯化钙、10mM氯化钠)，它含有一种选自以下的糖4种琼脂寡糖(琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂己糖和琼脂八糖)(浓度各为2.5mM)、3种新琼脂寡糖(新琼脂二糖、新琼脂四糖和新琼脂己糖)(浓度各为2.5mM)和琼脂糖L03(浓度为1％)。向其中加入10μl琼脂糖酶1-7或琼脂糖酶4-3溶液。使所述混合物于42℃反应30分钟。利用展开溶剂使反应产物进行薄层层析，所述展开溶剂的组成为氯仿∶甲醇∶醋酸＝3∶3∶1。展开后，苔黑酚-硫酸法证实反应产物。
结果证实，琼脂糖酶1-7和琼脂糖酶4-3均裂解琼脂己糖、琼脂八糖、新琼脂己糖和琼脂糖。
使琼脂糖酶1-7作用于琼脂己糖获得的薄层层析结果示于
图1。使琼脂糖酶4-3作用于琼脂己糖获得的薄层层析结果示于图2。在
图1和2中，在相应的道上展开的样品如下道1琼脂二糖；道2琼脂四糖；道3琼脂己糖；道4与本发明琼脂糖酶反应的琼脂己糖；道5琼脂二糖和琼脂四糖的混合物。由这些图可知，本发明的α-琼脂糖酶消化琼脂己糖产生琼脂二糖和琼脂四糖。
(2)鉴定α-琼脂糖酶反应的产物在10mM tris-盐酸盐(pH 7.0)、10mM氯化钙和10mM氯化钠中含有1.0％浓度琼脂糖L03的溶液2.0ml中加入琼脂糖酶1-7或琼脂糖酶4-3。使所述混合物于42℃反应60分钟。反应后，取部分反应混合物过凝胶过滤柱(Tosoh，TSKgel α-2500)，采用70％乙腈作洗脱剂、流速0.8ml/分钟进行层析。收集保留时间约26分钟洗脱的流分，用旋转蒸发器浓缩至干。测定产物重量约4mg。
利用JNM-EX270 FT NMR系统(Nippon Denshi)经核磁共振分析流分证实，各酶作用由琼脂糖产生而且包含于所述流分的物质为琼脂四糖。因此，证实琼脂糖酶1-7和琼脂糖酶4-3均可水解琼脂糖分子中D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖之间的α-1，3键，产生包含琼脂四糖的琼脂寡糖。
(3)反应pH
制备10μl反应混合物，它包含1％琼脂糖L03、10mM氯化钙和10mM氯化钠，采用终浓度为10mM的括号内所示缓冲液将反应混合物的pH调节至以下值4.5(醋酸盐缓冲液)；5.5(苹果酸盐缓冲液)；6.0、6.5(醋酸盐缓冲液)；或7.0、7.5或8.8(tris缓冲液)。向其中加入10μl酶溶液。使混合物于42℃反应1小时。使反应混合物进行薄层层析，用氯仿∶甲醇∶醋酸＝3∶3∶1(v/v/v)展开。通过苔黑酚-硫酸法证实反应产物。结果证实，琼脂糖酶1-7和琼脂糖酶4-3分别在中性至弱酸性条件下和弱碱性至弱酸性条件下呈现其消化琼脂糖的活性。
(4)最适温度于不同温度下检测琼脂糖酶1-7和琼脂糖酶4-3的酶活性。对于琼脂糖酶1-7和琼脂糖酶4-4而言，抑制酶失活而且反应迅速进行的温度为37-42℃。
(5)热稳定性于48℃、50℃或60℃加热琼脂糖酶1-7或琼脂糖酶4-3的纯化酶溶液30秒钟。然后在所加热的溶液中加入含0.2％浓度琼脂糖L03的10mM tris-盐酸盐(pH 7.0)、10mM氯化钙和10mM氯化钠的溶液。使混合物于42℃反应1小时。用沸水加热1分钟终止反应。按照实施例1所述测定活性的方法定量反应产物。结果，琼脂糖酶1-7于48℃处理后保留其25％活性，而琼脂糖酶4-3于50℃处理后保留其22％活性，没有热处理的活性定义为100％。
(6)分子量通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定琼脂糖酶1-7的分子量。用含SDS的10-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶，将琼脂糖酶1-7和分子量标记物(Bio-Rad，肌球蛋白(m.w.200,000)，β-半乳糖苷酶(m.w.116,250)、磷酸化酶b(m.w.97,400)、牛血清白蛋白(m.w.66,200)、卵清蛋白(m.w.45,000)、碳酸酐酶(m.w.31,000)、胰蛋白酶抑制剂(m.w.21,500)、溶菌酶(m.w.14,400))一起电泳。根据基于在凝胶中的迁移率测定，琼脂糖酶1-7的分子量约95,000道尔顿。
通过平衡密度梯度离心测定琼脂糖酶4-3的分子量。通过变化缓冲液中的15％-35％的甘油浓度制备密度梯度，所述缓冲液含有10mMtris-盐酸(pH 7.0)、10mM氯化钙和50mM氯化钠。用2个5-ml离心管制备4.8ml线性密度梯度，使得最低层的甘油浓度为35％，而最高层的甘油浓度为15％。将100μl溶液覆盖于一支离心管上层液，所述溶液含15μl分子量标记物Low Range(Bio-Rad)和15％浓度甘油的上述缓冲液。使100μl琼脂糖酶4-3酶制剂覆盖于另一支离心管上层液。利用摆动式转子于45,000rpm、4℃将两支离心管离心21小时。离心后，从每支离心管的顶部至底部收集各含250μl缓冲液的流分1-20。对从加入分子量标记物的离心管收集的相应流分进行SDS-PAGE。对从加入酶制剂的离心管收集的相应流分进行SDS-PAGE以及测量酶活性。根据含分子量标记物的流分的SDS-PAGE结果，在相当于分子量约65,000-85,000的流分第8-10号检测到α-琼脂糖酶活性峰。根据这些结果以及含所述酶制剂的流分的SDS-PAGE结果，估计琼脂糖酶4-3的分子量约85,000。
(7)利用Edman降解法分析氨基酸序列用Edman降解法测定实施例1和2获得的α-琼脂糖酶1-7和α-琼脂糖酶4-3的氨基酸序列。利用10-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶，对含相当于10皮摩尔酶蛋白的琼脂糖酶1-7或琼脂糖酶4-3的纯化酶制剂进行SDS-PAGE。电泳后，把在凝胶中分离的酶印迹到膜ProBlot(AppliedBiosystems)上。用蛋白质测序仪G1000A(Hewlett Packard)分析吸附有酶的膜部分。结果测得琼脂糖酶1-7和琼脂糖酶4-3分别包含氨基酸序列P1Asp-Thr-Leu-Ser-Val-Glu-Ala-Glu-Met-Phe(SEQ ID NO1)和氨基酸序列P2Gly-Asp-Ile-Val-Ile-Glu-Leu-Glu-Asp-Phe-Asp-Ala-Thr-Gly-Thr-Thr-Gly-Arg-Val-Ala(SEQ ID NO2)。
实施例4产生琼脂寡糖以1.0％(w/v)浓度在2ml反应缓冲液(10mM tris-盐酸盐(pH 7.0)、10mM氯化钙、10mM氯化钠)中加入琼脂糖L03。再向其中加入2U纯化的琼脂糖酶1-7制剂。使混合物于42℃反应16小时。反应后，使反应混合物通过0.22-μm滤膜(Millipore，编号SLGVL040S)过滤。在与在实施例1中用于测定本发明的所述酶的活性的相同条件下，利用高效液相层析分析过滤后的反应混合物，以测定所产生的琼脂寡糖。结果在反应混合物中检测到琼脂二糖、琼脂四糖和琼脂己糖。因此，证实上述酶反应产生这些较小的琼脂寡糖。
实施例5用TKR1-7AGα和TKR4-3AGα制备染色体DNA制备人工海水(产品名称Jamarine S；Jamarine Laboratory)。分别以0.3％(w/v)和0.02％(w/v)浓度向其中加入蛋白胨(DIFCO，编号0123-17-3)和酵母提取物(DIFCO，编号0127-17-9)。然后用3M碳酸钠将pH调节至8.0。以0.1％(w/v)浓度向其中加入琼脂(Nacalai Tesque，编号010-28)。用高压灭菌器灭菌混合物。将10μlα-琼脂糖酶生产菌株TKR1-7AGα和TKR4-3AGα之一的甘油原种接种到2ml所述培养基中，于25℃培养过夜。将1ml所述培养物接种到100ml所述相同培养基中，于25℃培养过夜。然后以8,000×g离心10分钟收集细胞。将细胞悬浮于10ml缓冲液A(100mM氯化钠、100mM tris-盐酸盐(pH 8.0)、10mM EDTA(pH 8.0))中。向其中加入0.25ml溶菌酶溶液(20mg/ml)。使混合物于37℃温育1小时。然后向其中加入2.5ml含5％浓度SDS的缓冲液A。振摇下使获得的混合物于60℃温育20分钟。向其中加入1.5ml蛋白酶K溶液(20mg/ml)。使混合物于37℃温育过夜。然后加入几乎等体积的酚，室温下轻轻振摇混合物约10分钟。以2,000×g离心混合物10分钟。将上清液转移到冷乙醇中。用玻棒缠绕染色体DNA。重复所述步骤2次后，加入50μl RNA酶溶液(10mg/ml)，使所述混合物于37℃温育10分钟。通过乙醇沉淀从所述溶液回收染色体DNA，并悬浮于5ml缓冲液B(140mM氯化钠、20mM tris-盐酸盐(pH 7.5)、1mM EDTA(pH 7.5))中。用相同缓冲液透析所述悬浮液过夜。然后从TKR1-7AGα和TKR1-7AGα分别获得约1.5mg和约3.1mg染色体DNA。根据OD260nm/280nm检测各DNA的纯度。在各情况下纯度测定值均约1.8。染色体DNA用于下文所述的克隆。
实施例6克隆α-琼脂糖酶1-7基因用1.0％低熔点琼脂糖凝胶对10μg用限制酶BamHI部分消化的TKR1-7AGα染色体DNA进行电泳。用溴化乙锭染色后，在紫外线照射下切取相当于4-10kb的部分。通过按照常规方法热熔化从凝胶提取以及纯化DNA。利用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo)使回收的DNA片段插入质粒pUC19(Takara Shuzo)的BamHI位点中。用质粒文库转化大肠杆菌JM109。使转化体在含1.5％(w/v)浓度琼脂和50μg/ml浓度氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长。于37℃培养过夜后，一个平板上生长约1000个转化体。使20个平板再于25℃培养4天。结果观测到2个菌落周围的琼脂降解。把各菌株接种到2ml含氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃培养过夜。检测到由获得细胞制备的粗提取物的α-琼脂糖酶活性。按照常规方法提取各转化体的质粒DNA。用限制酶BamHI消化测得各转化体的插入DNA长度约7.2kb。根据限制酶消化谱型认为这些杂种质粒彼此相同，命名为pAA1。将用质粒pAA1转化的大肠杆菌命名并表示为大肠杆菌JM109/pAA1，于1999年5月26日(最初保藏日期)根据布达佩斯条约以保藏号FERM BP-6992保藏于日本国际贸易和工业部工业科技局的国立生命科学和人体技术研究所。
根据SEQ ID NO1表示的琼脂糖酶1-7的氨基酸序列P1，设计SEQ ID NO3表示的混合引物1。采用该引物和与pUC载体特异性杂交、SEQ ID NO4表示的引物2以及pAA1作为模板进行PCR。
在0.5-ml试管中加入50ng pAA1、5μl ExTaq缓冲液、8μl dNTP混合物、1μl混合的引物1、1μl引物2和0.5μl TaKaRa ExTaq，以进行PCR。再加入无菌水使总体积为50μl。在所述溶液上方覆盖50μl矿物油后，将试管置于自动基因扩增仪Thermal Cycler(Takara Shuzo)中。于94℃变性2分钟后，进行30个PCR循环。每个循环包括于94℃变性1分钟，引物于50℃退火2分钟以及于72℃进行合成反应3分钟。PCR后，使全部反应混合物在1.0％低熔点琼脂糖凝胶中进行电泳。使从所述凝胶切除的约3.5kb的扩增DNA片段与pT7Blue(Novagen)连接。用Tap DNA聚合酶，按照双脱氧链终止法从其N端侧测定该DNA片段的核苷酸序列。根据如上所述测定的序列设计SEQID NO5表示的引物。利用该引物测定上游核苷酸序列。结果发现，在编码对应于SEQ ID NO1表示的氨基酸序列P1的核苷酸序列的上游存在编码27个氨基酸的核苷酸序列，在其进一步的上游区存在SD样序列，而pAA1含有编码总计925个氨基酸组成的多肽的读框(ORF)。该读框的核苷酸序列和此读框编码的氨基酸序列分别示于SEQID NO12和14。从微生物TKR1-7AGα纯化的α-琼脂糖酶的N-末端序列P1等于SEQ ID NO13氨基酸序列第28号至第37号氨基酸的序列。
实施例7克隆α-琼脂糖酶4-3基因根据SEQ ID NO2表示的琼脂糖酶4-3的氨基酸序列P2第2-11号以及第12-20号氨基酸的序列，设计混合的引物3和4。利用LAPCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)使用这些引物克隆琼脂糖酶4-3基因。混合的引物3和4的序列分别示于SEQ ID NO6和7。
如下进行第一轮PCR。用限制酶BamHI完全消化由实施例5的TKR4-3AGα制备的染色体DNA。用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo)使BamHI接头连接到消化的DNA末端。将一部分连接混合物置于0.5-ml试管中，以进行PCR，其中加入5μl 10×LA PCR缓冲液、8μl dNTP混合物、1μl混合引物3、1μl LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)附带的引物Cl和0.5μl TaKaRa LATaq。再加入无菌水使总体积为50μl。在所述溶液上方覆盖50μl矿物油后，将试管置于自动基因扩增仪Thermal Cycler(Takara Shuzo)中。于94℃变性2分钟后，进行30个PCR循环。每个循环包括于94℃变性1分钟，引物于50℃退火2分钟以及于72℃进行合成反应3分钟。
用如此获得的第一轮PCR产物进行第二轮PCR。在第一轮PCR所用的相同条件下，用1μL第一轮PCR反应混合物作模板，以及混合引物4和LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)附带的引物C2的组合进行PCR。去除上层覆盖的矿物油后，使5μl反应混合物在1.0％琼脂糖凝胶中进行电泳。利用溴化乙锭染色DNA证实扩增的产物。结果观测到约2kb的扩增产物，将所述DNA片段命名为4-3N。
从琼脂糖凝胶切除此扩增片段，按照常规方法提取纯化，并将其连接到载体pT7Blue。用连接混合物转化大肠杆菌JM109。用获得的转化体按照双脱氧链终止法测定4-3末端区核苷酸序列。
根据测定的4-3N末端区序列设计引物。利用LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)克隆位于4-3N上游以及下游的DNA片段。
根据如上所述测定的4-3N末端区中的N-末端周围区序列设计、分别以SEQ ID NO8和9表示的引物5和6，使用它们克隆位于4-3N上游的DNA片段。如上所述进行克隆，以克隆4-3N，不同的是退火引物的温度变为55℃。结果获得约1.0kb的DNA片段，命名为4-3U。
根据如上所述测定的4-3N末端区中的C-末端周围区序列设计、分别以SEQ ID NO10和11表示的引物8和9，使用它们克隆位于4-3N下游的DNA片段。如上所述进行克隆，以克隆4-3N，不同的是退火引物的温度变为55℃。结果获得约2.0kb的DNA片段，命名为4-3C。
将由此获得的4-3UN和4-3C片段各自连接到载体pT7Blue(Novagen)。按照双脱氧链终止法测定核苷酸序列。对如上所述测定的4-3N、4-3UN和4-3C DNA片段的核苷酸序列进行分析和序列对比，揭示一个读框(ORF)编码951个氨基酸组成的多肽。所述读框的核苷酸序列和所述读框的所述核苷酸序列编码的氨基酸序列分别以SEQ IDNO13和15表示。在4-3UN中，发现编码氨基酸序列P2的核苷酸序列、编码183个氨基酸的上游核苷酸序列和更上游的SD样序列。测得从微生物TKR4-3纯化的α-琼脂糖酶的N-末端氨基酸序列P2等于SEQ ID NO15氨基酸序列第184号至第203号氨基酸的序列。
如上所述获得的琼脂糖酶1-7和琼脂糖酶4-3的氨基酸序列以及所述基因的核苷酸序列与β-琼脂糖酶氨基酸序列及其基因的核苷酸序列没有同源性，已知β-琼脂糖酶以不同于本发明的琼脂糖酶的方式裂解琼脂糖的琼脂糖消化酶。因此，认为这些序列绝对是新型的。
实施例8构建表达α-琼脂糖酶1-7的质粒合成具有SEQ ID NO18序列的引物10。引物10是这样一种引物它在第8至13号碱基含有限制酶NdeI的识别序列，在第14至25号碱基含对应于α-琼脂糖酶1-7氨基酸序列(SEQ ID NO14)中的第28至31号氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列。
采用引物10和与pAA1的一部分载体pUC19杂交的引物2(SEQID NO4)以及用pAA1作模板进行PCR。
在0.5-ml试管中加入引物10和引物2各10皮摩尔、10ng作为模板的实施例6获得的pAA1、5μl 10×ExTaq缓冲液、8μl dNTP混合物和0.5μl TaKaRa ExTaq，以进行PCR。再加入无菌水使总体积为50μl。将试管置于自动基因扩增仪Thermal Cycler(Takara Shuzo)中。于94℃变性2分钟后，进行25个PCR循环。每个循环包括94℃1分钟，55℃2分钟以及72℃3分钟。通过乙醇沉淀浓缩PCR产物并使其脱盐，用限制酶NdeI(Takara Shuzo)和BamHI(Takara Shuzo)双重消化，然后使其在1.0％琼脂糖凝胶中进行电泳。分离、提取以及纯化NdeI-BamHI消化产物。用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo)使纯化产物与用NdeI和BamHI消化的pKF19k(Takara Shuzo)混合并连接。用10μl连接混合物转化大肠杆菌JM109。使转化体生长于含1.5％(w/v)浓度的琼脂和50μg/ml浓度的卡那霉素的LB培养基上。用白色菌落制备质粒，进行DNA测序，选择所述PCR产物正确插入的质粒，命名为pAA201。pAA201是编码琼脂糖酶1-7氨基酸序列(SEQ ID NO14)第28至925号氨基酸的氨基酸序列的质粒。
将插入pAA201的转化体接种到2.5ml含50μg/ml卡那霉素和10mM氯化钙的LB液体培养基中，于37℃培养过夜。取一部分培养物接种到2.5ml相同新鲜培养基中，于25℃培养直到指数生长期为止。此时以1.0mM终浓度加入IPTG。继续于15℃培养过夜，以诱导目的蛋白表达。然后离心收集细胞，将其悬浮于150μl细胞破碎溶液(20mM tris盐酸盐(pH 7.0)、10mM氯化钙、10mM氯化钠)中。超声破碎细胞。离心使上清液提取物和沉淀物彼此分离，并用作利用琼脂糖作底物检测α-琼脂糖酶活性的样品。然后观测提取物的活性。在100ml培养物中含有的活性比野生型菌株TKR1-7AGα活性高约25倍。
实施例9采用pT7BlueT载体表达α-琼脂糖酶1-7的系统合成具有SEQ ID NO19序列的引物11。引物11是这样一种引物它在第13至30号碱基具有对应于α-琼脂糖酶1-7氨基酸序列(SEQID NO14)第28至33号氨基酸序列的核苷酸序列。
用引物11和引物2并使用pAA1作为模板进行PCR。在1.0％琼脂糖凝胶中通过电泳分离PCR产物，提取以及纯化。使纯化PCR产物连接到设计用于克隆的载体pT7BlueT(Takara Shuzo)，以构建表达载体。用于PCR的条件与实施例8所述条件相同。进行DNA测序，并选择正确插入所述PCR产物的质粒。
选定的杂种质粒命名为pAA301。pAA301是一个类似于pAA201的质粒，编码α-琼脂糖酶1-7氨基酸序列(SEQ ID NO14)第28至925号氨基酸序列。
使用pAA301转化大肠杆菌JM109，将获得的转化体接种到含50μg/ml氨苄青霉素和10mM氯化钙的LB培养基中。利用IPTG诱导目的蛋白表达，按照以上实施例8所述测定α-琼脂糖酶活性。然后观测到提取物的活性。100ml所述培养物含有的活性比TKR1-7AGα的活性高约100倍。
实施例10利用pET16b表达α-琼脂糖酶1-7的系统合成具有SEQ ID NO20序列的引物12。引物12是这样一种引物它在第17至34号碱基具有与对应于α-琼脂糖酶1-7氨基酸序列(SEQ ID NO14)第919至924号氨基酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，在第9至14号碱基具有限制酶BamHI识别序列。
利用引物10(SEQ ID NO18)和引物12(SEQ ID NO18)并使用pAA1作为模板，在实施例8所述条件下进行PCR。通过乙醇沉淀浓缩所扩增的片段并使其脱盐，用NdeI(Takara Shuzo)和BamHI(TakaraShuzo)消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，提取以及纯化。使所述产物连接到用NdeI和BamHI消化的pET16b(Takara Shuzo)中。获得的杂种质粒命名为pAA401。pAA401是类似于pAA201和pAA301的质粒，编码α-琼脂糖酶1-7氨基酸序列(SEQ ID NO14)第28至925号氨基酸的氨基酸序列。
使用pAA401转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，用获得的转化体如以上实施例8所述测定α-琼脂糖酶活性，不同的是用氨苄青霉素代替卡那霉素作为药物。然后观测到提取物的活性。100ml所述培养物含有的活性比TKR1-7AGα的活性高约100倍。
实施例11构建表达α-琼脂糖酶4-3的质粒合成具有SEQ ID NO21序列的引物13和具有SEQ ID NO22序列的引物14。
引物13是这样一种引物它在第12至17号碱基具有限制酶NdeI识别序列，在第18至29号碱基具有与对应于α-琼脂糖酶4-3氨基酸序列(SEQ ID NO15)第184至187号氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列。
引物14是这样一种引物它在第8至13号碱基具有限制酶BamHI识别序列，并且具有与克隆获得的α-琼脂糖酶4-3基因的读框下游区杂交的序列。
利用引物13和14并使用野生型菌株TKR4-3AGα的染色体DNA作为模板进行PCR。制备PCR反应混合物，它含有引物13和14各10皮摩尔、10ng用作模板的用限制酶BamHI消化的野生型菌株TKR4-3AGα的染色体DNA和ExTaq(Takara Shuzo)。于94℃变性2分钟后，进行25个PCR循环。每个循环包括94℃1分钟，50℃2分钟以及72℃3分钟。通过乙醇沉淀浓缩PCR产物，用限制酶NdeI(Takara Shuzo)和BamHI(Takara Shuzo)双重消化。在1.0％琼脂糖凝胶中电泳分离NdeI-BamHI消化产物，提取以及纯化。如实施例8所述构建具有pKF19k的杂种质粒，并转化大肠杆菌JM109。用获得的转化体制备质粒，选择所述PCR产物以正确方向插入的的质粒，命名为pAH101。pAH101是编码α琼脂糖酶4-3氨基酸序列(SEQ ID NO15)第184至951号氨基酸的氨基酸序列的质粒。
用质粒pAH101转化的大肠杆菌命名并表示为大肠杆菌JM109/pAH101，于2000年1月27日根据布达佩斯条约以保藏号FERM BP-7008保藏于日本国际贸易和工业部工业科技局的国立生命科学和人体技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)。
如以上实施例8所述测定具有pAH101的转化体的α-琼脂糖酶活性。然后观测到所述提取物的活性。100ml培养物含有的活性比野生型菌株TKR4-3AGα的活性高约15倍。
实施例12利用pET16b表达α-琼脂糖酶4-3的系统合成具有SEQ ID NO23序列的引物15。
引物15是这样一种引物它在第10至15号碱基具有限制酶BamHI识别序列，在第18至35号碱基具有与对应于α-琼脂糖酶4-3氨基酸序列(SEQ ID NO15)第945至950号氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
利用引物13和15并使用实施例11所述的野生型菌株TKR4-3AGα的染色体DNA作为模板，在实施例8所述的条件下进行PCR。通过乙醇沉淀浓缩所扩增的PCR片段，用限制酶NdeI和BamHI消化，通过琼脂糖凝胶电泳分离，提取以及纯化。使所述产物连接到用NdeI和BamHI消化的pET16b(Takara Shuzo)中。获得的杂种质粒命名为pAH201。pAH201是编码α琼脂糖酶4-3氨基酸序列(SEQ ID NO15)第184至950号氨基酸的氨基酸序列的质粒。
用pAH201转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，获得的转化体用来如以上实施例8所述测定α-琼脂糖酶活性，不同的是用氨苄青霉素代替卡那霉素作为药物。然后观测到所述提取物的活性。100ml培养物含有的活性比TKR4-3AGα活性高约75倍。
实施例13修饰蛋白的活性如下所述通过基因工程制备修饰蛋白。测定修饰蛋白的α-琼脂糖酶活性。
合成具有SEQ ID NO24序列的引物16。
引物16是这样一种引物它在第3至11号碱基具有对应于α琼脂糖酶1-7氨基酸序列(SEQ ID NO14)的第172至174号氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列，在第18至32号碱基具有对应于α-琼脂糖酶1-7氨基酸序列(SEQ ID NO14)的第177至181号氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列，并且在第12-17号碱基具有限制酶NdeI识别序列。
利用引物16和引物2(SEQ ID NO4)并使用pAA1作为模板进行PCR。使所述产物连接到pKF19k，如实施例8所述转化大肠杆菌JM109。用获得的转化体制备质粒。通过证实连接位点的DNA序列获得的杂种质粒命名为pAA501。pAA501是编码缺失α-琼脂糖酶1-7直至第176号氨基酸的部分的多肽(即SEQ ID NO14第177至925号氨基酸的氨基酸序列)的质粒。
如实施例8所述培养用pAA501转化的大肠杆菌JM109，并用IPTG诱导pAA501编码的蛋白的表达，然后观测提取物的α-琼脂糖酶活性。随后观察到所述提取物的α-琼脂糖酶活性。
实施例14DNA印迹杂交用插入α-琼脂糖酶4-3克隆pAH101的片段作探针，针对野生型菌株TKR1-7AGα的染色体DNA进行DNA杂交。按照DIG DNA标记/检测试剂盒(Roche)的方案进行以下步骤。在这种情况下，用限制酶NdeI和BamHI消化pAH101。通过琼脂糖凝胶电泳分离产生的约2.4kb片段，提取和纯化。按照上述试剂盒的方案标记约1.0μg所述纯化片段并用作探针。
用BamHI消化约2.0μg TKR1-7AGα的染色体DNA，在1.0％琼脂糖凝胶中电泳。按照常规方法用0.4N氢氧化钠将DNA片段转移到硝酸纤维素膜(Amersham)上。然后于68℃预杂交1小时。热变性标记探针，并加入其中。用含6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt’s和100mg/ml鲱鱼精子DNA的溶液于68℃杂交过夜。所述膜用2×SSC、0.1％(w/v)SDS中于室温下洗涤2次，每次5分钟，然后用0.1×SSC、0.1％(w/v)SDS于68℃洗涤2次，每次15分钟，以去除过量的探针。然后按照所述方案进行检测反应。结果在相应于约7.2kb的位置观测到一条带。如上所述，通过利用α-琼脂糖酶4-3基因作探针在严格条件下进行检测，能够检测到编码活性α-琼脂糖酶的基因，即野生型菌株TKR1-7AGα的α-琼脂糖酶的基因。比较琼脂糖酶1-7和琼脂糖酶4-3读框的完整序列揭示，它们的氨基酸序列和基因的核苷酸序列的同源性分别为51％和61％。
工业实用性本发明提供新型α-琼脂糖酶。可利用所述酶直接由琼脂糖产生在其还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖的低聚合程度的琼脂寡糖(例如琼脂二糖和琼脂四糖)。用本发明的α-琼脂糖酶产生的琼脂寡糖具有生理活性，例如诱导细胞凋亡活性、抑癌活性、各种抗氧化剂活性、免疫调节活性和抗过敏活性。因此，它们可用于药用组合物、食品和饮料领域。
本发明首次公开了α-琼脂糖酶的氨基酸序列和核苷酸序列。因此，可提供编码具有α-琼脂糖酶活性的多肽的基因。本发明还提供利用所述基因通过基因工程生产具有α-琼脂糖酶活性的多肽的工业上有用的方法。
此外，在利用所述基因的基因工程生产方法中，不需要在培养基中加入琼脂糖诱导产生α-琼脂糖酶。因此，认为培养时能够节省力而且所述酶容易纯化。
另外，基于本发明首次提供α-琼脂糖酶基因的事实，根据所述基因的信息，本发明提供所述基因编码的重组多肽、特异性结合所述多肽的抗体或其片段、以及特异性杂交α-琼脂糖酶的探针或引物。
序列表独立文本SEQ ID NO1琼脂糖酶1-7的N-末端氨基酸序列。
SEQ ID NO2琼脂糖酶4-3的N-末端氨基酸序列。
SEQ ID NO3设计用于利用pAA1作为模板进行PCR的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO4设计用于利用pAA1作为模板进行PCR的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO5设计用于对pAA1进行DNA测序的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO6设计用于扩增DNA片段4-3N的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO7设计用于扩增DNA片段4-3N的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO8设计用于克隆DNA片段4-3UN的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO9设计用于克隆DNA片段4-3UN的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO10设计用于克隆DNA片段4-3C的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO11设计用于克隆DNA片段4-3C的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO12琼脂糖酶1-7基因中的ORF核苷酸序列。
SEQ ID NO13琼脂糖酶4-3基因中的ORF核苷酸序列。
SEQ ID NO14琼脂糖酶1-7的氨基酸序列。
SEQ ID NO15琼脂糖酶4-3的氨基酸序列。
SEQ ID NO16设计用于扩增16S核糖体的DNA片段的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO17设计用于扩增16S核糖体的DNA片段的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO18设计用于构建表达琼脂糖酶1-7的质粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO19设计用于构建表达琼脂糖酶1-7的质粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO20设计用于构建表达琼脂糖酶1-7的质粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO21设计用于构建表达琼脂糖酶4-3的质粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO22设计用于构建表达琼脂糖酶4-3的质粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO23设计用于构建表达琼脂糖酶4-3的质粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO24设计用于构建表达琼脂糖酶1-7的质粒的寡核苷酸。
权利要求
1.一种具有以下物理化学特性的α-琼脂糖酶(1)作用水解3，6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖之间的α-1，3键；(2)底物特异性作用于琼脂糖和琼脂己糖以及比琼脂己糖更长的琼脂寡糖，但是对琼脂四糖没有作用；(3)最适温度于55℃或更低温度呈现其酶活性；以及(4)热稳定性于48℃处理30秒钟后保留其20％或更高活性。
2.按照权利要求1的α-琼脂糖酶，它可得自微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)或微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)。
3.按照权利要求1或2的α-琼脂糖酶，它包含SEQ ID NO14氨基酸序列的第177号氨基酸至第925号氨基酸的749个残基组成的氨基酸序列、或在所述749个残基组成的氨基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
4.按照权利要求1或2的α-琼脂糖酶，它包含SEQ ID NO15氨基酸序列的第184号氨基酸至第950号氨基酸的767个残基组成的氨基酸序列、或在所述767个残基组成的氨基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
5.一种基因，它编码权利要求1-4任一项定义的α-琼脂糖酶。
6.按照权利要求5的基因，它可得自微生物TKR1-7AGα(FERMBP-6990)或微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)。
7.按照权利要求5或6的基因，它编码一种α-琼脂糖酶，该α-琼脂糖酶包含SEQ ID NO14氨基酸序列的第177号氨基酸至第925号氨基酸的749个残基组成的氨基酸序列、或在所述749个残基组成的氨基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
8.按照权利要求5或6的基因，它编码一种α-琼脂糖酶，该α-琼脂糖酶包含SEQ ID NO15氨基酸序列的第184号氨基酸至第950号氨基酸的767个残基组成的氨基酸序列、或在所述767个残基组成的氨基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
9.按照权利要求5或6的基因，它包含SEQ ID NO12核苷酸序列的第529号碱基至第2775号碱基的2247个碱基组成的核苷酸序列、或在所述2247个碱基组成的核苷酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一个或多个碱基的核苷酸序列。
10.按照权利要求5或6的基因，它包含SEQ ID NO13核苷酸序列的第550号碱基至第2850号碱基的2301个碱基组成的核苷酸序列、或在所述2301个碱基组成的核苷酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一个或多个碱基的核苷酸序列。
11.一种基因，它可与权利要求5-10任一项定义的基因在严格条件下杂交并编码具有以下物理化学特性的α-琼脂糖酶(1)作用水解3，6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖之间的α-1，3键；(2)底物特异性作用于琼脂糖和琼脂己糖以及比琼脂己糖更长的琼脂寡糖，但是对琼脂四糖没有作用；(3)最适温度于55℃或更低温度呈现其酶活性；以及(4)热稳定性于48℃处理30秒钟后保留其20％或更高活性。
12.一种重组DNA分子，它包含权利要求5-11任一项定义的基因。
13.一种转化体，它带有权利要求12定义的重组DNA分子。
14.一种产生权利要求1-4任一项定义的α-琼脂糖酶的方法，包括培养能够产生权利要求1-4任一项定义的α-琼脂糖酶的微生物以及从所述培养物收集所述α-琼脂糖酶。
15.按照权利要求14的方法，包括培养属于微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)或微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)所属微生物属的微生物以及从所述培养物收集所述α-琼脂糖酶。
16.一种产生权利要求1-4任一项定义的α-琼脂糖酶的方法，包括培养权利要求13定义的转化体以及从所述培养物收集α-琼脂糖酶。
17.一种产生琼脂寡糖的方法，包括用权利要求1-4任一项定义的α-琼脂糖酶消化琼脂糖以及从获得的消化物收集琼脂寡糖。
全文摘要
具有以下物理化学特性的α－琼脂糖酶:(1)作用:水解3,6－脱水－L－半乳糖和D－半乳糖之间的α－1,3键;(2)底物特异性:作用于琼脂糖和琼脂己糖以及更长琼脂寡糖,而不作用于琼脂四糖;(3)最适温度:于55℃或更低温度呈现其酶活性;以及(4)热稳定性:于48℃处理30秒钟后保有其20%或更高活性。
文档编号C12N9/24GK1347452SQ00806331
公开日2002年5月1日 申请日期2000年2月21日 优先权日1999年2月23日
发明者友野润, 野村佳子, 佐川裕章, 酒井武, 加藤郁之进 申请人:宝酒造株式会社