编码植物脂酶的dna、转基因植物和控制植物衰老的方法

专利名称：编码植物脂酶的dna、转基因植物和控制植物衰老的方法
技术领域：
本发明涉及编码植物多肽并表现出衰老诱导表达的的多核苷酸，含有呈反义方向的所述多核苷酸的转基因植物，以及控制植物衰老的方法。更具体地讲，本发明涉及一种植物脂酶基因，其表达是由衰老的开始诱导的，以及用所述脂酶基因控制植物的衰老。
现有技术衰老是植物生命中生物学发育的终结期。它预示着发生在各种生物学组构水平上的死亡，包括全植株、器官、花、果实、组织和单细胞。
细胞膜损伤是衰老的早期基本特征。脂类代谢，特别是膜脂代谢是细胞衰老的若干生化证据之一。例如，随着衰老的发展，玫瑰花瓣维持较高的乙酰水解酶活性，与它相伴的是膜功能的丧失(Borochov等，植物生理学，1982，69，296-299)。细胞膜损伤是衰老的早期特有的特征，逐渐形成增强了的可渗透性，丧失离子梯度并减弱关键膜蛋白，如离子泵的功能(Brown等，植物生理学论文，X卷，学术出版社，1991，227-275页)。膜结构和功能完整性的这种衰减，大多归因于脂酶介导的磷脂代谢。在衰老的花瓣、叶片、子叶和成熟的果实上，证实了磷脂的丧失(Thompson，J.E.，植物的衰老和老化，学术出版社，SanDiego，1988，51-83页)，并且，它似乎使膜双层的分子组构发生了大的变化，随着衰老的发展会导致细胞功能的损伤。具体地讲，对多种衰老植物组织所做的研究业已提供了膜中脂相分离的证据，这似乎归因于在膜双层中脂类代谢物的积累(McKersie和Thompson，1979，生物化学生物物理学学报，508197-212，Chia等，1981，植物生理学，67415-420)。有越来越多的证据表明，衰老组织中脂类的大部分代谢是通过基因表达的衰老特异性变化而实现的(Buchanan-Wollaston，V.，实验植物学杂志，1997，307181-199)。
衰老的开始可以通过不同的内部和外部因素诱导。例如，乙烯在许多植物的多种发育过程，如种子发芽、幼苗发育、果实成熟和花老化中起作用。植物中乙烯的产生还可能与外伤相关，所述外伤是通过机械创伤、化合物、胁迫(如通过温度和水量改变产生)和通过疾病诱导的。在很多植物中，乙烯都参与了叶片衰老的调控，但用转基因植物和乙烯响应突变体获得的证据表明，尽管乙烯对衰老有影响，但它不是该过程的重要调节子。在很多植物中，乙烯似乎在果实成熟或衰老中不起作用。例如，在诸如草莓的无转变期植物的果实成熟中，在诸如金针菜的某些花的衰老中，以及在诸如拟南芥属的某些叶片的衰老中，特别是在不需要乙烯信号的单子叶植物中乙烯似乎不起作用(Smart，C.M.，1994，新植物学，126419-448；Valpuesta等，1995，植物分子生物学，28575-582)。
能诱导衰老提前开始的外部因素包括环境胁迫，如温度、干旱、光照较差或营养供应，以及病原体的侵袭。对于自然(与年龄相关)衰老来说，环境胁迫诱导的衰老的特征是细胞膜完整性的丧失。具体地讲，接触环境胁迫诱导的电解质渗漏反映了膜损伤(Sharom等，1994，植物生理学，105305-308；Wright和Simon，1973，实验植物学杂志，24400-411；Wright，M.，1974，植物，12063-69；和Eze等，1986，植物生理学，68323-328)，膜磷脂含量的降低(Wright，M.，1974，植物，12063-69)和脂相转变(Sharom等，1994，植物生理学，105305-308)，以上所有现象均可归因于脂酶的作用。受到环境胁迫的植物组织也会产生乙烯，通常称为胁迫乙烯(Buchanan-Wollaston，V.，1997，实验植物学杂志，48181-199；Wright，M.，1974，植物，12063-69)。如上文所述，已知乙烯能导致某些植物的衰老。
会导致渗漏的膜损伤也是组织衰老的重要特征，并且有证据表明它恢复了来自膜磷脂的脂肪酸的脱酯化(McKersie，B.D.，Senarata，T.，Walker，M.A.，Kendall，E.J.和Hetherington，P.R.参见植物衰老和老化，L.D.Nooden和A.C.Leoopold著，学术出版社，1988，441-464页)。
目前，尚没有能广泛用于控制由诸如环境胁迫的内部或外部因素诱导的衰老开始的方法。目前，用于控制新鲜的、易坏的植物产品，如水果、鲜花和蔬菜的衰老，并延长其货架寿命的技术主要依赖于减少乙烯的生物合成。例如，US5824875披露了转基因天竺葵植物，由于它降低了乙烯的水平而具有较长的货架寿命，乙烯水平的降低，是由于三个呈反义方向的1-氨基-环丙烷-羧酸(ACC)合成酶基因之一的表达所导致的。因此，该技术仅能应用于对乙烯敏感的、范围有限的植物。
通过减少乙烯的生物合成，还可以延长某些果实的货架寿命，这样能导致成熟进行的更慢一些。由于这些果实的衰老是在成熟以后诱导的，减少乙烯生物合成对货架寿命的影响是间接的。用于延缓果实成熟的另一种方法是改变聚半乳糖醛酸酶的细胞含量，这种酶是在成熟早期合成的软化酶。该方法与控制乙烯生物合成的相似之处在于，它也是仅仅是间接地影响衰老，并且仅可应用于有限的植物。
因此，需要一种可应用于多种植物的控制植物衰老的方法，因此，有必要开发一种能应用于所有类型植物的与乙烯敏感性无关的衰老调控技术。
发明概述本发明基于编码香石竹衰老诱导脂酶的全长cDNA克隆的发现和克隆。本文披露了所述衰老诱导脂酶基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。香石竹衰老诱导脂酶基因的核苷酸序列，业已被用作异源探针，在若干以类似方式调控的植物中，检测相应的基因或RNA转录物。
本发明提供了一种用于对植物进行遗传学修饰，以便控制衰老(年龄相关的衰老或环境胁迫诱导的衰老)的开始的方法。沿反方向将本发明衰老诱导脂酶的核苷酸序列、及片段或所述片段的组合导入植物细胞，以便抑制内源衰老诱导脂酶基因的表达，从而降低内源衰老诱导脂酶的含量，并改变转化植物的衰老。
使用本发明的方法，产生了转基因植物，并监测其生长和发育。由于降低了衰老诱导脂酶的含量，而表现出相对植物生长、开花而言，具有延长了的寿命或货架寿命，降低了的果实易坏性，降低了的组织老化和/或降低了的叶片变黄的植物或分离的植物部分(例如，切穗、花、营养组织、果实、种子或叶片)被选择作为具有改善了的特性的理想产品，包括减弱了的叶片变黄，减弱了的花瓣脱落，在运输和储存期间减弱了的果实腐烂。繁殖所述优良植物。类似地，选择对环境胁迫具有增强了的抗性，例如，对低温(寒冷)、干旱、感染等的降低了的易感性的植物作为优良产品。
在一方面，本发明涉及编码衰老诱导脂酶的分离的DNA分子，其中，所述DNA分子能与SEQ ID NO1杂交，或者能与SEQ ID NO1杂交的所述分离的DNA分子的功能性衍生物。在本发明的一种实施方案中，所述分离的DNA分子具有SEQ ID NO1的核苷酸序列，即与SEQ ID NO1的互补性为100％(序列相同性)。在本发明这一方面的另一种实施方案中，所述分离的DNA包括SEQ ID NO4的核苷酸序列。
在本发明的另一种实施方案中，提供了一种由上述DNA分子编码的分离的蛋白或其功能性衍生物。一种优选的蛋白具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，或者是它的功能性衍生物。
本发明还提供了一种编码互补于上述DNA分子的RNA转录物的至少一部分的RNA分子的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述RNA分子能与所述RNA转录物杂交，因此，改变了内源衰老诱导脂酶的表达。所述反义寡核苷酸或多核苷酸可以是完整长度，或者优选具有大约6-大约100个核苷酸。
所述反义寡核苷酸或多核苷酸大体上互补于编码衰老诱导脂酶DNA分子的一股链的至少一部分，其中，所述编码衰老诱导脂酶的DNA分子能与SEQ ID NO1杂交，或者大体上互补于由编码衰老诱导脂酶的DNA分子编码的RNA序列的至少一部分。在本发明的一种实施方案中，所述反义寡核苷酸或多核苷酸大体上互补于SEQ ID NO1或由SEQ ID NO1所编码的RNA转录物的一股核苷酸序列的至少一部分。在另一种实施方案中，所述反义寡核苷酸大体上互补于编码衰老诱导脂酶的DNA分子的一股链的5’非编码部分的至少一部分，其中，所述DNA分子能与SEQ ID NO1杂交。在另一种实施方案中，所述反义寡核苷酸或多核苷酸大体上互补于SEQ ID NO4或由SEQ ID NO4所编码的RNA转录物的一股核苷酸序列的开放读框的一部分。
本发明还涉及用于转化植物细胞的载体，它包括(a)一种反义寡核苷酸或多核苷酸，它大体上互补于(1)编码衰老诱导脂酶的DNA分子的一股链的至少一部分，其中，所述编码衰老诱导脂酶的DNA分子能与SEQ ID NO1杂交，或(2)由所述编码衰老诱导脂酶的DNA分子所编码的RNA序列的至少一部分；和
(b)可操作地连接于所述反义寡核苷酸或多核苷酸上的调控序列，因此，所述反义寡核苷酸或多核苷酸能在用它转化过的细胞中表达。
所述调控序列包括能在转化过的植物细胞中起作用的启动子，所述启动子可以是诱导型的或组成型的。所述调控序列可选择性地包括一个聚腺苷酸化信号。
本发明还提供了一种用上述载体转化过的植物细胞，由所述细胞产生的小植株或成熟植株，或所述小植株或植株的植物部分。
本发明还涉及一种生产与未修饰过的植物相比具有降低了的衰老诱导脂酶含量的植物的方法，包括(1)用上述载体转化植物；(2)让所述植物至少生长到小植株阶段；(3)测定所述转化植株或小植株的改变了的衰老诱导脂酶活性，和/或改变了的衰老和/或改变了的环境胁迫诱导的衰老和/或乙烯诱导的衰老；和(4)选择并生长与非转化过植物相比具有改变了的衰老诱导脂酶活性，和/或改变了的衰老和/或改变了的环境胁迫诱导的衰老或乙烯诱导的衰老的植物。
按上述方法生产的植物、或后代、杂交种、克隆或植物部分，优选具有降低了的衰老诱导脂酶表达和推迟了的衰老和推迟了的胁迫诱导的衰老或乙烯诱导的衰老。
本发明还涉及一种抑制植物细胞中内源衰老诱导脂酶表达的方法，该方法包括(1)将包括以下部分的载体整合到所述植物的基因组中(A)一种反义寡核苷酸或多核苷酸，它大体上互补于(i)编码衰老诱导脂酶的DNA分子的一股链的至少一部分，其中，所述编码衰老诱导脂酶的DNA分子能与SEQ ID NO1杂交，或(ii)由所述衰老诱导脂酶基因所编码的RNA序列的至少一部分；和(B)可操作地连接于所述反义寡核苷酸或多核苷酸上的调控序列，因此，所述反义寡核苷酸或多核苷酸能表达；和(2)生长所述植物，以便转录所述反义寡核苷酸或多核苷酸，并且，该转录物结合于所述内源RNA上，因此抑制了所述衰老诱导脂酶基因的表达。
附图简述


图1表示由从香石竹花cDNA文库中获得的衰老诱导脂酶cDNA克隆(SEQ ID NO1)编码的衍生氨基酸序列。该氨基酸序列上的共有基序如下单下划线，酰胺化位点；下部点划线，蛋白激酶C磷酸化位点；双下划线，N-肉豆蔻酰化位点；方框，cAMP磷酸化位点；加阴影的方框，酪蛋白激酶II磷酸化位点；加交叉斜线的方框，脂酶家族的共有序列；点划线方框，N-糖基化位点。
图2表示与脂酶样蛋白的部分序列排比的衍生的全长香石竹花瓣衰老诱导脂酶氨基酸序列。Carlip，香石竹花瓣衰老诱导脂酶的全长序列(SEQ ID NO11)；arlip，源于拟南芥的脂酶样蛋白的部分序列(GenBank保藏号AL021710)(SEQ ID NO12)；ipolip，源于Ipomea的脂酶样序列的部分序列(GenBank保藏号U55867)(SEQ ID NO13)；arlipi，源于拟南芥的脂酶样蛋白的部分序列(GenBank保藏号U93215)(SEQ ID NO14)。在上述三种或四种序列上相同的氨基酸上加方框。
图3表示通过在大肠杆菌中表达香石竹脂酶cDNA所获得的融合蛋白表达产物的Western印迹分析。用所述衰老诱导脂酶蛋白的抗体检测所述Western印迹。泳道1，麦芽糖结合蛋白；泳道2，由香石竹脂酶通过一个蛋白水解(因子Xa)裂解位点与麦芽糖结合蛋白cDNA融合的融合蛋白；泳道3用因子Xa部分裂解过的融合蛋白，形成了游离的脂酶蛋白(50.2kDa)和游离的麦芽糖结合蛋白。
图4是从不同发育阶段的香石竹花瓣中分离的RNA的Northern印迹分析。图4A是总RNA的溴化乙锭染色的凝胶。每一个泳道含有10微克RNA。图4B是用32P-dCTP-标记的全长香石竹衰老诱导脂酶cDNA检测的所述Northern印迹的放射性自显影照片。
图5是原位验证解脂酰基水解酶，即通过在大肠杆菌中超量表达香石竹衰老诱导脂酶cDNA所获得的蛋白产物的脂酶活性。mal，在基础盐培养基中仅含有麦芽糖结合蛋白的大肠杆菌细胞；mLip，在基础盐培养基中仅含有由香石竹衰老诱导脂酶与麦芽糖结合蛋白融合所构成的融合蛋白的大肠杆菌细胞；40mal/40mLip，在补充了Tween40的基础盐培养基中仅含有麦芽糖结合蛋白[mal]的大肠杆菌细胞或含有脂酶-麦芽糖结合蛋白融合产物[mLip]的大肠杆菌细胞；60mal/60mLip，在补充了Tween60的基础盐培养基中仅含有麦芽糖结合蛋白[mal]的大肠杆菌细胞或含有脂酶-麦芽糖结合蛋白融合产物[mLip]的大肠杆菌细胞。
图6A表示香石竹衰老诱导脂酶的开放读框的限制酶图谱。有关数字表示该开放读框中的核苷酸。
图6B是用香石竹衰老诱导脂酶cDNA检测的用各种限制酶消化过的香石竹基因组DNA的Southern印迹分析。
图7是香石竹衰老诱导脂酶cDNA克隆的核苷酸序列。实下划线，所述香石竹衰老诱导脂酶cDNA的非编码序列；无下划线的序列是开放读框。
图8是香石竹衰老诱导脂酶cDNA的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图9A是表示接受0.5ppm乙烯处理15小时的II期花瓣中香石竹脂酶表达的Northern印迹分析。图9A是表示每一个泳道中加了相同量的香石竹RNA的溴化乙锭染色的凝胶(花瓣泳道1和2；叶片泳道3和4；+，用乙烯处理；-，未处理过的)；图9B是用标记过的全长香石竹花瓣衰老诱导脂酶cDNA检测的图9A所示凝胶的Northern印迹的放射性自显影。
图10是番茄叶片基因组衰老诱导脂酶的部分核苷酸序列(SEQ IDNO6)和相应的推测氨基酸序列。在保守的脂酶共有基序上加阴影。用于产生所述基因组片段的引物的序列分别加下划线。
图11是表示寒冷对膜渗漏影响的棒图。番茄植株在8℃下冷冻48小时，然后回温到室温。对没有冷冻过的对照植株和冷冻了6和24小时的植株的叶子圆切片进行扩散渗漏(μMhos)测定。
图12是从在8℃下冷冻了48小时，并回温到环境温度24小时的植物中分离的番茄叶片RNA的Northern印迹分析。
图12A是总叶片RNA的溴化乙锭染色的凝胶。
图12B是用32P-dCTP-标记的全长香石竹衰老诱导脂酶cDNA检测的所述Northern印迹的放射性自显影。
图13是拟南芥属EST(基因GenBank保藏号N38227)的部分核苷酸序列(SEQ ID NO15)和相应的推测氨基酸序列(SEQ ID NO16)，它与香石竹衰老诱导脂酶在64个氨基酸的片段上具有55.5％的相同性。在保守的脂酶共有基序上加阴影。
发明详述提供了改变植物细胞中衰老诱导脂酶基因表达的方法和组合物。植物中衰老诱导脂酶基因表达的改变会导致衰老开始的推迟，和改善了的对环境胁迫的抗性，因此，具有延长了植物的货架寿命和/或生长期。
业已从用香石竹花的衰老花瓣的mRNA制备的cDNA文库中分离了编码具有衰老诱导表达的香石竹脂酶基因的全长cDNA序列。将相当于所述分离的香石竹花脂酶cDNA序列的特定片段和全长香石竹脂酶cDNA的多核苷酸探针用于测定在衰老的香石竹叶片中、成熟的番茄果实中和衰老的绿豆叶片中、以及环境胁迫的(冷冻的)番茄叶片中编码脂酶基因的mRNA的存在。通过用香石竹脂酶cDNA设计的引物制备聚合酶链式反应(PCR)产物，使用番茄叶片基因组DNA作模板。该PCR产物含有编码包括保守的脂酶共有基序ITFTGHSLGA(SEQ IDNO3)在内的部分蛋白序列的部分开放读框。所述番茄核苷酸序列与香石竹衰老诱导脂酶序列具有53.4％的序列相同性，与拟南芥属脂酶序列具有43.5％的相同性。所述拟南芥属脂酶序列与香石竹核苷酸序列有44.3％的相同性。
通过抗细胞质脂蛋白颗粒(香石竹脂酶的一个来源)的抗体筛选用衰老的香石竹花瓣制备的cDNA表达文库，分离本发明的衰老诱导脂酶基因。获得了相当于所述衰老诱导脂酶基因的阳性全长cDNA克隆，并进行测序。所述衰老诱导脂酶cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。所述cDNA克隆编码计算分子量为50.2kDa的447个氨基酸多肽(SEQ ID NO2)。所述cDNA克隆在大肠杆菌中的表达得到了一种具有预期分子量的蛋白，该蛋白具有酰基水解酶活性，即所述表达蛋白能水解对硝基苯基棕榈酸、磷脂和三乙酰甘油。根据这种酶在发育中的香石竹花中的表达形式以及所述蛋白的活性，可以判断它与衰老相关。
用所述全长香石竹cDNA检测的香石竹花瓣总RNA的Northern印迹显示，在衰老即将开始之前，所述衰老诱导脂酶基因受到了显著诱导(图4)。Northern印迹分析还表明，所述衰老诱导脂酶基因是受诸如冷冻(
图12)和乙烯(图4和9)的环境胁迫条件诱导的，已知乙烯是相应环境胁迫而产生的。所述Northern印迹分析表明，香石竹衰老诱导脂酶mRNA在衰老中的(发育IV期)的花瓣中的含量明显高于在早期的I、II和III期香石竹花瓣中的含量。另外，乙烯刺激的II期花还表现出较高的衰老诱导脂酶基因表达。类似地，受到过寒冷温度并恢复到环境温度的植物也表现出所述衰老诱导脂酶基因的诱导表达，与冷害损伤症状(例如渗漏)的发展吻合(
图11和12)。在诸如香石竹、绿豆、番茄的各种植物和诸如叶片、果实和花的各种植物组织中基因的总体表达模式表明，本发明的脂酶基因与所述植物和植物组织中衰老的开始有关。因此，预计通过显著抑制或改变植物组织中衰老诱导脂酶基因表达，可以推迟变质和腐烂，延长易坏果实、花和蔬菜的货架寿命。这一目的是这样实现的；生产转基因植物，其中，在果实、花和营养组织中，所述脂酶cDNA或其寡核苷酸片段是以反义形式表达的，优选使用诸如CaMV35S启动子的组成型启动子，或使用组织专一型或衰老诱导型启动子。
所述香石竹衰老诱导脂酶基因是单拷贝基因。对用各种限制酶裂解过的香石竹基因组DNA进行Southern印迹分析，所述限制酶不能识别所述衰老诱导脂酶cDNA的开放读框之内的序列。用32P-dCTP-标记的全长cDNA(SEQ ID NO1)检测所述限制酶消化过的基因组DNA。在高严格杂交条件下，只有一种限制片段与所述cDNA克隆杂交(杂交和洗涤温度均为68℃，洗涤缓冲液0.2×SSC，0.1％SDS)。因此，所述香石竹衰老诱导脂酶基因是一种单拷贝基因(图6)。该基因不是香石竹中多基因家族的一员这一事实，强烈暗示了它在其他植物中是单拷贝基因。因此，了解所述香石竹衰老诱导脂酶基因的完整核苷酸序列，就足于从各种其他植物中分离衰老诱导脂酶基因。实际上，正如本发明所表明的，业已通过聚合酶链式反应将基于香石竹cDNA序列的寡核苷酸引物成功地用于制备番茄叶片衰老诱导脂酶基因，使用番茄叶片基因组DNA作模板。
以反向取向(反义)导入受诸如玄参花叶病毒35S启动子、花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S或MAS启动子的组成型启动子控制的所述克隆的衰老诱导脂酶基因或其片段，能够对植物进行遗传学修饰，并改变修饰过的植物的衰老。从其他植物中选择的与香石竹衰老诱导脂酶基因有组构的序列相同性的反义序列，可被用于进行类似的遗传学修饰。所述遗传学修饰的一个结果，是内源可翻译的衰老诱导脂酶编码mRNA含量的降低。因此，降低了植物细胞中所产生的衰老诱导脂酶的量，并因此降低了细胞膜损伤和细胞渗漏量，例如，由于老化或环境胁迫所导致的叶片、果实和/或花腐烂。所述遗传学修饰可以对所述植物中衰老诱导脂酶含量实施永久性改变，并可以通过自交或其他繁殖方式在后代植株中繁殖。用所述遗传学改变的植物生产植物新品种或品系，其中，所述改变能从一代到下一代稳定地传递。本发明首次提供了可用于对多种不同植物的衰老进行稳定的遗传学修饰的合适的DNA序列。
一般，为了鉴定和分离所述衰老诱导脂酶基因，质粒DNA的制备、限制酶消化、DNA的琼脂糖凝胶电泳、蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern印迹、Northern印迹、DNA连接和细菌转化是用本领域所熟知的常规方法进行的。例如，参见Sambrook，J.等，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，NY，1989。核酸杂交技术由Sambrook披露(同上)。
在本文中，术语“植物”是指全植株、植物部分、植物细胞或一组植物细胞。可用于本发明方法中的植物类型不受限制，并可以包括，例如，乙烯敏感型和乙烯不敏感型植物，结实植物，如杏、苹果、柑橘、香蕉、梨、番茄、草莓、鳄梨等；蔬菜，如胡萝卜、豌豆、莴苣、甘蓝、萝卜、马铃薯、花椰菜、芦笋等；花，如香石竹、玫瑰、梅等；并且，一般包括能吸收并表达本发明DNA分子的任何植物。它可以包括多种倍性水平的植物，包括单倍体、二倍体、四倍体和多倍体。
在本文中，转基因植物被定义为以某种方式进行过遗传学修饰的植物，包括，但不限于在其基因组中业已整合了异源或同源衰老诱导脂酶DNA或修饰过的DNA或异源衰老诱导脂酶DNA的某些部分或同源衰老诱导脂酶DNA的植物。所述改变了的遗传材料可以编码一种蛋白，它包括一个调控或控制序列，或可以是或包括一种反义序列或编码一种反义DNA，它相对该植物的内源衰老诱导脂酶DNA或mRNA序列或其部分而言是反义的。“转基因”或“转基因序列”被定义为被整合到转基因植物中的外源基因或部分序列。
在本文中，术语“杂交”通常被用于表示核酸在合适的严紧条件下的杂交，本领域技术人员可以根据探针序列和靶序列的性质，方便地确定所述杂交条件。杂交和洗涤条件为本领域所公知，根据序列的严格性，可以通过改变该培养时间、温度和/或溶液的离子强度，方便地实现条件的调整。例如，参见Sambrook J.等，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，NY，1989。条件的选择取决于待杂交序列的长度，特别是探针序列的长度、核酸的相对G-C含量和容容许的错配量。当需要在具有较低程度的互补性的链之间进行部分杂交时，优选低严紧条件。当需要完整的或接近完整的互补性时，优选高严紧条件。对于典型的高严紧条件来说，杂交溶液含有6×SSC、0.0MEDTA、1×Denhardt’s溶液和0.5％SDS。对于克隆DNA的片段来说，杂交要在大约68℃下进行大约3-4小时，而对于总的真核细胞DNA来说，要进行大约12-16小时。对于低严格性来说，杂交温度要降低到低于有关双链体解链温度(TM)大约12℃。已知TM受G-C含量和双链体长度以及溶液离子强度的影响。
在本文中，术语“显著的序列相同性”或“显著的同源性”被用于表示与另一种核苷酸或氨基酸序列有明显结构或功能相同性的核苷酸序列或氨基酸序列。具有显著序列相同性或显著同源性序列之间的任何结构或功能差异应当是微不足道的，就是说，它不会对该序列在预期用途中起作用的能力产生影响。例如，差异可能是由于不同物种之间密码子利用的固有差异所导致的。如果在两个或两个以上不同序列之间存在显著量的序列重叠或相似性，或者不同序列具有相似的物理特征，甚至如果有关序列在长度和结构上不同的话，这种结构差异被视为微不足道的。例如，所述特征包括在特定条件下杂交的能力，或者对于蛋白来说，免疫交叉反应性，类似的酶促活性等。
另外，如果两个序列之间具有至少大约70％，更优选80％，最优选大约90％的序列相似性的话，则认为这两种核苷酸序列是“大体上互补的”。如果两种氨基酸序列的多肽的活性部分之间具有至少50％，优选70％的相似性的话，则认为这两种序列是大体上同源的。
在本文中，术语核酸(多核苷酸或寡核苷酸)的“功能性衍生物”表示编码衰老诱导脂酶的基因或核苷酸序列的片段、变体、同系物或类似物。一种功能性衍生物可以至少保留衰老诱导脂酶编码DNA功能的一部分，使其能用于本发明中。所述功能可以包括与天然香石竹衰老诱导脂酶或来自另一种植物的编码衰老诱导脂酶的大体上同源的DNA或与它的mRNA转录物杂交的能力，或呈反义方向，以便抑制植物衰老诱导脂酶mRNA的转录和/或翻译。
基因或DNA序列的“片段”，是指所述分子的任何亚类，例如，较短的多核苷酸或寡核苷酸。“变体”是指与特定的完整基因或其片段大体上相似的分子，如具有一个或多个取代了的核苷酸取代变体，不过，它保留了与所述特定基因杂交的能力，或者编码能与天然DNA杂交的mRNA转录物。“同系物”是指源于不同植物属或种的片段或变体序列。“类似物”是指大体上类似于特定完整分子或其变体或片段，或以与之相关的方式起作用的非天然分子。
一种基因，例如，衰老诱导脂酶基因“改变了的表达”或“修饰过的表达”，表示发生在未修饰过的香石竹或其他植物中的特定的基因的正常表达，以某种方式发生改变的任何过程或结果。在本发明中，基因表达的改变，能全面或部分减弱衰老诱导脂酶基因的表达，但还可以包括表达时序的改变，或者另一种状态，其中，所述衰老诱导脂酶基因的表达，不同于最有可能在未修饰过的植物或栽培品种中天然发生的形式。一种优选的改变是，能导致与未修饰过的植物相比，导致衰老诱导脂酶的产量降低。
在按照本发明生产遗传学改变了的植物时，优选根据所需性状选择单个小植株或植株，通常是根据减弱了的衰老诱导脂酶的表达或产生。例如，可以用本文所披露的特殊抗体，通过常规免疫测定方法，对衰老诱导脂酶的表达进行定量。另外，可以通过本文所披露的生物化学方法测定衰老诱导脂酶的酶促活性。
为了让新插入的基因或DNA序列表达，导致它所编码蛋白的产生，或者对于要转录的反义DNA来说，得到反义RNA分子，在正确的位置上应当存在正确的调控因子，并且，相对所述基因或DNA序列而言呈正确取向。所述调控片段可以包括一个启动子，一个5’-非翻译前导序列和3’聚腺苷酸化序列，以及增强子和其他调控序列。
可以与衰老诱导脂酶基因组合用于生产该基因的有义或反义转录物的启动子调控因子，一般来说包括任何植物启动子，更具体地讲，包括组成型启动子，如包括玄参花叶病毒35S，花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S启动子，或MAS启动子或组织专一性或衰老诱导启动子，如香石竹花瓣GST1启动子或拟南芥属SAG12启动子(例如，参见J.C.Palaqui等，植物生理学1221447-1456(1996)；Morton等，分子育种，1123-132(1995)；Fobert等，植物杂志，6567-577(1994)；和Gan等，植物生理学113313(1997)，以上文献被收作本文参考)。用于本发明中的所述启动子优选是组成型启动子。
用于本发明的启动子的表达水平可以用常规表达系统测试，例如，通过测定导入了所述启动子/报导基因的转基因植物的叶片、花、果实或其他组织提取物中报导基因产物(例如，蛋白或mRNA)的含量而完成。
本发明提供了互补于编码香石竹衰老诱导脂酶或互补于能在低至高严紧条件下与所述香石竹衰老诱导脂酶基因杂交的、来自其他植物的基因或基因片段的反义寡核苷酸和多核苷酸。所述反义寡核苷酸的长度应当至少大约为6个核苷酸，以便提供杂交的最低专一性，并可以互补于编码衰老诱导脂酶或其一部分的DNA或mRNA的一股链，或互补于与调控衰老诱导脂酶基因表达相关的基因组DNA的旁侧序列。所述反义寡核苷酸可以大到有100个核苷酸，并且其长度可以延长到与它反义的编码序列的长度或超过该长度。所述反义寡核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA或其嵌合混合物或其衍生物或其修饰过的形式。
所述反义寡核苷酸的作用是，可以导致细胞中衰老诱导脂酶基因表达的改变，主要是抑制。有关反义的一般性说明可以参见Alberts等，细胞分子生物学，第2版，Garland出版公司，纽约(1989)，特别参见195-196页，被收作本文参考。
所述反义寡核苷酸可以互补于衰老诱导脂酶基因的任何部分。例如，在一种实施方案中，所述反义寡核苷酸的长度可以为6-100个核苷酸，并可以互补于衰老诱导脂酶基因的5’-非编码序列。已知主要互补于5’-非编码序列的寡核苷酸，是编码转录因子的基因表达的有效抑制剂。Branch，M.A.，分子细胞生物学134284-4290(1993)。
优选的反义寡核苷酸大体上互补于编码衰老诱导脂酶的mRNA的一部分。例如，沿反义方向向植物中导入编码衰老诱导脂酶的全长cDNA克隆，预计能导致成功地改变衰老诱导脂酶基因表达。而且，导入针对衰老诱导脂酶基因的特定部分的部分序列可能同样有效。
本发明所需要的最低同源性程度为，足于产生重复的互补性，以便能够识别特定的靶RNA或DNA，抑制并减弱其翻译或功能，同时又不会影响其他RNA或DNA分子的功能和其他基因的表达。尽管本发明的反义寡核苷酸包括互补于衰老诱导脂酶基因的RNA转录物的至少一部分的序列，但绝对的互补性是不必要的(尽管是优选的)。杂交的能力取决于反义寡核苷酸的长度和互补性程度。一般，杂交的核酸越长，它所包含的与衰老诱导脂酶靶序列的碱基错配就越多，但仍然能形成稳定的双链体。本领域技术人员可以用标准方法通过测定杂交复合体的解链温度来确定容许的错配程度。
所述反义RNA寡核苷酸可以通过外源导入的核酸序列的转录而在细胞内产生。可以用诸如质粒或病毒的载体转化或转染或感染将所述反义分子输送到细胞中，所述载体中整合了编码反义衰老诱导脂酶序列的DNA，该序列可操作地连接于包括启动子在内的合适的调控因子上。所述外源DNA序列在所述细胞中表达，产生衰老诱导脂酶基因的反义RNA。
载体可优选为质粒，或者可以是本领域所公知的病毒或其他载体，以便能在植物细胞或细菌细胞中复制并表达其编码的基因。所述载体被整合到染色体上，以便它能够转录并产生所需的反义衰老诱导脂酶RNA。所述质粒或病毒载体可以通过本领域中标准的重组DNA方法构建。例如，所述载体可以是含有能在原核宿主中起作用的复制系统和本发明的反义寡核苷酸或多核苷酸的质粒载体。另外，所述载体可以是含有能在农杆菌中起作用的复制系统和本发明的反义寡核苷酸或多核苷酸的质粒载体。能够在农杆菌中复制的质粒为本领域所熟知。参见Miki等，将外源DNA导入植物的方法，植物分子生物学和生物技术方法，B.R.Glick和J.E.Thompson著，CRC出版社(1993)，67-83页。
按以下方法将所述香石竹脂酶基因沿反义方向克隆到质粒载体上。用pCD质粒克隆香石竹脂酶基因。所述质粒是用pUC18主链构建的，并且包括来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，它后面是一个多克隆位点和一个章鱼氨酸合成酶终止序列。pCd-脂酶(反义)质粒是通过将全长香石竹脂酶基因沿反义方向亚克隆到pCd的HindIII和EcoRI位点而构建的。类似地，pCDΔ35S-GST-1脂酶(反义)质粒是通过首先将香石竹谷胱苷肽S转移酶1(GST1)启动子的PCR扩增片段(-703至+19bp)亚克隆到pCd载体的BamHI和SalI位点上而构建的。然后将全长香石竹脂酶基因沿反义方向亚克隆到该结构的HindIII和EcoRI位点上。另一种质粒pGdΔ35S-GST1-GUS质粒是通过首先将香石竹谷胱苷肽S转移酶1(GST1)启动子的PCR扩增片段(-703至+19bp)亚克隆到pCd载体的BamHI和SalI位点上而构建的。然后将报导基因β-葡糖醛酸酶(GUS)亚克隆到该结构的SalI和EcoRI位点上。通过首先将双链35S启动子(含有两个拷贝的串联CaMV35S启动子)亚克隆到pCd载体的SalI和HindIII位点上构建pCd-35S2-脂酶(反义)质粒。然后将全长香石竹脂酶基因沿反义方向亚克隆到该结构的HindIII和EcoRI位点上。
例如，可以通过重组核苷酸技术或从单核苷酸或较短寡核苷酸合成制备长度优选为大约6-大约100个核苷酸并且互补于衰老诱导脂酶的靶系列的寡核苷酸。可以用自动合成仪化学合成本发明的寡核苷酸和多核苷酸。构建本发明重组核苷酸分子的方法披露于Sambrook等的著述中，参见分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.(1989)，以全文形式将其收作本文参考文献。可以用本领域技术人员所熟知的方法制备编码互补于衰老诱导脂酶序列的反义RNA的核苷酸。有关所述方法的细节披露于Maniatis，T.等的著述中，控制基因表达的分子机制，Nierlich等著，学术出版社，N.Y.(1976)。
在本发明的另一种实施方案中，对内源植物衰老诱导脂酶表达的抑制是通过超量表达导入该植物细胞中的外源衰老诱导脂酶基因或基因片段而进行共抑制所产生的。在本发明的该实施方案中，用本文所披露的用于反义分子的相同方式，将编码衰老诱导脂酶的载体沿有义方向导入所述细胞。所述衰老诱导脂酶优选可操作地连接于强的组成型启动子上，如玄参花叶病毒启动子或CaMV35S。
按照本发明生产的转基因植物可以用本领域所公知的任何植物转化方法通过DNA转化制备。植物转化方法包括植物、组织或细胞与根癌农杆菌的直接共培养或直接感染(Miki等，植物分子生物学方法和生物技术，1993，67-88页)；将基因直接转移到原生质体中或原生质体吸收(Paszkowski等，EMBO J.，122717，1984)；粒子轰击(Klein等，生物技术，6559-563，1988)；注射到幼苗或植物的分生组织中(De LaPena等，自然，325274-276，1987)；注射到培养细胞和组织的原生质体(Reich等，生物技术，41001-1004，1986)。
通常，通过所述转化方法获得全植株。植株是由原生质体、愈伤组织、组织部分或外殖体等再生的。在本文中，“植物”的定义包括从其中的衰老诱导脂酶表达已经改变了的再生植物获得的植物部分，如叶片、花、果实、种子等。“植物”的定义还包括所述再生植物的后代、变体和突变体。
本发明还提供了由本发明的cDNA分子所编码的香石竹衰老诱导脂酶蛋白，和能与所述香石竹蛋白的抗体发生交叉反应的蛋白。所述蛋白具有图2中所示SEQ ID NO2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO2所示蛋白的抗体具有交叉反应性。
所述香石竹衰老诱导脂酶蛋白或其功能性衍生物，优选是通过重组技术生产的，选择性地与化学合成方法组合生产。在本发明的一种实施方案中，所述衰老诱导脂酶是作为包括与麦芽糖结合蛋白融合的衰老诱导脂酶的融合蛋白形式表达的。编码所述重组融合蛋白的克隆的表达，得到了一种具有预期分子量的融合蛋白，它能水解对硝基苯基棕榈酸，磷脂和三乙酰甘油，这些都是脂酶活性的指标。在用抗香石竹衰老诱导脂酶的抗体进行免疫吸印之后进行的Western印迹分子中，所述重组衰老诱导脂酶蛋白表现出一个优势带。在Western印迹分析中，通过用蛋白酶因子Xa处理所述融合蛋白所释放出的游离的衰老诱导脂酶(50.2kDa)，也能与所述衰老诱导脂酶抗体起反应(图3)。对衰老诱导脂酶氨基酸序列进行的基序检索，发现了用于通过酰胺键与肉桂酸共价结合的潜在的N-肉桂酰化位点的存在(
图1)(参见Johnson等，生物化学年度综述，63869-914，1994；Towler等，生物化学年度综述，5797-99，1988；和R.J.A.Grand，生物化学杂志258625-638，1989)。蛋白基序检索还证实，所述香石竹衰老诱导脂酶含有序列ITFAGHSLGA(SEQ ID NO4)，它是保守脂酶的共有序列(表1)。来自多种植物的保守脂酶共有序列示于下表中。
表1
本发明的衰老诱导脂酶蛋白，在体外和原位测定中都被证实具有脂酶活性。对于体外测定来说，用对硝基苯基棕榈酸和大豆磷脂(40％磷脂酰胆碱和60％其他磷脂)作底物，并通过分光光度法测定该反应的产物，它们分别是对硝基苯酚和游离的脂肪酸(Pencreac’s和Baratti，1996；Nixon和Chan，1979；Lin等，1983)。还利用改进过的Nixon和Chan(1979)和Lin等(1983)的方法通过气相层析体外测定脂酶活性。反应混合物含有100mM Tris-HCl(pH8.0)，2.5mM底物(三亚油精，大豆磷脂或二亚油酰磷脂酰胆碱)和酶蛋白(100微克)终体积为100微升。所述底物在添加到反应混合物中之前用5％的阿拉伯树胶乳化。为此将底物溶解在氯仿中，添加到阿拉伯树胶溶液中，并通过超声波乳化30秒。在乳化之后，通过氮气流使氯仿蒸发。反应在25℃下进行不同的时间，最多达2小时。然后对反应混合物进行脂类提取，并通过TLC纯化游离脂肪酸，衍生化，并通过GC定量(McKegney等，1995)。
用由Tsuboi等(1996)改进的Furukawa等(1983)的方法，原位测定解脂酰基水解酶活性。在后一种测定中，在补充了Tween40或Tween60(二者均为长链脂肪酸酯，作为唯一的碳源)的基础盐培养基中，生长用编码衰老诱导脂酶的全长cDNA克隆转化过的大肠杆菌。因此，只有当所述脂肪酸酯被脂酶水解之后，才能提供细菌生长所需要的碳。用衰老诱导脂酶cDNA转化过的大肠杆菌，在经过最初的延滞期之后，能在Tween40和ween60基础培养基这中生长，而没有转化过的大肠杆菌对照培养物不能生长，这一发现，证实了所述编码重组蛋白的脂酶活性(图5)。就是说，衰老诱导脂酶能释放硬脂酸(Tween60)和棕榈酸(Tween40)，以便获得生长所必需的碳。
本文所披露的衰老诱导脂酶蛋白的“功能性衍生物”，是衰老诱导脂酶的片段、变体、类似物、或化学衍生物，它保留了衰老诱导脂酶活性的至少一部分，或者能与衰老诱导脂酶的专一性抗体进行免疫交叉反应。衰老诱导脂酶蛋白的片段是指该分子的任何亚类。变体肽可以通过直接化学合成制备，例如，使用本领域众所周知的方法。衰老诱导脂酶的类似物，是指大体上类似于所述完整蛋白或其片段的非天然蛋白。衰老诱导脂酶的化学衍生物，含有正常情况下不是所述肽或肽片段的一部分的其他化学部分。可以通过让所述肽的靶氨基酸残基与能够与特定侧链或末端残基起反应的有机衍生试剂起反应，将改变引入衰老诱导脂酶肽或其片段。
本发明的衰老诱导脂酶蛋白或肽可以这样生产培养用本发明核苷酸序列转化过的细胞(沿有义方向)，让所述细胞合成所述蛋白，然后根据所使用的克隆方法，从培养基或细胞提取物中以游离蛋白或融合蛋白形式分离所述蛋白。另外，所述蛋白可以在无细胞系统中生产。Ranu等，酶学方法，60459-484，1979。
在对本发明作过一般性说明之后，通过参考下面的实施例，可以更好地理解本发明，提供这些实施例是为了说明目的，而不是要限定本发明，除非特别指明。实施例1用于分离香石竹脂酶cDNA的植物材料用生长并保持在温室中的香石竹植物(Dianthus caryophyllusL.cv.，改良的白色Sim)分离相当于衰老诱导脂酶基因的核苷酸序列。将衰老花瓣形式的花组织(来自不同发育阶段)收集到缓冲液中或者在-70℃下保存待用。
从衰老即将开始时所收集的香石竹花瓣中分离细胞质脂类颗粒。用Omnimizer在匀浆缓冲液(50mM Epps-0.25M山梨醇，pH7.4，10mMEDTA，2mM EGTA，1mM PMSF，1mM苄脒，10mM氨基-n-己酸和4％的聚乙烯吡咯烷酮)，在4℃下将香石竹花瓣(25克/150毫升缓冲液)匀浆45秒，并在Polytron匀浆器中再匀浆1分钟。通过四层纱布过滤匀浆物，并在4℃下以10000g的速度离心滤液20分钟。以250000g的速度离心上清液1小时，以便分离微粒体膜。用Hudak和Thompson的方法(1997，植物生理学，114705-713)，通过在漂浮离心之后收集颗粒，在微粒体上清液之后获得脂类颗粒。用蔗糖将上清液调整到10％(w/v)，并将23毫升上清液注入60Ti Beckman离心管中，用1.5毫升分离缓冲液覆盖，并在4℃下以305000g的速度离心12小时。用巴氏吸管从所述分离缓冲液覆盖层中取出颗粒。将3毫升颗粒悬浮液加样到用无菌PBS(10mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，加0.85％氯化钠)平衡过的Sepharose G-25柱上，并用无菌PBS洗脱该悬浮液。洗脱含有所述颗粒的外水体积，并用Centricon-10过滤器(由Amicon提供)将其浓缩到蛋白浓度为600微克。然后用300微克脂类颗粒接种兔子，在兔子体内制备抗体。通过Western印迹分析测定血液的IgG效价。mRNA分离大体上按Chomczynski和Sachi所披露的方法(分析生物化学，162156-159，1987)从I、II、III或IV期香石竹花瓣中分离总RNA。简单地讲，在液氮中冷冻15克花瓣组织，并在含有4M硫代盐酸胍，25mM柠檬酸，pH7.0，0.5％十二烷基肌氨酸钠和0.1Mβ-巯基乙醇的缓冲液中匀浆30秒。将150毫升水饱和的苯酚，30毫升氯仿和15毫升2M乙酸钠，pH4.0加入所述匀浆样品中。以10000g的速度离心该样品10分钟，并除去水相，用150毫升异丙醇从中沉淀出核酸。以5000g的速度离心该样品10分钟，并用30毫升的4M氯化锂洗涤沉淀物1次，用30毫升氯仿提取，并用含有0.2M乙酸钠，pH5.0的异丙醇沉淀。将RNA溶解在DEPC处理过的水中，并在-70℃下保存。
用Promega提供的PolyA+片段mRNA分离系统，从总RNA中分离PolyA+mRNA。用PolyA+mRNA作模板，用Stratagene(La Jolla，Calif.)提供的ZAP ExpresscDNA合成系统进行cDNA合成。香石竹花瓣cDNA文库筛选将用从IV期香石竹花瓣中分离的mRNA制备的cDNA文库稀释到大约5×106PFU/ml，并用脂类颗粒抗血清进行免疫筛选。用ExAssist辅助噬菌体/SOLR菌株系统回收阳性cDNA克隆，并重新环化在pBluescript噬菌粒上(Stratagene)。同样用32P-标记过的19个碱基的探针(5’-ACCTACTAGGTTCCGCGTC-3’)(SEQ ID NO5)筛选III期香石竹花瓣cDNA。将阳性cDNA克隆从噬菌体上切除，并用生产商说明书中的方法，将其重新环化到pBK-CMV(Stratagene)噬菌粒上。将全长cDNA(1.53kb片段)插入pBK-CMV载体上。质粒DNA分离，DNA测序用Sambrook等所披露的碱性裂解方法(同上)分离质粒DNA。用双脱氧测序方法对全长阳性cDNA克隆进行测序。Sanger等，美国科学院院报，74；5463-5467。通过BLAST检索(GenBank，Bethesda，MD)编辑并分析开放读框，用BCM检索发射器多序列排比形式诱导的多重排比方法(参见F.Corpet，核酸研究，1610881-10890，1987)完成五种同源性最高的蛋白与编码基因的衍生氨基酸序列的排比。通过MultiFinder确认所述衍生氨基酸序列中的功能性基序。以融合蛋白形式表达脂酶用EcoRI和XbaI消化含有全长衰老诱导脂酶的噬菌粒pBK-CMV，释放出1.53kb的脂酶片段，将该片段亚克隆到EcoRI和XbaI消化过的融合载体pMalc(新英格兰生物实验室)上。将被命名为pMLip的含有衰老诱导脂酶pMalc载体用于转化大肠杆菌B1-21(DE3)细胞。
按照Sambrook等所披露的方法(同上)和Ausubel等所披露的方法(参见当代分子生物学方法，Green Publishing Associates和WileyInterscience，纽约，1987，16.4.1-16.4.3)分离并纯化由pMLip编码的融合蛋白(衰老诱导脂酶和麦芽糖结合蛋白的融合体)。简单地讲，将用pMLip转化过的大肠杆菌BL21细胞重新悬浮在含有8微升50mMPMSF和80微升20毫克/毫升溶菌酶的3毫升/克裂解缓冲液(50mMTris，pH8.0，100mM氯化钠和1mM EDTA)/克细胞中，并在室温下振荡培养20分钟。然后添加80微升5％脱氧胆酸和40单位的DNAseI，并在室温下振动细胞，直到细胞被完全裂解。通过离心使细胞碎片沉淀，并重新悬浮在2倍体积的添加了8M尿素和0.1mM PMSF的裂解缓冲液中。1小时之后，添加7倍体积的缓冲液(50mM磷酸二氢钾，1mMEDTA和50mM氯化钠，pH7.0)，以便中和该悬浮液。用盐酸将该细胞悬浮液的pH调整到8.0，并使细胞碎片沉淀。上清液用20mM Tris，pH8.0，100mM氯化钠和1mM EDTA在4℃下透析过夜。用直链淀粉柱(新英格兰实验室提供)纯化麦芽糖结合蛋白-脂酶融合产物(Malip)。用蛋白酶因子Xa(1微克/100微克融合蛋白)裂解含有融合蛋白的级份，以便从该融合产物上分离脂酶。通过SDS-PAGE电泳和Western印迹，分析融合蛋白和裂解过的脂酶。用由pMalc编码的麦芽糖结合蛋白作对照。结果示于图3中。香石竹RNA的Northern印迹杂交在1％变性的甲醛琼脂糖凝胶上分离从I、II、III、IV期花中分离的10微克总RNA，并固定到尼龙膜上。将用随机引物试剂盒(Boereinger)由32P-dCTP标记过的1.53kb EcoRI-XbaI脂酶片段检测所述滤膜(7×107cpm)。用室温下的1×SSC，0.1％SDS洗涤滤膜1次，用65℃的0.2×SSC，0.1％SDS洗涤3次。让滤膜干燥，并在-70℃下对X光胶片曝光1夜，结果示于图4中。基因组DNA分离和Southern印迹杂交将新采割的香石竹花瓣冷冻在液氮中，磨成粉，并用提取缓冲液(0.1MTris，pH8.2，50mMEDTA，0.1M氯化钠，2％SDS，和0.1毫克/毫升蛋白酶K)匀浆(2毫升/克)，以便分离基因组DNA。将匀浆材料在37℃下培养10分钟，并用苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)提取。用乙酸钠和异丙醇使DNA沉淀。将DNA沉淀溶解在1×TE，pH8.0中，用苯酚再次提取，重新沉淀并重新悬浮于1×TE，pH8.0中。
分别用限制性内切核酸酶(BamHI、XbaI、XhoI、EcoRI、HindIII和SalI)消化基因组DNA，并且在1％琼脂糖凝胶上分离消化过的DNA。将分离的DNA吸印到尼龙膜上，并用32P dCTP-标记过的1.53kb脂酶片段进行杂交。在高严紧条件(68℃，6×SSC，2×Denhardt’s试剂，0.1％SDS)和低严紧条件(杂交和洗涤温度为42℃)(6×SSC，5×Denhardt’s试剂，0.1％SDS)下进行杂交和洗涤。结果示于图6中，从图中可以看出，所述脂酶cDNA探针仅能检测到一种基因组片段，这表明香石竹脂酶基因是单拷贝基因。脂酶测定用对硝基苯基棕榈酸和大豆磷脂作外源底物，通过分光光度法，测定纯化的脂酶融合蛋白的解脂酰基水解酶活性。对于被用作对照的麦芽糖结合蛋白本身来说，在以磷脂作底物时没有可检测的脂酶活性(表2)。在将对硝基苯基棕榈酸用作麦芽糖结合蛋白本身的底物时，可检测到少量的脂酶反应的预期产物对硝基苯酚，反映了商业对硝基苯基棕榈酸制剂中对硝基苯酚的背景水平(表2)。不过，在存在纯化脂酶融合蛋白的情况下，强的脂酶活性表现为从磷脂中释放游离脂肪酸，和从对硝基苯基棕榈酸中释放出对硝基苯酚(表2)。
表2通过分光光度法测定在大肠杆菌中表达的并且通过直链蛋白柱层析纯化的麦芽糖结合蛋白和脂酶融合蛋白的解脂酰基水解酶活性。
使用两种底物，对硝基苯基棕榈酸和大豆磷脂。
活性以所产生的产物形式表达(由对硝基苯基棕榈酸产生的对硝基苯酚和由大豆磷脂产生的游离脂肪酸)。
示出了n＝3重复的平均值±SE。
在其他实施方案中，通过气相层析测定脂酶融合蛋白的酶促活性。该技术能够对从底物中释放出的游离脂肪酸进行定量和鉴定。用三亚油精、大豆磷脂和二亚油酰磷脂酰胆碱作底物，并通过薄层层析纯化脱酯化的脂肪酸，然后通过气相层析分析。与所述分光光度测定相似(表2)，对于麦芽糖结合蛋白本身来说，它对于大豆磷脂和二亚油酰磷脂酰胆碱没有可检测的脂酶活性，这表明所述底物基本上不含脱酯化脂肪酸(表3)。不过，在将脂酶融合蛋白用做酶源时，从大豆磷脂提取物中脱酯化产生了棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，从二亚油酰磷脂酰胆碱中脱酯化产生了亚油酸(表3)。与磷脂底物不同，在三亚油精中存在可检测含量的游离亚油酸，不过，在存在脂酶融合蛋白的情况下游离亚油酸的含量明显提高，这表明所述脂酶能从三乙酰甘油中将脂肪酸脱酯化(表3)。
表3通过GC测定大肠杆菌中表达的通过直链淀粉柱层析纯化的麦芽糖结合蛋白和脂酶融合蛋白的解脂酰基水解酶活性。
产物(μg/mg蛋白)1脂酶底物融合蛋白 麦芽糖结合蛋白三-亚油精2亚油酸(18∶2) 15.9±0.75 33.4±1.58大豆磷脂3棕榈酸(16∶0) ND44.80硬脂酸(18∶0) ND 9.68亚油酸(18∶2) ND 5.80二亚油酰 亚油酸(18∶2) ND 20.0磷脂酰胆碱31让反应进行2小时，在这段时间内不是连续的线性2示出n＝3重复的平均值±SE3一次实验4不可检测按照Tsuboi等(感染免疫学，642936-2940，1996)；Wang等(生物技术9741-746，1995)；和Sierra(微生物学和血液学杂志，2315-22，1957)所披露的方法，在活体内测定通过在大肠杆菌中表达所述脂酶cDNA所获得的蛋白脂酶活性。将用pMal转化过的大肠杆菌BL-21细胞的单菌落和pMLip转化过的另一种大肠杆菌BL-21菌落接种含有以下成分的基础盐培养基(pH7.0)(克/升)磷酸氢二钾(4.3)，磷酸二氢钾(3.4)，硫酸铵(2.0)，氯化镁(0.16)，四水氯化锰(0.001)，七水硫酸铁(0.0006)，二水氯化钙(0.026)和二水钼酸钠(0.002)。以1％的浓度添加Tween40(聚氧乙烯山梨聚糖单棕榈酸酯)或Tween60(聚氧乙烯山梨聚糖单硬脂酸酯)。让所述细菌细胞在37℃下，在振荡的条件下生长，通过测定600nm的吸收监测其生长(图5)。从图5可以看出，用pMLip转化过的大肠杆菌细胞，在经过最初的延滞期之后，能够在添加了Tween40/Tween60的基础盐中生长。不过，用pMal转化过的大肠杆菌细胞不能在添加了Tween的培养基中生长。实施例2香石竹衰老诱导脂酶基因的乙烯诱导在密封容器中，用0.5ppm乙烯处理II期香石竹花和香石竹切穗15小时。按以下方法从乙烯处理过的II期花瓣和处理过的切穗的叶片中提取RNA，并从未处理过的香石竹花和切穗中提取RNA。
在液氮中研磨花或叶片(一朵花或5克叶片)。将研磨的粉末与30毫升胍盐缓冲液(4M异硫氰酸胍，5mM乙酸钠，pH8.5，0.8％β-巯基乙醇)混合。通过四层纱布过滤混合物，并在4℃下，以10000g的速度离心30分钟。然后以26000g的速度对上清液进行氯化铯密度梯度离心20小时。用75％的乙醇洗涤沉淀的RNA，重新悬浮在600微升DEPC处理过的水中，并在-70℃下用0.75毫升95％乙醇和30微升3M乙酸钠沉淀RNA。在1.2％变性甲醛琼脂糖凝胶上分离10微克RNA，并转移到尼龙膜上。用随机启动的32P-dCTP标记的全长香石竹脂酶cDNA(SEQ ID NO1)，在42℃下检测所述尼龙膜过夜。然后，在室温下，用含有0.1％SDS的1×SSC洗涤所述膜1次，15分钟，并在65℃下用含有0.1％SDS的0.2×SSC洗涤3次，每次15分钟。在-70℃下用所述膜对X光胶片曝光一夜，结果示于图9中。从图中可以看出，通过乙烯在花和叶中诱导了香石竹脂酶的转录。实施例3用香石竹脂酶引物制备番茄PCR产物通过嵌套式PCR，制备来自从番茄叶片中获得的番茄基因组DNA的部分长度的衰老诱导脂酶序列，使用根据香石竹衰老诱导脂酶序列设计的一对寡核苷酸引物。5’引物是19-聚体，其序列为5’-CTCTAGACTATGAGTGGGT(SEQ ID NO7)；3’引物是18聚体，其序列为CGACTGGCACAACCTCCA-3’(SEQ ID NO8)。用番茄基因组DNA进行的聚合酶链式反应是按以下方式完成的。反应成分基因组DNA 100ngdNTP(各10mM) 1μl氯化镁(5mM)+10x缓冲液 5μl引物1和2(各20μM) 0.5μlTaq DNA聚合酶 1.25U反应体积 50μl反应参数94℃，3分钟94℃/1分钟，48℃/1分钟，72℃/2分钟，进行45轮72℃/15分钟。
通过PCR获得的番茄部分长度序列，具有SEQ ID NO6所示核苷酸序列，和如
图10所示的推测的氨基酸序列。所述部分长度序列包括一个内含子(
图10，小写字母)位于两个编码序列之间。所述番茄序列含有保守的脂酶共有序列ITFTGHSLGA(SEQ ID NO3)。
所述番茄序列与香石竹衰老诱导脂酶序列有53.4％的序列相同性，与拟南芥属脂酶有43.5％的序列相同性，而后者与香石竹序列有44.3％的序列相同性。实施例4冷冻对番茄植物细胞膜完整性的影响在7-8℃下将番茄植物冷冻48小时，然后恢复到室温，保持24小时。通过测定电解质渗漏量(μMhos)评估冷冻对叶片的影响。
具体地讲，将1克叶片组织切入50毫升的试管中，用蒸馏水快速漂洗，并加入40毫升去离子水。在所述试管上加盖，并在室温下旋转24小时。以6小时和24小时的间隔，获得对照和冷冻损害叶片组织能反映电解质渗漏的导电性(μMhos)读数。由
图11可以看出，在冷冻损伤的叶片组织中，在回温期间发生了反映膜损伤的电解质渗漏。
从冷冻番茄叶片中获得的RNA的Northern印迹分析从未冷冻过的番茄植物(对照)和恢复到室温并保持0、6和24小时之后的冷冻的番茄植物的15克叶片中分离总RNA。按例3所述方法提取RNA。在1.2％的变性甲醛凝胶上分离来自每一种样品的10微克RNA，并转移到尼龙膜上。用32P-dCTP-标记过的探针(SEQ ID NO3)检测所述尼龙膜，然后在与例3相同的条件下洗涤，结果示于
图12中。
从放射性自显影(
图12B)上可以看出，通过冷冻诱导了番茄脂酶基因的表达，并且，基因诱导的形式与冷冻损伤叶片中电解质渗漏的增加相关(
图11)。
序列表<110>Senesco，Inc.<120>编码植物脂酶的DNA、转基因植物和控制植物衰老的方法<130>10799/7<140><141><150>09/250,280<151>1999-02-16<150>09/105,812<151>1998-06-26<160>17<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1537<212>DNA<213>香石竹<400>1gcacgagcca ttccaaaact ccttacacca ctcaaaacta ttccaacatg gctgcagaag 60cccaaccttt aggcctctca aagcccggcc caacatggcc cgaactcctc gggtccaacg 120cttgggccgg gctactaaac ccgctcaacg atgagctccg tgagctcctc ctacgctgcg 180gggacttctg ccaggtgaca tacgacacct tcataaacga ccagaactcg tcctactgcg 240gcagcagccg ctacgggaag gcggacctac ttcataagac cgccttcccg gggggcgcag 300accggtttga cgtggtggcg tacttgtacg ccactgcgaa ggtcagcgtc ccagaggcgt 360ttctgctgaa gtcgaggtcg agggagaagt gggataggga atcgaattgg attgggtatg 420tcgtggtgtc gaatgacgag acgagtcggg tggcgggacg aagggaggtg tatgtggtgt 480ggagagggac ttgtagggat tatgagtggg ttgatgttct tggtgctcaa cttgagtctg 540ctcatccttt gttacgcact caacaaacta ctcatgttga aaaggtggaa aatgaggaaa 600agaagagcat tcataaatca agttggtacg actgtttcaa tatcaaccta ctaggttccg 660cgtccaaaga caaaggaaaa ggaagcgacg acgacgatga tgacgacccc aaagtgatgc 720aaggttggat gacaatatac acatcggagg atcccaaatc acccttcaca aaactaagtg 780caagaacaca acttcagacc aaactcaaac aactaatgac aaaatacaaa gacgaaaccc 840taagcataac attcgccggt cacagcctag gcgcgacact atcagtcgtg agcgccttcg 900acatagtgga gaatctcacg accgagatcc cagtcacggc cgtggtcttc gggtgcccaa 960aagtaggcaa caaaaaattc caacaactct tcgactcgta cccaaaccta aatgtcctcc 1020atgtaaggaa tgtcatcgac ctgatccctc tgtatcccgt gaaactcatg ggttacgtga 1080acataggaat cgagctggag atcgactcga ggaagtcgac ctttctaaag gactcgaaaa 1140acccgagtga ttggcataat ttgcaagcaa tattgcatgt tgtaagtggt tggcatgggg 1200ttaaggggga gtttaaggtt gtaaataaga gaagtgttgc attggttaat aagtcatgtg 1260attttcttaa ggaagaatgt ttggttcctc cagcttggtg ggttgtgcag aacaaaggga 1320tggttttgaa taaggatggt gagtgggttt tggctcctcc tgaggaagat cctactcctg 1380aatttgattg ataatatttc atcatgtttt atatttttat aaattttact aaatttacat 1440gacaatttat gggactaagt tacttattta tatgtttatt atatttgaaa tgtgttttaa 1500gttacataaa attgcaatta gttttaaaaa aaaaaaa 1537<210>2<211>447<212>PRT<213>香石竹<400>2Met Ala Ala Glu Ala Gln Pro Leu Gly Leu Ser Lys Pro Gly Pro Thr1 5 10 15Trp Pro Glu Leu Leu Gly Ser Asn Ala Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro20 25 30Leu Asn Asp Glu Leu Arg Glu Leu Leu Leu Arg Cys Gly Asp Phe Cys35 40 45Gln Val Thr Tyr Asp Thr Phe Ile Asn Asp Gln Asn Ser Ser Tyr Cys50 55 60Gly Ser Ser Arg Tyr Glu Lys Ala Asp Leu Leu His Lys Thr Ala Phe65 70 75 80Pro Gly Gly Ala Asp Arg Phe Asp Val Val Ala Tyr Leu Tyr Ala Thr85 90 95Ala Lys Val Ser Val Pro Glu Ala Phe Leu Leu Lys Ser Arg Ser Arg100 105 110Glu Lys Trp Asp Arg Glu Ser Asn Trp Ile Gly Tyr Val Val Val Ser115 120 125Asn Asp Glu Thr Ser Arg Val Ala Gly Arg Arg Glu Val Tyr Val Val130 135 140Trp Arg Gly Thr Cys Arg Asp Tyr Glu Trp Val Asp Val Leu Gly Ala145 150 155 160Gln Leu Glu Ser Ala His Pro Leu Leu Arg Thr Gln Gln Thr Thr His165 170 175Val Glu Lys Val Glu Asn Glu Glu Lys Lys Ser Ile His Lys Ser Ser180 185 190Trp Tyr Asp Cys Phe Asn Ile Asn Leu Leu Gly Ser Ala Ser Lys Asp195 200 205Lys Gly Lys Gly Ser Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Pro Lys Val Met210 215 220Gln Gly Trp Met Thr Ile Tyr Thr Ser Glu Asp Pro Lys Ser Pro Phe225 230 235 240Thr Lys Leu Ser Ala Arg Thr Gln Leu Gln Thr Lys Leu Lys Gln Leu245 250 255Met Thr Lys Tyr Lys Asp Glu Thr Leu Ser Ile Thr Phe Ala Gly His260 265 270Ser Leu Gly Ala Thr Leu Ser Val Val Ser Ala Phe Asp Ile Val Glu275 280 285Asn Leu Thr Thr Glu Ile Pro Val Thr Ala Val Val Phe Gly Cys Pro290 295 300Lys Val Gly Asn Lys Lys Phe Gln Gln Leu Phe Asp Ser Tyr Pro Asn305 310 315 320Leu Asn Val Leu His Val Arg Asn Val Ile Asp Leu Ile Pro Leu Tyr325 330 335Pro Val Lys Leu Met Gly Tyr Val Asn Ile Gly Ile Glu Leu Glu Ile340 345 350Asp Ser Arg Lys Ser Thr Phe Leu Lys Asp Ser Lys Asn Pro Ser Asp355 360 365Trp His Asn Leu Gln Ala Ile Leu His Val Val Ser Gly Trp His Gly
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20 25 30Lys Gly Met Leu Gln Pro Leu Asp Gln Asp Leu Arg Glu Tyr Ile Ile35 40 45His Tyr Gly Glu Met Ala Gln Ala Gly Tyr Asp Thr Phe Asn Ile Asn50 55 60Thr Glu Ser Gln Phe Ala Gly Ala Ser Ile Tyr Ser Arg Lys Asp Phe65 70 75 80Phe Ala Lys Val Gly Leu Glu Ile Ala His Pro Tyr Thr Lys Tyr Lys85 90 95Val Thr Lys Phe Ile Tyr Ala Thr Ser Asp Ile His Val Pro Glu Ser100 105 110Phe Leu Leu Phe Pro Ile Ser Arg Glu Gly Trp Ser Lys Glu Ser Asn115 120 125Trp Met Gly Tyr Val Ala Val Thr Asp Asp Gln Gly Thr Ala Leu Leu130 135 140Gly Arg Arg Asp Ile Val Val Ser Trp Arg Gly Ser Val Gln Pro Leu145 150 155 160Glu Trp Val Glu Asp Phe Glu Phe Gly Leu Val Asn Ala Ile Lys Ile165 170 175Phe Gly Glu Arg Asn Asp Gln Val Gln Ile His Gln Gly Trp Tyr Ser180 185 190Ile Tyr Met Ser Gln Asp Glu Arg Ser Pro Phe Thr Lys Thr Asn Ala195 200 205Arg Asp Gln Val Leu Arg Glu Val Gly Arg Leu Leu Glu Lys Tyr Lys210 215 220Asp Glu Glu Val Ser Ile Thr Ile Cys Gly His Ser Leu Gly Ala Ala225 230 235 240Leu Ala Thr Asp Ser Ala Ile Asp Ile Val Ala Asn Gly Tyr Asn Arg250 250 255Pro Lys Ser Arg Pro Asp Lys Ser Cys Pro Val Thr Ala Phe Val Phe260 265 270Ala Ser Pro Arg Val Gly Asp Ser Asp Phe Arg Lys Leu Phe Ser Gly275 280 285Leu Glu Asp Ile Arg Val Leu Arg Thr Arg Asn Leu Phe Asp Val Ile290 295 300Pro Ile Tyr Pro Pro Ile Gly Tyr Ser Glu Val Gly Asp Glu Phe Pro305 310 315 320Ile Asp Thr Arg Lys Ser Pro Tyr Met Lys Ser Pro Gly Asn Leu Ala325 330 335Thr Phe His Cys Leu Glu Gly Tyr Leu His Gly Val Ala Gly Thr Gln340 345 350Gly Thr Asn Lys Ala Asp Leu Phe Arg Leu Asp Val Glu Arg Ala Ile355 360 365Gly Leu Val Asn Lys Ser Val Asp Gly Leu Lys Asp Glu Cys Met Val370 375 380Pro Gly Lys Trp Arg Val Leu Lys Asn Lys Gly Ala Gln Gln Asp Asp385 390 395 400Gly Ser Trp Glu Leu Val Asp His Glu Ile Asp Asp Asn Glu Asp Leu405 410 415Asp Phe<210>13<211>401<212>PRT<213>Ipomoea sp.<400>13Met Ser Gly Ile Ala Lys Arg Trp Lys Val Leu Ser Gly Ser Asp Asn1 5 10 15Trp Glu Gly Leu Leu Glu Pro Leu Asp Ser Asp Leu Arg Arg Tyr Leu
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1.一种编码衰老诱导脂酶的分离的DNA分子，其中，所述DNA分子能在低严紧条件下与SEQ ID NO1杂交，或者能够与SEQ ID NO1杂交的所述分离的DNA分子的功能性衍生物。
2.如权利要求1的分离的DNA分子，其中，所述DNA分子具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
3.如权利要求1的分离的DNA分子，其中，所述分离的DNA分子含有SEQ ID NO4的核苷酸序列。
4.一种由能在低严紧条件下与SEQ ID NO1杂交的核苷酸序列编码的分离的衰老诱导脂酶，或所述衰老诱导脂酶的功能性衍生物。
5.如权利要求4的衰老诱导脂酶，其中，所述脂酶具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
6.一种用于转化植物细胞的载体，它包括(a)一种反义寡核苷酸或多核苷酸，它大体上互补于(1)编码衰老诱导脂酶的DNA分子的一股链的至少一部分，其中，所述编码衰老诱导脂酶的DNA分子能在低严紧条件下与SEQ ID NO1杂交，或(2)由所述编码衰老诱导脂酶的DNA分子所编码的RNA序列的至少一部分；和(b)可操作地连接于所述反义寡核苷酸或多核苷酸上的调控序列，因此，所述反义寡核苷酸或多核苷酸能在用它转化过的细胞中表达。
7.如权利要求6的载体，其中，所述调控序列包括一个启动子和转录终止区。
8.如权利要求6的载体，其中，所述调控序列包括一个组成型启动子。
9.如权利要求6的载体，其中，所述调控序列包括一个植物组织专一性启动子。
10.如权利要求6的载体，其中，所述调控序列包括一个衰老诱导植物启动子。
11.如权利要求6的载体，其中，所述调控序列包括一个病毒启动子。
12.如权利要求11的载体，其中，所述调控序列包括一个组成型启动子。
13.一种反义寡核苷酸或多核苷酸，它所编码的RNA分子大体上互补于植物衰老诱导脂酶基因的RNA转录物的至少一部分，其中，所述植物基因能在低严紧条件下与SEQ ID NO1杂交。
14.如权利要求13的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述寡核苷酸或多核苷酸包括大约6-大约100个核苷酸。
15.如权利要求13的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述植物基因的编码区具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
16.如权利要求13的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述植物基因是香石竹基因。
17.如权利要求13的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述植物基因是番茄基因。
18.如权利要求13的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述植物基因是绿豆基因。
19.如权利要求13的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述反义寡核苷酸或多核苷酸大体上互补于所述RNA转录物的5’非编码区的至少一部分。
20.一种载体，它包括(a)一种编码衰老诱导脂酶的DNA分子，其中，所述DNA分子能在低严紧条件下与SEQ ID NO1杂交；和(b)可操作地连接于所述DNA分子上的调控序列，因此，所述DNA分子能在用它转化过的细胞中表达。
21.一种用权利要求20的载体转化过的细菌细胞。
21.一种用权利要求6的载体转化过的植物细胞。
22.一种由用权利要求6的载体转化过的植物细胞再生的植物及其后代。
23.如权利要求22的植物、植物部分或植物后代。
24.一种抑制植物细胞中内源衰老诱导脂酶表达的方法，该方法包括(1)将包括以下部分的载体整合到所述植物的基因组中(A)一种反义寡核苷酸或多核苷酸，它大体上互补于(i)编码内源衰老诱导脂酶的DNA分子的一股链的至少一部分，其中，所述编码内源衰老诱导脂酶的DNA分子能与SEQ ID NO1杂交，或(ii)由所述内源衰老诱导脂酶的DNA分子所编码的RNA序列的至少一部分；和(B)可操作地连接于所述反义寡核苷酸或多核苷酸上的调控序列，因此，所述反义寡核苷酸或多核苷酸能表达；和(2)生长所述植物，以便转录所述反义寡核苷酸或多核苷酸，并且，该转录物结合于所述RNA序列上，因此抑制了所述衰老诱导脂酶基因的表达。
25.如权利要求24的方法，其中，与所述反义寡核苷酸或多核苷酸大体上互补的DNA部分或RNA部分包括5’非编码序列。
26.如权利要求24的方法，其中，所述抑制会导致植物衰老的改变。
27.如权利要求24的方法，其中，所述抑制会导致所述植物对环境胁迫诱导的衰老抗性的增强。
28.如权利要求24的方法，其中，所述调控序列包括能在植物中起作用的组成型启动子。
29.如权利要求24的方法，其中，所述调控序列包括组成型启动子。
30.如权利要求24的方法，其中，所述调控序列包括能在植物中起作用的组织专一性启动子。
31.如权利要求24的方法，其中，所述调控序列包括能在植物中起作用的衰老诱导启动子。
32.如权利要求24的方法，其中，所述植物选自结果实的植物，开花植物和蔬菜。
33.如权利要求24的方法，其中，所述植物是番茄。
34.如权利要求24的方法，其中，所述植物是香石竹。
35.一种抑制植物细胞中内源衰老诱导脂酶表达的方法，该方法包括(1)将包括以下部分的载体整合到所述植物至少一个细胞的基因组中(A)一种编码内源衰老诱导脂酶的分离的DNA分子，其中，所述DNA分子能在低严紧条件下与SEQ ID NO1杂交，或能与SEQ ID NO1杂交的所述分离的DNA分子的功能性衍生物；和(B)可操作地连接于所述DNA分子上的调控序列，因此，由它所编码的内源衰老诱导脂酶能表达；和(2)生长所述植物，以便超量表达所述DNA分子，并且，由外源衰老诱导脂酶抑制了所述内源衰老诱导脂酶基因的表达。
36.如权利要求35的方法，其中，所述调控序列包括组成型启动子。
37.一种改变植物的与年龄相关的衰老和与环境胁迫相关的衰老的方法，该方法包括(1)将包括以下部分的载体整合到所述植物的基因组中(A)一种反义寡核苷酸或多核苷酸，它大体上互补于(i)编码内源衰老诱导脂酶的DNA分子的一股链的至少一部分，其中，所述编码内源衰老诱导脂酶的DNA分子能与SEQ ID NO1杂交，或(ii)由所述内源衰老诱导脂酶基因所编码的RNA序列的至少一部分；和(B)可操作地连接于所述反义寡核苷酸或多核苷酸上的调控序列，因此，所述反义寡核苷酸或多核苷酸能表达；和(2)生长所述植物，以便转录所述反义寡核苷酸或多核苷酸，并且，该转录物结合于所述RNA序列上，因此抑制了所述衰老诱导脂酶基因的表达。
38.一种转基因植物细胞，包括权利要求6的载体。
39.一种转基因植物细胞，包括权利要求20的载体。
40.一种质粒，包括能在原核宿主中起作用的复制系统和 13的反义寡核苷酸或多核苷酸。
41.一种质粒，包括能在农杆菌属中起作用的复制系统和 13的反义寡核苷酸或多核苷酸。
42.一种由具有受到抑制了的或减弱了的衰老诱导脂酶表达的细胞所产生的植物及其后代，所述细胞包括权利要求6的载体。
43.一种由具有受到抑制了的或减弱了的衰老诱导脂酶表达的细胞所产生的植物及其后代，其中，所述细胞是通过以下步骤产生的；(1)将包括以下部分的载体整合到所述细胞的基因组中(A)一种反义寡核苷酸或多核苷酸，它大体上互补于(i)编码内源衰老诱导脂酶的DNA分子的一股链的至少一部分，其中，所述编码内源衰老诱导脂酶的DNA分子能与SEQ ID NO1杂交，或(ii)由所述内源衰老诱导脂酶基因所编码的RNA序列的至少一部分；和(B)可操作地连接于所述反义寡核苷酸或多核苷酸上的调控序列，因此，所述反义寡核苷酸或多核苷酸能表达；和(2)生长所述植物，以便转录所述反义寡核苷酸或多核苷酸，并且，该转录物结合于所述RNA上，因此抑制了所述衰老诱导脂酶基因的表达。
44.如权利要求43的植物和后代，其中，所述植物是番茄。
45.如权利要求43的植物和后代，其中，所述植物是香石竹。
46.一种抑制种子衰老的方法，该方法包括(1)将包括以下部分的载体整合到所述植物的基因组中(A)一种反义寡核苷酸或多核苷酸，它大体上互补于(i)编码内源衰老诱导脂酶的DNA分子的一股链的至少一部分，其中，所述编码内源衰老诱导脂酶的DNA分子能与SEQ ID NO1杂交，或(ii)由所述内源衰老诱导脂酶的编码DNA分子所转录的RNA序列的至少一部分；和(B)可操作地连接于所述反义寡核苷酸或多核苷酸上的调控序列；和(2)生长所述植物，以便转录所述反义寡核苷酸或多核苷酸，并且，该转录物结合于所述RNA上，因此抑制了所述衰老诱导脂酶基因的表达。
全文摘要
通过将编码衰老诱导脂酶基因或基因片段沿反义方向整合到植物基因组中,实现了对植物衰老表达的调控。鉴定了编码衰老诱导脂酶香石竹基因,并将其核苷酸序列用于改变转基因植物的衰老。
文档编号C12N15/09GK1354797SQ00806296
公开日2002年6月19日 申请日期2000年2月14日 优先权日1999年2月16日
发明者J·E·汤普森, T·-W·王, K·胡达克, Y·洪 申请人:森尼斯科公司