专利名称：：一种牡丹组织培养方法及改良的基本培养基的制作方法
技术领域：
：本发明属于植物组织培养领域，涉及一种牡丹的组织培养繁殖方法，具体地，涉及一种牡丹组织的无菌培养方法和一种改良的基本培养基。
背景技术：
：牡丹(paeoniasiz/f/Y/z^'cassAndr.)属于芍药禾斗(paeoniaceae)芍药属牡丹组落叶亚灌木植物，因其花朵大，花色多，雍容华贵，仪态万千，被尊为"百花之王"，是中国十大名花之首，在国内外有极高盛誉。中国作为牡丹唯一的原产地，栽培历史悠久，从南北朝至今已有1500多年，其品种类型已达800余种，分布于我国大江南北。它作为我国原生的、古老的特有植物是研究栽培植物起源、人工选择理论和进行科学试验的良好材料。牡丹作为我国重要的出口花卉，在长期的牡丹栽培历史过程中，我国人民对它的认识逐步深入，产生了深厚的感情，也历史地形成和发展出了我国特有的牡丹文化。目前，牡丹生产主要依靠常规繁殖，通过播种牡丹种子进行有性繁殖。由于其繁殖系数大，生产上多用于选育优良品种与培育砧木，药用牡丹也用种子繁殖。但主要用于观赏的重瓣品种一般不结实，并且种子还具有上胚轴休眠现象，繁育周期长，而且播种得到的苗木容易发生变异和性状分离。在无性繁殖中，主要依靠分株繁殖、嫁接繁殖、压条繁殖和扦插繁殖。但这些技术都存在着种种限制，不仅繁殖系数小，繁殖速度慢，而且其生产周期相对较长。一株商品种苗的生产至少需要3年的时间，很难形成规模，根本无法满足市场的需求。尤其是一些优良品种，用传统的繁殖方法难以在短期内得到推广，这些都严重影响并制约着牡丹的商品化、产业化、规模化生产。因此，组织培养就是解决其快速繁殖的最有效手段之一。通过对牡丹组织培养技术的研究，可以改变传统的繁殖方法，缩短牡丹的生产周期，极大地提高其繁殖系数，为生产提供大量种苗。有些牡丹品种感染病毒病后就会大大地影响其观赏价值，采用组织培养技术就可以利用植株的分生组织不易感染病毒的原理培育牡丹的脱毒苗木。由于常规的有性繁殖往往会造成大小不一的变异，如牡丹花的红色可能变异成粉红色等。而组织培养不存在变异，可保持其原母本的一切遗传特性，防止种质资源的退化。而且，利用组织培养技术保存种质资源还有诸多优点(1)占空间小；(2)可防止病虫；(3)可以迅速大量繁殖；(4)费用低；(5)便于交流等。国内外学者已经对牡丹的组织培养进行了大量的研究工作，均取得了不同程度的进展，有的已经获得了生根植株，在理论上进行生产是可行的，但尚未投入生产。因为在牡丹组培苗的生产工艺中，外植体表面消毒污染率高一直是一个瓶颈一方面其大量增加人为工作量，一方面又耗费掉相当数量种资材料。此外，用于外植体灭菌的消毒剂，多采用升汞、次氯酸盐及抗生素。其中，升汞由于对环境的严重污染，已不提倡使用；抗生素由于对植物生长造成抑制，应用也不广泛。次氯酸盐，尤其次氯酸钠，以灭菌效果好，对环境污染很小，使用方便等优点成为外植体灭菌剂的最佳选择。文献中常用于牡丹组织培养的有两种基本培养基MS培养基和WPM培养基。然而，在培养过程中，这两种培养基经常使培养物发生严重褐变、玻璃化，而且繁殖系数低、组培苗生长缓慢，培养出的不定芽生根困难；在有的研究中甚至未获得瓶内生根苗。还有炼苗、出瓶等问题，尤其是后者，这是在当前牡丹组织培养环节中众所周知的最大困扰，特别在高温季节，造成成本过高，难于推广。此外，褐化是伴随牡丹组织培养始终的一个现象，其本质是酚类物质在多酚氧化酶作用下，氧化成蒽醌类物质。牡丹作为一种肉质根的亚灌木植物，富含该类物质。此物质对植物本身的生长，有一定促进作用，但积累过多，也会造成毒害。所以，关键在于改善其组培苗的生长环境。首要的，即是改善其生长培养基组分。因此，在牡丹的组织培养技术中，这些关键步骤仍需进行深入的研究。本申请的发明人通过多年潜心研究，改进了目前牡丹组织无菌培养的方法，建立了一种牡丹组织无菌培养体系，并且发现了一种更适于牡丹组织培养的培养基，克服了当前培养技术中的上述缺陷。
发明内容因此，本发明的一个目的是提供一种用于牡丹组织无菌培养的基本培养基PM，其配方的组成为200—700mg/LNH4N03、300—400mg/LMgS047H20、150_350mg/LKH2P04、50—900mg/LCaCl22H20、O—1000mg/LK2S04、0—1400mg/LCa(N03)2、1500—2000mg/L跳、20—100mg/LFeS047H20、37.3mg/LNa2-EDTA、22.3rag/LMnS044H20、8.6mg/LZnS047H20、6.2mg/LH3B03、0.025mg/LCuS045H20、0.25mg/LNa2Mo042H20、0.83mg/LKI、0.025mg/LCoCl26H20、0.1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸VB5、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、25g/L蔗糖和6—7g/L琼脂。优选地，其中N^N03为296mg/L、MgS047H20为370mg/L、KH2P04为340mg/L、CaCl22H20为95.55mg/L、K2S04》990mg/L、Ca(N03)24H20为1309.8mg/L、訓3为1900mg/L、FeS047H20为27.8mg/L。更优选地，其中NH萬为700mg/L、MgS047H20为370mg/L、,04为340mg/L、CaCl22H20为882mg/L、1(2504为0mg/L、Ca(N0》2为0mg/L、跳为1500mg/L、FeS047H20为99.90mg/L。本发明另一个目的是提供一种用于牡丹组织培养的增殖培养基，其配方为在基本培养基PM的基础上添加0.5—1.5mg/LBA、25g/L蔗糖和6—7g/L琼脂。本发明的另一个目的是提供一种牡丹组织无菌培养的方法，其特征在于包括下列步骤(1)外植体的消毒；(2)将步骤(1)处理后的外置体接种于基本培养基PM;(3)将经过步骤(2)培养的外植体组织转接于增殖培养基中继续进行培养。其中，外植体灭菌的步骤包括先将外植体以70%乙醇浸泡30秒钟，然后使用浓度为0.2—0.5%的次氯酸钠作为表面灭菌剂消毒10分钟，无菌水冲洗4次，剥去外层鳞片；再用0.1%次氯酸钠溶液消毒5分钟，用无菌水冲洗4次。由于本发明的基本培养基PM是在MS培养基的基础上，改变了大量元素的组成和含量，使得基本培养基中盐分的总摩尔数减少，大大降低了牡丹培养物的褐变；同时也避免了高盐培养基对植株生长的抑制，使得在继代增殖阶段的植株生长健壮，叶片浓绿，叶柄呈粉红、红紫色，茎段木质化程度增加，增殖率显著高于平均水平。此外，在本发明的牡丹组织无菌培养体系中，由于改进了目前对牡丹组织培养过程中外植体消毒的方法，显著降低了外植体的污染率，提高了组织培养的存活率。具体实施方式以下实施例仅用于说明本发明，但不用于来限制本发明的范围。6实施例l:牡丹外植体的消毒处理在12月_次年1月间在晴朗的午后，从生长健壮的"赵粉"品种的牡丹植株上采集无病虫害、饱满的鳞芽作为外植体，放入4'C冰箱中保存备用。先用自来水冲洗外植体的表面，再用毛刷蘸洗衣粉溶液刷洗每一个鳞芽，然后在自来水下冲洗30—60分钟，转移到超净台工作上，在每个无菌三角瓶中放5—7个鳞芽。将上述采集的鳞芽分别按下述方法进行消毒处理(1)70%的乙醇消毒30秒钟，无菌水清洗2次；添加2—3滴吐温80的5%次氯酸钠溶液消毒5分钟，无菌水冲洗4次；(2)70%的乙醇消毒30秒钟，无菌水清洗2次；添加2—3滴吐温80的5%次氯酸钠溶液消毒10分钟，无菌水冲洗4次；(3)70%的乙醇消毒30秒钟，无菌水清洗2次；添加2—3滴吐温80的5%次氯酸钠溶液消毒15分钟，无菌水冲洗4次；(4)70%的乙醇消毒30秒钟，无菌水清洗2次；添加2—3滴吐温80的1%次氯酸钠溶液消毒15分钟，无菌水冲洗4次；(5)70%的乙醇消毒30秒钟，无菌水清洗2次；添加2—3滴吐温80的1%次氯酸钠溶液消毒20分钟，无菌水冲洗4次；(6)70%的乙醇消毒30秒钟，无菌水清洗2次；添加2—3滴吐温80的1%次氯酸钠溶液消毒25分钟，无菌水冲洗4次；(7)70%的乙醇消毒30秒钟，无菌水清洗2次；添加2—3滴吐温80的0.2%次氯酸钠溶液消毒10分钟，无菌水冲洗4次；再用0.1%次氯酸钠溶液消毒5分钟，用无菌水冲洗4次；(8)70%的乙醇消毒30秒钟，无菌水清洗2次；添加2—3滴吐温80的0.5%次氯酸钠溶液消毒10分钟，无菌水冲洗4次；再用0.1%次氯酸钠溶液消毒5分钟，用无菌水冲洗4次；经过上述消毒方法处理后，将鳞芽置于培养皿中，用剪刀、镊子拨掉芽外部鳞片，剪去芽基部较硬的部分后将芽接种在预先制备的基本培养基MS上，每瓶放一个外植体，在25±1°C，光照周期14h/d，相对湿度60%，光照强度为200030001x条件下培养7天，统计经上述处理后的鳞芽的污染率，比较不同消毒方法的消毒效果。结果如下表l:"赵粉"品种表面灭菌情况消毒方法接种数污染数污染率％1302790.002302066.673301756.674302170.005301653.336301343.337301033.33830826.67上述结果表明与现有的单一消毒液浓度一次灭菌的方法相比，本发明的先用0.2_0.5%的次氯酸钠消毒，然后剥去外层鳞片，再用0.1%次氯酸钠溶液消毒的二次消毒方法能够显著降低外植体的污染率，提高无菌组织培养的存活率。实施例2:基本培养基对牡丹培养组织增殖的影响在12月一次年1月间在晴朗的午后，从生长健壮的"紫兰魁"品种的牡丹植株上釆集无病虫害、饱满的鳞芽作为外植体，按上述实施例1所述方法对外植体进行消毒灭菌。将无菌消毒后的外植体接种到分别添加了0.5—1.5mg/LBA、25g/L蔗糖和6—7g/L琼脂的1/2MS、MS、WPM、PM—1和PM—2基础培养基中，在25土1。C，光照周期14h/d，相对湿度60%，光照强度为200030001x条件下培养30天，重复进行三次，并根据组织培养增值率的计算方法统计增殖率，并且观察植株的生长状况。PM—1基本培养基的配方为700mg/LNH萬、370mg/LMgS047H20、340mg/LKH2P04、882mg/LCaCl22H20、1500mg/LKN03、99.90mg/LFeS047H20、22.3mg/LMnS04■、8.6mg/LZnS047H20、6.2mg/LH肌、0.025mg/LCuS045H20、0，25mg/LNa2Mo042H20、0.83mg/LKI、0.025mg/LCoCl26H20、37.3mg/LNa厂EDTA、0.1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡眵辛、0.5mg/L烟酸VBs、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇；PM—2基本培养基的配方为296mg/LNH萬、370mg/LMgS047H20、340mg/LKH2P04、95.55mg/LCaCl22H20、1309.8mg/LCa(N03)24H20、990mg/LK2S04、1900rag/LKN03、27.8mg/LFeS047H20、22.3mg/LMnS044H20、8.6mg/LZnS047H20、6.2mg/LH3B03、0.025mg/LCuS045H20、0.25mg/LNa2Mo042H20、0.83mg/LKI、0.025mg/LCoCl26H20、37.3mg/LNa2-EDTA、0.1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸VB5、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇。结果如表2所示。表2:基本培养基对"紫兰魁"增殖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>上述结果表明由于本发明的基本培养基PM—1和2在MS培养基的基础上，改变了大量元素的组成和含量，使得培养基中盐分的总摩尔数减少，增殖率显著高于普通基础培养基；并且同时还观察到在基本培养基PM—1和2上培养的植株生长健壮，叶片浓绿，叶柄呈粉红、红紫色，茎段木质化程度增加，褐变也显著降低。权利要求1.一种用于牡丹组织无菌培养的基本培养基PM，其组成为200-700mg/LNH4NO3、300-400mg/LMgSO4·7H2O、150-350mg/LKH2PO4、50-900mg/LCaCl2·2H2O、0-1000mg/LK2SO4、0-1400mg/LCa(NO3)2·4H2O、1500-2000mg/LKNO3、20-100mg/LFeSO4·7H2O、37.3mg/LNa2-EDTA、22.3mg/LMnSO4·4H2O、8.6mg/LZnSO4·7H2O、6.2mg/LH3BO3、0.025mg/LCuSO4·5H2O、0.25mg/LNa2MoO4·2H2O、0.83mg/LKI、0.025mg/LCoCl2·6H2O、0.1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸VB5、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇。2.权利要求1的基本培养基PM，其中顺4冊3为296mg/L、MgS047H20为370mg/L、,04为340mg/L、CaCl22H20为95.55mg/L、K2S04为990mg/L、Ca(N03)24H20为1309.8mg/L、跳为1900mg/L、FeS047H20为27.8mg/L。3.权利要求1的基本培养基PM，其中朋4恥3为700mg/L、MgS04，7H20为370mg/L、,04为340mg/L、CaCl22H20为882mg/L、K2S04》0mg/L、Ca(N03)2■为0mg/L、跳为1500mg/L、FeS047H20为99.90mg/L。4.一种用于牡丹组织无菌培养的增殖培养基，其组成为在权利要求1_3中任一项的基本培养基PM基础上添加0.5—1.5mg/LBA、25g/L蔗糖和6—7g/L琼脂。5.—种牡丹组织无菌培养的方法，其特征在于包括下列步骤(1)外植体的消毒；(2)将步骤(1)处理后的外植体接种于权利要求1_3任一项所述的基本培养基PM中；(3)将经过步骤(2)培养的外植体组织转接于权利要求4所述的增殖培养基中继续培养。6、权利要求5的方法，其中外植体消毒的步骤包括将外植体以70%乙醇浸泡30秒钟，无菌水清洗2次，然后用0.2—0.5%的次氯酸钠消毒10分钟，无菌水冲洗4次，剥去外层鳞片；再用0.1%次氯酸钠溶液消毒5分钟，用无菌水冲洗4次。全文摘要本发明提供一种用于牡丹组织培养的方法，包括下列步骤(1)外植体的灭菌；(2)灭菌处理后的外置体接种于基本培养基PM；(3)外植体转接到增殖培养基中继续培养。本发明还提供一种更适于牡丹组织无菌培养的改良的基本培养基PM和增殖培养基。在本发明的牡丹组织的无菌培养方法中，采用将外植体先用70％酒精消毒，然后用0.2-0.5％次氯酸消毒，剥去外植体外壳，再用0.1％次氯酸再次进行灭菌的方法，大大降低了外植体的污染率，显著提高了组织培养的存活率。此外，发明的基本培养基PM是在MS培养基的基础上，改变了其中的大量元素的组成和含量，减少了基本培养基中盐分的总摩尔数，提高了外植体的增殖率，同时降低了牡丹培养物的褐变，也避免了高盐培养基对植株生长的抑制。文档编号C12N5/04GK101248764SQ20081008969公开日2008年8月27日申请日期2008年4月14日优先权日2008年4月14日发明者张俊琦,莹李,罗晓芳申请人:北京林业大学