专利名称：使用改良的培养基从破囊壶菌目菌群生产ω-3脂肪酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及以石皮嚢壶菌目(Thraustochytriales)」微生物生产co-3 脂肪酸的改良方法，其^f吏用一种改良的培养基组合物。尤其是，本 发明涉及一种通过在发酵罐内培养孩i生物(如Ulkenia菌、 Thraustochytrium菌和/或Schizochytrium菌)生产co-3月旨肪酉臾的方 法，该方法包含在钠离子降低、钾离子浓度升高的环境中培养破嚢 壶菌目微生物群的步骤。
背景技术：
摄入特定co-3脂肪酸对人体或动物机体有多种益处，包含但不 限于减少心血管和炎症疾病。已知在发酵罐内，石皮嚢壶菌目的多个 微生物成员是极好的多烯脂肪酸生产者，尤其是低盐水平生长时， 因此它们可用来商业4匕生产co-3高不々包和脂肪酸，如DHA,最重 要的co-3脂肪酸之一。
海洋来源的海洋微藻通常需要确定的条件来生长和生产脂质。 例如，用于这些微生物的培养和/或发酵的培养基必须在某一盐度范 围，以维持微生物生长和生产脂质。由Bahnweg, Veroff. Inst. Meeresforsch. Bremerh" 17 (1979), 245-268页丢口道， 一些菌才朱，"^口 Thraustochytrium aureum,在NaCl浓度为1.5%-3%之间时生长最好， 且培养基中不含钾离子会减緩这些菌株的生长，但是其它的菌抹， ^口 Schizochytrium aggregatum,贝"不'吏f;^向。it匕夕卜，i咅养基'义、》贞有一定的pH范围。如果这一条件没有达到，石皮嚢壶菌目细月包停止生
长和/或细胞生产较少的多烯酸。根据Bahnweg， Ver6ff. Inst. Meei'csforsch. Bremerh.， 17(1979), 245-268页，^f于大多凄t的石皮嚢壶 菌目菌抹，最佳的pH值是在6.0-8.0之间，而pH值小于5.0时， 未见菌抹生长。然而，发酵期间随着发酵液中养分的消耗和细胞释 放废产物进入发酵液，pH值会发生变化。美国专利US 5,340,594 记载了发酵期间培养基变得更呈石咸性，并因此通过加酸来控制pH 值。德国专利DE 103 52 837 Al报道正好相反，海洋微生物发酵期 间如不控制pH值，培养基会变酸。
发酵破嚢壶菌目常用的培养基具有相对高的氯化钠浓度。但 是，从Barcley的美国专利US 6,410,281 Bl已知，用来发酵石皮嚢壶 菌目的培养基中如此高的氯化物浓度将促使不锈钢发酵罐腐蚀。另 一个发酵破嚢壶菌目遇到的问题是，尽管使用的发酵培养基具有相 对高的盐浓度，但是破嚢壶菌目的高密度培养或高脂质生产所必须 的重要金属离子(如4曱)的含量极〈氐。
因此，本领域存在需要为破嚢壶菌目的发酵提供一种改良的培 养基，且还需要一种改良的方法来培养这些樣i藻以4吏石皮嚢壶菌目细 胞在发酵罐内更高密度发酵以及高不饱和脂肪酸(如DHA)的产 量更高，由此而减少使用高盐度培养基的发酵方法有关的副反应，
如腐蚀发酵在律。
发明内容
本发明提供破嚢壶菌目微生物的发酵方法，其特征为发酵期间 培养基的pH值通过加入^5咸来控制，尤其是氢氧化钾。另外，本发 明提供了从破囊壶菌目微生物中获取脂质的方法，其特征为在这些微藻的发酵期间发酵培养基的pH值通过加入石成来控制，优选氪氧化钟。
由此，4艮据本发明，在石皮嚢壶菌目菌4朱的发酵期间氢氧化钾作
为pH值控制剂使用。发酵培养基中加入氢氧化钾防止由于某些养 分的消耗以及微生物细胞生成废产物而导致培养基的pH值发生变 化，因为氢氧化钾的OH—离子中和了释放进入培养基的质子。而且， 由于氢氧化钾的加入，培养基中钾离子的浓度显著升高，这对培养 的微生物细胞的生长和脂质生产有着积才及的、有利的作用。
此外，在发明的方法中氢氧化钾作为pH值控制剂使用有利地 助于显著地降低发酵设备的腐蚀，尤其是降低不锈钢发酵罐腐蚀。 现有4支术常将酸作为pH ^i控制剂^吏用。例如美国专利US 5,340,594。盐酸是本领域频繁作为pH值控制剂4吏用的酸之一。盐 酸溶解后离解成带负电荷的氯离子和带正电荷的氢离子。但是，阴 离子例如氯离子显著地促使不4秀钢发酵罐的腐蚀。例如参见美国专 利US 6,410,281。因此，在那篇专利中，推荐在发酵培养基中使用 非氯化钠盐(如碳酸钠，碳酸氢纳，石克酸钠等等)以降低不4秀钢发 酵罐的腐蚀。然而，那篇专利未注意到，在发酵培养基中加入pH 值控制剂会引入大量的离子而促使发酵罐的腐蚀。与那篇专利相 反，本发明完全避免了有害阴离子(通过加入促使发酵罐腐蚀的pH 值控制剂)的引入。改为氢氧化钾(KOH)作为pH值控制剂，其 离解成钾离子和氬氧离子，解离后的氢氧离子立即被发酵培养基中 的氢离子中和。因此，与美国专利US6，410，281比较，本发明以本 质上不同的方法解决了发酵罐的腐蚀问题。
因此，本发明一方面涉及石皮嚢壶菌目嶺炎生物的发酵的方法，其 包括在控制的条件下在含钠浓度0.2g/升到约10.8g/升之间的发酵培养基中培养微生物，发酵期间使用氢氧化钾调节培养基的pH值以 及收获微藻生物量的步骤。
本发明另一方面涉及在含盐发酵培养基中破嚢壶菌目微生物 的发酵期间降低发酵罐腐蚀的方法，其包含在控制的条件下在含钠
浓度0.2g/升到约10.8g/升之间的含盐发酵培养基中于发酵罐内培养 微生物以及发酵期间使用碱(尤其是氢氧化钾)调节培养基pH值。 本降^^腐蚀的发明方法还包4舌在发酵后收获纟效生物生物量步骤以 及视情况可包括从生物量中提取脂质的步骤。
本发酵微生物的发明方法以及降低发酵罐腐蚀的发明方法包 括在限定条件下于培养基中培养和/或发酵破嚢壶菌目微藻，如 Ulkenia 、Thraustochytrium 、Schizochytrium 、Althornia 、 Aplannochytrium、 apanochytrium或Labyrinthuloides。
根据本发明的发明方法中^吏用的液体培养基包含一种适宜的 -炭源，如4唐。^!源的优选例子包括^旦不限于葡萄^f唐、淀并分和一唐蜜。 本发明方法使用的发酵培养基或发酵液还包含一种适宜的氮源，如 硝酸盐、氨化合物、氨基酸、酵母4是耳又液、玉米浆等。本发明方法 使用的培养基还包舍浓度约为0.2g/升到约10.8g/升之间的氯离子， 其大致相当于海水的钠离子浓度。此外，培养和/或发酵过程用的培 养基还包含钾离子。在本发明优选的实施方式中，培养基包含浓度 约为O.lg/升到约1.0g/升之间的钾离子。
通过本发明方法，微藻的生长和脂质生产可在与允许得到得到 满意的微藻生长和/或细胞的高脂质生产的温度下实现，例如，在 15。C到48。C之间，4尤选十青)兄下在25。C到28。C之间。摆t葉的生长可以 在适宜微藻发酵或培养的容器和槽内进行。优选的发酵设备包括但 不限于搅拌的和/或通气的容器、气升式反应器、摇瓶等等。破嚢壶菌目菌群培养在一个大的容器或反应器中时，优选地通过以一抹或 多抹微藻菌抹的斜面培养的一等分或者一林或多林菌抹的低温保 存培养的一等分接种营养的肉汤培养基生产接种物。然后连续将该 接种物转移至较大的体积的液体培养基中，直至其最终达到一个适 宜接种入最终生产体积的体积。
在本发明方法的 一种优选的实施方式中，用来发酵的石皮囊壶菌
目微生物属于 Thraustochytrium 、 Schizochytrium 、 Ulkenia 、 Althornia、 Aplananochytrium、 Japanochytrium或 Labyrinthuloides 属。菌妹或种的具体的优选实例包括但不限于Ulkenia SAM 2179 、 Thraustochytrium aureum、 Schizochytrium limacinum SR21和Schizo-chytrmm aggregatum。石皮嚢壶菌目的4敬藻属于异养生物群，即，它 们是获取从有机底物获取能量和细胞碳的有机体，而且可以在暗处 (即，没有光)生长。
根据本发明不同种的微生物的混合物也可以发酵。这意味着2 种以上不同种的破嚢壶菌目物种可以同时在同一个发酵在律内发酵， 以生产一种混合的生物量(其包含破嚢壶菌目的至少2种不同种的 物种)和/或一种混合的油(其包含由两种或多种不同物种生产的脂质)。
通过同时在同一个发酵罐—内培养两种或多种不同物种，可能获 得一种生物量，其脂质组成与从其中单独一种物种获得生物量的脂 质组成显著不同。在本发明的一种优选的实施方式中，Ulkenia SAM2179和Schizochytrmm limacinum SR21 —起发酵，以生产';昆 合的生物量和混合的油。
通常发酵发生在温7复为15。C以上，优选情况下在2(TC以上，更 优选情况下在25。C以上，如约28。C。根据本发明，发酵或培养微藻的时间超过约2天到约14天之间，优选情况下为直至发酵培养基
中的养分耗尽。
根据本发明的方法，通过加入氢氧化钾，发酵培养基的pH值 维持在3.5到8.0之间，优选在4.0到7.0之间。氢氧化钾可以以固 体形式(如氲氧化钾片)或以水溶液形式加入培养基。
根据本发明，加入培养基氢氧化钾的量使得最终钾离子浓度至 少为约0.2g/升、至少为约0.3g/升、至少为约0.4g/升、至少为约0.5g/ 升、至少为约0.6g/升或至少为约0.7g/升。
优选钾离子浓度的较高范围为最高约10g/升、最高约6g/升、 最高约4g/升、最高约3g/升、最高约2.5g/升、最高约2g/升、最高 约1.5g/升或最高约lg/升。
最优选的钟离子浓度为约1.5g/升到约3g/升，尤其是2.0g/升到 2.4g/升。
发酵期间，即，石皮嚢壶菌目细胞的生长和繁殖期间积聚脂质， 尤其是co-3高不饱和脂肪酸。这些含有脂质的细胞可以在指lt生长 期或之后收获，此时细胞已到达它们最大的细胞密度，可以获得富 含w-3不饱和脂肪酸的生物量。如果期望获得co-3不饱和脂肪酸含 量显著增加的生物量，破嚢壶菌(Thraustochytrids)的培养可以使用 有限的养分。在本发明方法的一种^尤选实施方式中，i咅养,皮嚢壶菌， 将氮限制在适宜的时间供给，例如，将培养转移至无氮的培养基。
通本发明方法，可以获得发酵培养基的生物量密度达50g/升以 上，优选70g/升以上，更优选90g/升以上，最优选100g/升以上。 以重量计，干的生物量含有的脂^"酸至少为20%,伊乙选至少为30%'更优选至少为40%,最优选至少为50%。通常，本发明方法中，石皮 囊壶菌目微藻生产的脂肪酸或脂质的至少约为20%,且生物量中含 有的脂肪酸或脂质为多不饱和脂肪酸，尤其是o>3脂肪酸，如DHA。 优选情况下，生物量中含有的脂质30%以上为多不饱和脂肪酸，尤 其是w-3脂肪酸，如DHA。更优选的情况下，生物量中含有的脂 肪酸40%以上或50%以上为多不饱和脂肪酸，尤其是DHA。
细胞的收获可以通过例如过滤技术、离心(使用或不使用本领 域已知的方法先络合或絮凝)完成。例如，细胞可以通过带过滤、 旋转滚筒过滤等收获。收获细胞后进行冲洗、冷冻、冷冻干燥或喷 雾千燥，于非氧化性条件下储藏。收获富含co-3不々包和脂肪酸(尤 其是富含DHA)的生物量后，也可以进行干燥处理以得到干的生 物量。在干燥之前，视情况可将收获的细胞予以冲洗。此外，发酵 破囊壶菌目的特定物种后获得的生物量，可以与发酵的破嚢壶菌目 的第二物种后获得的生物量进行混合，以得到生物量混合物。在一 种4尤选的实施方式中，Ulkenia SAM2179生物量与Schizochytrium limacinum生物进ft混合。获得的生物量可以直4妄加入动物饲4牛或 者供人类使用的食品中。
本发明应用因此也涉及通过本发明方法获耳又的生物量或生物 量混合物及其用以生产食品和飼料组合物的用途。
本发明另 一方面涉及乂人破嚢壶菌目4汰生物获耳又脂质(尤其是 co-3不饱和脂肪酸，如DHA)的方法，其包括于控制的条件下在含 钠浓度0.2g/升到约10.8g/升之间的发酵培养基中培养微生物，发酵 期间使用氢氧化钾调节培养基的pH值，收获微藻生物量以及从微 藻生物量中提取脂质的步骤。在本发明的这个实施方式中，如上所概述，可以完成于控制的
条件下在含钠浓度0.2g/升到约10. 8g/升之间的发酵培养基中培养微 生物，发酵期间使用氢氧化钾调节培养基的pH值以及收获微藻生 物量的步骤。收获细胞后，获得湿的或干的生物量可以用本领域已 知的适宜从微藻细胞中提取脂质的任何一种提取方法处理。提取方 法包括但不限于超临界二氧化碳提取、HPLC提取、使用溶剂或溶 剂混合物(如己烷、氯仿、乙醚和曱醇)提取。在应用上述4是取方 法之前，收获生物量的细胞的细胞壁可以使用超声、碾磨、冻融或 酶破坏技术予以破坏。通过应用 一种前述的提取方法获得的粗制油 或粗制脂质可以采用本领域熟知的方法进行进步纯化，纯化方法包 括但不限于精制、冷结晶等等。根据本发明， 一种从发酵给定种的 破囊壶菌目获得的油与从发酵破囊壶菌目的第二物种获得的第二 种油予以混合是可能的。
由上茯得的脂质的20%以上为多不饱和脂肪酸，尤其是co-3不 饱和脂肪酸，如DHA。优选情况下，由上获得的脂质的30%以上 为多不饱和脂i^r酸，尤其是w-3不饱和脂肪酸，如DHA。更优选 情况下，由上获得的脂肪酸的40%以上或50%以上为多不々包和脂肪 酸，尤其是DHA。由上获得的脂质可以用来生产食品组合物、饲 料组合物、药物组合物和化妆品组合物。
本发明的另一方面涉及从;皮囊壶菌目孩史生物获取脂质，尤其是 是co-3不饱和脂肪酸如DHA的方法，所述的方法包4舌于控制的条 件下在含钠浓度0.2g/升到约10.8g/升之间的发酵培养基中培养微生 物，发酵期间使用氢氧化钾调节培养基的pH值，收获^:藻生物量 以及从微藻生物量中提取脂质的步骤。
具体实施例方式
实施例1
根据如下方案制备接种培养物。
2000 ml摇瓶中装有无菌预培养培养基350ml (其每1000ml蒸 馏水含Tropic Marin盐16.7g、葡萄冲唐30g、酵母才是耳又物10g, pH 值为6 ),以Ulkenia SAM 2179冷冻保存的培养物1ml进行4妄种。 摇瓶在温度为25。C转速为160rpm (每分钟转数)的摇床上培养68 小时以上。68小时后，660 nm的光密度为16.1。
转移上述Ulkenia SAM 2179 4妄种培养物135 ml ( 3% )至含有 发酵培养基的发酵#翟内，发酵培养基含有如下组分每1000ml自 来水，4、有右it^f唐165 g、石粦酉菱《甲3 g、石克西吏4妄5 g、氯4b4美1 g、石克 酸钠1 g、氯化钙0.3 g、玉米浆3.75 g, pH值为4。发酵罐的总容 积为5升，有效.容积为4.5升。
温度为28"C,转速为380 rpm,发酵约166小时。通气速率为 3.5升/分。发酵期间为控制pH值，配制好灭菌的20% KOH溶液。 pH值予以自动控制，使得pH值不得低于4。
约155小时后，发酵培养基内的主要养分已耗尽。这时取含有 微生物细胞的培养基样品，分析生物量数量和脂质含量。
冲洗所取的富含生物量的培养基样品，然后冷冻干燥。然后将 生物量样品与氢氯酸甲醇进行酯交换反应。根据熟知的标准试验方 案，采用气相色i普法4全测样本的脂肪酸组成和脂肪酸含量。得如下结果生物量干重为68.7 g/升。该生物量的DHA含量 为16.1 g/升。总脂肪酸的DI-IA含量为45%。 DHA与DPA( —种to-6 不饱和脂肪酸)比值为3.5。
实施例2
根据如下方案制备接种培养物。
2000 ml摇瓶中装有无菌预培养培养基350ml (其每1000ml蒸 馏水含Tropic Marin盐16.7g、葡萄沣唐30g、酵母^是耳又液10g, pH 值为6 ),以Ulkenia SAM 2179冷冻j呆存的i咅养物1ml进4亍4妻种。 摇瓶在温度为25。C转速为160rpm (每分钟转数)的摇床上培养48 小时以上。48小时后，660nm的光密度为9.5。
转移上述Ulkenia SAM 2179接种培养物300 ml ( 3% )至含有
发酵培养基的发酵4蓽内，发酵培养基含有如下组分
右旋糖 165g/升
玉米浆 3.75 g/升
磷酸二氢钾 3.0 g/升
氯化钠 0.8 g/升
七水好u酸4美 1.5 g/升
二7jc氯^匕钙 0.3 g/升
石危酸羞^ 5.0 g/升 pH值为4
发酵匈f的总有效容积为10升。温度为28。C,转速为350 rpm,发酵约114小时。通气速率为 7.5升/分。发酵期间为控制pH值，配制好灭菌20。/。KOH溶液。pH 值予以自动控制，使得pH值不得低于4。
约110小时后，发酵培养基内的主要养分已耗尽。这时取含有 微生物细胞的培养基样品，分析生物量数量和脂质含量。
冲洗所取的富含生物量的培养基样品，然后冷冻干燥。然后将 生物量样品与氢氯酸曱醇进行酯交换反应。根据熟知的标准试验方 案，采用气相色谱法检测样本的脂肪酸性质和脂肪酸含量。
得如下结果生物量千重为62.3 g/升。该生物量的DHA含量 为15.8 g/升。总脂肪酸的DHA含量为44.3%。 DHA与DPA ( —种 co-6不饱和脂肪酸)比值为3.5。
权利要求
1.破囊壶菌目微生物的发酵方法，其特征为微生物的发酵期间，发酵培养基的pH值通过加入氢氧化钾来控制。
2. 权利要求1所述的方法，其包含在含钠浓度0.2g/升到约10.8g/ 升之间的发酵培养基中培养微生物，发酵期间使用氢氧化钾调 节培养基的pH值和收获微藻生物量的步骤。
3. 从破嚢壶菌目微生物获取脂质的方法，其特征为纟敛生物的发酵 期间，发酵培养基的pH值通过加入氢氧化钾来控制。
4. 权利要求3所述的方法，其包含在含钠浓度0.2g/升到约10.8g/ 升之间的发酵培养基中培养微生物，发酵期间使用氢氧化钾调 节培养基的pH值，收获微藻生物量和从微藻生物量中提取脂质的步骤。
5. 破嚢壶菌目微生物的发酵期间降低发酵罐腐蚀的方法，所述的 方法包含发酵罐内在含钠浓度0.2g/升到约10.8g/升之间的含 盐发酵培养基中培养冬汰生物和发酵期间通过加入氢氧化钾调 节培养基pH值。
全文摘要
本发明涉及以属于破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物群中的微生物生产ω-3脂肪酸的改良方法，其使用一种改良的培养基组合物。尤其是，本发明涉及一种通过在发酵罐内培养微生物群(如Ulkenia菌、Thraustochytrium菌和/或Schizochytrium菌)生产ω-3脂肪酸的方法，该方法包括在钠离子降低、钾离子浓度升高的环境中培养破囊壶菌目微生物群的步骤。
文档编号C12P7/64GK101528939SQ200780040072
公开日2009年9月9日 申请日期2007年10月9日 优先权日2006年10月27日
发明者奥利弗·措伊纳, 托马斯·基益, 马库斯·卢伊 申请人:隆萨股份公司