生成可灌注微血管系统的方法

专利名称：：生成可灌注微血管系统的方法
技术领域：
：本发明涉及用于研究生理的和病理的血管生长以及响应促血管生成因子或抗血管生成因子的血管生长的方法。
背景技术：
：在正常的血管生长的过程中(例如，月经周期、胎盘形成、发胖、创伤愈合、炎症)，新血管的生成是被调控的并最终停止。值得关注的是，血管生长失去调控是病理学上的一个关键因素。例如，肿瘤的生长、糖尿病性视网膜病变、关节炎和牛皮癣涉及直接促成病理状态的血管过度增殖。相反，作为老年个体的特征，血管生长的削弱危害了创伤愈合以及由损伤或疾病导致的缺血组织的血管再生(revascularization)。因此，对指导组装新血管的机制以及启动和终止血管生长的过程的理解，是控制疾病中的血管形成的策略发展的核心。在新血管的生长过程中(血管生成(angiogenesis))，萌芽(sprout)源自血管内皮细胞，该血管内皮细胞排列成毛细血管和后毛细血管(postcapillary)的内腔(Iument)-血管系统的最小分枝。血管生成是一个复杂的、多步骤的过程。尽管公开了数以千计的关于血管生成的研究，但是，对介导和调控血管生成的生长和形态发生的细胞机制了解甚少。由于大部分组织的不透明性，很难在体内实时地观察血管生成萌芽态的具体情况。很难在三维空间重建组织切片，且无法与血管生长的动态性质相联系。此外，很难在组织切片中发现接近血管生成萌芽的尖端的区域(控制血管侵入(vascularinvasion)和形态发生的关键区域)。为了克服传统组织学的局限性，开发出了多种体内的和体外的血管生成“模型”。体内的血管牛成樽型为了克服活体组织的不诱明件，研究者通过活体动物体内的“窗口”或专门的观察腔来观察血管生成，所述动物体内的“窗口”包括两栖类幼虫的天然透明的尾(ClarkandClark1939)，所述专门的观察腔可以植入到兔的耳朵(ClarkandClark1939)、小鼠的皮肤(Algire，Chalkleyetal，1945)和仓鼠的颊囊(cheekpouches)(GreenblattandShubi1968)中，或者由兔角膜囊袋(Gimbrone，Cotranetal.1974)或鸡胚绒毛尿囊膜(Ausprunk，Knightonetal.1974)发展而来。从这些早期的、大量描述性的研究中，得出了对肿瘤诱导的血管化学趋向性的中心范例的验证，以及能促进血管生长的可扩散的肿瘤衍生分子的相关发现。体内血管生成的新实验，检测了血管向聚合海绵体或皮下植入至啮齿动物的凝胶基底膜蛋白栓塞中的向内生长(PassanitiTayloretal.1992；Andrade,Machadoetal.1997；Akhtar,Dickersonetal.2002；Koike,Vernonetal.2003)0由于下述原因，体内的方法难以实施(1)动物之间血管生成反应的种内变异；(2)缺乏从一个物种到另一个物种的结果转译；(3)购买和饲养动物的花费高；(4)公众不赞成以研究为目的使用动物；以及(5)在动物手术和可视化方面以及结果的评估上遇到的复杂性。体外血管牛成的二维(2D)樽型在努力了解血管牛成的分子力学的过稈中,将从较大的血管中分离出的内皮细胞置于平板培养皿中培养，直至它们形成汇合的(confluent)、平铺状(pavement-like)的单细胞层，该单细胞层模拟了血管内层(lining)内皮细胞层(Jaffe，Nachmanetal.1973；Gimbronel976)。尽管可以用作在大血管中对内皮损伤的增生性响应的模型(Gimbrone，Cotranetal.1974；Fishman,Ryanetal.1975；MadriandStennl982；MadriandPratt1986；Jozaki,Maruchaetal.1990；Rosen,Meromskyetal.1990)，但是，在模拟血管生成的过程中，在刚性基质上内皮细胞的单层培养物并不典型地组织成毛细血管样的管状。然而，在1980年，在成功地长期培养毛细管内皮细胞后(F0lkman，Haudenschildetal1979)，据报道，培养牛或人类毛细血管内皮细胞20-40天后，在汇合的单层细胞的上部形成二维的细胞网络，这个过程被称为“体外血管生成”(Folkmar^Haudenschildetal1980)。内皮细胞网络呈现为填充有纤维状/无定形物质的“管”和“内腔”，所述纤维状/无定形物质被认为是内源合成的“轴芯”网络，细胞在轴芯上组织起来。后续的研究报道了类似的二维网络的形成，该二维网络是由源自大血管的内皮细胞(Maciag,Kadishetal.1982；Madri1982；Feder,Marasaetal.1983)和接种在基底膜蛋白的延展性水凝胶(例如Matrigelgel)顶部的内皮细胞形成的(Kubota，Kleimanetal.1988)。尽管血管发育的二维模型仍沿用至今(基于Matrigel的测试(Kubota，Kleinmanetal.1988)是商业上可获得的)，该模型不具备真正的血管生成的以下5个特点1、侵入(invasion)-二维模型中的内皮细胞在细胞外基质的顶部形成网络并显示出很小的向下进入细胞外基质的倾向(Vernon,Angeiloetal.1992，Vernon,Laraetal.1995)。2、方向性_在二维模型中，在体外形成的内皮细胞网络或多或少会同时遍及预置细胞的区域，而体内血管生成包括通过多级分枝使纤维状萌芽分叉而向细胞外基质的定向(vectorial)侵入。3、正确的极性-尽管二维模型使单细胞管与毛细血管非常类似(Maciag，Kadishetal.1982；Feder,Marasaetal.1983；SageandVernon1994)，但是，它们的极性是“由内向外的”，即它们将基底膜物质沉积在它们的内腔表面，并且使它们的凝血酶原表面向外面向周围的培养基(Maciag，Kadishetal.1982；Feder,Marasaetal.1983)，这与体内的情形相反。4、内腔形成-二维模型生成具有专属内腔的内皮细胞(EC)管的证据不足。通常，内皮细胞管具有“内腔”空间，该内腔空间填充有细胞外基质(外源的或由细胞合成的)(Maciag,Kadishetal.1982；Madri1982；Feder,Marasaetal.1983；SageandVernon1994；Vernon,Laraetal.1995)。存在专属内腔时，专属内腔通常以由内皮细胞细胞质的厚壁所分隔的缝隙状或狭窄的圆柱形空间的形式出现-与体内典型的毛细管的膨胀的、薄壁内皮细胞管具有显著的不同。5、细胞特性-二维模型中的细胞网络通过机械过程生成，该机械过程可以由非内皮细胞型来实现(Verrton，Angelloetal.1992；Vernon,Laraetal.1995)。当然，数学建模显示出，任何能够使具有延展性的二维细胞外基质(内源合成的或提供的(例如Matrigel凝胶))具有张力的附着细胞型，均能在最佳条件下生成网络(Manoussaki，Lubkinetal.1996)。体外血管牛成的三维(3D)樽型对三维细胞外基质中发牛的体内血管牛成的认识已经得出多种模型，其中，在体外的三维细胞外基质凝胶中诱导萌芽。在早期的三维模型中，内皮细胞分散于由芯和管的网络(ElsdaleandBard1972)形成的胶原凝胶中(Montesano,Orcietal.1983)。尽管内皮细胞管显示出正确的极性，但是缺乏侵入和方向性的特性(内皮细胞被预先植入并均勻地分散在细胞外基质中)。虽然如此，已经证明这个方法在研究内腔形成(DavisandCamarillo1998)和内皮细胞对生长因子的响应方面是有用的(Madri,Prattetal1988；Merwin.Andersonetal.1990；KuzuyaandKinsellal994；Marx,Perlmutteretal.1994；DavisandCamarillo1996)。在一个可选的方法中，将1毫米大鼠主动脉切片(环状)植入三维的血浆凝块中会生成有分枝的吻合(anastomosing)管(Nicosia，Tchaoetal.1982)。源自动脉环的萌芽显示出类似于血管生成的侵入以及除了极性以外的方向性。利用源自大鼠的主动脉环或源自小鼠的微血管片段的移植模型，已经被用于研究肿瘤、生长因子、多种细胞外基质载体、和衰老的情况对血管生成的影响(Nicosia,Tchaoetal.1983；Mori,Sadahiraetal.1988；NicosiaandOttinetti1990；Nicosia,Bonannoetal.1992；VillaschiandNicosia1993；Nicosia,Bonannoetal.1994；Nicosia,Nicosiaetal,1994；NicosiaandTuszynski1994；Hoying.Boswelletal.1996；Arthur,Vernonetal.1998)。多种现存的模型诱导纯化的内皮细胞(单细胞层或聚集体)萌发侵入至三维细胞夕卜基质疑胶的下面或周围(MontesanoandOrci1985；Pepper,Montesanoetal.1991；Montesano,Pepperetal.1993；NehlsandDrenckhahnl995；NehlsandHerrmann1996；VernonandSage1999；VernonandGooden2002)。每一种模型都具有特殊的局限性，包括很难用肉眼观察萌芽形成、受限制的萌芽、切片法(sectioning)的要求、或者缺乏特定类型的内皮细胞的效力。Wolverine和Gulec公开了一种三维血管生成系统(US2002/0150879A1)，包括将肿瘤组织片段植入基质中。可表征出微血管的向外生长以分析该组织的血管生成潜能。但是，这个方法不能提供微血管的内腔灌注。Neumann(本发明人)等，在2003年公开了在体外包括在人工组织中生成可灌注的微血管是可能的。Neumann等人在2003年教导，使用127微米的尼龙钓鱼线作为用于制造微血管的轴芯，该轴芯被收缩管材(shrinktubing)夹持。由植入到琼脂中的大鼠主动脉平滑肌细胞制造血管。这些微血管具有试探性的性质，并不适合于产生人类血管移植物。体外血管生长的二维模型不能形成前述列出的血管生成的定义性特征，然而，现有的三维模型重建了其中一些或多数的特征。重要的是，现今的三维模型中没有一个模型能重建包含有压力的、流动的、循环流体的亲代血管。所以，现有的体外三维模型中没有一个模型能够进行关于内腔压力和流动对血管生长和形态生成的贡献方面的研究。
发明内容本发明公开了一种在体外生成可灌注微血管的方法。将轴芯从基质中撤出，从而形成通过所述基质的通道。将细胞注入到具有内壁的所述通道中。培育所述基质以使所述细胞附着到内壁上。灌注所述通道以去除未附着的细胞，从而生成亲代血管，其中该亲代血管包括由所述基质中的细胞衬里的(lined)可灌注的空通道。所述亲代血管被诱导生成进入周围基质凝胶的萌芽以便形成微血管网络。通过所述亲代血管对所述微血管网络进行内腔灌注。本发明克服了现有血管生成模型的局限性，提供了通过将用于在三维细胞外基质(ECM)中生成侵入的、管状的微血管萌芽的已验证方法与用于构建将成为内腔流动源头的组织工程化亲代血管的新方法相结合的方法和系统。通过灌注液，可以将调节血管生成的化合物施用于已知存在特定靶受体的内皮细胞的内腔表面。营养培养基内腔流体的存在将会充分地增加体外毛细血管的存活时间。本发明的血管生成系统可用于评估多个实验参数，包括缺氧/氧过量、特定的可溶性生物活性化合物的测试、基因修饰(geneticallymodified)的细胞的使用、以及经病毒转染的基因传递。该系统还可以用于研究与创伤修复、衰老、癌症、和动脉粥样硬化相关的血管生成。重要的是，根据本发明教导的模型可以适用于提供能够整合到生物工程化人工组织中的功能齐全的血管系统。本发明也提供了新型的方法，包括用于生成微血管、从内皮细胞生成微血管、以及生成较大血管(例如，具有冠状动脉大小的血管)的多支管设计。这些和其它重要的新教导包括，例如，一种生成微血管网络的方法，该方法是以下述说明书和权利要求书的描述为依据的。图1A、图IB和图IC示意性地描述了亲代血管生成的实例。图2A、图2B、图2C和图2D示意性地描述了已知的热收缩过程的实例。图3A示意性地描述了已知的安装(mounting)培养/灌注设备的设计图。图3B示意性地描述了安装培养/灌注设备的制备方法所用的设计图。图4A和图4B示意性地描述了培养/灌注设备的多支管的制造。图5A、图5B和图5C示意性地描述了微装配(microfabricated)的培养/灌注设备的可选设计图。图6示意性地描述了细胞接种程序。图7示意性地描述了两个生物人工亲代血管之间的毛细管网络。图8a描述了在体外接种平滑肌细胞后的多个轴芯的图例。图8b描述了灌注的肌板(muscleplate)的实例。图9示意性地描述了CPD的可选实施方式。图10描述了单个亲代血管生长萌发而进入周围基质。图11描述了一个亲代血管通过萌芽网络与第二亲代血管相接。图12描述了通过将细胞接种至胶原基质的通道中生成亲代细胞的可选方法。具体实施例方式本文列出实施例的目的是为了进一步了解本发明。这些实施例是示例性的，本发明并不仅限于这些实例性的实施方式。本发明的方法可以用于研究生理学和病理学的血管生长和响应促血管生成因子或抗血管生成因子的血管生长。其它有益的应用是评估癌组织血管生成的可能和对抗血管生成药物的响应的方法。此外，本发明的方法可用于构建多种创伤愈合设备以及用于组织工程化构建的血管形成。在一个实施例中，公开了一种用于生成可灌注的三维微血管网络的方法和设备。此处所用的“EC”指内皮细胞，“SME”指平滑肌细胞，以及“CAS”指冠状动脉替代物。一般来说，用于培养和灌注微血管网络的设备由可在中心处容有一个或多个轴芯的腔室构成(最好如图1所示)。该腔室能够通过使用许多技术由任何生物相容性的材料制得，例如，通过使激光切割的框架形成夹层。以可收回的(retractable)方式将轴芯装在腔室中。这可以通过将轴芯的端部固定在管中来实现，例如，通过热收缩(如图2所示)。所述轴芯的直径取决于期望的血管管径。可改变设置以适应单个血管、两个血管、或直至二维或三维中的整体血管阵列(arrays)。轴芯可以是多种材料，例如，聚合纤维、玻璃纤维、线材等。通过将细胞接种在轴芯上，刺激细胞在所述轴芯周围增殖，当细胞形成管壁后取出所述轴芯，从而生成微血管。随后将血管植入基质中。依赖于培养的条件、基质的组成、以及血管生成刺激的存在(例如，生长因子)，亲代血管将形成萌芽而进入周围的基质中。所述萌芽将会相互连接而形成毛细血管网络。在除去所述轴芯后，将设备连接到灌注系统上，向血管中注入内腔液体流。现在参考图1A、图IB和图1C，图中描述了生成亲代血管的示意性实例。图IA显示了在生长培养基100中的内皮细胞1，被接种在轴芯2上，轴芯2由设备主体3中的收缩管4支撑。图IB显示了所述细胞1增殖并形成细胞套筒(sleeve)102形式的环状层。图IC显示了在细胞外基质(ECM)凝胶110中取出轴芯2后，所述细胞套筒被灌注生长培养基100。本发明公开的方法包括对用于组织工程化应用和研究模型的可灌注生物人工血管结构进行工程化。公开的方法的基本原理包括培养细胞而在被紧固在薄壁管或其它固定物上的可去除轴芯的周围环绕细胞层。一旦细胞层达到期望的壁厚度，即取出轴芯，并在灌注系统的帮助下向由此生成的生物人工血管(BAVs)中灌注培养基、血液、血液替代物、或其它流体。公开的方法可以用于生产大量制造的或常规生成的血管、体外灌注的血管生成模型、创伤愈合设备、组织成分、整个组织和器官、以及研究模型。培养/灌注设备的制造现在参考图2A、图2B、图2C和图2D，图中描述了已知的热收缩过程的示意性实例。特别如图2A所示，每个培养/灌注设备(CPD)可以包括一个或多个装在支撑框架12内的轴芯2。轴芯2的直径为期望的血管口径，轴芯2的末端与医药级收缩管片段4紧密配合。轴芯2可以包括生物相容性纤维(例如，聚合物纤维、玻璃纤维、线材、或等同物)，根据待模拟的血管尺寸，轴芯2的直径可以为几微米到几毫米。在一个实施例中，采用含有光学纤维的微毛细管作为轴芯。更详细的描述如图2B所示，每个收缩管片段4的中间部位14在一个轴芯2的周围热收缩。随后，特别如图2C所示，轴芯2被收回(retracted)，并将管切断。图2D示出了重置轴芯以便将该轴芯的两端封闭在正切断并分离的收缩管片段4中之后的情况。可以使用多种材料和工艺构建框架12。可以改变设置以适应单独的生物人工血管或生物人工血管阵列。同样地，通过将轴芯阵列分层放置，由血管网络可以生成厚的、可灌注的组织。灌注腔室的制造现在参考图3A，描述了已知的用于灌注多个轴芯/收缩管组件(assemblies)11的设置。框架20可以方便地由聚碳酸酯或等同材料碾压制成。分配腔室30可以包括在设计中，这样可以允许同时灌注多个生物人工血管。包含轴芯2的一套线程(thread)的末端被收集(gathered)在硅管23中。聚酯膜框架的激光切割现在参考图3B，示意性地描述了用于安装培养/灌注设备的制造方法的新设计。单血管设计(CPD70)可以便利地通过将轴芯2夹在两个激光切割的Mylar框架22之间而生成，所述轴芯2由热收缩管4支撑。一个环状的环氧多支管21可以方便地用于支撑轴芯/收缩管组件11，该多支管的构成将在下面说明。将轴芯/收缩管组件夹在两个聚酯膜等(例如Mylar)的框架之间，并将粘着的侧面压在一起，这样每个轴芯通过在端部的两个收缩管片段4’悬挂在框架窗口76中。通过在框架22中包括至少一根细稳固线材26，并通过封装在圆柱形的环氧多支管中，来稳定并强化两个收缩管4’，所述环氧多支管是通过使用硅酮(silicone)管的模具，环绕着收缩管和至少一根细的稳固线材26而铸成的。所述两个收缩管片段4’最后将变成CPD70的流入口和流出口。现在参考图4A和图4B，图中示意性地描述了一种生成用于培养增殖(profusion)设备的多支管的方法。图4A特别描述了通过例如硅酮管50的套管被拉出的多个收缩管/轴芯组件11。注入环氧胶水40以填充硅酮管50并使它硬化(harden)。图4B特别描述了环氧胶40硬化后以及硅酮管50被切开并被移开之后的情况。剩下的是硬化的环氧棒44。将轴芯收回至切点之后，切断环氧棒44，留下由收缩管形成的通道42。多个收缩管的端部46可以被整合，以形成多支管21。叠加单个的CPDs或CPD框架组件可用于生成三维血管阵列。可选择的方法现在参考图5A、图5B和图5C，示意性地描述了用于微组装的培养/灌注设备的可选设计图。图5A特别描述了通过小孔(perforations)54将一套轴芯2引入框架，所述小孔具有套筒56，它们用于替代收缩管。图5B特别描述了细胞接种前的CPD，包括安装在框架壁52上的一套轴芯2。图5C特别描述了一个可选实例，该实例为具有血管62的培养/灌注设备，其中微组装多支管64可以在框架52外面联接在套管56上。如这里所示，血管62在轴芯上生长，并在轴芯被移除后而被保留下来。可以使用微组装的方法(例如微成型)来大量生产这样的CPD框架组件。血管生成和灌注现在参考图6，这里示意性地描述了细胞接种程序。为了制备用于细胞接种的CPDs70，首先对它们进行清洗并用紫外线灭菌。在无菌条件下，将CPDs固定在一个表面上(例如彼得里(Petri)盘72的底部)。随后在CPD框架组件70的内部窗口76(如图3B所示)中填充含有附着蛋白(例如层粘连蛋白-1)的溶液。根据需要，可以使用一个或多个衬垫(spacer)77。在培育期后，将含有附着蛋白的溶液除去，然后将培养基中含有期望类型细胞(例如平滑肌细胞或内皮细胞)的悬浮液转移至所述CPD70的窗口76中。通过将一定体积的细胞悬浮液填充在窗口中进行细胞接种，翻转CPD框架组件70使它的上部向下，因此产生了悬滴(hangingdroplet)80。在大约为45分钟的培育期内，大量细胞将附着在位于CPD框架组件中的轴芯/收缩管组件上。过量的细胞将沉到悬滴的端部，并可以很容易的被收集和除去。然后将包括一个或多个CPD框架组件的彼得里(Petri)盘恢复到朝上的位置，填充培养基直到CPD框架组件被浸没，并进行培养。在一个实施例中的培养条件包括环境中CO2含量为5%，温度为37°C。附着在轴芯/收缩管组件上的细胞，将向外延伸并增殖，形成同轴的单细胞层(例如内皮细胞)或150微米或更厚的多细胞层(例如平滑肌细胞)。达到期望的壁形状或厚度时，取出轴芯从而制得空心细胞管。较薄的壁需要通过在取出轴芯前在细胞套管的周围涂覆凝胶(例如琼脂糖、胶原、基底膜蛋白凝胶等等)进行保护，以防止破裂。然后将CPD框架组件的多支管连接到灌注系统上，灌注选择的流体，例如生长培养基。在另一个实施方式中，一种由人血管内皮细胞(HUVEC)生成内皮“亲代”血管的方法包括下述步骤，其中首先清洗培养设备，并用紫外线从各个侧面照射灭菌30分钟。在无菌条件下，将设备固定在具有无菌条(sterilestrip)的彼得里(Petri)盘的底部。然后，用层粘连蛋白-1附着蛋白溶液填充所述设备的内部窗口(可用其它的附着蛋白代替，例如纤连蛋白(fibronectin)或明胶)。培育过夜后，除去含有附着蛋白的溶液，并将培养基中的人血管内皮细胞的悬浮液转移至所述设备的窗口中。翻转彼得里盘使上部向下，在所述设备的窗口中产生了细胞-培养基悬浮液的悬滴。在细胞培养箱中(CO2含量为5%，温度为37°C)培育45分钟后，大量细胞将附着到所述设备中的轴芯/收缩管组件上。然后将彼得里盘回转到朝上的位置，在其中填充用于人血管内皮细胞的生长培养基，直到设备被浸没。未附着在轴芯上的细胞将落下并被吸出和除去。然后将所述彼得里盘放置在培养箱(CO2含量为5%，温度为37°C)中。附着在所述轴芯上的细胞将向外扩散并增殖，形成同轴的人血管内皮细胞的单细胞层。除去所述彼得里盘中的培养基。在培养设备的窗口中装入胶原溶液并使其凝固(solidify)，并包围带有细胞层的轴芯。人血管内皮细胞将形成萌芽而进入胶原凝胶中。然后将轴芯慢慢地取出，留下可灌注的人血管内皮细胞的“亲代”微血管。然后，将所述设备的多支管连接到灌注系统，并灌注人血管内皮细胞的生长培养基。灌注系统CPDs可以以线性模式或循环模式联接在灌注系统上。线性设置可以由重力流系统形成，或者由商业可获得的或常规构建的注射泵形成。在注射器中装满灌注培养基并将其安装在注射泵上，通过气密管材与CPDs的上游端连接。CPDs可以储存在无菌条件的培养箱中，或在CDPs内部建立无菌的细胞培养环境。将CPDs的下游多支管连接到收集灌注液的蓄水池的末端。可以通过使用蠕动泵构建循环系统。所述线性系统和循环系统均可以被固定在气体交换设备上。气体的浓度、灌注的压力、流程、温度、和营养物及代谢副产物的浓度可通过传感器进行测量。所收集的数据进入反馈回路，以严格控制所需的参数。特定应用用于与血管生成相关研究的模型现在参考图7，图7示意性地描述了在两个生物人工亲代血管200、202之间的毛细血管网络。通过减少流体(f)流入“静脉”亲代血管202，并增加在“动脉”亲代血管200上的阻力R，使流动的灌注液204通过毛细管206改道。从而，驱动灌注液204从具有较高压力的血管进入具有较低压力的血管，以模拟从毛细管床的动脉端到静脉端的自然血流。轴芯法也可以用于血管生成研究模型的开发，如在药物测试以及在创伤愈合、衰老、和癌症、糖尿病、关节炎和牛皮癣等疾病的研究中所需要的。只采用内皮细胞，或者内皮细胞、平滑肌细胞、和外周细胞(pericytes)的结合，能够环绕微米直径的轴芯来培养亲代生物人工微血管(BMVs)，并植入到细胞外基质的载体凝胶中。然后将所述轴芯取出，将亲代内皮细胞管留在细胞外基质凝胶210中。轴芯的取出可以手动完成，或者借助于自动化设备，可以使用从极慢到极快的不同速度进行。其它变化可以包括在冷冻状态下从生物人工微血管中取出轴芯，用热反应性聚合物涂覆轴芯，或牵拉轴芯的任一端使它变细直至断裂。化合物可以诱导亲代血管形成萌芽而进入凝胶210中，所述化合物例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、和12-肉豆蔻酸_13_佛波乙酯(PMA)，它们被加入到凝胶和/或灌注液(例如生长培养基)中。可以通过在两个相邻的亲代生物人工微血管间形成压力差来生成复杂的毛细血管网络222，从而模拟动脉和静脉血流。液体流将改向，从“动脉”生物人工血管通过相互连接的萌芽进入“静脉”生物人工微血管。有利地，所述灌注液可以含有含氧细胞生长培养基，不含血清、和促血管生成或抗血管生成的物质。在另一个实施例中，所述灌注液可以是补充了血清和/或影响血管生成的化合物的含氧细胞生长培养基。而在另一个实施方式中，所述灌注液可以是含氧的生理盐溶液。在另一个实施例中，所述灌注液可以包括含氧血液、血液组分、或血液替代品。在另一个实施方式中，所述灌注液可以是不含氧的，并通过基质扩散来实现系统的充氧。而在另一个实施方式中，可以在灌注液中加入促血管生成或抗血管生成的化合物。在一个实施方式中，在所述基质中加入促血管生成或抗血管生成的化合物等。而在另一个实施方式中，所述细胞包括基因修饰的细胞，该细胞能够向灌注液中或基质中释放产物。而在另一个实施方式中，所述基质可以优选含有纤维蛋白、胶原、基底膜蛋白基质和明胶。一种可用的基质是Matrigel凝胶。在另一个实施方式中，所述基质可以包括琼月旨、琼脂糖、藻酸盐或硅胶。在一个实施方式中，所述细胞可以选自由内皮细胞、平滑肌细胞、外周细胞、人细胞、动物细胞、植物细胞、干细胞、肌细胞、肝细胞、肾细胞、肺细胞、皮肤细胞、上皮细胞、和基因修饰的细胞所组成的组中。类似地，细胞可以位于所述基质中，所述细胞可以选自由内皮细胞、平滑肌细胞、外周细胞、人细胞、动物细胞、植物细胞、干细胞、肌细胞、肝细胞、肾细胞、肺细胞、皮肤细胞、上皮细胞和基因修饰的细胞所组成的组中，所述细胞可以分散在整个基质中，或者局部集中。在一些情况下，健康或病态组织(例如癌组织)的片段被植入到基质中。源自亲代血管的萌芽可以在体外以切片材料或整体标本(whole-mount)的形式进行显微镜研究。以荧光溶液(例如荧光右旋糖酐)灌注生物人工微血管可以辅助分析萌芽直径、萌芽内腔的开放(patency)、和吻合(anastomization)的程度。萌芽形态的三维重建可以通过将由共聚焦显微镜得到的荧光图像的ζ轴重叠来实现。可以通过使用抗层粘连蛋白和IV型胶原的第一抗体和荧光或过氧化物酶标记的第二抗体的免疫标记在整体标本和组织(石蜡)切片对通过萌芽220的细胞外周基底膜基质的合成进行监控。在复合的EC/SMC萌芽中，可以通过使用人CD31(克隆P2Bl-Chemicon公司)的FITC单克隆抗体(MAb)或FITC-UEA1凝集素(一种用于人类内皮细胞的特异性标记物)标记内皮细胞，对两种细胞型之间的空间关系进行检测。可以用人的α-SM肌动蛋白的单克隆抗体并随后用RITC抗小鼠第二抗体对平滑肌细胞进行标记。内腔结构的细节以及内皮细胞和平滑肌细胞之间的相互作用，可以从用前述试剂标记的石蜡切片中获得。所描述的构建方法是具有高重复性的，可作为商业上大量生产血管生成设备的基础。经过适当的保存(例如冷冻保存)，研究人员能够以现货的方式获得预生长的亲代血管或整个毛细管网络。冠状动脉的替代品为了生成冠状动脉的替代品，挑选具有一定外径的轴芯来制备冠状动脉替代品，该冠状动脉替代品具有内径约为4-5.5毫米的血管内腔。可选地，所述轴芯可以是空心管，其可被灌注且它的渗透性足以满足在冠状动脉的替代品的生长期间的营养物质和气体的交换。冠状动脉的替代品可以只由平滑肌细胞生长得到，因此，生成的结构类似于血管中的中膜层，或可以由两种或三种细胞型形成复合结构。将平滑肌细胞接种在轴芯上，并生长至300-400微米的环形层。为了加速冠状动脉替代物的生成，可以用下述方式操纵SMC表型在初始的生长阶段，使细胞进入高度增殖的表型；然后在血管壁达到期望的厚度后转换成分化状态。表型转换(switch)将导致平滑肌细胞的生长速率显著地减缓，并诱导细胞外基质蛋白质(例如胶原和弹性蛋白)的产生，这些蛋白影响血管的机械性能。可以通过控制特定基因的表达实现表型的转换。例如，在四环素反应性启动子的帮助下，基因表达(例如弹性蛋白)受到抑制直到管壁达到期望的厚度(ClontechLaboratoriesInc.)。从生长培养基中除去四环素，可以激活插入的基因。例如，弹性蛋白的过度表达，将进一步抑制细胞的增殖以及执行管壁的结构功能和信号功能。机械调节(例如脉动流)可以用于强化冠状动脉替代品，并诱导细胞的生理排列(physiologicalalignment)。也可以使用其它外部或内部的“表型转换”。在取出轴芯后或在平滑肌细胞的调整(conditioning)和重建后，可以直接将内皮细胞接种在SMC套管上。内皮细胞的接种可以通过将内皮细胞悬浮液灌注到SMC套管中来完成。然后停止流动一段时间，以实现内皮细胞的适当附着。如果需要，为了促进内皮细胞平均分布，可以旋转或重复地上下倒转血管。可选地，可以先将内皮细胞接种在轴芯上。在这种情况下，平滑肌细胞被接种在汇合的内皮细胞层上。使用这个方法，需要防止内皮细胞向富含氧气和养分的冠状动脉代替品的外围迁移。如果期望，在SMC套管外面接种成纤维细胞能够形成外膜层。用于生成冠状动脉替代品的细胞可以源自自体同源的(autologous)、异源的、或异种的材料。所述细胞可以是干细胞、前体细胞(precursorcells)、或分化细胞。所述细胞可以进行基因修饰，以获得特定的表型或降低宿主生物体的免疫应答。本发明公开的CPD方法提供了用于大量生产可现货供应的血管替代品或为受体定制设计的血管替代品的选择。本发明公开的CPD方法还适用于组织工程化的冠状动脉替代品模型的开发，动脉粥样硬化、动脉生成的研究，不同的血管细胞类型彼此之间以及与细胞外基质组分之间的相互作用的研究，一氧化氮效应的研究，和多种药物的研究。不同大小或类型的血管和淋巴管本发明公开的CPD方法还可以用于生成在直径和类型上不同于冠状动脉的血管。轴芯直径的改变将改变血管的直径。可以通过细胞的表型和/或抑制细胞增殖的时间点来改变血管的类型(例如动脉、静脉、淋巴管)。例如静脉仅含有小的平滑肌细胞层。其它管状组织本发明公开的CPD方法可以被用于其它管状组织的工程化，例如胆管、泪管、咽鼓管(pharyngotympanytube)、输卵管、输精管、输尿管、尿道、肺气管等。本发明公开的CPD方法也证明可用于由包括胶质细胞在内的不同类型细胞生成神经导管，并指导神经的生长和修复。用于工程化组织的BAV系统本发明公开的CPD方法可以用于通过使用可去除的轴芯阵列作为骨架的组织和器官的工程化。将期望的组织/器官(肌肉、肝脏、肾脏、肺、皮肤等)的细胞接种到涂覆有附着蛋白的轴芯上。这些轴芯可由固体纤维或线材制成，或可选地由可灌注的、渗透性的管制成，例如纤维素。所述轴芯以允许结合单细胞套管的精确间距相互分离。使用这个方法可以形成片状或块状的组织。然后取出轴芯(或以不同方法去除)，通过灌注系统的帮助向生物人工组织进行内部灌注。创伤愈合设备预制的生物人工血管系统可以用于帮助创伤愈合，例如糖尿病人的慢性溃疡(ulcers)。生物人工毛细管网络可以被植入片状的载体材料中(例如来自富含血管生成生长因子的细胞外基质凝胶)，并放置在创伤处。用含氧的营养液进行自动灌注，所述生物人工血管将会促进供体血管和皮肤的萌发。可选地，这样的生物人工血管修复片段可以夹在创伤和皮肤移植物之间，并促进移植物的向内生长。基因治疗设备生物人工血管可以用于植入式给药设备。从病人体内取得的细胞，能够在体外进行基因修饰以生成特定的蛋白(激素、酶等)。使用上述方法，可以使这些细胞生长成生物人工血管或血管网络。重新植入到宿主中，所述细胞可以继续产生目标物质并将它释放到局部或全身。人工组织和器官如上所述，组织工程化的血管网络可以用于生成组织或乃至整个器官。一个方法是生成一个或多个体外可灌注的亲代血管。将从期望的组织或器官中得到的实质(parenchymal)细胞接种在所述亲代血管的周围，例如，在凝胶中。通过所述亲代血管给实质细胞供应养分和氧气。随着实质细胞的增殖，养分和氧气的需求量将增加。所述细胞释放血管生成因子，并刺激血管萌发。血管系统以与组织生长相同的速率萌发，其非常类似于自然生长。因此，这个系统也将是一个用于发育生物学研究的良好模型。另一个方法利用平行排列的轴芯阵列作为基质细胞的骨架。随着基质细胞的增殖，环绕轴芯形成细胞层。最终，所有轴芯之间的空间被实质细胞充满，生成了片状组织。在取出轴芯后，该组织可以通过在轴芯处留下的通道进行灌注。通过内腔接种，这些通道能够变成内皮状。该方法不限于在二维空间。可以堆积多个片状组织，或使用三维骨架。本发明的发明人使用了用于肌肉组织的工程化的二维阵列和三维阵列。而在另一个方法中，能够独立地生成组织层和血管网络层，然后间歇地进行堆积。所有的这些方法能够生成具有一种或两种细胞型的简单模型，或者能够生成含有多个细胞型的复合构型。在植入后，以这些方法工程化的组织或器官可直接与血流接触，或通过灌注系统持续灌注直至宿主脉管系统生长进移植物中。灌注组织工程化肌肉结构的实施例现在参考图8a，描述了在体外接种平滑肌细胞后的多个轴芯的图片。多个轴芯与收缩管单元M被夹在Mylar框架中。轴芯M之间的距离可以调整到约100微米。所有收缩管片段的末端结合在一个上游多支管和一个下游多支管中(图中未示出)。所述Mylar框架是经过灭菌的，内腔被覆盖并使用每毫升5X106个的大鼠动脉平滑肌细胞SM(RASMCs)的悬浮液进行接种。所述SM细胞附着在每个单独的轴芯M上并增殖，因而形成了环状层。10天后，独立的层结合到一起并最终形成了平滑肌细胞的厚片或厚盘。在生长培养基中再放置7天后，向培养基中补充50U/毫升的肝素(heparin)，并再培养7天。然后，取出所有的轴芯，并用肝素培养基以10毫升/天的速度对组织进行灌注。灌注的腔室被固定在填充有肝素培养基的100毫米Petri盘的底部。对SMC盘灌注11天。灌注结束后，通道CH的功能仍被保留，并在体外清晰可见(如图8b所示)。现在参考图8b，描述了灌注肌板MP的实例。所示的灌注流体通过管道末端(T)进入由除去的轴芯留下的通道(CH)中。现在参考图9，示意性描述了CPD的可选实施方式。在一个实施例中，CPD900包括并列放置在第一载玻片904和第二载玻片920之间的一层902。该层902的厚度适宜于植入以通道922相接的多个流通口。所述多个流通口包括细胞悬浮液口914、多个入口912和多个出口918。以通道922相接的口可以流通并类似地分享流体功能。排布了多个口(例如口912)以提供多个出入点。优选地，其它应用可采用带流体腔和以微流体材料形成的口的微流体设计。同样地，所述层可含有硅酮或适宜用于显微镜或微流体应用的其它材料。胶原腔906优选由一对空的、柔韧的毛细管916定位用于出入。所用毛细管的数量从一到远大于二，这由CPD的大小和生成血管的数量所调节。通过管入口940A、940B可由一个或多个注射泵通过层出入每个口和腔，其中所述注射泵依附在具有针的注射器上。虽为了简化附图只显示两个注射泵管入口940A、940B，但可以理解的是根据情况可采用分离的注射泵、注射器或等同物来注入或抽取材料至每个腔和/或口。在一个实施方式中，所述注射泵与气密注射器连接。描述了可选实施方式CPD900的特征，可帮助理解本发明现在要描述的构建CPD的方法。在一个实施例中，层902采用硅酮层，在硅酮层上钻孔得到洞和通道的模型，并以粘合顶层943和粘合底层945覆盖硅酮层。然后，以空心针刺穿所述硅酮，之后将它用于指引聚酰亚胺涂覆的熔融石英毛细管916进入胶原腔906以及进入一个入口912。以小口径管910支撑两个毛细管，引导从主腔进入出口908。然后在粘合层的帮助下将所述硅酮层902夹在两个载玻片之间。然后将CPD900高压灭菌并保存备用。为获得准备生成血管的腔906，制备胶原溶液，通过注射针直接将该溶液注入胶原腔906中，并在培养箱中过夜形成凝胶。再通过将注射针插入两个入口将CPD900与注射泵相接。依次将注射针与气密管相接，形成两个气密注射器，充入调节好PH的生长培养基，并安装注射泵。以相似的方式将两个出口908A、908B与废液储池相接。然后按操作灌注泵一样打开注射泵，由此充进入口继而填充入口、毛细管和出口。当所有空气被排出体系时，以镊子夹取每个毛细管，将伸入胶原腔的端部通过胶原凝胶往回拉直至毛细管端部到达基质腔中。按这个程序，在胶原凝胶中形成了两个可灌注通道。为了将细胞接种至胶原通道中，将高度浓缩的内皮细胞悬浮液注入到细胞悬浮液口中。然后关掉注射泵，其它毛细管端部被拉回至含有细胞的小储池914R中，这导致大量细胞立即回流进入所述胶原通道。通过废液储池的高度，可严密控制细胞的流动速率。然后将CPD在培养箱中放置45分钟，使细胞附着到胶原通道的壁上。可将CPD倒转几次或以其它操作使细胞呈最佳分布。最后，毛细管被拉出细胞储池进入作为入口的一部分的储池，打开注射泵并设定期望的灌注速率。过量的细胞被洗出。这个接种程序可在生长一段时间之后获得具有同源单细胞层的两个亲代血管，其中注入更加高度浓缩的细胞数会使所需时间更短。应注意的是依据所用的轴芯类型，可通过抽取和/或降解从基质中去除轴芯。现在参考图10，描述了单个亲代血管1050生长萌发1052进入周围基质1054中。当将人脐带静脉细胞(HUVECs)接种至胶原通道中时，生成的亲代血管开始形成萌芽进入胶原中。这些萌芽延伸并开始分枝。最终这些分枝与来自另一亲代血管的分枝相吻合，从而形成血管网络。现在参考图11，描述了第一亲代血管1102通过萌芽1106网络与第二亲代血管1104相接。所述萌芽1106具有内腔并且是可灌注的。生成亲代血管的方案现在参考图12，描述了通过在胶原基质的通道中接种来生成亲代血管的可选方法。已经描述了采用硅酮层的可选CPD，将描述用于生成微血管系统的应用的特定实施例以促进本领域技术人员理解本发明。将CPD在高压灭菌锅中灭菌，并保存在无菌环境中备用。制备胶原溶液并在冰上保存。将胶原充入小注射器中。在注射器中固定30G的注射针，并通过注射针将胶原溶液注入胶原腔中直至腔中完全充满了胶原1002。从该腔的对面插入第二注射针作空气出口。然后通过将注射针插入两个入口，将CPD与注射泵相连1004。依次将注射针与气密管相接，形成两个气密注射器，充入调节好PH的生长培养基，并安装注射泵。以相似的方式将两个出口与废液容器相接(即将注射针插入出口，该注射针带有引导至废液容器的管)1006。通过操作作为灌注泵的注射泵来灌注CPD，由此充进入口继而填充入口、毛细管和出口1008。当所有空气被排出体系时(例如以小口径注射针充当可去除的空气出口)，然后以镊子夹取每个毛细管，将伸入胶原腔的端部通过胶原凝胶往回拉直至毛细管端部到达基质腔中。按这个程序，在胶原凝胶中形成了两个可灌注通道1010。为了将细胞接种至胶原通道中，将高度浓缩的内皮细胞悬浮液注入到细胞悬浮液口中1012。然后关掉注射泵，其它毛细管端部被拉回至含有细胞的小储池中，这导致大量细胞立即通过毛细管回流进入胶原通道1014。通过背压(废液储池的高度)可严密控制细胞的流动速率。然后将所述毛细管进一步拉回进入与入口相接的储池中。再将CPD在培养箱中放置45分钟，使细胞附着到胶原通道的壁上1016。可将CPD倒转几次或以其它操作使细胞呈最佳分布。最后，打开注射泵并设定期望的灌注速率1020。过量的细胞被洗出。这个接种程序可获得具有同源单细胞层的两个亲代血管1022。通过灌注如上所述的亲代血管可生成一个或多个微血管网络。可选地，用于生成亲代血管的程序也可包括将轴芯植入胶原基质中，抽取轴芯，将细胞注入至轴芯留下的通道中，也可以如上所述参照图1A-1C和其它将细胞接种在轴芯上。两种方法的组合可实现不同细胞类型形成层。本发明在这里所描述的相当多的细节是为了遵守专利法，并为本领域技术人员实施本发明的新原理而提供信息，并构建和使用所需要的这些示例性的和专门的组分。但是，应该理解的是，本发明可以通过不同的专用设备和装置以及构建法则进行实施，在不偏离本发明的实质精神和范围的情况下，可以进行包括具体设备和操作程序在内的多种改变。说明书中所引用的所有参考文献的全文在此一并引入作为参考。如果发生其它方面的不可调和的冲突，以本说明书为准。参考文献AkhtarN,DickersonEB,AuerbachR.2002.Thesponge/Matrige1angiogenesisassay.Angiogenesis5:75_80·AlgireGH,ChalkleyHW.LegallaisFY,ParkHD.1945.Vascularreactionsofnormalandmalignanttissuesinvivo.I.Vascularreactionsofmicetowoundsandtonormalandneoplastictransplants.JNatlCancerInst6:73-85.AndradeSP,MachadoRD,TeixeiraAS,BeloAV,TarsoAM.BeraldoWT.1997.Sponge-inducedangiogenesisinmiceandthepharmacologicalreactivityoftheneovasculaturequantitatedbyafluorimetricmethod.MicrovascRes54:253_261.ArthurWT,VernonRB,SageEH,ReedMJ.1998.Growthfactorsreversetheimpairedsproutingofmicrovesselsfromagedmice.MicrovascRes55:260—270·AusprunkDH,KnightonDR,FolkmanJ.1974.Differentiationofvascularendotheliuminthechickchoroallantolsastructuralandautoradiographicstudy.DevBiol38:237-248.ClarkER,ClarkEL.1939.Microscopicobservationsonthegrowthofbloodcapillariesinthelivingmammal.AmJAnat64:251—301·DavisGE,CamarilloCW.1996.Analpha2beta1integrin-denendentpinocyticmechanisminvolvingintracellularvacuoleformationandcoalescenceregulatescapillarylumenandtubeformationinthree-dimensionalcollagenmatrix.ExpCellRes224:39-51.ElsdaleT，BardJ.1972.Collagensubstataforstudiesoncellbehavior,JCellBiol54:626_637.FederJiMarasaJCiOlanderJV.1983.Theformationofcapillary-liketubesbycalfaorticendothelialcellsgrowninvitro.JCellPhvsiol116:1_6·FishmanJA,RyanGB,KarnovskyMJ.1975.Endothelialregenerationintheratcarotidarteryandthesignificanceofendothelialdenudationinthepathogenesisofmyointimalthickning，LabInvest32:339_35LFolkmanJ，HaudenschildC.1980.Angiogenesisinvitro.Nature288551-556.FolkmanJ，HaudenschiIdCC,ZetterBR.1979.Long-termcultureofcapi1laryendotheIialcells.ProcNatlAcadSciUSA76:5217-5221.GimbroneMA,Jr.1976，Cultureofvascularendotheliun.In.ProgHemostThromb.p.1-28.GimbroneMA,Jr.CotranRS,FolkmanJ.1974a.Humanvascularendothelialcellsinculture.GrowthandDNAsynthesis.JCellBiol60:673_684.GimbroneMA,Jr.CotranRS.LeapmanSB.FolkmanJ.1974b.Tumorgrowthandneovasculartzation:anexperimentalmodelusingtherabbitcornea.JNatlCancerInst52:413-427.GreenblattM.ShubiP.1968.Tumorangiogenesis:transfilterdiffusionstudiesinthehamsterbythetransparentchambertechnique.JNatlCancerInst41:111-124.HoyingJB,Boswel1CA,WilliamsSK.1996.Angiogenicpotentialofmicrovesselfragmentsestablishedinthree-dimensionalcollagengels.InVitrocellDevBiolAnim32:409-419.JaffeEA，NachmanRL，BeckerCG，MinickCR.1973.Cultureofhumanendothelialcellsderivedfromumbilicalveins.Identificationbymorphologicandimmunologiccriteria.JClinInvest5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