专利名称：：表达非淀粉多糖复合酶的重组巴氏毕赤酵母菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种表达非淀粉多糖复合酶的重组菌及其应用，特别涉及一种表达非淀粉多糖复合酶的重组巴氏毕赤酵母菌及其应用。
背景技术：
：非淀粉多糖(NSP)是植物组织中由多种单糖和糖醛酸经糖苷键连接而成的，大多有分支的链状结构，常与无机离子和蛋白质结合在一起，是细胞壁的主要成分，一般难于被单胃动物自身分泌的消化酶所分解。许多研究成果表明，饲料中添加NSP酶制剂，通过对饲料中抗营养因子一NSP的水解，可以降低动物胃肠道食糜黏度，消除其抗营养作用，改善饲料营养价值，提高动物生产性能。因此为了高效地、最大限度地消除日粮中NSP的抗营养作用，提高饲料消化利用率，在饲料中添加应用NSP复合酶就显得十分重要，与此同时还可以充分发挥不同NSP酶系在底物降解上的协同效应，提高饲用酶制剂的生物学效价。当前饲用非淀粉多糖复合酶制剂的生产方式主要有以下三种①完全复配法指生产或购买各种单一酶制剂，按照酶谱配方比例进行合理配比，再加入一定的分散剂、稀释剂并经混合而成。这是饲用复合酶早期生产普遍采用的方法。完全复配法要求各单一酶制剂的质量均可靠，同时各单酶复配时应严格按照酶谱配方来执行。该方法缺点较多，如基础数据的缺乏使得饲用复合酶酶谱配方的合理设计较为困难，各种商品纯酶制剂的高成本使得复配后饲用复合酶的成本较高；此外，完全复配法所生产的饲用复合酶很难获得除酶功能以外的可促进动物生长的一些未知生长因子等。②单菌株发酵法在自然界中筛选能够同时分泌表达多种非淀粉多糖酶的菌株，并利用各种诱变的方法获得符合配方要求的优良高产菌株，经发酵制取所得的粗酶即为复合酶制剂。然而大多数菌株在分泌酶时会根据培养基中底物的组成而进行有选择性的分泌酶，故利用该法获得的复合酶制剂实质上仅以一种或两种酶制剂为主，而其它相应酶制剂的分泌量较少且活性很低。目前工业用复合酶的来源主要是好氧丝状真菌木霉属和曲霉属，木霉菌发酵产物中存在多种真菌毒素，有毒性嫌疑，且丝状真菌发酵较难控制，菌种易退化。③多菌株混合发酵将各个菌株混合接种，一次发酵形成符合配方要求的复合酶制剂产品。该法理论上可行，但实际生产操作过程中因不同菌种发酵产酶的条件及需求各异，彼此间相互拮抗，故该技术应用难度很大。
发明内容本发明的目的在于提供表达非淀粉多糖复合酶的重组巴氏毕赤酵母菌及其应用。本发明的重组菌，是含有木聚糖酶基因、纤维素酶基因和e-甘露聚糖酶基因的重组巴氏毕赤酵母菌。上述木聚糖酶基因的编码序列是自Genbank号为AJ292317的5'端第1-576位的核苷酸序列；上述纤维素酶基因的核苷酸序列是自Genbank号为EU022559的5'端第88-1500位的核苷酸序列；上述P-甘露聚糖酶基因的核苷酸序列是自Genbank号为AY623903的5'端第122-1051位的核苷酸序列。其中，所述木聚糖酶基因通过重组表达载体a导入所述巴氏毕赤酵母菌中，构成重组巴氏毕赤酵母菌A，该重组表达载体a是将所述木聚糖酶基因插入到表达载体pPIC9中得到的表达木聚糖酶的重组表达载体。所述纤维素酶基因通过重组表达载体b导入所述重组巴氏毕赤酵母菌中A，构成重组巴氏毕赤酵母菌B，该重组表达载体b是将所述纤维素酶基因插入到表达载体pPIC9K中得到的表达纤维素酶的重组表达载体。所述P-甘露聚糖酶基因通过重组表达载体c导入所述重组巴氏毕赤酵母菌B中得到本发明的重组菌；所述重组表达载体c是将所述0-甘露聚糖酶基因连接到表达载体pPICZaA上得到的表达P-甘露聚糖酶的重组表达载体。所述巴氏毕赤酵母菌为巴氏毕赤酵母菌(ZVc力iapa"orA)GS115。上述重组菌为巴氏毕赤酵母(尸j'c/l^pa^orA)GS115-NSP，已于2009年04月16日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCCNq.3025。本发明的另一目的在于提供所述的重组菌在生产非淀粉多糖复合酶中的应用。所述应用是将本发明的重组菌，在温度28-3CTC，pH5.0-6.0，溶氧为30%-60%，进行诱导发酵，表达出非淀粉多糖复合酶。所述培养用培养基为YPD培养基或BMGY培养基；所述BMGY培养基为1%酵母提取物，2%蛋白胨，100mmol/L磷酸缓冲液(p朋.0)，1.34%YNB，0.00004%生物素(Biotin)，1%(体积百分比)甘油；所述YPD培养基为1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖(除甘油外，其余物质的"％"均表示质量百分含量)所述重组菌在YPD培养基中培养30-60小时，优选48小时。本发明的又一目的在于提供所述的重组菌在生产饲料中的应用。本发明通过构建不同的巴氏毕赤酵母真核表达载体，将克隆得到的橄榄绿链霉菌木聚糖酶基因、解淀粉芽孢杆菌的纤维素酶基因和环状芽孢杆菌的e-甘露聚糖酶基因分别重组进出发菌株中，得到能够同时高效的分泌表达多种酶的工程菌株GS115-NSP，其中木聚糖酶的产量可达到5012U/ml，纤维素酶的产量可达到4109U/ml，甘露聚糖酶的产量可达到2017U/ml。本发明的重组巴氏毕赤酵母生物反应器培养营养要求低、生长快、培养基廉价，其自身分泌的蛋白非常少，十分有利于复合酶的纯化，便于工业化生产，这为生产非淀粉多糖复合酶提供了一种新方法。具体实施例方式下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。本发明所用试剂均用水配制，其溶质分别由以下终浓度的物质组成RDB固体培养基lmol/L山梨醇，1%葡萄糖，1.34%YNB(酵母氮源，不含氨基酸(美国BD公司))，0.00004%生物素，0.005%谷氨酸，0.005%甲硫氨酸，0.005%赖氨酸，0.005%亮氨酸，0.005%异亮氨酸，1.5%琼脂(上述"％"均表示质量百分含量)。LB培养基0.5%酵母提取物，1.0%蛋白胨，1.0Q/QNaCl，用NaOH调至pH7.0，(固体培养基含1.5%琼脂)121°C灭菌15min(上述"％"均表示质量百分含量)。YPD培养基1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖(上述"％"均表示质量百分含量)。醒固体培养基1.34%YNB，0.00004%生物素(Biotin)，0.5%甲醇，1.5%琼脂(上述"％"均表示质量百分含量)。MD固体培养基:1.34%YNB，0.00004%生物素(Biotin)，2%葡萄糖，1.5%琼脂(上述"％"均表示质量百分含量)。BMGY培养基1%酵母提取物，2%(质量百分含量)蛋白胨，100mmol/L磷酸缓冲液(p朋.O)，1.34%(质量百分含量)YNB酵母氮源，不含氨基酸(美国BD公司)，0.00004%(质量百分含量)生物素(Biotin)，1%(体积百分比)甘油。BMMY甲醇诱导培养基除以0.5%(体积百分比)甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同。PTM盐硫酸铜6.0g/L、碘化钠0.08g/L、硫酸锰3.0g/L、钼酸钠0.2g/L、硼酸0.02g/L、氯化钴0.5g/L、氯化锌20g/L、硫酸亚铁65g/L、生物素0.25g/L、硫酸5ml/L。菌株发酵培养基磷酸26.7ral/L，硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g/L，七水合硫酸镁14.9g/L，氢氧化钾4.13g/L，葡萄糖50g/L并添加1.5%(体积百分比)PTM盐。实施例1、表达非淀粉多糖复合酶的重组菌的获得一、分泌表达木聚糖酶巴氏毕赤酵母重组菌GS115-xynb的构建1、含橄榄绿链霉菌木聚糖酶基因巴氏毕赤酵母真核表达载体pPIC9K-xynb的构建根据网上已经发表的橄榄绿链霉菌木聚糖酶基因，其编码序列是Genebank号为AJ292317的5'端第1-576位的核苷酸序列，将该序列进行人工合成(北京奥科)，共合成576个碱基，并在合成的基因片段5'端添加EcoRI酶切位点，其3'端添加NotI酶切位点，并以正确的阅读框架插入巴氏毕赤酵母表达载体pPIC9(invitrogen公司)的EcoRI和NotI酶切位点之间得到重组载体，将得到的重组载体命名为pPIC9-xynb。2、可表达木聚糖酶的巴氏毕赤酵母工程菌GS115-xynb的构建1)巴氏毕赤酵母酵母GS115感受态细胞的制备(1)挑取巴氏毕赤酵母酵母GS115的单菌落接种于10mlYPD培养基中，30°C摇床12小时。(2)以1%(体积百分比)接种量转接至100mlYPD液体培养基，3(TC摇床过夜至0De。cpL3-1.5。4。C离心5000rpm，5min，弃上清，收集沉淀(菌体)。(3)将步骤(2)获得的菌体用100ml冰预冷无菌水将菌体重悬，4"C离心5000rpm，10min，弃上清，收集菌体。然后将菌体用50ml冰预冷无菌水将菌体重悬，4。C离心5000rpm，10min，弃上清，收集沉淀(菌体)。(4)将步骤(3)再用20mllraol/L的山梨醇洗涤1次。然后溶于200^lmol/L的冰预冷的山梨醇，得到巴氏毕赤酵母酵母GS115感受态细胞。2)目的基因插入巴氏毕赤酵母酵母GS115感受态细胞染色体取5ng的重组质粒pPIC9-xynb，并用BglII进行酶切2个小时。酶切反应体系如下含有目的基因的真核表达载20W(5ug);体pPIC9-xynb10Xbuffer5W;BglII5ddH2020PL;总体积50叱。将酶切好的体系中加入5ul3MpH=5.2的NaAC，和100ul的无水乙醇，-20°C静置15分钟后10000g离心l分钟，再用75%的乙醇洗，烘干，用IOul灭菌水溶解，得到线性化的pPIC9-xynb，以备转化。在80ul步骤l)获得的酵母感受态细胞GS115中加入l-5ug线性化的pPIC9-xynb，在冰上放置15分钟，迅速加入冰预冷0.2cm电击杯(MicroPulserBio-Rad165-2100)中，电击转化酵母感受态细胞(2.5KV，5ms)，立即向电击杯中加入lml冰冷的lmol/L山梨醇，混匀后，以每板200ixl菌液涂布到RDB平板上，3(TC培养至长出转化子。将转化子接种于3mlBMGY培养基，250rpm30。C摇床培养48h，5000rpm离心8min，弃去上清收集菌体，将菌体用lralB醒Y甲醇诱导培养基重悬，继续在28。C诱导培养48h后5000rpm离心8min取上清，将上清按照如下方法测木聚糖酶的酶活来鉴定其是否能够表达木聚糖酶，及其产酶能力的高低。实验重复三次，木聚糖酶产量的测定结果如表l所示表l.木聚糖酶产量的测定结果(平均值)l号菌株2号菌株3号菌株木聚糖酶产量600U/ml750U/ml1006U/ml木聚糖酶测定方法吸取0.2ml适当稀释的酶液加入试管中，再加入1.8mlP/。的木聚糖溶液(lg燕麦木聚糖溶于100mlpH5.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液)，电磁振荡3s，37'C精确保温10min。加入3mlDNS试剂，电磁振荡3s沸水浴加热5min，冷却至室温，测定其产生的还原糖量。木聚糖酶活力单位在37T:和pH4.5条件下，每分钟从木聚糖溶液中降解释放1ixmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。将酶活最高的菌株(3号)，命名为GS115-xynb。二、可表达木聚糖酶和纤维素酶的巴氏毕赤酵母工程菌GS115-xynb-cen的构建1、解淀粉芽孢杆菌纤维素酶基因的克隆根据网上已经发表的解淀粉芽孢杆菌纤维素酶基因序列，将其编码信号肽的碱基去掉，该序列是Genbank号为EU022559的5'端第88-1500位的核苷酸序列，并以此设计引物，引物序列如下所示5，引物5'-GAATTCGCAGGGACAAAAACGCCA-3'(下划线标注的是EcoRI酶切位点)；3，弓l物5'-GCGGCCGCC7MTTTGGTTCTGTTCCCC-3'(下划线标注的是NotI酶切位点，斜体字是终止密码子)。以上述5，引物和3'引物为引物，以解淀粉芽孢杆菌(购自中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(编号CGMCC1.1226))的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系解淀粉芽孢杆菌的基因组DNA1叱(0.5Pg)，5，弓|物1叱(0.1Pg)，3'引物1PL(0.lPg),10XPCRbuffer2.5叱，TaqPlus(北京天根公司)1叱(2.5U),dNTPmix(2.5mmol/L)4PL,ddH2014.5叱，总体积25叱。PCR扩增条件为:先94。C3min;然后94。C30s，53.5°C30s，72°C90s，共28个循环；最后72'C10min。PCR扩增得到1413bp的片段，将得到的PCR产物回收，连接T载体(北京全式金生物技术有限公司pEASY-T3)，并送北京奥科进行测序，测序结果表明PCR扩增得到的片段具有自Genbank号为EU022559的5'端第88-1500位的核苷酸序列。当然，上述解淀粉芽孢杆菌去信号肽纤维素酶基因也可通过人工合成的方法来制备。2、含解淀粉芽孢杆菌去信号肽纤维素酶基因巴氏毕赤酵母真核表达载体(pPIC9K-cen)的构建将步骤1的测序结果正确的解淀粉芽孢杆菌去信号肽纤维素酶基因重组T载体用EcoRI和NotI进行双酶切，回收解淀粉芽孢杆菌去信号肽纤维素酶基因片段，插入到巴氏毕赤酵母表达系统载体pPIC9K(invitrogen公司)的EcoRI和NotI酶切位点之间得到重组载体，将得到的重组载体命名为pPIC9K-cen。3、可表达木聚糖酶和纤维素酶的巴氏毕赤酵母工程菌GS115-xynb-cen的构建1)巴氏毕赤酵母酵母GS115-xynb感受态细胞的制备(1)挑取巴氏毕赤酵母酵母GS115-xynb的单菌落接种于10mlYPD培养基中，3(TC摇床12小时。(2)以1%(体积百分比)接种量转接至100mlYPD液体培养基，30'C摇床过夜至0D,:1.3-1.5。4。C离心5000rpm，5min,弃上清，收集沉淀(菌体)。(3)将步骤(2)获得的菌体用100ml冰预冷无菌水将菌体重悬，4t:离心5000rpm,10min，弃上清，收集菌体。然后将菌体用50ml冰预冷无菌水将菌体重悬，4。C离心5000rpm，10min，弃上清，收集沉淀(菌体)。(4)将步骤(3)再用20mllraol/L的山梨醇洗涤1次。然后溶于200叱lmol/L的冰预冷的山梨醇，得到巴氏毕赤酵母酵母GS115-xynb感受态细胞。2)目的基因插入巴氏毕赤酵母GS115-xynb感受态细胞染色体取5Pg的重组质粒pPIC9K-cen，并用BglII进行酶切2个小时。酶切反应体系如下含有目的基因的真核表达载体20叱pPIC9K-cen(5iig)10Xbuffer5PLBglII5PLddH2020PL总体积5(^L。将酶切好的体系中加入5叱3MpH=5.2的NaAC，和IOO叱的无水乙醇，-20°C静置15分钟后lOOOOg离心1分钟，再用75%的乙醇洗，烘干，用10叱灭菌水溶解，得到线性化pPIC9K-cen，以备转化。在80y1步骤1)获得的巴氏毕赤酵母GS115-xynb感受态细胞悬浮液中，加入1-5Ug上述获得的线性化pPIC9K-cen，冰上放置15分钟，迅速加入冰预冷0.2cm电击杯(MicroPuLserBio-Rad165-2100)中，电击转化酵母感受态细胞(2.5KV，5ms)，立即向电击杯中加入lml冰冷的lmol/L山梨醇，混匀后，以每板200^1菌液涂布到RDB平板上，3(TC培养至长出转化子。转化子通过8mg/ml的G418(invitrogen公司)筛选得到多拷贝菌株，将筛选得到的阳性菌株分别接种于3mlBMGY培养基，250rpra30。C摇床培养48h，然后将摇培获得菌液于5000rpm离心8min，弃去上清收集菌体，将菌体用lmlBMMY甲醇诱导培养基重悬，继续在28。C诱导培养48h后5000rpm离心8min取上清，将上清测纤维素酶和木聚糖酶的酶活，其中木聚糖酶的酶活按照步骤一中的步骤2提供的方法测定；纤维素酶的酶活按照如下方法测定，实验重复3次，其中木聚糖酶和纤维素酶产量的测定结果如表2所示表2.木聚糖酶和纤维素酶产量的测定结果(平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>纤维素酶活测定方法采用CMCNa-DNS方法测定，吸取2ml适当稀释的酶液加入试管中，再加入2ml0.8%的羧甲基纤维素钠溶液(0.8gCMC-Na溶于100mlpH5.2乙酸-乙酸钠缓冲溶液)，电磁振荡3s，37"精确保温30min。加入5mlDNS试剂，沸水浴加热5min，冷却至室温，加水定容至25ml，测定其产生的还原糖量。纤维素酶活力单位在37'C和pH^5.5条件下，每分钟从的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1ug还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。挑出上述表达木聚糖酶和纤维素酶酶活最高的重组巴氏毕赤酵母菌(3号)，命名为GS115-xynb-cen。三、可表达木聚糖酶、纤维素酶和e-甘露聚糖酶的巴氏毕赤酵母工程菌的构建1、环状芽孢杆菌去信号肽e-甘露聚糖酶基因的克隆根据网上已经发表的环状芽孢杆菌e-甘露聚糖酶基因序列，将其编码信号肽的碱基去掉，该序列是Genbank号为AY623903的5'端第122-1051位的核苷酸序列，并以此设计引物，引物序列如下所示-5，引物5'-GAATTCCAAAACGGATTTCACGTATC-3'(下划线是EcoRI切点)3，引物5'-GCGGCCGC7T^ATCACTCTTAAGCCCAT-3'(下划线是NotI酶切位点，斜体字是终止密码子)以上述5'引物和3'引物为引物，以环状芽孢杆菌购自中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(编号CGMCC1.2411))的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系环状芽孢杆菌的基因组DNAl叱(O.5Pg)，5'引物1叱(O.lPg)，3'引物1PL(0.1Pg)，10XPCRbuffer2,5HL，TaqPlus(北京天根公司)1叱(2.5U)，dNTPmix(2.5mmol/L)4^L，ddH2014.5叱，总体积25叱。PCR扩增条件先94。C3min;然后94°C30s，54°C30s,72°Clmin;共28个循环；最后72°C10min。PCR扩增得到930bp的片段，将得到的PCR产物回收，连接T载体(北京全式金生物技术有限公司pEASY-T3)，并送北京奥科进行测序，测序结果表明PCR扩增得到的片段具有自Genbank号为AY623903的5'端第122-1051位的核苷酸序列。当然，含环状芽孢杆菌去信号肽P-甘露聚糖酶基因也可通过人工合成的方法来制备。2、含环状芽孢杆菌去信号肽的0-甘露聚糖酶基因巴氏毕赤酵母真核表达载体(pPICZ-man)的构建将步骤1的测序结果正确的环状芽孢杆菌去信号肽的3-甘露聚糖酶基因重组T载体用EcoRI和NotI进行双酶切，回收环状芽孢杆菌去信号肽的P-甘露聚糖酶基因，插入到巴氏毕赤酵母表达系统载体pPICZaA(invitrogen公司)的EcoRI和NotI酶切位点之间得到重组载体，将得到的重组载体用EcoRI和NotI进行酶切鉴定和测序鉴定，将酶切和测序鉴定表明正确的含上述环状芽孢杆菌去信号肽的0-甘露聚糖酶基因片段的重组载体命名为pPICZ-man。3、可表达木聚糖酶、纤维素酶和e-甘露聚糖酶的巴氏毕赤酵母工程菌GS115-NSP的构建1)巴氏毕赤酵母酵母GS115-xynb-cen感受态细胞的制备(1)挑取巴氏毕赤酵母酵母GS115-xynb-cen的单菌落接种于lOmlYPD培养基中，30。C摇床过夜(12小时)。(2)以1%(体积百分比)接种量转接至100mlYPD液体培养基，3(TC摇床过夜至0D,:1.3-1.5。4。C离心5000rpm，5min,弃上清，收集沉淀(菌体)。(3)将步骤(2)获得的菌体用100ml冰预冷无菌水将菌体重悬，4'C离心5000rpm，10min，弃上清，收集菌体。然后将菌体用50ml冰预冷无菌水将菌体重悬，4。C离心5000rpm，10min，弃上清，收集沉淀(菌体)。(4)将步骤(3)再用20mllmol/L的山梨醇洗涤1次。然后溶于200叱lmol/L的冰预冷的山梨醇，得到巴氏毕赤酵母酵母GS115-xynb-cen感受态细胞。2)目的基因插入巴氏毕赤酵母GS115-xynb-cen感受态细胞染色体取5ug的重组质粒pPICZ-man,并用BglII进行酶切2个小时。酶切反应体系如下含有目的基因的真核表达载体20叱pPICZ-man(5ng)10Xbuffer5叱BglII5叱ddH2020PL总体积50叱。将酶切好的体系中加入5叱3MpH=5.2的NaAC，和IOO叱的无水乙醇，-20°C静置15分钟后lOOOOg离心1分钟，再用75%的乙醇洗，烘干，用10叱灭菌水溶解，得到线性化pPICZ-man，以备转化。在80u1步骤1)获得的巴氏毕赤酵母GS115-xynb-cen感受态细胞悬浮液中，加入1-g上述获得的线性化pPICZ-raan，冰上放置15分钟，迅速加入冰预冷0.2cm电击杯(MicroPuLserBio-Rad165-2100)中，电击转化酵母感受态细胞(2.5KV，5ms)，立即向电击杯中加入lml冰冷的lmol/L山梨醇，混匀后，以每板200iil菌液涂布到RDB平板上，3(TC培养至长出转化子。转化子通过300ug/ml的Zeocin(invitrogen公司)筛选得到阳性重组菌株，将筛选得到的阳性菌株分别接种于3mlBMGY培养基，250rpm3(TC摇床培养48h，5000rpm离心8min，弃去上清，用lmlB醒Y甲醇诱导培养基重悬，继续在28。C诱导培养48h后5000rpm离心8min取上清。将上清测酶活来鉴定其是否能够表达e-甘露聚糖酶、纤维素酶和木聚糖酶，及其产酶能力的高低，其中，纤维素酶和木聚糖酶的酶活测定按照步骤一中的步骤3所述的方法检测，e-甘露聚糖酶活测定方法吸取0.2ml适当稀释的酶液加入试管中，再加入5mg/m的1洋槐豆粉溶液1.8ml(0.5g洋槐豆粉溶于100mlpH5.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液)，电磁振荡3s，37。C精确保温10min。加入3mlDNS试剂，沸水浴加热5min，冷却至室温，加水定容至15ml，测定其产生的还原糖量。0-甘露聚糖酶活力单位在37T:和pH4.5条件下，每分钟从洋槐豆粉溶液中降解释放1limol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。结果筛选得到一株能同时表达木聚糖酶、纤维素酶和e-甘露聚糖酶的菌株，将其命名为巴氏毕赤酵母(^'c力^/^Wow's)GS115-NSP，其表达木聚糖酶、纤维素酶和P-甘露聚糖酶酶活测定重复3次，平均值的结果如表3所示表3.GS115-NSP的木聚糖酶、纤维素酶和P-甘露聚糖酶酶活的测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>巴氏毕赤酵母(尸^力^/a"oWs)GS115-NSP，已于2009年04月16日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCCNs.3025。将构建的巴氏毕赤酵母CGMCCN2.3025GS115-NSP或巴氏毕赤酵母GS115接种于YPD培养基中培养48小时，作为发酵种子液。转接入5L发酵罐中培养，接种量为5-10%，温度28-30°C，pH5.0-6.0，溶氧(DO)控制在30%-60%，并诱导发酵132小时，每隔24小时取样(发酵上清液)，按照上述方法测定木聚糖酶、纤维素酶和P-甘露聚糖酶酶活。上述方法重复五次，结果如表4所示巴氏毕赤酵母GS115发酵132小时时的上清液没有酶活。表4.巴氏毕赤酵母CGMCCNs.3025GS115-NSP表达酶活鉴定结果(平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1、重组菌，是含有木聚糖酶基因、纤维素酶基因和β-甘露聚糖酶基因的重组巴氏毕赤酵母菌。2、如权利要求l所述的重组巴氏毕赤酵母菌，其特征在于所述木聚糖酶基因的编码序列是自Genbank号为AJ292317的5'端第1-576位的核苷酸序列；所述纤维素酶基因的核苷酸序列是自Genbank号为EU022559的5'端第88-1500位的核苷酸序列；所述e-甘露聚糖酶基因的核苷酸序列是自Genbank号为AY623903的5'端第122-1051位的核苷酸序列。3、如权利要求2所述的重组巴氏毕赤酵母菌，其特征在于所述木聚糖酶基因通过重组表达载体a导入巴氏毕赤酵母菌中，构成重组巴氏毕赤酵母菌A;所述重组表达载体a是将所述木聚糖酶基因插入到表达载体pPIC9上得到的表达木聚糖酶的重组表达载体。4、如权利要求3所述的重组巴氏毕赤酵母菌，其特征在于所述纤维素酶基因通过重组表达载体b导入重组巴氏毕赤酵母菌A中，构成重组巴氏毕赤酵母菌B;所述重组表达载体b是将所述纤维素酶基因插入到表达载体pPIC9K上得到的表达纤维素酶的重组表达载体。5、如权利要求4所述的重组巴氏毕赤酵母菌，其特征在于所述P-甘露聚糖酶基因通过重组表达载体c导入所述重组巴氏毕赤酵母菌B中得到权利要求1所述的重组菌；所述重组表达载体c是将所述3-甘露聚糖酶基因连接到表达载体pPICZaA上得到的表达e-甘露聚糖酶的重组表达载体。6、如权利要求1-5任一所述的重组巴氏毕赤酵母菌，其特征在于所述巴氏毕赤酵母菌为巴氏毕赤酵母菌GS115。7、如权利要求1-6所述的重组巴氏毕赤酵母菌，其特征在于所述重组菌为巴氏毕赤酵母(/^'c/w'apa"arA)CGMCCNa.3025。8、权利要求1-7中任意一项所述的重组巴氏毕赤酵母菌在生产非淀粉多糖复合酶中的应用。9、如权利要求8所述的应用，其特征在于所述应用是将权利要求1-7中任意一项所述的重组巴氏毕赤酵母菌，在温度28-3(TC，PH5.0-6.0，溶氧为30%-60%，进行诱导发酵，表达出非淀粉多糖复合酶；所述培养用培养基为YPD培养基或BMGY培养基；所述BMGY培养基含有如下终浓度的物质质量百分浓度为线的酵母提取物，质量百分浓度为2%的蛋白胨，100mmol/LpH6.0磷酸缓冲液，质量百分浓度为1.34%的YNB，质量百分浓度为0.00004%生物素，和体积百分比1%的甘油的培养基；所述YPD培养基含有如下终浓度的物质质量百分浓度为1%酵母提取物，质量百分浓度为2%的蛋白胨，质量百分浓度为2%的葡萄糖的培养基；所述重组菌在YPD培养基中培养30-60小时，优选48小时。10、权利要求1-7中任意一项所述的重组巴氏毕赤酵母菌在生产饲料中的应用。全文摘要本发明公开了一种表达非淀粉多糖复合酶的重组巴氏毕赤酵母菌及其应用。所述重组菌，是将木聚糖酶基因、纤维素酶基因和β-甘露聚糖酶基因导入巴氏毕赤酵母菌中。本发明提供的重组菌可以用来生产非淀粉多糖复合酶，所述重组菌表达的木聚糖酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶的产量分别可达5012U/ml、4109U/ml、2017U/ml。本发明提供的重组菌可用在生产饲料中。本发明的重组巴氏毕赤酵母生物反应器培养营养要求低、生长快、培养基廉价，其自身分泌的蛋白非常少，十分有利于复合酶的纯化，便于工业化生产，这为生产非淀粉多糖复合酶提供了一种新方法。文档编号C12R1/84GK101544954SQ20091008348公开日2009年9月30日申请日期2009年5月6日优先权日2009年5月6日发明者吴培均,李卓夫,李富伟,段文娟申请人:北京挑战生物技术有限公司