专利名称：改变产纤维植物中纤维强度的方法和手段的制作方法
技术领域：
本发明涉及农业领域，更具体地，涉及使用分子生物学技术改变产纤维植物特别 是棉花植物和/或加速此类产纤维植物育种。提供了改变纤维品质如提高纤维强度的方法 和手段。本发明还提供了鉴定一群棉花品种和相关祖先植物中与纤维强度相关的分子标记 物的方法。
背景技术：
棉花提供了大量用于纺织工业的高品质纤维。修饰棉花纤维特征以更好地适应该 工业的需求是通过经典方法或通过遗传改变棉花植物的基因组进行育种方面的主要努力。全球种植的棉花中大约90%是陆地棉(Gossypium hirsutum L.)，而海岛棉 (Gossypium barbadense)占大约8%。如大多数开花植物中那样，认为棉花基因组已经经 历一个或多个多倍体化事件并且已经因趋异基因组在共有核中接合而进化。棉花商业由两 种“AD”异源四倍体物种(陆地棉和海岛棉(Gossypium barbadense L.))(均为2n = 4x = 52)的改良形式主导。认为异源四倍体棉花已经在大约1-2百万年前于新世界(New World) 通过母本旧世界(Old World) “Α”基因组分类群类似的草棉(Gossypiumhertaceum) (2n = 2x = 26)与父本新世界“D”基因组分类群类似的雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)或拟 似棉(Gossypium gossypioides))(均为2n = 2x = 26)之间杂交形成。野生的A基因组 二倍体和AD异源四倍体棉属(Gossypium)分类群产生可纺纤维。一种A基因组二倍体物 种，树棉(Gossypium arboreum) (2n = 2x =沈)，仍在亚洲被广泛育种和栽培。它的密切 相关并且可能的棉属祖先，A基因组二倍体物种草棉(G. hertaceum)也产生可纺纤维。虽 然D基因组二倍体的种子是被柔毛的(pubescent)，但是均不产生可纺纤维。没有驯化来自 其余已认知的二倍体棉属基因组(B、C、E、G和K)的分类群。由人类进行的密集定向选择 一贯以来已经产生了与A基因组二倍体栽培种相比具有优异产量和/或品质特征的AD异 源四倍体棉花。对陆地棉(G. hirsutum) (AADD;“Upland”棉花)的选择性育种强调最大产 量，而海岛棉(AADD;“海岛”、“Pima”或“埃及”棉花)则以其具有优异长度、强度和精细度 的纤维见长(Jiang 等人，1998，Proc Natl Acad Sci U S A. 95(8) :4419-4424)。棉花纤维是在开花或恰在此前从胚珠的外珠被的表皮启动的单个细胞。之后，纤 维迅速伸长约3周，然后它们转变成强烈的次生细胞壁纤维素合成。纤维细胞仅在其基部 末端(basal ends)与下面的种皮相互连接，并且溶质、水和其它分子的流入经胞间连丝或 胞质膜进行。Ruan等人2001 (Plant Cell 13 :47-6 展示了纤维延伸期间胞间连丝的暂 时闭合。Ruan等人2004 (Plant Physiology 136 :4104-4113)比较了在纤维长度方面不同 的不同棉花基因型之间胞间连丝闭合的持续时间，并且发现胞间连丝闭合的持续时间与纤 维长度之间的正相关。此外，提供了显微证据，其显示纤维基底处的胼胝质沉积和降解与胞 间连丝闭合和重开的时机相关。纤维中令胼胝质降解的内切-1，3-β-葡聚糖酶(endo-1， 3-beta-glucanase)基因表达与胞间连丝在纤维基底处的重开相关。W02005/017157描述了通过改变纤维延伸期调节产纤维植物(如棉花)中纤维长度的方法和手段。纤维延伸期可以通过干扰纤维细胞基底处胞间连丝中的胼胝质沉积来增 加或减少。W02008/083969(其要求欧洲专利申请EP 07000550的优先权)公开了分离的 DNA分子，其包含编码棉花内切-1，3-β-葡聚糖酶的核苷酸序列和纤维细胞偏好性启 动子或启动子区域，以及使用这些序列或启动子用于调节棉花植物的纤维长度的方法。 W02008/083969还描述陆地棉中纤维特异性内切_1，3- β -葡聚糖酶基因的A和D亚基因组 特定等位基因表达的时机是不同的。虽然D亚基因组特定等位基因表达的启动与迅速延伸 期终结(开花后(下文缩写为“DPA”)约14至17日)相关，但A亚基因组特定等位基因表 达的启动延迟直至纤维成熟晚期(约35-40DPA)开始，这取决于生长条件。对棉花工业具有特殊意义的一个纤维特征是纤维强度。不仅纤维强度与纱线强度 之间存在高度相关性，而且具有高纤维强度的棉花更可能抵抗制造过程期间的断裂作用。在棉花纤维的许多其他纺织特性(例如，纤维壁厚度或成熟度、可染性、伸长 性等)当中，纤维强度被描述成直接取决于纤维素的量和特性(例如，聚合程度、微晶 尺寸和微纤维方向)(Ramey，1986，在Mauney J. R.和 Stewart J. McD.(编著)Cotton Physiology. The Cotton Foundation, Memphis, TN,第 351-360 页；Triplett, 1993,在 Cellulosics :Pulp, Fibre, and Environmental Aspects. Ellis Horwood, Chichester, UK,第 135-140 M ；Hsieh, 1999, ^t =Basra Α. S. ( Hlr ) Cotton Fibers =Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing. The Haworth Press, NewYork, 第137-166页)。过去十年间的进展，尤其使用拟南芥属(Arabidopsis)模式植物(Arioli 等人，1998，Science 279(5351) :717-720)，已经导致对参与纤维素合成的蛋白质的了解大 大增加。即便如此，仍存在更多关于纤维素合成的内容待习得，尤其关于如何在转录和转录 后水平调节纤维素合成(Taylor, 2008, New Phytologist 178 ( ，239-252)。陆地棉中厚约0. 5 μ m并含有20-25%纤维素连同果胶、木葡聚糖及蛋白质的典型 初生纤维细胞壁(Meinert 和 Delmer 1977，Plant Physiol59 :1088-1097)在纤维延伸期 间合成(Haigler，2007，在:R. Μ. Brown, Jr.禾口 I. Μ· Saxena(编著)，Cellulose =Molecular and Structural Biology, 147-168，Springer.)。初生壁沉积单独继续进行直至 14-17DPA， 然后在15-24DPA之间出现伴以同时初生壁及次生壁沉积的过渡期(代表“卷绕层”的沉 积)，随后主要是次生壁合成直到至少40DPA。壁增厚的第一阶段(12-16DPA)通过持续合 成相同比例的初生壁组分实现(Meinert和Delmer，1977，见上文)，这是一个与增加的壁双 折射一致的观察结果，同时纤维素微纤维横向地保持取向(Seagull，1986，Can J Bot 64: 1373-1381)。次生壁最终围绕纤维的整个周边达到3-6 μ m厚度，仅在纤维尖端变得较纤 细。在海岛棉中，在每根纤维内而非在纤维群体中初生壁沉积与次生壁沉积之间存在交叠， 原因是交叠期大为延长，并且90%的次生壁沉积在延伸停止之前完成(DeLanghe，1986， 在Mauney J. R.禾口 Stewart J. McD (编著)CottonPhysiology. The Cotton Foundation, Memphis，TN，第325-350页)。认为随着次生壁沉积在大部分的细胞表面上，延伸排他地在 纤维尖端继续。Maltby 等人(1979，Plant Physiol. 63，1158-1164)描述了正在发育的陆地棉纤 维在次生壁沉积开始时短暂合成l，3-i3_D-葡聚糖(胼胝质)，随后是纤维素的大量合成。 Meier等人(1981，NatUre 289 =821-822)描述了胼胝质可以是棉花纤维的纤维素生物合成中的可能中间体。DeLanghe (1986，见上文)描述了可能在棉花纤维次生壁中需要胼胝质， 旨在为纤维素微纤维在常见基质分子不存在下在外质区中结晶和最终取向提供空间。下文在不同实施方案、实施例、图和权利要求中描述的本发明提供了用于调节纤 维长度的改良方法和手段。更具体地，本发明描述了如何在植物中提高纤维强度并且同时 维持高的纤维产量。特别地，本发明描述了如何通过渐渗源自针对高纤维强度所选择的其 他棉花物种(如海岛棉)的纤维强度决定基因而在针对高产量所选择的棉花物种(如陆 地棉)中提高纤维强度。本发明还提供了鉴定多个棉花品种和相关祖先植物中与纤维强 度相关的分子标记物的方法。下文描述的本发明也提供编码纤维特异性棉属葡聚糖酶蛋白 (GLUC1.1)的新核酸分子和这类蛋白质。
发明概述本发明人在棉属植物染色体A05上鉴定到纤维强度的数量性状基因座并且发现 海岛棉包含这个纤维强度基因座的等位基因，其优于来自陆地棉的这个QTL的等位基因， 即，与包含陆地棉纤维强度等位基因的棉属植物的纤维强度相比，该海岛棉纤维强度等位 基因在棉属植物中的存在导致更高的纤维强度。因此，在第一方面，本发明提供非天然存在的棉属植物及其部分和后代，其包含在 染色体A05上的纤维强度基因座的至少一个优异等位基因。在一个实施方案中，该植物是来自A基因组二倍体棉属物种(如草棉或树棉)或 AD基因组异源四倍体棉属物种(如陆地棉和海岛棉)的植物，并且优异纤维强度等位基因 从不同的A或AD基因组棉属物种衍生。在另一个实施方案中，该植物是陆地棉、草棉或树棉植物，优选地是陆地棉植物， 并且优异纤维强度等位基因从海岛棉衍生。在一个方面，该海岛棉纤维强度等位基因位于海岛棉的染色体A05上的AFLP标记 物P5M50-M126. 7与SSR标记物CIR280之间。在另一个方面，位于AFLP标记物P5M50-M126. 7 与SSR标记物BNL3992之间。仍在另一个方面，位于AFLP标记物P5M50-M126. 7与SSR标记 物CIR401c之间。又在另一个方面，海岛棉纤维强度等位基因的LOD峰值位于SSR标记物 NAU861或GLUC1. 1基因与SSR标记物CIR401c之间。在其他方面，海岛棉纤维强度等位基因 的LOD峰值位于距SSR标记物NAU861或GLUC1. 1基因约0至5cM处，更具体地在约4. 008cM 处。仍在其他方面，海岛棉纤维强度等位基因的LOD峰值位于距SSR标记物CIR401c约0 至12cM处，更具体地在约IOcM处，尤其在约10. 52cM处。在另一个方面，该海岛棉纤维强度等位基因包含核苷酸序列的至少一个海岛棉直 向同源物，所述的核苷酸序列包含于SEQ ID NO 53中所示的跨度覆盖陆地棉GLUC1. IA基 因的基因组DNA序列中。仍在另一个方面，该海岛棉纤维强度等位基因包含编码无功能GLUC1. 1蛋白的 GLUC1. 1基因。在一个方面，海岛棉GLUC1. 1基因的特征在于T核苷酸在与SEQ ID NO :5的 第712核苷酸位置相对应的核苷酸位置处存在。在其他方面，海岛棉GLUC1. 1基因位于海岛 棉纤维强度等位基因的LOD峰值约0至5cM处，更具体地在约4cM处。又在其他方面，海岛 棉GLUC1. 1基因位于NAU861标记物的约0至2cM处、约0至IcM出，更具体地在约0. 008cM 处。
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又在另一个实施方案中，该植物是陆地棉、海岛棉、草棉或树棉植物，优选地是陆 地棉植物，并且优异纤维强度等位基因从达尔文棉(Gossypium darwinii)衍生。在一个方 面，该达尔文棉纤维强度等位基因包含编码无功能GLUC1. 1蛋白的GLUC1. 1基因。在另一 个方面，达尔文棉GLUC1. 1基因的特征在于一个T核苷酸在与SEQ ID NO :56的第761核苷 酸位置相对应的核苷酸位置处存在。仍在另一个实施方案中，该植物是陆地棉、海岛棉或草棉植物，优选地是陆地棉植 物，并且优异纤维强度等位基因从树棉衍生。在一个方面，该树棉纤维强度等位基因包含编 码无功能GLUC1. 1蛋白的GLUC1. 1基因。在另一个方面，树棉GLUC1. 1基因的特征在于C 核苷酸在与SEQ IDNO 21第327与第3 位置之间的核苷酸位置相对应的核苷酸位置处不存在。在又一个实施方案中，该植物中纤维的胼胝质含量与同等棉属植物的纤维的胼胝 质含量相比增加，所述的同等棉属植物不包含纤维强度基因座的至少一个优异等位基因。在又一个实施方案中，该植物中纤维的强度与同等棉属植物的纤维的强度相比提 高，所述的同等棉属植物不包含纤维强度基因座的至少一个优异等位基因。在一个方面，纤 维的强度平均是高约5%与约10%之间、优选地高约7. 5%。在另一个方面，纤维的强度平 均是高约1. 6g/tex与约3. 3g/tex之间、优选地高约2. 5g/tex。仍在另一个方面，纤维的强 度平均是在约34. 6g/tex与约36. 3g/tex之间、优选地约35. 5g/tex。在另一个实施方案中，该植物是对海岛棉纤维强度等位基因纯合的陆地棉植物。仍在另一个实施方案中，本发明提供从第13至23段任一段所述的植物可获得的 纤维。在又一个实施方案中，本发明提供了鉴定植物中染色体A05上纤维强度基因座的 海岛棉等位基因的方法，所述植物优选地是棉属植物，如陆地棉植物，该方法包括步骤确 定与该纤维强度基因座连锁的标记物的海岛棉等位基因在该植物的基因组DNA中存在，所 述的标记物选自由以下标记物组成的组AFLP标记物P5M50-M126. 7、SSR标记物(ΠΙ^80、 SSR标记物BNL3992、SSR标记物CIR401c、SSR标记物NAU861、核苷酸序列的直向同源物中 的多态性位点，所述的核苷酸序列包含于SEQ IDNO 53中所示的跨度覆盖陆地棉GLUC1. IA 基因的基因组DNA序列中；和该植物的GLUC1. IA基因的核苷酸序列中的多态性位点，如 位于与SEQID NO 5中第418至第4 核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP2、位于与SEQ ID NO 5中第573核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标 记物GLUC1. 1A-SNP3、位于与SEQ ID NO 5中第712核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的 SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5、位于与SEQ ID NO :5中第864核苷酸位置相对应的核苷酸位置 处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6或者位于与SEQ ID NO 5中第832核苷酸位置相对应的核 苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8。在一个特定方面，通过用在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 43和44的至少两条 引物扩增约126. 7bp的DNA片段而检测AFLP标记物P5M50-M126. 7的海岛棉等位基因；通过 用在其3，最末端分别包含SEQ IDNO 51和52的至少两条引物扩增约2(^bp的DNA片段而 检测SSR标记物CIR280的海岛棉等位基因；通过用在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 49 和50的至少两条引物扩增约140bp至约145bp的DNA片段而检测SSR标记物BNL3992的海 岛棉等位基因；通过用在其3’最末端分别包含SEQID NO 47和48的至少两条引物扩增约245至约250bp的DNA片段而检测SSR标记物CIR401c的海岛棉等位基因；通过用在其3， 最末端分别包含SEQ ID NO 45和46的至少两条引物扩增约215bp至约220bp的DNA片段 而检测SSR标记物NAU861的海岛棉等位基因；通过在与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP2的位置 相对应的位置处检测CTCATCAAA核苷酸序列或通过用在其3’最末端分别包含SEQ ID NO 37和38的至少两条引物扩增约14;3bp的DNA片段而检测SNP标记物GLUC1. 1A-SNP2的海 岛棉等位基因；通过在与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3的位置相对应的位置处检测C核苷酸 而检测SNP标记物GLUCl. 1A-SNP3的海岛棉等位基因；通过在与SNP标记物GLUCl. 1A-SNP5 的位置相对应的位置处检测T核苷酸而检测SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5的海岛棉等位基 因；通过在与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6的位置相对应的位置处检测A核苷酸而检测SNP 标记物GLUC1. 1A-SNP6的海岛棉等位基因；通过在与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8的位置相 对应的位置处检测C核苷酸而检测SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8的海岛棉等位基因。在又一个实施方案中，本发明提供了鉴定植物中染色体A05上纤维强度基因座的 达尔文棉等位基因的方法，所述植物优选地是棉属植物，如陆地棉植物，该方法包括确定达 尔文棉特异性多态性位点，如位于与SEQ ID NO 56中第476至第477核苷酸位置相对应的 核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP2、如位于与SEQ ID NO 56中第622核苷酸位置 相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3、位于与SEQID NO 56中第761核苷酸 位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5、位于与SEQ ID NO 56中第913 核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6或者位于与SEQ ID NO 56中第881核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8，在该植物基 因组DNA中对应于SEQ ID NO 56所示GLUC1. IA基因核苷酸序列的GLUC1. IA基因核苷酸 序列中存在的步骤。在一个特定方面，通过在与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP2的位置相对应的位置处检 测CTCATCAAA核苷酸序列或通过用在其3’最末端分别包含SEQ ID NO 37和38的至少两 条引物扩增约14:3bp的DNA片段而检测SNP标记物GLUC1. 1A-SNP2的达尔文棉等位基因、 通过在与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3的位置相对应的位置处检测C核苷酸而检测SNP标 记物GLUC1. 1A-SNP3的达尔文棉等位基因、通过在与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5的位置相 对应的位置处检测T核苷酸而检测SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5的达尔文棉等位基因、通过 在与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6的位置相对应的位置处检测A核苷酸而检测SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP6的达尔文棉等位基因，并且通过在与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8的位置相对 应的位置处检测G核苷酸而检测SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8的达尔文棉等位基因。在又一个实施方案中，本发明提供了鉴定植物中染色体A05上纤维强度基因座的 树棉等位基因的方法，所述植物优选地是棉属植物，如陆地棉植物，该方法包括步骤确定 树棉特异性多态性位点，如位于与SEQID NO 21中第327和第3 核苷酸位置之间的核苷 酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP7，在该植物的基因组DNA中与 SEQ ID NO 21的GLUC1. IA基因核苷酸序列相对应的GLUC1. IA基因核苷酸序列中存在。在 一个特定方面，通过检测C核苷酸在与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP7的位置相对应的位置处 不存在而检测SNP标记物GLUC1. 1A-SNP7的树棉等位基因。在又一个实施方案中，本发明提供了区分染色体A05上纤维强度基因座的海岛 棉等位基因与植物中纤维强度基因座的陆地棉等位基因的方法，所述植物优选地是棉属植物，如陆地棉植物，该方法包括步骤确定与该纤维强度基因座连锁的标记物的海 岛棉等位基因和/或陆地棉等位基因在该植物的基因组DNA中存在，所述的标记物选 自由以下标记物组成的组:AFLP标记物P5M50-M126. 7、SSR标记物CIR280, SSR标记物 BNL3992、SSR标记物CIR401、SSR标记物NAU861 ；在植物的包含于SEQ ID NO 53中所示 的跨度覆盖陆地棉GLUC1. IA基因的基因组DNA序列中的核苷酸序列直向同源物中的多 态性位点；和在该植物的基因组DNA中GLUC1. IA基因的核苷酸序列中的多态性位点，如 位于与SEQ IDNO 5中第418至第4 核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP2、位于与SEQ ID NO 5中第573核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标 记物GLUC1. 1A-SNP3、位于与SEQ ID NO 5中第712核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的 SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5、位于与SEQ ID NO :5中第864核苷酸位置相对应的核苷酸位置 处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6或者位于与SEQ ID NO 5中第832核苷酸位置相对应的核 苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8。在一个特定方面，该陆地棉等位基因通过用在其3’最末端分别包含SEQ ID NO 43和44的至少两条引物分别扩增不到DNA片段和扩增到约126. 7bp的DNA片段而与AFLP 标记物P5M50-M126. 7的海岛棉等位基因区分；该陆地棉等位基因通过在其3’最末端分别 包含SEQ ID NO 51和52的至少两条引物分别扩增不到DNA片段和扩增到约2(^bp的DNA 片段而与SSR标记物CIR280的海岛棉等位基因区分；该陆地棉等位基因通过在其3’最末 端分别包含SEQ ID NO 49和50的至少两条引物分别扩增到两个DNA片段，一个约160bp 至约165的片段和一个约85bp至约90的片段，以及约140bp至约I^bp的DNA片段而 与SSR标记物BNL3992的海岛棉等位基因区分；该陆地棉等位基因通过在其3’最末端分 别包含SEQ ID NO 47和48的至少两条引物分别扩增到约25^ρ的DNA片段(CIR401b) 和约245bp至约250bp的DNA片段(CIR401c)而与SSR标记物CIR401的海岛棉等位基 因区分；该陆地棉等位基因通过在其3，最末端分别包含SEQ ID NO :45和46的至少两 条引物分别扩增到约205bp至约210bp的DNA片段和约215bp至约220bp的DNA片段而 与SSR标记物NAU861的海岛棉等位基因区分；该陆地棉等位基因分别通过在与SNP标 记物GLUC1. 1A-SNP2的位置相对应的位置处检测不到核苷酸或检测到CTCATCAAA核苷酸 序列或通过用在其3’最末端分别包含SEQ IDNO 37和38的至少两条引物分别扩增到 约134bp的DNA片段和约14;3bp的DNA片段而与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP2的海岛棉等 位基因区分；该陆地棉等位基因通过在与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3的位置相对应的位 置处分别检测G或C核苷酸而与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3的海岛棉等位基因区分；该 陆地棉等位基因通过在与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5的位置相对应的位置处分别检测C 或T核苷酸而与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5的海岛棉等位基因区分；该陆地棉等位基因 通过在与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6的位置相对应的位置处分别检测G或A核苷酸而与 SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6的海岛棉等位基因区分；并且该陆地棉等位基因通过在与SNP 标记物GLUC1. 1A-SNP8的位置相对应的位置处分别检测G或C核苷酸而与SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP8的海岛棉等位基因区分。在另一个实施方案中，本发明提供了用于产生和/或选择在染色体A05上包含纤 维强度基因座的至少一个优异等位基因的非天然存在棉属植物及其部分和后代的方法，其 中优异纤维强度等位基因从海岛棉衍生，该方法包括步骤使来自A基因组二倍体棉属物
16种(如草棉或树棉)或AD基因组异源四倍体棉属物种(如陆地棉)的植物与海岛棉植物 杂交，并且根据第25或沈段鉴定海岛棉纤维强度等位基因。在另一个实施方案中，本发明提供了用于产生和/或选择在染色体A05上包含纤 维强度基因座的至少一个优异等位基因的非天然存在棉属植物及其部分和后代的方法，其 中优异纤维强度等位基因从达尔文棉衍生，该方法包括步骤使来自A基因组二倍体棉属 物种(如草棉或树棉)或AD基因组异源四倍体棉属物种(如陆地棉或海岛棉)的植物与 达尔文棉植物杂交，并且根据第27或观段鉴定达尔文棉纤维强度等位基因。在另一个实施方案中，本发明提供了用于产生和/或选择在染色体A05上包含纤 维强度基因座的至少一个优异等位基因的非天然存在棉属植物及其部分和后代的方法，其 中优异纤维强度等位基因从树棉衍生，该方法包括步骤使来自A基因组二倍体棉属物种 (如草棉)或AD基因组异源四倍体棉属物种(如陆地棉或海岛棉)的植物与树棉植物杂 交，并且根据第四段鉴定树棉纤维强度等位基因。仍在另一个实施方案，本发明提供了用于改变棉属植物中纤维的胼胝质含量、特 别是提高纤维的胼胝质含量的方法，包括步骤根据第32至34段任一段所述渐渗棉属植物 中染色体A05上纤维强度基因座的优异等位基因，并且选择其纤维中具有改变的胼胝质含 量、尤其提高的胼胝质含量的植物。又在另一个实施方案，本发明提供了用于改变棉属植物中纤维的特性、特别是提 高纤维强度的方法，包括步骤根据第32至34段任一段所述渐渗棉属植物中染色体A05上 纤维强度基因座的优异等位基因，选择具有改变的纤维强度、尤其提高的纤维强度的植物。在又一个实施方案中，本发明提供了用于鉴定植物中染色体A05上纤维强度基因 座的海岛棉等位基因或者用于区分染色体A05上纤维强度基因座的海岛棉等位基因与植 物中纤维强度基因座的陆地棉等位基因的试剂盒，所述植物优选地是棉属植物，如陆地棉 植物，该试剂盒包含用于确定与该纤维强度基因座连锁的标记物的海岛棉等位基因和/或 陆地棉等位基因在该植物基因组DNA中存在的引物和/或探针，所述的标记物选自由以 下标记物组成的组AFLP标记物P5M50-M126. 7、SSR标记物CIR280、SSR标记物BNL3992、 SSR标记物CIR401、SSR标记物NAU861、核苷酸序列的直向同源物中的多态性位点，所述 的核苷酸序列包含于SEQID N0:53中所示的跨度覆盖陆地棉GLUC1. IA基因的基因组 DNA序列中，和该植物的基因组DNA中GLUC1. IA基因的核苷酸序列中的多态性位点，如 位于与SEQ ID NO 5中第418至第4 核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP2、位于与SEQ ID NO 5中第573核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标 记物GLUC1. 1A-SNP3、位于与SEQ ID NO 5中第712核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的 SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5、位于与SEQ ID NO :5中第864核苷酸位置相对应的核苷酸位置 处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6或者位于与SEQ IDNO 5中第832核苷酸位置相对应的核 苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8。在一个方面，该试剂盒包含选自由以下引物组成的组中的至少两个引物和/或探 针在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 43和44的引物、在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 51和52的引物、在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 49和50的引物、在其3，最末端 分别包含SEQ ID NO :47和48的引物、在其3，最末端分别包含SEQ ID NO :45和46的引 物、在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 37和38的引物。
发明人已经进一步发现可以通过控制纤维发育的次生细胞壁合成阶段和成熟阶 段(本文统称为纤维强度建立阶段)期间在纤维中“功能性表达”的，即产生功能性(生物 学活性)内切_1，3-β-葡聚糖酶蛋白(GLUC)的内切-1，3-β-葡聚糖酶基因/等位基因的 数目来控制棉花植物中纤维的特性。通过消除纤维发育的纤维强度建立阶段期间、特别在 成熟阶段期间纤维中功能性表达的许多内切_1，3-β -葡聚糖酶基因/等位基因(如陆地 棉中的A亚基因组特异性内切-1，3-β-葡聚糖酶基因)的功能性表达，同时维持许多此类 内切-1，3-β -葡聚糖酶基因/等位基因(如陆地棉中D亚基因组特异性内切-1，3-β -葡 聚糖酶基因)的功能性表达，据信可以减少胼胝质的降解至导致更高纤维强度的水平，同 时维持足以获得工业相关的纤维长度的胼胝质降解水平。因此，在另一个方面，本发明提供非天然存在的产纤维植物及其部分和后代，其特 征在于纤维发育的纤维强度建立阶段、尤其纤维成熟阶段期间功能表达的至少一个纤维特 异性GLUC基因的至少一个等位基因的功能性表达消除。此类植物及其部分和后代可以用 于获得具有改变的胼胝质含量和/或改变的纤维特性的植物，特别用于获得产纤维植物， 其在纤维中具有优选地维持工业相关的纤维长度的增加的胼胝质含量和/或提高的纤维 强度。如本文中所用，“植物部分”包括从本发明植物衍生的任意物质，包括植物部分如细 胞、组织、器官、种子、纤维、种子脂肪或油。在一个实施方案中，GLUC基因是编码与SEQ ID NO :4具有至少90%序列同一性的 GLUC蛋白的GLUC1. 1基因。在另一个实施方案中，该植物是棉属植物，其中GLUC基因是编码与SEQ ID NO 4 具有至少97%序列同一性的GLUC蛋白的GLUC1. IA基因或编码与SEQ ID Ν0:10具有至少 97%序列同一性的GLUC蛋白的GLUC1. ID基因，优选地是GLUC1. IA基因。仍在另一个实施方案中，该植物是陆地棉植物。在又一个实施方案中，与至少一个GLUC等位基因的功能性表达未消除的植物中 纤维发育的纤维强度建立阶段、尤其纤维成熟阶段期间纤维中所产生的功能性GLUC蛋白 的量相比，功能性GLUC蛋白的量在该植物中纤维发育的纤维强度建立阶段、尤其纤维成熟 阶段期间的纤维中显著减少。仍在又一个实施方案中，与未消除至少一个GLUC等位基因功能性表达的植物内 纤维中的胼胝质含量相比，胼胝质含量在该植物的纤维中显著增加。在又一个实施方案中，与未消除至少一个GLUC等位基因功能性表达的植物中纤 维的强度相比，纤维的强度明显提高。在一个方面，纤维的强度平均是高约5%与约10%之 间、优选地高约7.5%。在另一个方面，纤维的强度平均是高约1.6g/teX与约3.3g/tex之 间、优选地高约2. 5g/tex。仍在另一个方面，纤维的强度平均是在约34. 6g/tex与约36. 3g/ tex之间。仍在又一个实施方案中，该植物是特征在于至少一个纤维特异性GLUC基因的至 少两个等位基因的功能性表达被消除的陆地棉植物。在另一个实施方案中，本发明提供从第40至47段任一段所述的产纤维植物可获 得的纤维。在又一个实施方案中，本发明提供核酸分子，其编码具有以下氨基酸序列的无功 能GLUC1. 1蛋白，在所述氨基酸序列中与SEQ ID NO :4的GLUC1. 1蛋白的活性中心残基相似或与其糖基化位点残基相似的至少一个氨基酸残基缺少或被替换为不相似的氨基酸残基。 在一个方面，SEQID NO 4的GLUC1. 1蛋白的活性中心残基选自由Tyr48、Glu249, Trp252 和Glu308组成的组，并且其中SEQ ID NO 4的GLUCl. 1蛋白的糖基化位点残基是Asn202。 在另一个方面，无功能GLUC1. 1蛋白包含与SEQ IDNO :6、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO 57或 SEQ ID NO :22的氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列。在另一个方面，该核酸分子包含 与SEQ IDNO 3从第101至第1078位核苷酸具有至少92%序列同一性的核酸序列，其中至 少一个核酸残基被缺失、插入或替换。又在另一个方面，该核酸分子包含与SEQ ID N0:54 从第50至第589位核苷酸的核酸序列至少92%同一的核酸序列。仍在其他方面，该核酸 分子包含与SEQ ID NO 54从第50至第589位核苷酸的核酸序列。仍在另一个方面，该核 酸分子包含与SEQ ID NO :1从第2410至第3499位核苷酸具有至少92%序列同一性的核 酸序列，其中至少一个核酸残基被缺失、插入或替换。又在另一个方面，该核酸分子包含与 SEQ ID NO 5从第63至第711位核苷酸、SEQ ID NO 17从第2至第472位核苷酸、SEQ ID NO 56从第112至第760位核苷酸或SEQ ID NO 21从第27至第372位核苷酸的核酸序列 至少92%同一的核酸序列。仍在其他方面，该核酸分子包含SEQ ID NO 5从第63至第711 位核苷酸、SEQ ID NO 17从第2至第472位核苷酸、SEQ ID NO 56从第112至第760位核 苷酸或SEQ ID NO 21从第27至第372位核苷酸的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供由第49段的核酸分子编码的无功能GLUC1. 1蛋白。仍在另一个实施方案中，本发明提供了用于鉴定植物中编码无功能GLUC1. 1蛋白 的GLUC1. 1基因的方法，所述植物优选地是棉属植物，如陆地棉植物，所述的GLUC1. 1基因 包含与SEQ ID NO 1从第MlO至第3499位核苷酸具有至少92%序列同一性的核酸序列， 包括步骤在导致无功能GLUC1. 1蛋白产生的植物的基因组DNA中鉴定GLUC1. 1基因的核 苷酸序列中的多态性位点。在一个方面，本发明提供了用于鉴定来自海岛棉或来自达尔文 棉的GLUC1. 1基因的方法，包括步骤在与SEQ IDNO 1中第3050核苷酸位置相对应的核苷 酸位置处鉴定T核苷酸。在另一个方面，本发明提供了用于鉴定来自树棉的GLUC1. 1基因 的方法，包括步骤鉴定C核苷酸在与SEQ ID N0:1中第沈74、第沈75或第沈76核苷酸位 置相对应的核苷酸位置处缺失。在又一个实施方案中，本发明提供了区分编码无功能GLUC1. 1蛋白的GLUC1. 1基 因与编码功能性GLUC1. 1蛋白的GLUC1. 1基因的方法，所述的GLUC1. 1基因均包含与SEQ ID NO 1从第MlO至第3499位核苷酸具有至少92 %序列同一性的核酸序列，该方法包 括鉴定所述GLUC1. 1基因的核苷酸序列中多态性位点的步骤。在一个方面，本发明提供了 分别区分来自海岛棉、来自达尔文棉或来自树棉的GLUC1. 1基因与来自陆地棉的GLUC1. 1 基因，包括鉴定选自由以下标记物组成的组中多态性位点的步骤位于SEQ ID N0:1中第 2765和第2766位置处核苷酸之间的多态性序列标记物GLUC1. 1A-SNP2、位于SEQ ID NO 1中第四11核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3、位于SEQ ID NO 1中第3050核 苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5、位于SEQ ID NO=I中第3202核苷酸位置处的 SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6、位于SEQ IDNO 1中第洸74、第洸75或第洸76核苷酸位置处 的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP7，和位于SEQ ID NO 1中第3170核苷酸位置处的SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP8。在另一个方面，通过用在其3’最末端分别包含SEQ ID NO :37和38的引物
19分别扩增到约143bp和约134bp的DNA片段来检测分别来自海岛棉或达尔文棉和来自陆地 棉的多态性序列标记物GLUC1. 1A-SNP2。仍在另一个方面，分别通过用包含SEQ ID NO 41 和42的引物扩增到约57bp的DNA片段和用包含SEQ ID NO 39和40的荧光标记探针检测 该DNA片段而分别检测来自海岛棉或达尔文棉和来自陆地棉的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3。在又一个实施方案中，本发明提供了用于产生和/或选择非天然存在的产纤维植 物及其部分和后代的方法，其中在纤维发育的纤维强度建立阶段、尤其纤维成熟阶段期间 功能表达的至少一个纤维特异性GLUC基因的至少一个等位基因的功能性表达被消除，该 方法包括步骤诱变该GLUC基因的至少一个等位基因，或渐渗该GLUC基因的无功能表达的 直向同源物的至少一个等位基因或诱变的GLUC基因的至少一个等位基因，或导入包含以 下有效连接的DNA元件的嵌合基因(a)植物可表达启动子，(b)转录的DNA区域，其转录时 产生能够减少GLUC等位基因表达的抑制性RNA分子，和(c)3’末端区域，其包含在该植物 的细胞中有功能的转录终止与多腺苷酸化信号。在一个方面，该GLUC基因是编码与SEQ ID NO :4具有至少90%序列同一性的GLUC蛋白的GLUC1. 1基因。在另一个方面，产纤维植物是 棉属植物，并且该GLUC基因是编码与SEQ ID NO 4具有至少97%序列同一性的GLUC蛋白 WGLUCL Α基因或编码与SEQ IDNO :9具有至少97%序列同一性的GLUC蛋白的GLUCI. ID 基因，优选地是GLUCl. IA基因。仍在另一个方面，产纤维植物是棉属植物，并且该GLUC基 因的无功能表达的直向同源物是从海岛棉、从达尔文棉或树棉植物、优选地从海岛棉衍生 的GLUCl. IA基因。在又一方面，该方法还包括步骤根据第51段的方法鉴定GLUC基因或 诱变的GLUC基因的无功能表达的直向同源物。在又一个实施方案中，本发明提供了用于改变产纤维植物中纤维的胼胝质含量、 尤其增加纤维的胼胝质含量的方法，包括步骤根据第53段的方法产生和/或选择非天然 存在的产纤维植物及其部分和后代，其中在纤维发育的纤维强度建立阶段、尤其纤维成熟 阶段期间功能表达的至少一个纤维特异性GLUC基因的至少一个等位基因的功能性表达被 消除，并且选择其纤维中具有改变的胼胝质含量、尤其增加的胼胝质含量的植物。在又一个实施方案中，本发明提供了用于改变产纤维植物中纤维的特性、尤其提 高纤维强度的方法，包括步骤根据第53段的方法产生和/或选择非天然存在的产纤维植 物及其部分和后代，其中在纤维发育的纤维强度建立阶段、尤其纤维成熟阶段期间功能表 达的至少一个纤维特异性GLUC基因的至少一个等位基因的功能性表达被消除，并且选择 其纤维中具有改变的纤维强度、尤其提高的纤维强度的植物。在又一个实施方案中，本发明提供了用于鉴定植物中编码无功能GLUCl. 1蛋白的 GLUCl. 1基因的试剂盒，所述的GLUCl. 1基因包含与SEQ ID NO 1从第MlO至第3499位 核苷酸具有至少92%序列同一性的核酸序列，所述试剂盒包含引物和/或探针，它们用于 确定植物的基因组DNA中存在导致无功能GLUCl. 1蛋白产生的GLUCl. 1基因的核苷酸序 列中的多态性位点。在一个方面，该试剂盒包含用于确定T核苷酸在与SEQ ID N0:1中第 3050核苷酸位置相对应的核苷酸位置处存在或者用于确定C核苷酸在与SEQ ID NO :1中 第沈74、第沈75或第沈76核苷酸位置相对应的核苷酸位置处缺失的引物和/或探针。仍在另一个实施方案中，本发明提供了区分编码无功能GLUCl. 1蛋白的GLUCl. 1 基因与编码功能性GLUCl. 1蛋白的GLUCl. 1基因的试剂盒，所述的GLUCl. 1基因均包含与 SEQ ID NO 1从第MlO至第3499位核苷酸具有至少92%序列同一性的核酸序列，该试剂盒包含用于确定多态性位点存在于所述GLUC1. 1基因的核苷酸序列中的引物和/或探 针。在一个方面，本发明提供试剂盒，其包含用于分别区分海岛棉、达尔文棉或树棉特定等 位基因与陆地棉特定等位基因的多态性位点的的引物和/或探针，所述的多态性位点选自 由以下标记物组成的组位于SEQ ID NO 1中第2765和第2766位置处核苷酸之间的多态 性序列标记物GLUC1. 1A-SNP2、位于SEQ ID NO 1中第四11核苷酸位置处的SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP3、位于 SEQ ID NO 1 中第 3050 核苷酸位置处的 SNP 标记物 GLUC1. 1A-SNP5、 位于SEQ ID NO 1中第3202核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6、位于SEQ ID NO 1中第洸74、第洸75或第洸76核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP7和位于SEQ ID NO :1中第3170核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8.在另一个方面，该试剂盒包含 选自由以下对象组成的组中的至少两个引物和/或探针在其3’最末端分别包含SEQ ID NO :37和38以鉴定多态性序列标记物GLUC1. 1A-SNP2的引物、分别包含SEQ ID N0:41和42 以鉴定SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3的引物、分别包含SEQ ID NO 39和40以鉴定SNP标记 物GLUC1. 1A-SNP3的探针、分别包含SEQ ID NO :62禾日63以鉴定SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5 的引物，和分别包含SEQ ID NO 60和61以鉴定SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5的探针。
附图
简述图 1 来自陆地棉(‘GhGLUCl. lA-gDNA，与 SEQ ID NO 1 从第 2246 至第 3753 位 核苷酸相对应，iGhGLUCl. lA-cDNA，与 SEQ ID NO 3 相对应，iGhGLUCl. lD-gDNA，与 SEQ ID NO 7从第3206至第4694位核苷酸相对应，并且iGhGLUCl. lD-cDNA，与SEQ ID NO 9相对 应)和海岛棉(iGbGLUCl. lA-gDNA，与 SEQ ID NO 5 相对应，iGbGLUCl. lA-cDNA，与 SEQ ID NO 54 相对应，iGbGLUCl. lD-gDNA，与 SEQ ID NO 11 相对应，并且 ‘GbGLUCl. ID-cDNA， 与SEQ ID NO 13相对应)的A和D亚基因组特异性GLUC1. 1基因的基因组和cDNA序列的 比对。推定的TATA框以粗体字指示，推定的起始密码子和推定的第一外显子分别以粗体字 和以粗体字用箭头指示，推定的内含子序列和第二外显子序列用箭头规律地指示，推定的 内含子序列在‘/’之间进一步指示，推定的(提早)终止密码子以斜体字指示并下划标出。图 2 来自陆地棉(iGhGLUCl. 1A，与 SEQ ID NO 2 和 4 相对应并且 iGhGLUCl. 1D， 与SEQ ID NO 8和10相对应)和海岛棉(‘GbGLUCl. 1A，与SEQ ID NO 6和55相对应并 且‘GbGLUCl. ID，与SEQID NO :12和14相对应)的A和D亚基因组特异性GLUC1. 1蛋白的 氨基酸序列的比对。推定的信号肽以斜体字指示，将推定的翻译后剪接位点显示为‘><’， GH17标签以粗体字指示。突出显示在这四个序列中至少三个序列之间相同的氨基酸。虚线 显示(ibGLUCl. IA中丢失的蛋白质区段。图3 基于大麦1，3-1，4- β -葡聚糖酶的X射线结构(IaqO ；图3a和b ；左)，陆地 棉(图3a ；右)和海岛棉(图北；右)的GLUC1. IA蛋白的蛋白质模型。IaqO的活性中心 位于由桶内平行β-折叠链的羧基端所限定桶的底部处的开放裂隙中(MUller等人，1998， J. Biol. Chem 273(6) :3438-3446)并由氨基酸指示氨基酸，并且这些氨基酸的位置编号在 图3a和b左侧的IaqO蛋白质模型的左上部分显示。IaqO(图3a，左)中的活性中心残 基 Glu288, Glu232 和 Tyr33 与 GhGLUCl. IA (图 3a，右)中的 Glu308、Glu249 和 Tyr48 相 对应并且不存在于(GbGLUCl. IA(图北，右)中。IaqO(图3A，左)中的糖基化位点Asnl90 与GhGLUCl. IA (图3a，右)中的Asn 202相对应并且也不存在于(ibGLUCl. IA (图北，右)中。图北进一步显示了在(ibGLUCl. IA(图北；右)的第82、第83和第84位置处不存在于 GhGLUCl. IA中的苏氨酸、组氨酸和谷氨酰胺(见例如图7)位于一个远处环中，其中所述的 环不是该活性中心的部分并且不参与糖基化。图4 显示未处理的纤维(‘未处理’)和用外源葡聚糖酶处理的纤维(‘处理’) 之间纤维强度上差异的箱线图(如通过测量单一纤维的断裂力所确定；在Y轴上以CN表 示)，所述纤维衍生自陆地棉栽培品种FM966，为欧洲在温室中培育的(‘FM966Astene’ )、 美国在田间培育的(‘FM966kllers，)和澳大利亚在田间培育的(‘FM966Australia，)； 衍生自陆地棉栽培品种Coker312，为欧洲在温室中培育的(‘Coker 312’)；衍生自海岛棉 栽培品种PimaS7，为欧洲于温室中培育的(‘PimaS7’)；和衍生自海岛棉栽培品种PimaY5， 为澳大利亚在田间培育的(‘Pimay5’)。图5 显示未处理的纤维(‘未处理’)和用外源葡聚糖酶处理的纤维(‘处理’) 之间胼胝质含量上差异的箱线图(如通过苯胺蓝染色纤维的荧光度量所确定；在Y轴上显 示为绿色荧光对蓝色荧光的比)，所述纤维衍生自陆地棉栽培品种FM966，为欧洲在温室中 培育的(‘FM966 Astene')、美国在田间培育的(‘FM966 Sellers')和澳大利亚在田间 培育的(‘FM966Australia’)；衍生自陆地棉栽培品种Coker312，为欧洲于温室中培育的 (iCoker 312，)；衍生自海岛棉栽培品种PimaS7，为欧洲于温室中培育的(‘PimaS7，)；和 衍生自海岛棉栽培品种PimaY5，为澳大利亚在田间培育的(‘PimaY5’)。图 6 来自陆地棉(‘GhGLUCl. lA_gDNA，与 SEQ ID NO 1 从第 2348 至第 3554 位 核苷酸相对应并且“(ihGLUCl. lD_gDNA，与SEQ IDNO 7从第3311至第4496位核苷酸相对 应)、毛棉(Gossypiumtomentosum) ( iGtGLUCl. lA_gDNA，与 SEQ ID NO 15 相对应，并且 iGtGLUCl. lD_gDNA，与 SEQ ID NO 25 相对应)、海岛棉(‘GbGLUCl. lA_gDNA，与 SEQ ID NO 5 相对应，并且 ‘GbGLUCl. lD_gDNA，与 SEQ ID NO :11 相对应)、达尔文棉(‘GdGLUCl. 1A_ gDNA，与 SEQ ID NO 17 相对应，并且 ‘GdGLUCl. lD_gDNA，与 SEQ ID NO :27 相对应)、黄褐棉 (Gossypiummustelinum) (iGmGLUCl. lA_gDNA，与 SEQ ID NO 19 相对应，并且 ‘GmGLUCl. 1D_ gDNA，与 SEQ ID NO :29 相对应)、树棉(iGaGLUCl. lA_gDNA，与 SEQ ID NO :21 相对应)、草 棉(‘GheGLUCl. lA_gDNA，与 SEQ ID NO :23 相对应)和雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii) (iGrGLUCl. lD_gDNA，与SEQ ID NO :31相对应)的A和D亚基因组特异性GLUC1. 1基因的 基因组DNA序列的比对。下划标出用来产生从起始密码子至终止密码子的完整编码序列的 弓I物SE077和SE078的位置以及用来产生部分编码序列的引物SE003和SE002的位置。推定 的起始密码子和推定的第一外显子分别以粗体字和以粗体字用箭头指示，推定的内含子序 列和第二外显子序列用箭头规律地指示，推定的内含子序列在‘/’之间进一步指示，推定的 (提早)终止密码子以斜体字指示并下划标出。存在于例如陆地棉FM966和海岛棉Pima S7 或达尔文棉的GLUC1. IA或GLUC1. ID序列之间5个多态性位点G个单核苷酸多态性(SNP) 和一个延伸的插入/缺失))以箭头指示并命名为‘GLUC1. ID-SNPl，和‘GLUC1. 1A-SNP2、 3、5和6’。等位基因变体显示如下[陆地棉等位基因/海岛棉或达尔文棉等位基因]。存 在于例如陆地棉FM966和树棉的GLUC1. IA序列之间的一个多态性位点(1个SNP)以箭头 指示并命名为‘GLUC1. 1A-SNP7’。等位基因变体显示如下[陆地棉等位基因/树棉等位基 因]。存在于例如海岛棉Pima S7或达尔文棉的GLUC1. IA序列之间的一个多态性位点(1 个SNP)以箭头指示并命名为‘GLUC1. 1A-SNP8’。等位基因变体显示如下[海岛棉等位基因/达尔文棉等位基因]。图7 来自陆地棉(‘GhGLUCl. lA_prot，与SEQ ID NO 2和4相对应，并且 iGhGLUCl. lD_prot，与 SEQ ID NO 8 禾Π 10 相对应；全长序列)、毛棉(‘GtGLUCl. lA_prot' 与SEQ ID NO 16相对应，并且‘GtGLUCl. lD_prot，与SEQ ID NO :26相对应；部分序列)、 海岛棉(iGbGLUCl. lA_prot，与 SEQ ID NO 6 和 55 相对应，并且 GbGLUCl. lD_prot，与 SEQ ID NO 12和14相对应；全长序歹Ij )、达尔文棉(iGdGLUCl. lA_prot，与SEQ ID NO 57相对 应，并且 iGdGLUCl. lD_prot，与 SEQ ID NO 59 相对应；全长序列)、黄褐棉(iGmGLUCl. 1A_ prot'与 SEQ ID NO 20 相对应，并且 iGmGLUCl. lD_prot，与 SEQ ID NO 30 相对应；部分序 列)、树棉(‘GaGLUCl. lA_prot’ 与 SEQ ID NO :22 相对应；全长序列)、草棉(‘GheGLUCl. 1A_ prot'与SEQ ID NO :24相对应；全长序列)和雷蒙德氏棉(GrGLUCl. lD_prot，与SEQ ID NO :32相对应；部分序列)的A和D亚基因组特异性GLUC1. 1蛋白的氨基酸序列的比对。推 定的信号肽以斜体字指示，将推定的翻译后剪接位点显示为‘><’，GH17标签以粗体字指 示。突出显示与上部序列即(ihGLUCl. lA_prot中氨基酸不同的氨基酸。图8 :GLUC1. IA和GLUC1. ID在海岛棉中的表达。提取来自海岛棉的(发育中) 纤维的cDNA文库的DNA并使之均衡(equalized)。PCR片段使用寡核苷酸引物SE002和 SE003 (SEQ ID No 35和36)扩增并且用限制酶AlwI消化。GLUC1. IA的PCR扩增产物产生3 个片段079bp+118bp+59bp)，而GLUC1. ID的PCR扩增产物仅产生2个片段(538bp+118bp)。 泳道 1 和 12 Ikb 大小标记物；泳道 2 至 9 在 0，5，10，15，20，25，30 和 40DPA 时 GbGLUCl. IA 表达和GbGLUCl. ID表达；泳道10 阴性(无模板；NTC)；泳道11 阳性对照(来自Pima S7 的基因组DNA)。图9 跨度覆盖陆地棉GLUC1. IA基因的165250bps DNA片段(SEQ ID NO 53)示意 图。框逆转录转座子区域；* :CIR280同源性区域的位置；箭头编码用以下缩写所示蛋 白质的DNA片段SHMT (丝氨酸羟甲基转移酶)；GrpE/HSP-70(GrpE蛋白/HSP-70辅因子)； ARF17 与At-ARF17相似的推定的植物生长素应答因子；eIF_5_l 可能的真核翻译起始因 子F因子5-1 ；Avr9 推定的Avr9激发子应答蛋白；VPS9 与液泡蛋白分选相关蛋白VPS9相 似；HAT 推定的组蛋白乙酰转移酶基因；Glucl. 1 =GLUCl. IA编码区；MEKKl 推定的有丝分 裂原激活的蛋白激酶激酶激酶1 ；PIP5K1 磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶1。
详述的实施方案本发明基于以下出乎意料的发现与包含纤维强度基因座的陆地棉直向同源物的 陆地棉植物的纤维强度相比，陆地棉植物中染色体A05上纤维强度基因座的海岛棉直向同 源物的存在导致该陆地棉植物的纤维强度提高。因此，在第一方面，本发明提供非天然存在的棉属植物及其部分和后代，其包含位 于染色体A05上的纤维强度的数量性状基因座^TL)的至少一个优异等位基因。如本文中所用，术语“非天然存在的”或“栽培的”当谈及植物使用时，意指具有已 经被人修饰过的基因组的植物。转基因产纤维植物例如是非天然存在的产纤维植物，该植 物含有外源核酸分子，例如，包含转录区域的嵌合基因，其中所述的转录区域在转录时产生 了能够减少本发明GLUC基因表达的生物学活性RNA分子，并且因此已经被人遗传地修饰。 此外，将因暴露于诱变剂而在内源GLUC基因中(例如在调节元件或在编码序列中)含有例如突变的产纤维植物也视为非天然存在的产纤维植物，因为它已经被人遗传地修饰。另外， 将某个特定物种(如陆地棉)的在内源GLUC基因中含有例如天然不在这个特定植物物种 中存在的下述突变的产纤维植物也视为非天然存在的产纤维植物，其中所述的突变因采用 产纤维植物的另一个物种(如海岛棉)的例如定向育种方法(如标记物辅助育种和选择或 渐渗法)所致。相反，仅含有自发或天然存在突变的产纤维植物，即没有被人遗传地修饰过 的植物不是如本文中定义的"非天然存在植物"，并且因此不包含在本发明内。本领域技 术人员理解尽管非天然存在的产纤维植物一般具有与天然存在的产纤维植物相比被改变 的核苷酸序列，然而非天然存在的产纤维植物也可以被人遗传地修饰，而不改变其核苷酸 序列，例如通过修饰其甲基化模式。术语“数量性状”在本文中指性状，如纤维强度，其表型特征在程度上不同并可以 归因于两个或多个基因与其环境之间的相互作用。如本文中所用，术语“基因座(locus)，，(复数形式是loci)或“位点”意指染色体 上例如存在基因、遗传标记物或QTL的一个或多个特定位置。“数量性状基因座(QTL)，，是与决定所讨论性状的基因紧密连锁的一段DNA (如染 色体臂、染色体区、核苷酸序列、基因等)。“QTL作图”涉及使用遗传标记物或分子标记物 如AFLP、RAPD, RFLP, SNP、SSR等、可视多态性和等位基因酶产生基因组图谱并确定该基因 组上的特定区域与目的性状的遗传性的关联程度。由于所述标记物不是必需涉及基因，故 QTL作图结果涉及一段DNA与性状的关联程度，而非直接指向负责该性状的基因。使用不同 的统计方法来确定该关联程度是否显著。如果一个分子标记物和某基因或基因座在遗传性 上具有比本应从独立分配所期望那样更大的关联性，则称该分子标记物与此基因或基因座 连锁，即该标记物和此基因座在分离群体中共分离并且位于相同的染色体上。“连锁”指该 标记物与此基因座或基因(或两个基因座或两个标记物相互)的遗传距离。连锁越接近， 使该标记物与此基因或基因座分离的重组事件发生的可能性越小。遗传距离(图距)从重 组频率计算并用厘摩尔根(cM)表示[Kosambi (1944)，Ann. Eugenet. 12 :172-175]。如本文中所用，“纤维强度基因座”或“强度基因座”指棉属物种的染色体A05上同 参与调节纤维强度的基因紧密连锁的一段DNA。“纤维强度基因座”是所述与“(纤维强度) 因果基因”连锁的QTL。如本文中所用，“纤维”，如“棉花纤维”，指产纤维植物(如棉花)的种毛、更具体 地是单个细胞，其在开花或恰在此前从胚珠外珠被的表皮启动。已经充分记录了棉花纤维 的形态发育(Basra 和 Malik，1984，Int Revof Cytology 89 :65-113 ;Graves 和 Mewart， 1988，见上文；Ramsey 禾口 Berlin，1976，American Journal of Botany 63(6) :868-876; Ruan 禾口 Chourey，1998，Plant Physiology 118 :399-406 ；Ruan 等人 2000，Aust. J. Plant Physiol. 27 :795-800 ；Stewart, 1975，Am. J. Bot. 62，723-730)。棉花纤维，尤其来自陆地 棉的棉花纤维，经历4个重叠的发育阶段纤维细胞启动、延伸、次生细胞壁生物合成和成 熟。纤维细胞启动是一个快速过程。白色绒纤维在开花后立即开始发育并持续直至开花后 (DPA)约3日，继之是纤维细胞延伸(直至约10至约17DPA)。取决于生长条件，次生细胞壁 生物合成启动并继续至约25至约40DPA，继而是成熟过程直至约45至约60DPA。次生细胞 壁合成阶段和成熟阶段在本文统称为“纤维强度建立阶段”。仅约25至30%的表皮细胞分 化成商业重要的棉绒纤维(Kim和Triplett，2001)。大部分细胞不分化成纤维或发育成短纤维或绒毛。在纤维延伸和次生壁代谢期间，纤维细胞快速伸长，合成次生壁组分并显示巨 大的细胞改变、分子改变和生理改变。纤维延伸与细胞快速生长及膨大(Seagull，1991，在 Biosynthesis and biodegradation of cellulose (Haigler, C. H.禾口 Weimer, P. J.,编著) 第1432163页，MarcelDekker，New York)和恒定合成大量细胞代谢物和细胞壁组分(如纤 维素)偶联。成熟棉花纤维中约95%的干重是纤维素(Pfluger和Zambryski，200ItCurr Biol 11 :R436-R439 ;Ruan 等人，2001，Plant Cell 13:47-63)。非细胞样组分对纤维细胞 发育也是重要的(Hayashi 和 Delmer，1988，Carbohydr. Res. 181 :273-277 ；HuwyIer 等人， 1979，Plantal46 :635-642 ；Meinert 禾口 Delmer，1977，Plant Physiol 59 :1088-1097 ；Peng 等人，2002，kience 295:147-150)。与其他植物细胞相比，棉花纤维不在次生壁中含有木 质素，但是具有认为与细胞快速生长和膨大相关的大液泡(Basra和Malik，1984，见上文； Kim 和 Triplett，2001，Plant Physiology 127 :1361-1366 ；Mauney，1984，见上文；Ruan 和 Chourey，1998，见上文；Ruan 等人，2000，见上文；Van Hof，1999，American Journal of Botany86 :776-779)。如本文中所用，“纤维强度”可以通过确定一束纤维的强度即“纤维束强度”或通 过确定单根纤维的强度来确定。单根纤维强度越高并且单根纤维断裂延伸性的变异越低， 则纤维束越紧密，并且纱线抗拉强度将是单根纤维强度的总和；理想地，纤维束韧度会等于 总的单根纤维断裂韧度，如果该束范围内的全部纤维具有相等的断裂延伸性并且没有松弛 (Liu 等人，2005 年 2 月，Textile Res. J)。如本文中所用，“纤维束强度”指通常以克/特表述的一种度量单位。纤维束强度 的这种商业性大容量棉纤维测试仪(HVI)度量单位(“HVI强度”)也叫作“韧度”。一个特 单位等于1，000米纤维的以克计的重量。因此，所报道的强度是使大小1个特单位的一束 纤维断裂所要求的以克计的力。例如可以根据USDA标准进行棉花纤维束强度的测量。将 一撮棉花夹在相距八分之一英寸的两组夹持器夹口中，并且确定断裂纤维所要求的力。表 1可以用作解读纤维强度测量的指南。表1 :HVI纤维强度测量的解读
强度的程度HVI *强度(克/特)很强的31或更大强的29-30平均的26-28中等的24-25弱的23或更小
*大容量精确测试仪备选地，可以通过例如在 FAVIMAT Robot (Textechno)上如 http //www. textechno. com/上和实施例中所述开展单根纤维拉伸试验，通过确定“单根纤维强度”来比 较纤维的强度。简而言之，将单根纤维夹在两个纤维夹持器之间，可连续调节量规长度在5 和IOOmrn之间(设定在例如8mm上)和拉断(draw-off)夹持器速度在0. 1和IOOmm/分钟之间(设定在例如4mm/分钟)，并且确定断裂纤维所要求的力(“断裂力”)(cN)。可以在 实施例中找到具体棉花品种的平均断裂力。如本文中所用，“染色体A05”指A基因组二倍体棉属植物(如草棉或树棉)或AD 异源四倍体棉属植物(如陆地棉、海岛棉和达尔文棉)中(根据Wang等人，2006，Theor Appl Genet 113(1) :73-80编号)的染色体A05。在一个实施方案中，棉属植物是包含根据 Wang 等人(2006, Theor Appl Genetl 13(1) :73-80)编号为 AOl 至 A13 的 13 对 A 基因组染 色体的A基因组二倍体棉属植物，如草棉或树棉。在另一个实施方案中，棉属植物是包含根 据Wang等人(上文)分别编号为AOl至A13和DOl至D13的13对A基因组和13对D基 因组染色体的AD基因组异源四倍体棉属植物，如陆地棉、海岛棉和达尔文棉。在一个实施方案中，非天然存在的棉属植物是陆地棉、草棉或树棉植物，优选地是 陆地棉植物，并且纤维强度基因座的优异等位基因从海岛棉衍生。海岛棉、尤其海岛棉栽培品种Pima S7、种子是公开可获得的并且可以例如从棉花 保藏中心(USDA，ARS，Crop Germplasm Research，2765F&B Road，College Station, Texas 77845 ；http://www. ars-grin. gov/)获得。术语纤维强度基因座的“优异等位基因”在本文中指纤维强度基因座的等位基因， 其中与不包含优异等位基因(即包含非优异等位基因)的这种产纤维植物中的纤维强度相 比，该等位基因在产纤维植物的基因组中的存在导致更高的纤维强度。如本文中所用，术语“等位基因”意指基因或标记物在特定基因座处的或数量性状 基因座(QTL)的任意一个或多个可变形式。在生物的二倍体或异源四倍体(双二倍体)细 胞中，给定基因、标记物或QTL的等位基因位于染色体上的特定位置或一个或多个基因座 处。一个等位基因存在于成对同源染色体的每条染色体上。如本文中所用，术语“同源染色 体”意指这样的染色体，它们含有相同生物学特征的信息并且含有在相同的基因座和相同 的数量性状基因座处的相同基因或标记物，但可能含有这些基因、标记物或数量性状基因 座的不同等位基因。同源染色体是减数分裂期间配对的染色体。代表某生物全部生物学特 征的“非同源染色体”形成一个组，并且细胞中的组数目称作倍性。二倍体生物含有两组非 同源染色体，其中每条同源染色体遗传自不同的亲本。在异源四倍体(双二倍体)物种如 棉花中，实质上存在两组二倍体基因组，因此这两个基因组的染色体称作“同源染色体”(并 且类似地，这两个基因组的基因、标记物和基因座称作同源基因、标记物或基因座)。二倍体 或异源四倍体(双二倍体)植物物种可以在特定基因座处包含巨大数目的不同等位基因。术语某种基因或蛋白质或QTL的“直向同源物”在本文中指另一个物种中存在的 同源基因或蛋白质或QTL，其具有与所述基因或蛋白质或QTL相同的功能，但是(通常)依 次从下述时间点趋异，其中在所述时间点上携带所述基因或数量性状基因座的物种趋异 (即所述基因或数量性状基因座因物种形成作用从共同祖先进化)。例如海岛棉GLUC基因 或纤维强度基因座的直向同源物因此可以在其他植物物种(例如树棉、达尔文棉等)中基 于两个序列的比较(例如基于全序列范围或特定区域范围内的序列同一性百分数)和/或 功能分析来鉴定。在一个实施方案中，纤维强度基因座的优异等位基因是从海岛棉、尤其海岛棉栽 培品种PimaS7可获得的，即，与不包含该海岛棉等位基因，但包含例如陆地棉等位基因的 棉属植物(如陆地棉植物)中的纤维强度相比，海岛棉纤维强度等位基因在该棉属植物如陆地棉植物中的存在导致提高的纤维强度。仍在另一个实施方案中，该海岛棉纤维强度等位基因位于海岛棉的染色体A05上 的AFLP标记物P5M50-M126. 7与SSR标记物CIR280之间。在另一个实施方案中，该海岛棉 纤维强度等位基因位于海岛棉的染色体A05上的AFLP标记物P5M50-M126. 7与SSR标记物 BNL3992之间。又在另一个实施方案中，该海岛棉等位基因位于海岛棉的染色体A05上的 AFLP标记物P5M50-M126. 7与SSR标记物CIR401c之间。在又一个实施方案中，海岛棉的 纤维强度QTL等位基因的LOD峰值位于SSR标记物NAU861或GLUC1. 1标记物与SSR标记 物CIR401c之间，特别在距SSR标记物NAU861或GLUC1. 1标记物约0至5cM处，更具体地 在约4cM处、尤其在约4. 008cM处，和在距SSR标记物CIR401c约0至12cM，更具体地在约 IOcM处，尤其在约10. 52cM处。如本文中所用，“(遗传或分子)标记物”指在特定基因座处的多态性基因座，即多 态性核苷酸(所谓单核苷酸多态性或SNP)或多态性DNA序列。标记物指在基因组中具有固 定位置的可测量遗传特征，其通常以孟德尔方式遗传并且可以用于对目的性状作图。例如， 将纤维强度性状标记物在海岛棉的染色体A05上作图为尤其位于标记物的P5M50-M126. 7 与(1似80、P5M50-M126. 7 与 BNL3992、P5M50-M126. 7 与 CIR401 之间，并与标记物 NAU861， GLUC1. 1和其他标记物连锁，如实施例中例如表6中所示。因此，遗传标记物可以是短DNA序 列，如围绕单个碱基对即单核苷酸多态性或SNP的序列；或是长DNA序列，如微卫星或简单 序列重复(SSR)。标记物的本质取决于所用的分子分析法并可以在DNA、RNA或蛋白质水平 检测。遗传作图可以使用分子标记物，如但不限于RFLP(限制性片段长度多态性；Botstein 等人(1980)，Am J Hum Genet 32 :314-331 ;Tanksley 等人(1989)，Bio/technology 7 257_263)、RAPD[随机扩增的多态性 DNA ;Williams 等人(1"0)，NAR 18 :6531-6535], AFLP [扩增片段长度多态性；Vos等人(1995) NAR 23 :4407-4414]、SSR或微卫星[Tautz等 人(1989)，NAR 17 :6463-6471]进行。适宜的引物或探针由所用作图方法决定。术语"AFLP ”(AFLP 是荷兰 KeyGene N. V.，Wageningen 的注册商标)、 "AFLP分析”和"AFLP标记物”根据标准术语[Vos等人(1995)，NAR23 =4407-4414 ； EP0534858 ；http://www. keygene. com/keygene/techs-apps/ 使用]。简而言之，AFLP 分析 是借助PCR扩增检测多个DNA限制性片段的DNA指纹技术。AFLP技术通常包括以下步骤 i)用两种限制酶、优选六聚体切割酶和八聚体切割酶如EcoRI、PstI和MseI限制性消化 DNA ； (ii)将双链接头如EcoRI JstI和MseI接头连接至限制性片段的末端；(iii)使用互 补于所述接头和限制位点序列的两条引物扩增所述限制性片段的亚群并通过1至3个“选 择性”核苷酸在其3'末端延伸，即通过使用延伸进入限制性片段的引物实现选择性扩增， 从而扩增这些片段，在所述片段中引物延伸部分匹配在所述限制性位点侧翼分布的核苷 酸。AFLP引物因此具有特定序列并且每条AFLP引物具有专门代码(引物代码及其序列可 以在 Keygene 网站 http //www. keyRene. com/keyRene/pdf/PRIMERCO. pdf 上找到；该文献 通过引用的方式并入本文)；(iv)扩增的限制性片段在变性凝胶板或毛细管上进行凝胶电 泳；(ν)借助放射自显影、磷成像术或其他方法观察DNA指纹。使用这种方法，可以在不知道 核苷酸序列的情况下通过PCR观察成组的限制性片段。如本文中所用，AFLP标记物是具有 特定大小的DNA片段，它通过实施AFLP分析而产生并作为凝胶上的条带被看到。每个AFLP 标记物由用来扩增它的引物组合命名，后附所扩增DNA片段的大致长度(以碱基对计)，例如P5M50-M126. 7指AFLP引物组合P05 (或Keygene代码Pl 1，它是带有额外核苷酸AA的 PstI引物；见表2、和M50(它是带有额外核苷酸CAT的MseI引物；见表幻，该引物组合在 海岛棉中的使用产生126. 7bp的扩增DNA片段(见表2)。应当理解这些片段的大小可以根 据实验室条件和所用设备略微变动。本文中每次通过提到引物组合和片段的具体大小指称 AFLP标记物时，应当理解这种大小是约略的并且包含或意图包括不同实验室中观察到的轻 微变动。每个AFLP标记物代表基因组中的某个基因座。术语“SSR”指简单序列重复或微卫星[Tautz等人(1989)，NAR17 :6463-6471]。短 的简单序列段作为高度重复性元件出现在全部真核基因组中。简单序列基因座通常显示广 泛的长度多态性。这些简单的序列长度多态性(SSLP)可以通过聚合酶链反应(PCR)分析 法检测并用于同一性检验、群体研究、连锁分析和基因组作图。如本文中所用，“SSR标记物” 指表示为CIRx、NAUx和BNLx (其中χ是一个数字)的标记物，它们是用来产生不同棉属物 种遗传图的公开可获得的标记物(见http://www. cottonmarker. org/的棉花微卫星数据 库)。“(遗传或分子)标记物”，如AFLP或SSR标记物，可以是显性(纯合个体和杂合个 体不是可区分的)或共显性(区分纯合个体和杂合个体，例如，通过条带强度区分)的，如 下表2中所例举。“(遗传或分子)标记物”，如AFLP或SSR标记物，可以与基因或基因座以 “互引相”或以“互斥相”连锁。如，互引地与某基因或基因座连锁的显性标记物存在于具有 该基因或基因座的个体中并且不存在于没有该基因或基因座的个体中，而互斥地与某基因 或基因座连锁的显性标记物不存在于具有该基因或基因座的个体中并且存在于没有该基 因或基因座的个体中。标记物的不同等位基因可以存在于不同的植物物种中。如本文中所用，“与纤维强 度基因座连锁的标记物的海岛棉或陆地棉等位基因”指具有分别从海岛棉或陆地棉衍生并 对其特异的标记物的一种形式。表2例举说明如何可以鉴定或区分不同等位基因的不同标 记物第1列指示海岛棉和/或陆地棉的染色体A05上的不同标记物基因座，第2列对每个 标记物基因座指示可以用来鉴定特定标记物基因座存在或不存在的特异性引物对，第3列 指示海岛棉(尤其栽培品种Pima S7 ；显示为‘Pima’)和陆地棉(尤其栽培品种FM966 ；显 示为‘FM’)的特定标记物等位基因是否产生扩增的DNA片段，并且如果产生，则指示扩增 DNA片段的大小，第4列指示第1列中所示标记物是否为如上文所定义的显性或共显性标记 物。表2 检测染色体A05上标记物的特定海岛棉或陆地棉等位基因
权利要求
1.非天然存在的产纤维植物及其部分和后代，其特征在于，在纤维发育的纤维强度建 立阶段、尤其纤维成熟阶段期间功能表达的至少一个纤维特异性GLUC基因的至少一个等 位基因的功能性表达被消除。
2.权利要求1的植物，其中GLUC基因是编码与SEQID NO 4具有至少90%序列同一 性的GLUC蛋白的GLUC1. 1基因。
3.权利要求1或2的植物，其是棉属(Gossypium)植物，其中GLUC基因是编码与SEQ ID NO :4具有至少97%序列同一性的GLUC蛋白的GLUC1. IA基因或编码与SEQ ID NO 10 具有至少97%序列同一性的GLUC蛋白的GLUC1. ID基因，优选地是GLUC1. IA基因。
4.权利要求1至3任一项的植物，其是陆地棉(Gossypiumhirsutum)植物或草棉 (Gossypium herbacium)植物。
5.权利要求1至4任一项的植物，其中与至少一个GLUC等位基因的功能性表达未消 除的植物中纤维发育的纤维强度建立阶段、尤其纤维成熟阶段期间纤维中所产生的功能性 GLUC蛋白的量相比较，功能性GLUC蛋白的量在纤维发育的纤维强度建立阶段、尤其纤维成 熟阶段期间的纤维中显著减少。
6.权利要求1至5任一项的植物，其中与未消除至少一个GLUC等位基因的功能性表达 的植物内纤维中的胼胝质含量相比较，胼胝质含量在纤维中显著增加。
7.权利要求1至6任一项的植物，其中与至少一个GLUC等位基因的功能性表达未消除 的植物中纤维的强度相比，纤维的强度明显提高。
8.权利要求7的植物，其中纤维的强度平均提高了约5%与约10%之间、优选地提高了 约 7. 5%。
9.权利要求7或8的植物，其中纤维的强度平均提高了约1.6g/tex与约3. 3g/tex之 间、优选地提高了约2. 5g/tex。
10.权利要求7至9任一项的植物，其中纤维的强度平均是在约34.6g/tex与约36. 3g/ tex之间、优选地约35. 5g/tex。
11.权利要求7至10任一项的植物，其是特征在于至少一个纤维特异性GLUC基因的至 少两个等位基因的功能性表达被消除的陆地棉植物。
12.从权利要求1至11任一项的产纤维植物可获得的纤维。
13.核酸分子，编码具有以下氨基酸序列的无功能GLUC1.1蛋白，在所述氨基酸中与 SEQ ID NO :4的GLUC1.1蛋白的活性中心残基相似或与其糖基化位点残基相似的至少一个 氨基酸残基缺少或被替换为不相似的氨基酸残基。
14.权利要求13的核酸分子，其中SEQID NO 4的GLUCl. 1蛋白的活性中心残基选自 由Tyr48、Glu249、Trp252和Glu308组成的组，并且其中SEQ ID NO 4的GLUC1. 1蛋白的 糖基化位点残基是Asn202。
15.权利要求13或14的核酸分子，其中无功能GLUC1.1蛋白包含与SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO 57或SEQ ID NO 22的氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列。
16.权利要求14或15的核酸分子，包含与SEQID NO 3从第101至第1078位核苷酸 具有至少92%序列同一性的核酸序列，其中至少一个核酸残基被缺失、插入或替换。
17.权利要求14至16任一项的核酸分子，包含与SEQID NO 54从第50至第589位 核苷酸的核酸序列至少92%同一的核酸序列。
18.权利要求17的核酸分子，包含与SEQID NO 54从第50至第589位核苷酸的核酸 序列。
19.权利要求14至15任一项的核酸分子，包含与SEQID NO :1从第2410至第3499位 核苷酸具有至少92%序列同一性的核酸序列，其中至少一个核酸残基被缺失、插入或替换。
20.权利要求19的核酸分子，包含与SEQID NO :5从第63至第711位核苷酸、SEQ ID NO 17从第2至第472位核苷酸、SEQ ID NO 56从第112至第760位核苷酸或SEQ ID NO 21从第27至第372位核苷酸的核酸序列至少92%同一的核酸序列。
21.权利要求20的核酸分子，包含SEQID NO :5从第63至第711位核苷酸、SEQ ID NO 17从第2至第472位核苷酸、SEQ ID NO 56从第112至第760位核苷酸、SEQ ID NO 56从第112至第760位核苷酸或SEQID NO 21从第27至第372位核苷酸的核酸序列。
22.由权利要求13至21任一项的核酸分子编码的无功能GLUC1.1蛋白。
23.用于鉴定植物中编码无功能GLUC1.1蛋白的GLUC1. 1基因的方法，所述的GLUC1. 1 基因包含与SEQ ID NO :1从第2410至第3499位核苷酸具有至少92%序列同一性的核 酸序列，所述方法包括步骤在导致无功能GLUC1. 1蛋白产生的植物的基因组DNA中鉴定 GLUC1. 1基因的核苷酸序列中的多态性位点。
24.权利要求23的方法，用于鉴定植物中来自海岛棉(Gossypiumbarbadense)或来自 达尔文棉(Gossypium darwinii)的GLUC1. 1基因，所述方法包括步骤在植物的基因组DNA 中与SEQ ID NO 1第3050核苷酸位置相对应的核苷酸位置处鉴定T核苷酸。
25.权利要求23的方法，用于鉴定植物中来自树棉(Gossypiumarboreum)的GLUC1.1 基因，所述方法包括步骤鉴定C核苷酸在植物的基因组DNA中与SEQ ID N0:1第2674、 2675或2676核苷酸位置相对应的核苷酸位置处缺失。
26.区分编码无功能GLUC1.1蛋白的GLUC1. 1基因与编码功能性GLUC1. 1蛋白的 GLUC1. 1基因的方法，所述的GLUC1. 1基因均包含与SEQ ID NO :1从第2410至第3499位 核苷酸具有至少92%序列同一性的核酸序列，所述方法包括鉴定所述GLUC1. 1基因的核苷 酸序列中多态性位点的步骤。
27.权利要求26的方法，用于分别区分来自海岛棉、来自达尔文棉或来自树棉的 GLUC1. 1基因与来自陆地棉的GLUC1. 1基因，所述方法包括鉴定选自由以下标记物组成的 组中多态性位点的步骤-位于SEQ ID NO :1中第2765和第2766位置处核苷酸之间的多态性序列标记物 GLUC1. 1A-SNP2,-位于SEQ ID NO 1中第2911核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3，-位于SEQ ID NO 1中第3050核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5，-位于SEQ ID NO 1中第3202核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6，-位于SEQ ID NO 1中第2674、第2675或第2676位置处核苷酸之间的SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP7，和-位于SEQ ID NO 1中第3170核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8。
28.权利要求27的方法，其中通过用在其3，最末端分别包含SEQIDNO 37和38的引 物分别扩增约143bp和约134bp的DNA片段来检测分别来自海岛棉或达尔文棉和来自陆地 棉的多态性序列标记物GLUC1. 1A-SNP2。
29.权利要求27的方法，其中分别通过用包含SEQID NO 41和42的引物扩增约57bp 的DNA片段和用包含SEQ ID NO 39和40的荧光标记探针检测DNA片段而分别检测来自海 岛棉或达尔文棉和来自陆地棉的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3。
30.用于产生和/或选择非天然存在的产纤维植物及其部分和后代的方法，其中在纤 维发育的纤维强度建立阶段、尤其纤维成熟阶段期间功能表达的至少一个纤维特异性GLUC 基因的至少一个等位基因的功能性表达被消除，所述方法包括步骤-诱变GLUC基因的至少一个等位基因，或-渐渗GLUC基因的无功能表达的直向同源物的至少一个等位基因或诱变的GLUC基因 的至少一个等位基因，或-导入包含以下有效连接的DNA元件的嵌合基因a.植物可表达的启动子，b.转录的DNA区域，其转录时产生能够减少GLUC等位基因表达的抑制性RNA分子，和c.3’末端区域，其包含在植物的细胞中有功能的转录终止和聚腺苷酸化信号。
31.权利要求30的方法，其中GLUC基因是编码与SEQID NO 4具有至少90%序列同 一性的GLUC蛋白的GLUC1. 1基因。
32.权利要求30或31的方法，其中产纤维植物是棉属植物，并且其中GLUC基因是编码 与SEQ ID NO 4具有至少97%序列同一性的GLUC蛋白的GLUC1. IA基因或编码与SEQ ID NO :9具有至少97%序列同一性的GLUC蛋白的GLUC1. ID基因，优选地是GLUC1. IA基因。
33.权利要求30至32任一项的方法，其中产纤维植物是棉属植物，并且其中GLUC基因 的无功能表达的直向同源物是从海岛棉、从达尔文棉或树棉植物、优选地从海岛棉衍生的 GLUC1. IA 基因。
34.权利要求30至33任一项的方法，还包括步骤根据权利要求23至25任一项的方 法鉴定GLUC基因或诱变的GLUC基因的无功能表达的直向同源物。
35.用于改变产纤维植物中纤维的胼胝质含量、尤其提高纤维的胼胝质含量的方法，包 括步骤-根据权利要求30至34任一项，产生和/或选择非天然存在的产纤维植物及其部分和 后代，其中在纤维发育的纤维强度建立阶段、尤其纤维成熟阶段期间功能表达的至少一个 纤维特异性GLUC基因的至少一个等位基因的功能性表达被消除，-选择其纤维中具有改变的胼胝质含量、尤其增加的胼胝质含量的植物。
36.用于改变产纤维植物中纤维的特性、尤其提高纤维强度的方法，包括步骤-根据权利要求30至34任一项，产生和/或选择非天然存在的产纤维植物及其部分和 后代，其中在纤维发育的纤维强度建立阶段、尤其纤维成熟阶段期间功能表达的至少一个 纤维特异性GLUC基因的至少一个等位基因的功能性表达被消除，-选择具有改变的纤维强度、尤其提高的纤维强度的植物。
37.用于鉴定植物中编码无功能GLUC1.1蛋白的GLUC1. 1基因的试剂盒，所述的 GLUC1. 1基因包含与SEQ ID NO :1从第2410至第3499位核苷酸具有至少92%序列同一性 的核酸序列，所述试剂盒包含引物和/或探针，它们用于确定植物的基因组DNA中存在导致 无功能GLUC1. 1蛋白产生的GLUC1. 1基因的核苷酸序列中的多态性位点。
38.权利要求37的试剂盒，包含用于确定T核苷酸在与SEQID NO 1中第3050核苷酸位置相对应的核苷酸位置处存在或者用于确定C核苷酸在与SEQ ID NO 1中第2674、2675 或2676核苷酸位置相对应的核苷酸位置处缺失的引物和/或探针。
39.用于区分植物中编码无功能GLUC1.1蛋白的GLUC1. 1基因与编码功能性GLUC1. 1 蛋白的GLUC1. 1基因的试剂盒，所述的GLUC1. 1基因均包含与SEQ ID NO 1从第2410至 第3499位核苷酸具有至少92%序列同一性的核酸序列，所述试剂盒包含用于确定多态性 位点存在于所述GLUC1. 1基因的核苷酸序列中的引物和/或探针。
40.权利要求39的试剂盒，包含用于分别区分海岛棉、达尔文棉或树棉特定等位基因 与以下多态性位点的陆地棉特定等位基因的引物和/或探针，所述的多态性位点选自由以 下标记物组成的组-位于SEQ ID NO :1中第2765和第2766位置处核苷酸之间的多态性序列标记物 GLUC1. 1A-SNP2,-位于SEQ ID NO 1中第2911核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3， -位于SEQ ID NO 1中第3050核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5， -位于SEQ ID NO 1中第3202核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6， -位于SEQ ID NO :1中第2674、第2675或第2676核苷酸位置处的SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP7，和-位于SEQ ID NO 1中第3170核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8。
41.权利要求40的试剂盒，包含选自以下的至少两条引物和/或探针-在其3，最末端分别包含SEQ ID NO :37和38以鉴定多态性序列标记物 GLUC1. 1A-SNP2 的引物，-分别包含SEQ ID NO 41和42以鉴定SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3的引物， -分别包含SEQ ID NO 39和40以鉴定SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3的探针， -分别包含SEQ ID NO 62和63以鉴定SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5的引物， -分别包含SEQ ID NO 60和61以鉴定SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5的探针。
42.非天然存在的棉属植物及其部分和后代，包含在染色体A05上的纤维强度基因座 的至少一个优异等位基因。
43.权利要求42的植物，其来自A基因组二倍体棉属物种，如草棉或树棉(Gossypium arboreum)，或AD基因组异源四倍体棉属物种，如陆地棉和海岛棉，并且其中优异纤维强度 等位基因从不同的A或AD基因组棉属物种衍生。
44.权利要求42的植物，其是陆地棉、草棉或树棉植物，优选地是陆地棉植物，并且其 中优异纤维强度等位基因从海岛棉衍生。
45.权利要求44的植物，其中海岛棉纤维强度等位基因位于海岛棉的染色体A05上的 以下标记物之间-AFLP标记物P5M50-M126. 7与SSR标记物CIR280之间， -AFLP 标记物 P5M50-M126. 7 与 SSR 标记物 BNL3992 之间， -AFLP标记物P5M50-M126. 7与SSR标记物CIR401c之间，或 -SSR标记物NAU861或GLUC1. 1基因与SSR标记物CIR401c之间。
46.权利要求44或45的植物，其中海岛棉纤维强度等位基因的LOD峰位于-距离SSR标记物NAU861或GLUC1. 1基因约0至5cM处，更具体地在约4. 008cM处，或-距离SSR标记物CIR401约0至12cM处，更具体地在约IOcM处，尤其在约10. 52cM处。
47.权利要求44的植物，其中海岛棉纤维强度等位基因包含核苷酸序列的至少一个 海岛棉直向同源物，所述的核苷酸序列包含于SEQ ID NO :53中所示的跨度覆盖陆地棉 GLUC1. IA基因的基因组DNA序列中。
48.权利要求44的植物，其中海岛棉纤维强度等位基因包含编码无功能GLUC1.1蛋白 的GLUC1. 1基因。
49.权利要求48的植物，其中GLUC1.1基因的特征在于，T核苷酸在与SEQ ID NO 5的 第712核苷酸位置相对应的核苷酸位置处存在。
50.权利要求42的植物，其是陆地棉、海岛棉、草棉或树棉植物，优选地是陆地棉植物， 并且其中优异纤维强度等位基因从达尔文棉衍生。
51.权利要求50的植物，其中达尔文棉纤维强度等位基因包含编码无功能GLUC1.1蛋 白的GLUC1. 1基因。
52.权利要求51的植物，其中GLUC1.1基因的特征在于，T核苷酸在与SEQ ID NO 56 的第761核苷酸位置相对应的核苷酸位置处存在。
53.权利要求42的植物，其是陆地棉、海岛棉或草棉植物，优选地是陆地棉植物，并且 其中优异纤维强度等位基因从树棉衍生。
54.权利要求53的植物，其中树棉纤维强度等位基因包含编码无功能GLUC1.1蛋白的 GLUC1. 1 基因。
55.权利要求M的植物，其中GLUC1.1基因的特征在于，C核苷酸在与SEQ ID NO 21 第327与第3 位置之间的核苷酸位置相对应的核苷酸位置处不存在。
56.权利要求42至55任一项的植物，其中纤维的胼胝质含量与同等棉属植物的纤维的 胼胝质含量相比增加，所述的同等棉属植物不包含纤维强度基因座的至少一个优异等位 基 因。
57.权利要求42至56任一项的植物，其中纤维的强度与同等棉属植物的纤维的强度相 比增加，所述的同等棉属植物不包含纤维强度基因座的至少一个优异等位基因。
58.权利要求57的植物，其中纤维的强度平均提高了约5%与约10%之间、优选地提高 了约 7. 5%。
59.权利要求57或58的植物，其中纤维的强度平均提高了约1.6g/tex与约3. 3g/tex 之间、优选地提高了约2. 5g/tex。
60.权利要求57至59任一项的植物，其中纤维的强度平均是在约34.6g/tex与约 36. 3g/tex 之间、优选地约 35. 5g/tex。
61.权利要求57至60任一项的植物，其是对海岛棉纤维强度等位基因纯合的陆地棉植物。
62.从权利要求42至61任一项的植物可获得的纤维。
63.鉴定植物中染色体A05上纤维强度基因座的海岛棉等位基因的方法，包括步骤确 定与该纤维强度基因座连锁的标记物的海岛棉等位基因在该植物的基因组DNA中存在，所 述的标记物选自由以下标记物组成的组-AFLP 标记物 P5M50-M126. 7，-SSR 标记物 CIR280， -SSR 标记物 BNL3992， -SSR 标记物 CIR401c， -SSR 标记物 NAU861，-植物的核苷酸序列的直向同源物中的多态性位点，其包含于SEQ IDN0:53所示的跨 度覆盖陆地棉GLUC1. IA基因的基因组DNA序列中，和-植物的GLUC1. IA基因的核苷酸序列中的多态性位点，如位于与SEQ ID NO :5中第418 至第4 核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP2、位于与SEQ ID NO 5中第573核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3、位于与SEQ ID NO 5中第712核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5、位于 与SEQ ID NO 5中第864核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6 或者位于与SEQ ID NO :5中第832核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP8。
64.权利要求63的方法，其中-通过用在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 43和44的至少两条引物扩增约126. 7bp 的DNA片段而检测AFLP标记物P5M50-M126. 7的海岛棉等位基因，-通过用在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 51和52的至少两条引物扩增约205bp的 DNA片段而检测SSR标记物CIR280的海岛棉等位基因，-通过用在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 49和50的至少两条引物扩增约140bp至 约I^bp的DNA片段而检测SSR标记物BNL3992的海岛棉等位基因，-通过用在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 47和48的至少两条引物扩增约245至 约250bp的DNA片段而检测SSR标记物CIR401c的海岛棉等位基因，-通过用在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 45和46的至少两条引物扩增约215bp至 约220bp的DNA片段而检测SSR标记物NAU861的海岛棉等位基因，-通过在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP2的位置处检测CTCATCAAA核苷酸序列或通过用在 其3，最末端分别包含SEQ ID NO 37和38的至少两条引物扩增约14;3bp的DNA片段而检 测SNP标记物GLUC1. 1A-SNP2的海岛棉等位基因，-通过在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3的位置处检测C核苷酸而检测SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP3的海岛棉等位基因，通过在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5的位置处检测T核苷酸而检测SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP5的海岛棉等位基因，-通过在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6的位置处检测A核苷酸而检测SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP6的海岛棉等位基因，和-通过在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8的位置处检测C核苷酸而检测SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP8的海岛棉等位基因。
65.鉴定植物中染色体A05上纤维强度基因座的达尔文棉等位基因的方法，包括确定 达尔文棉特异性多态性位点，如位于与SEQ ID NO :56中第476至第477核苷酸位置相对 应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP2、如位于与SEQ ID NO 56中第622核苷酸 位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3、位于与SEQ ID NO 56中第761核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5、位于与SEQ ID NO 56中 第913核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6或者位于与SEQ ID NO 56中第881核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8，在该植物 的GLUC1. IA基因的核苷酸序列中存在的步骤。
66.权利要求65的方法，其中-通过在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP2的位置处检测CTCATCAAA核苷酸序列或通过用在 其3，最末端分别包含SEQ ID NO 37和38的至少两条引物扩增约14;3bp的DNA片段而检 测SNP标记物GLUC1. 1A-SNP2的达尔文棉等位基因，-通过在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3的位置处检测C核苷酸而检测SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP3的达尔文棉等位基因，-通过在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5的位置处检测T核苷酸而检测SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP5的达尔文棉等位基因，-通过在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6的位置处检测A核苷酸而检测SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP6的达尔文棉等位基因，和-通过在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8的位置处检测G核苷酸而检测SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP8的达尔文棉等位基因。
67.鉴定植物中染色体A05上纤维强度基因座的树棉等位基因的方法，包括确定树棉 特异性多态性位点，如位于与SEQ ID NO 21中第327和第3 核苷酸位置之间的核苷酸位 置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP7，在该植物的GLUC1. IA基因的核苷 酸序列中存在的步骤。
68.权利要求67的方法，其中通过检测C核苷酸在SNP标记物GLUC1.1A-SNP7的位置 不存在而检测SNP标记物GLUC1. 1A-SNP7的树棉等位基因。
69.区分染色体A05上纤维强度基因座的海岛棉等位基因与陆地棉植物中纤维强度基 因座的陆地棉等位基因的方法，包括步骤确定与纤维强度基因座连锁的标记物的海岛棉 等位基因和/或陆地棉等位基因的存在，所述的标记物选自由以下标记物组成的组-AFLP 标记物 P5M50-M126. 7， -SSR 标记物 CIR280， -SSR 标记物 BNL3992， -SSR 标记物 CIR401， -SSR 标记物 NAU861，-在包含于SEQ ID NO 53中所示的跨度覆盖陆地棉GLUC1. IA基因的基因组DNA序列 中的核苷酸序列中的多态性位点，-陆地棉植物的GLUC1. 1基因的核苷酸序列中的多态性位点，如位于与SEQ ID NO 5中第418至第4 核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP2、 位于与SEQ ID N0:5中第573核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP3、位于与SEQ IDNO 5中第712核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标 记物GLUC1. 1A-SNP5、位于与SEQ ID NO 5中第864核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的 SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6或者位于与SEQ ID NO 5中第832核苷酸位置相对应的核苷酸 位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8。
70.权利要求69的方法，其中-通过用在其3’最末端分别包含SEQ ID NO 43和44的至少两条引物分别扩增不到 DNA片段和扩增到约126. 7bp的DNA片段而将陆地棉等位基因与AFLP标记物P5M50-M126. 7 的海岛棉等位基因区分，-通过用在其3’最末端分别包含SEQ ID NO 51和52的至少两条引物分别扩增不到 DNA片段和扩增到约205bp的DNA片段而将陆地棉等位基因与SSR标记物CIR280的海岛棉 等位基因区分，-通过用在其3’最末端分别包含SEQ ID NO 49和50的至少两条引物分别扩增到两 个DNA片段，一个约160bp至约165的片段和一个约85bp至约90bp的片段，以及约140bp 至约I^bp的一条DNA片段而将陆地棉等位基因与SSR标记物BNL3992的海岛棉等位基因 区分，-通过用在其3，最末端分别包含SEQ ID NO :47和48的至少两条引物分别扩增到约 255bp的DNA片段(CIR401b)和约M5bp至约250bp的DNA片段(CIR401c)而将陆地棉等 位基因与SSR标记物CIR401的海岛棉等位基因区分，-通过用在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 45和46的至少两条引物分别扩增到约 205bp至约210bp的DNA片段和约215bp至约220bp的DNA片段而将陆地棉等位基因与SSR 标记物NAU861的海岛棉等位基因区分，-分别通过在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP2的位置处检测不到核苷酸或检测到 CTCATCAAA核苷酸序列或通过用在其3’最末端分别包含SEQID NO 37和38的至少两条引 物分别扩增到约134bp的DNA片段和约14;3bp的DNA片段而将陆地棉等位基因与SNP标记 物GLUC1. 1A-SNP2的海岛棉等位基因区分，-通过在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3的位置处分别检测到G或C核苷酸而将陆地棉等 位基因与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3的海岛棉等位基因区分，-通过在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5的位置处分别检测到C或T核苷酸而将陆地棉等 位基因与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5的海岛棉等位基因区分，-通过在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6的位置处分别检测到G或A核苷酸而将陆地棉等 位基因与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6的海岛棉等位基因区分，和-通过在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8的位置处分别检测到G或C核苷酸而将陆地棉等 位基因与SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8的海岛棉等位基因区分。
71.用于产生和/或选择在染色体A05上包含纤维强度基因座的至少一个优异等位基 因的非天然存在棉属植物及其部分和后代的方法，其中优异纤维强度等位基因从海岛棉衍 生，所述方法包括步骤-使来自A基因组二倍体棉属物种如草棉或树棉或来自AD基因组异源四倍体棉属物种 如陆地棉的植物与海岛棉植物杂交，-根据权利要求63或64鉴定海岛棉纤维强度等位基因。
72.用于改变棉属植物中纤维的胼胝质含量、特别是提高纤维的胼胝质含量的方法，包 括步骤-根据权利要求71在棉属植物中染色体A05上渐渗纤维强度基因座的优异等位基因， -选择其纤维中具有改变的胼胝质含量、尤其提高的胼胝质含量的植物。
73.用于改变棉属植物中纤维的特性、特别是提高纤维强度的方法，包括步骤-根据权利要求71在棉属植物中染色体A05上渐渗纤维强度基因座的优异等位基因， -选择具有改变的纤维强度、尤其提高的纤维强度的植物。
74.用于鉴定植物中染色体A05上纤维强度基因座的海岛棉等位基因或者用于区分染 色体A05上纤维强度基因座的海岛棉等位基因与植物中纤维强度基因座的陆地棉等位基 因的试剂盒，包含用于确定与该纤维强度基因座连锁的标记物的海岛棉等位基因和/或陆 地棉等位基因存在的引物和/或探针，所述的标记物选自由以下标记物组成的组-AFLP 标记物 P5M50-M126. 7， -SSR 标记物 CIR280， -SSR 标记物 BNL3992， -SSR 标记物 CIR401c， -SSR 标记物 NAU861，-核苷酸序列的直向同源物中的多态性位点，所述的核苷酸序列包含于SEQ ID N0:53 中所示的跨度覆盖该植物的陆地棉GLUC1. IA基因的基因组DNA序列中，-植物的GLUC1. IA基因的核苷酸序列中的多态性位点，如位于与SEQ ID NO :5中第418 至第4 核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP2、位于与SEQ ID NO 5中第573核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP3、位于与SEQ ID NO 5中第712核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5、位于 与SEQ ID NO 5中第864核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6 或者位于与SEQ ID NO :5中第832核苷酸位置相对应的核苷酸位置处的SNP标记物 GLUC1. 1A-SNP8。
75.权利要求74的试剂盒，包含选自以下的至少两条引物和/或探针 -在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 43和44的引物，-在其3，最末端分别包含SEQ ID NO :51和52的引物， -在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 49和50的引物， -在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 47和48的引物， -在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 45和46的引物， -在其3，最末端分别包含SEQ ID NO 37和38的引物，-在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP2的位置处分别检测不到核苷酸或检测到CTCATCAAA核 苷酸序列的引物和探针，-在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP5的位置处分别检测C或T核苷酸的引物和探针， -在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP6的位置处分别检测G或A核苷酸的引物和探针，和 -在SNP标记物GLUC1. 1A-SNP8的位置处分别检测G或C核苷酸的引物和探针。
全文摘要
本发明涉及农业领域，更具体地，涉及使用分子生物学技术改变产纤维植物特别是棉花植物和/或加速此类产纤维植物育种。提供了改变纤维品质如提高纤维强度的方法和手段。本发明还提供了鉴定一群棉花品种和相关祖先植物中与纤维强度相关的分子标记物的方法。
文档编号C12N9/24GK102076857SQ200980124338
公开日2011年5月25日 申请日期2009年5月25日 优先权日2008年5月26日
发明者A·阿廖利, J·雅各布斯, 托尔诺特 M·范, S·布罗, S·恩格勒恩 申请人:拜尔生物科学公司