利用核酸分析方法来诊断黑素瘤和太阳能雀斑的制作方法

专利名称：利用核酸分析方法来诊断黑素瘤和太阳能雀斑的制作方法
利用核酸分析方法来诊断黑素瘤和太阳能雀斑发明背景 发明领域本发明总体涉及利用基本非创伤性的皮肤取样表征疑为黑素瘤的色素沉着性皮 肤损伤的方法。背景信息黑素瘤是人类皮肤癌的严重形式。其由色素沉着细胞(黑素细胞)引起，通常在 皮肤中。黑素瘤的发生率以在美国所有癌症中最快的速率增长，具有1/68的寿命风险。虽 然黑素瘤仅占所有皮肤病癌症的4%，但其造成全部皮肤癌死亡的80%。很早就认识到在 其为早期疾病时，黑素瘤的识别和诊断对其治疗是关键。鉴于此，迫切需要进行不仅关于黑素瘤治疗而且关于黑素瘤各方面的研究，包括 预防和检测。如果可以在其早期检测到最初位于皮肤上的黑素瘤，就可以预防大多数这些 源自黑素瘤的死亡。如果黑素瘤被完全地手术切除，那么在其最早皮肤期原位治愈黑素瘤 的能力实质上是100%。如果黑素瘤在较晚期被捕获，在该位置其已侵入4mm或更深的深 度，那么十年的存活率低于50%。如果直到黑素瘤已蔓延至身体的远距部分(IV期)才将 其检测到，那么后果不容乐观，仅7-9%的患者存活了 5年，中值存活时间为8-9个月。IV 期黑素瘤的长期“治愈”率仅为1_2%。为了提高黑素瘤的早期检测，必须提高几件事。人们需要被更好地教导关于黑素 瘤的风险和如何在其所在的皮肤上预防及检测黑素瘤。医生也需要更加警惕黑素瘤的可能 性，并在检测方面被更好地培训。但即使提高了这两个领域，对皮肤上黑素瘤的诊断仍很困 难。研究显示甚至就职于黑素瘤是其专项的色素沉着损伤诊所的专家临床医师也仅能以 60-80%灵敏度确定可疑的色素沉着损伤是否是黑素瘤。这导致这样的需要对每一个被检 测到的黑素瘤的大量色素沉着损伤的手术活组织检查，并且无疑是对于一些黑素瘤在其早 期的错过所需的。在当前实践中，通过活组织检查和组织病理学检查诊断黑素瘤；必须进行约20至 30个活组织检查以找到一个黑素瘤，甚至那时还是在最早期错过一些黑素瘤。视觉检测的 限制对于皮肤病学家很明显，皮肤科医师不断寻找更好地确定可疑损伤是否是黑素瘤的途 径，而无需先将其切割下来。因此，表皮荧光显微镜(ELM)已经投入使用。这是观测损伤所 借助的方法，其应用这样的装置在减少源自皮肤-空气界面上折射率差异的视觉干扰的 同时放大损伤。当ELM给出不同的视图时，其具有有限的提高。研究显示直到技术人员相 当熟练使用该装置，黑素瘤检测的灵敏度才不会实际上降低。即使非常熟练的ELM使用者 也仅将其检测黑素瘤的能力提高5-10%。这仍导致检测中不可接受的灵敏度和需要活组织 检查大量良性损伤以检测少量黑素瘤。并且再一次，一些黑素瘤会在其早期被完全错过。很明显，有这样的需要进一步发展使医生能确定皮肤可疑损伤的本质和程度的 技术。这种技术将理想地直接检测可疑损伤的生理学，使得能进行灵敏的诊断。发明概述
本发明部分基于如下发现源自特异基因的核酸分子或核酸分子的蛋白质表达产 物的分析可用于表征对象中的皮肤损伤。该方法提供了有价值的遗传信息，基于例如DNA、 信使RNA或由其得到的蛋白质表达产物。在一个实施方式中，该方法包括非创伤性方法的应用，通过胶带剥离过程从皮肤 表面获得核酸，如DNA或信使RNA或蛋白质，该胶带剥离过程允许生物标记的直接定量和定 性评价。虽然显示胶带获得的核酸和蛋白质表达产物在性质和应用上与通过活组织检查获 得这种分子具有可比性，但非创伤性方法提供了关于皮肤最外层细胞的信息，应用活组织 检查样本不能得到该信息。最终，非创伤性方法比活组织检查大幅减少创伤。因此，应用非创伤性方法捕获疑为黑素瘤的色素沉着性皮肤损伤上的细胞。分析 得自通过非创伤性方法捕获的皮肤细胞的核酸分子以诊断损伤的性质(例如，恶性黑素 瘤)。在一个实施方式中，在分析前扩增核酸分子。次级结果可包括诊断和预后多种色素沉 着性皮肤损伤的测试，甚至预测治疗方案。在另一个实施方式中，溶解皮肤细胞以提取一种 或多种蛋白质，然后将其定量以诊断损伤性质。应当理解的是，本发明所述的方法不限于用 于得到皮肤样本的非创伤性技术。例如但不限于，本领域技术人员会知道用于得到皮肤样 本的其他技术，如刮皮、活组织检查、吸引、吹气和其他技术。如本文所述，非创伤性胶带剥 离是用于得到皮肤样本的示例性实例。在另一个实施方式中，该方法包括得自皮肤的核酸分子的核酸序列中一个或多个 突变的检测。这种突变可以是造成皮肤样本所取的对象病态的核酸序列的置换、缺失和/ 或插入。在一个实施方式中，在表10-12和15中列举了所分析的核酸分子。在另一个实 施方式中，该方法进一步包括分析表1-8中所列举的一种或多种核酸分子。例如，在一 个实施方式中，所分析的基因是下列中的一种或多种干扰素调节因子6、密蛋白23、黑 素(melarO-A、骨硬化症相关跨膜蛋白1、RAS样家族11成员B、辅肌动蛋白α 4、跨膜蛋 白68、富甘氨酸蛋白(GRP3S)、转录因子4、假设蛋白FLJ20489、体细胞色素C、转录因子4、 叉头框Ρ1、转导蛋白ERBB2-2、谷氨酰胺酰-肽环转移酶(谷氨酰胺酰环化酶)、假设蛋白 FLJ10770、磷酸硒合成酶2、胚胎Fyn相关底物、Kruppel样因子8、Discs大同源物5 (果蝇 (Drosophila)), G蛋白信号传导调节物10、ADP核糖基化因子相关蛋白2、TIMP金属肽酶 抑制因子2、5_氨基咪唑-4-氨甲酰核糖核苷酸转甲酰酶/IMP环水解酶、类似RIKEN cDNA 5730421E18基因、G蛋白信号传导调节物10、假设核RNA结合蛋白、酪氨酸酶相关蛋白1、 TIMP金属肽酶抑制因子2、密蛋白1、转录因子4、溶质载体家族16(单羧酸转运体)成员 6 (类似于溶质载体家族16成员6 ；单羧酸酯转运体6)或其任意组合。在另一个实施方式 中，核酸分子来自表10-12和15中所列举的一种或多种基因。因此，本文所提供的是在对象中表征和/或诊断黑素瘤的方法，包括通过对象上 皮肤损伤的活组织检查得到核酸分子或蛋白质，并分析该核酸分子，从对象的发育不良痣 和/或正常色素沉着皮肤分辨黑素瘤。以此方法，在表皮样本中检测至少一种其表达提供 黑素瘤信息的核酸分子。在一个实例中，在表皮样本中检测表1-8、10-12、15或其组合中列 举基因的一种或多种的表达，以表征黑素瘤。在一个实施方式中，该基因是下列的一种或多 种干扰素调节物6、密蛋白23、黑素-A、骨硬化症相关跨膜蛋白1、RAS样家族11成员B、辅 肌动蛋白α 4、跨膜蛋白68、富甘氨酸蛋白(GRP3S)、转录因子4、假设蛋白FLJ20489、体细胞色素c、转录因子4、叉头框P1、转导蛋白ERBB2-2、谷氨酰胺酰-肽转移酶(谷氨酰胺酰环 化酶)、假设蛋白FLJ10770、磷酸硒合成酶2、胚胎Fyn相关底物、Kruppel样因子8、Discs 大同源物5 (果蝇)、G蛋白信号传导调节物10、ADP核糖基化因子相关蛋白2、TIMP金属 肽酶抑制因子2、5_氨基咪唑-4-氨甲酰核糖核苷酸转甲酰酶/IMP环水解酶、类似RIKEN CDNA5730421E18基因、G蛋白信号传导调节物10、假设核RNA结合蛋白、酪氨酸酶相关蛋白 1、TIMP金属肽酶抑制因子2、密蛋白1、转录因子4、溶质载体家族16 (单羧酸转运体)成员 6 (类似于溶质载体家族16成员6 ；单羧酸酯转运体6)或其任意组合。本发明所述的非创伤性方法包括以足以分离粘附至胶带的样本的方式将胶带应 用于皮肤目标区域，其中样本包括核酸分子或蛋白质。一般，在样本中检测至少一种其表达 提供黑素瘤信息的核酸分子或蛋白质。利用胶带剥离表征皮肤的方法具有多种应用，如下 (i)疾病分类/子分类；(ii)监控疾病严重性和进展；(iii)监控治疗效力；以及(iv)具 体治疗方案的预测。所有这些应用，其本身代表本文所公开的实施方式，优选应用非创伤性 取样获得信息，否则该信息难以获得或实际不可获得(例如，通过活组织检查的应用)。该 信息可包含在接近皮肤表面的皮肤细胞的DNA、蛋白质或RNA中。在一个实施方式中，在样 本中检测表1-8、10-12、15或其组合中所列举基因一种或多种的表达，以表征样本。该示例 性方法对于从发育不良痣和/或正常色素沉着皮肤分辨黑素瘤尤为有用。在一个实施方式 中，在样本中检测表12或15中所列举基因其中一种或多种的表达，以表征样本。同样，本 文也提供的是从对象中的发育不良痣和/或基底细胞癌和/或正常色素沉着皮肤分辨日光 性着色斑(太阳能雀斑)的方法，包括以足以分离粘附于胶带的样本的方式将胶带应用于 皮肤目标区域，其中样本包括核酸分子。在样本中检测至少一种其表达提供日光性着色斑 信息的核酸分子。在一个实施方式中，在样本中检测表10_12、15或其组合中所列举基因的 一种或多种的表达，以表征黑素瘤。在另一个实施方式中，在样本中检测表12或15中所列 举基因的一种或多种的表达，以表征日光性着色斑。其他实施方式部分基于下列发现对于皮肤的胶带剥离，非极性的软胶带，尤其具 有橡胶粘合剂的软带比其他类型的胶带更有效。使用具有橡胶粘合剂的软带，少至10次或 更少次胶带剥离，并且在某些实例中少至4次甚至1次的胶带剥离可用于从皮肤表皮层分 离和/或检测核酸分子。在另一个实施方式中，本发明所述的方法提供皮肤损伤的原位表征，包括直接向 皮肤损伤应用可检测地标记的探针以用于视觉分析。使用特异探针在皮肤损伤或周围边缘 或组织上检测至少一种核酸分子，该核酸分子的表达提供黑素瘤或发育不良痣或正常皮肤 的信息。在一个实例中，在皮肤损伤或周围边缘或组织上检测表1-8、10-12、15或其组合所 列举基因中一种或多种的表达，以表征黑素瘤。在一个实施方式中，在样本中检测表10-12 或15中所列举基因中一种或多种的表达，以表征黑素瘤。本文同样提供的是通过以下诊断疾病状态的方法建立对象皮肤上疑为黑素瘤的 目标区域的基因表达模式，并将对象的基因表达模式与得自相应正常皮肤样本的参考基因 表达模式比较。在一个实施方式中，皮肤的目标区域同时在蛋白质水平上表达多种是黑素 瘤的标志的基因。在另一个实施方式中，在表1-8、10-12、15或其任意组合中列举了该基 因。在另一个实施方式中，在表8或12中列举了该基因。在一个实施方式中，诊断疾病状态的方法包括基因的核酸序列中一个或多个突变的检测。这种突变可以是造成皮肤样本所来源对象的病态的核酸序列的置换、缺失和/或 插入。在一个实施方式中，在表1-8、10_12、15或其任意组合中列举了该基因。在另一个实 施方式中，在表8或12中列举了该基因。另一方面，本发明提供了用于表征对象皮肤损伤的试剂盒。在一个实施方式中，该 试剂盒包括皮肤样本收集装置，如活组织检查针或用于非创伤性胶带剥离的胶带，以及一 种或多种探针或引物，该探针或引物选择性结合表1-8和10-12、15任意一个中的一种或多 种核酸分子或表1-8、10-12和15任意一个中的核酸或核酸分子的蛋白质表达产物。例如， 在一个实施方式中，所分析的基因是下列的任意一种或多种干扰素调节物6、密蛋白23、 黑素-A、骨硬化症相关跨膜蛋白1、RAS样家族11成员B、辅肌动蛋白α4、跨膜蛋白68、富甘 氨酸蛋白(GRP3S)、转录因子4、假设蛋白FLJ20489、体细胞色素C、转录因子4、叉头框Ρ1、 转导蛋白ERBB2-2、谷氨酰胺酰-肽环转移酶(谷氨酰胺酰环化酶)、假设蛋白FLJ10770、磷 酸硒合成酶2、胚胎Fyn相关底物、Kruppel样因子8、Discs大同源物5 (果蝇)、G蛋白信号 传导调节物10、ADP核糖基化因子相关蛋白2、TIMP金属肽酶抑制因子2、5_氨基咪唑-4-氨 甲酰核糖核苷酸转甲酰酶/IMP环水解酶、类似RIKEN cDNA 5730421E18基因、G蛋白信号 传导调节物10、假设核RNA结合蛋白、酪氨酸酶相关蛋白1、TIMP金属肽酶抑制因子2、密蛋 白1、转录因子4、溶质载体家族16 (单羧酸转化体)成员6 (类似于溶质载体家族16成员 6;单羧酸酯转化体6)或其任意组合。在另一个实施方式中，试剂盒包括微阵列，该微阵列 至少包含表1-8、10-12、15的任一个或其任意组合所鉴定基因或核酸或基因的蛋白质产物 的片段。在另一个实施方式中，用于表征对象皮肤损伤的试剂盒包含涂布器和一个或多个 探针或引物，该探针或引物选择性结合表1-8和10-12、15中任一个的一种或多种核酸分子 或表1-8、10-12和15中任一个的核酸或核酸分子的蛋白质表达产物。在一个实施方式中， 探针可检测地标记以用于RNA表达的视觉鉴定。附图简述图IA和IB是将EDR、PTP和PTN的数据显示为样本大小的函数的图表，其假设阈 P < 0. 05，该阈值说明痣和初级黑素瘤之间探针/基因表达差异的显著性。图2A和2B是显示样本大小分析数据的图表，该分析在比较正常皮肤、痣和初级黑 素瘤的方差分析(ANOVA)背景中考虑痣与初级黑素瘤的对比结果。图3A和;3B是以不同的假设显著性水平显示专门集中于后验真概率(PTP)的分析 数据的图表。图4A至4D是显示用于从非典型痣和正常色素沉着皮肤分辨黑素瘤的基因分类建 立的图像和图表。图5A和5B是显示用于从非典型痣和正常色素沉着皮肤分辨黑素瘤的已建立分类 的预测分析数据的图表。图6A至6E是显示用于从非典型痣和正常色素沉着皮肤分辨黑素瘤的已建立分类 的预测分析数据的图表。图7是从非典型痣和正常色素沉着皮肤分辨黑素瘤的鉴定基因的等级聚簇分析。图8是显示鉴定基因分类建模结果的图表。图9是显示用于从非典型痣和正常色素沉着皮肤分辨黑素瘤的已建立分类数据的图表。

图10是显示应用基于非入侵性胶带剥离的基因组模式从非典型痣分辨黑素瘤的 分类建立的图像。图11是描述从非典型痣分辨黑素瘤的19-基因分类建立的图像。图12是这样的图像显示在图11中鉴定的19-基因分类中的鉴定基因的等级聚 簇分析。图13是显示10个黑素瘤和10个痣样本针对图11所鉴定的19-基因分类的结果 的图像。图14是显示用于从正常色素沉着皮肤分辨日光性着色斑的已建立分类数据的图表。图15是图14中从正常色素沉着皮肤分辨日光性着色斑的鉴定基因的等级聚簇分 析。图16是显示用于从正常色素沉着皮肤分辨日光性着色斑的已建立分类的预测分 析数据的图表。图17是从非典型痣和基底细胞癌分辨日光性着色斑的基因表达模式的等级聚簇 分析。图18是从恶性雀斑样痣分辨日光性着色斑的基因表达模式的等级聚簇分析。图19是从恶性雀斑样痣分辨日光性着色斑的28-基因的等级聚簇分析。发明详述本发明部分基于下列发现核酸分子的分析或来自特异基因的核酸分子的蛋白质 表达产物的分析可用于表征对象的皮肤损伤。因此，本发明通过确定一种或多种特异目标 基因的表达模式(expression profile)提供了对检测癌症，尤其黑素瘤有用的方法和试剂 盒。此外，本发明通过确定一种或多种特异目标基因的表达模式提供了对于从癌症分辨日 光性着色斑有用的方法和试剂盒。对于进行基因组范围的黑素瘤表达模式研究有两个主要动机。第一，黑素瘤是从 良性损伤至癌症的逐渐恶化最佳表征的癌变模型之一正常色素沉着细胞至痣至非典型痣 至原位初级黑素瘤至侵入性初级黑素瘤至侵袭转移性黑素瘤。已知该恶化与独特的染色体 变化有关，并据认为由基因表达中逐步递进的变化调节，这意味着表达模式可鉴定造成黑 素瘤肿瘤发生的基因。确实，已用黑素瘤细胞系的微阵列分析鉴定候选肿瘤基因。第二个 原因是肿瘤的分子表征可允许更好的肿瘤和预后预测的阶段分类。当组织学特征如肿瘤厚 度和溃烂作为预后前兆具有一些价值时，缺少有助于确定哪些患者会恢复良好、哪些患者 会有恶化疾病和转移的信息标记。肿瘤微阵列实验中所鉴定的分子标记已被引入乳癌控制 的临床实践。黑素瘤和黑素瘤细胞系的基因表达模式实验表明可改善黑素瘤的分类，但研 究缺乏足够的能力来定义分子诊断标准或鉴定预后标记；这些标记的建立将代表黑素瘤治 疗的重大进步。缺乏有力的黑素瘤微阵列研究的主要原因是不像大多数的实体肿瘤，有必 要将石蜡嵌入和对整个损伤切片以用于组织学，未给RNA分离留下样本。虽然现在这种情 况正在改变，但在做出确诊前避免活组织检查的能力对于一般不适于一个或多个活组织检 查的对象还是强大的。如本说明书和所附权利要求所用，单数形式(“a”、“an”和“the”)包括复数的指代，除非上下文明确另外表示。因此，例如，指代“方法(the method)”包括本文所述类型的 一种或多种方法和/或步骤，在阅读本公开等的基础上其对于本领域技术人员将是显而易 见的。除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技 术人员常规理解相同的含义。虽然与本文所述那些相似或等同的任何方法和物质均可用于 本发明的实践或测试，但现说明优选的方法和材料。本文所用术语“对象”指主题方法所进行的任何个体或患者。一般，对象是人，尽 管如本领域技术人员会知道，该对象可以是动物。因此，其他动物，包括哺乳动物如啮齿类 动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔；农场动物，包括牛、马、山羊、绵羊、猪等；以 及灵长类动物(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)被包含在对象的定义中。如本文所用，术语“样本”和“生物样本”指适于本发明所提供方法的任何样本。细 胞样本可以是任何样本，包括例如，通过对象的非创伤性胶带剥离或活组织检查得到的皮 肤样本或对象的体液样本。因此，在一个实施方式中，本发明的生物样本是组织样本，例如 活组织检查样本，如来自针活组织检查的样本。在一个实施方式中，术语“样本”指得自对 象皮肤的任何制备物。例如，应用本文所述非创伤性方法得到的细胞样本可用于分离用于 本发明所述方法的核酸分子或蛋白质。本发明的样本一般取自皮肤损伤——该损伤被疑为 疾病或病理或生理状态的结果，如牛皮癣或皮炎或周围边缘或组织。如本文所用，“周围边 缘”或“周围组织”指邻近皮肤损伤，但却呈现正常或无损伤的对象的组织。如本文所用，“相应的正常细胞”或“相应的正常样本”指来自与检测的细胞相同 器官和相同类型的对象的细胞或样本。一方面，相应的正常细胞包括得自没有皮肤损伤或 皮肤癌的健康个体的细胞样本。这种相应的正常细胞可以但不必来自同龄或与提供检测 细胞的个体同性的个体。因此，术语“正常样本”或“对照样本”指取自相似物种对象的任 何样本，该样本被认为健康或另外没有遭受某种疾病、病理或生理状态，或者来自相同对象 无皮肤损伤的区域。因此，RNA的正常/标准水平表示正常样本里样本中所含RNA的水平。 可以通过结合取自正常健康对象的皮肤样本或细胞提取物和确定所存在的一种或多种RNA 的水平来建立RNA的正常水平。此外，也可将RNA的正常水平确定为取自对象群体的平均 值，该对象群体被认为是健康的，或至少无特定疾病、病理或生理状态。因此，可将对象、对 照和疾病样本的RNA水平与标准值比较。标准值和对象值间的偏差确定用于诊断或表征疾 病的参数。术语“皮肤”指身体的外保护层，由表皮(包括角质层)和下方真皮组成，并且被 理解为包括汗腺和皮脂腺以及毛囊结构。贯穿本发明，形容词“皮肤的”可用，并应当被理 解为一般指皮肤特性，适于其所应用的上下文。人类皮肤的表皮包括皮肤组织的几种不同 层。最深层是表皮基底层，其由柱状细胞组成。覆盖层是棘层，其由多面形细胞组成。由棘 层推高的细胞变平并合成透明角质颗粒，形成颗粒层。随着向外移动，这些细胞失去其核， 并且透明角质颗粒融合并混合张力原纤维。这样形成清晰的层，被称为透明层。透明层的 细胞紧密聚集。随着从透明层向上移动，细胞变压紧成为多个不透明鳞状层。这些细胞均 为变平的细胞残体，其已被充满角蛋白并失去所有其他内部结构，包括核。这些鳞片构成表 皮外层，角质层。在角质层底部，细胞紧密堆积并相互牢固地粘附，但在该层较高处，其变得 松散堆积，并最终从表面脱落。
如本文所用，术语“皮肤损伤”指皮肤区域中颜色或结构的变化。如此，“疑为黑素 瘤的皮肤损伤”是具有恶性黑素瘤特征的皮肤损伤，其为本领域技术人员如皮肤科医师和 肿瘤学家所熟知。这种损伤有时突起，并可具有与个体正常皮肤颜色不同的颜色(例如，棕 色、黑色、红色或蓝色)。疑为黑素瘤的损伤有时包括混合颜色，通常不对称，可随时间在外 观上改变，并可能出血。疑为黑素瘤的皮肤损伤可以是痣(mole或nevus)。黑素瘤损伤通 常但不总是在直径大于6mm。黑素瘤包括浅表扩展性黑素瘤、结节性黑素瘤、肢端黑素瘤和 恶性雀斑样痣黑素瘤。术语“恶性雀斑样痣”指皮肤上尤其暴露于阳光下的区域的癌前期 损伤，其为扁平、斑点状和棕色的，具有不规则的轮廓，并缓慢生长数年时间。黑素瘤可发生 在过度暴露于阳光下的皮肤上。因此，在一个实施方式中，皮肤样本取自过度暴露于阳光的 皮肤区域。术语“发育不良痣”指非典型痣或其外观不同于普通痣的痣。发育不良痣一般比普 通痣大，并具有不规则和不清晰的边线。其颜色通常不均勻，并且在粉色至黑棕色范围内； 其一般扁平，但部分可能突起在皮肤表面上。可在任何地方找到发育不良痣，但最常见是在 对象的躯体上。如本文所用术语“癌(cancer)”包括任何恶性肿瘤，包括但不限于癌(carcinoma) 和肉瘤。癌源于细胞不受控和/或不正常的分裂，然后该细胞侵入并毁坏周围组织。如本文 所用，“增殖(proliferating和proliferation)”指细胞进行有丝分裂。如本文所用，“转 移”指恶性肿瘤自其起源区向远处扩展。癌细胞可通过血流、通过淋巴系统、穿过体腔或其 任意组合转移。本文所提供的术语“癌细胞”包括被任意一种本文所提供的癌状况感染的 细胞。术语“癌(carcinoma)”指由趋于渗入周围组织并引起转移的上皮细胞组成的恶性新 生长。术语“黑素瘤”指黑素细胞的恶性肿瘤，其主要被发现在皮肤中，但也在肠和眼睛中。 “黑素细胞”指位于皮肤表皮的底层，基底层和眼睛中间层的细胞。因此，“黑素瘤转移”指 黑素瘤细胞向区域性淋巴结和/或远处器官的扩展(例如，肝脏、大脑、乳房、前列腺等)。术语“基底细胞癌”或“BCC”指缓慢生长的肿瘤，其具有局部侵入性，但鲜有转移。 其得自表皮或毛囊上皮细胞最深层的基底细胞。BCC是普通的皮肤癌，其通常与过度暴露于 阳光有关。也已知为阳光引起的雀斑或老年斑的术语“日光性着色斑(solar lentigo或 solar lentigines)”是由自然或人为紫外(UV)光引起的深色(过度色素沉着)损伤。日 光性着色斑可以是单个或多个。日光性着色斑是良性的，但其的确表明过度阳光暴露，是皮 肤癌产生的风险因素。该损伤在数量上趋于随年龄增长，使其在中年和老年人群中成为普 遍。其大小可从0.2至2. Ocm变化。这些扁平损伤通常具有离散的边线，颜色深暗，并具有 不规则的形状。如本文所用，术语“基因”指沿DNA片段的线性核苷酸序列，其为RNA的合成提供 编码指令，当该RNA被翻译为蛋白质时，导致遗传性状的表达。如此，术语“皮肤标记”或 “生物标记”指这样的基因其在恶性黑素瘤位点的皮肤表面样本与正常皮肤或良性损伤如 良性痣的皮肤表面样本之间的表达水平不同。因此，本发明黑素瘤皮肤标记的表达与黑素 瘤有关或指示黑素瘤。本领域已知多种统计技术，其可用于确定是否是在高(例如，90%或 95%)置信水平上观察到统计学上显著的表达差异。如此，这些基因在表达中的增加或减 少与恶性黑素瘤有关并可表征恶性黑素瘤。在一个实施方式中，在恶性黑素瘤位点附近的
14皮肤样本与正常皮肤的皮肤样本之间具有至少两倍的水平差异。如本文所用，术语“核酸分子”指单链、双链或三链DNA、RNA及其任何化学修 饰。考虑核酸的实际上任何修饰。“核酸分子”几乎可以是任何长度，长度从10、20、30、 40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、500、600、700、800、900、1000、 1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10，000、15，000、 20，000,30, 000,40, 000,50, 000,75, 000,100,000,150,000,200, 000,500, 000,1, 000，000、 1，500, 000,2, 000, 000,5, 000, 000或甚至更多碱基，多至全长染色体DNA分子。对于分析基 因表达的方法，从样本中分离的核酸一般是RNA。微小RNAs (miRNA)是平均22个核苷酸长度的小型单链RNA分子，其参与调控不 同物种——包括人类——的mRNA表达(Bartel 2004中综述)。第一个miRNA的报道是 lin-4基因的miRNA，被发现于蠕虫C. elegans(Lee，Feinbaum等.1993)中。从那以后，在 昆虫、植物和哺乳动物中发现大量miRNAs。miRNAs通过结合mRNA的3’ -非编码区调控基 因表达，并催化i)mRNA的分裂；或2)翻译的抑制。miRNAs对基因表达的调控是多种生物 过程的核心，如细胞发育、分化、通信和凋亡(Reinhart，Slack等.2000，Baehrecke 2003 ； Brennecke, Hipfner等· 2003 ；Chen, Li等· 2004)。最近，显示miRNA在小鼠表皮胚胎发生 过程中具有活性，并在皮肤形态发生中具有重要作用(Yi，0' Carroll等.2006)。鉴于miRNA在基因表达中的作用，明确的是如果不完全地指定在特定细胞类型 中mRNA的相对量，并由此确定不同细胞类型中特定的基因表达模式(即，特异mRNAs群)， miRNAs会产生影响。此外，很可能不同细胞类型中特异miRNAs在细胞中的特定分布也不 同。因此，组织的miRNA模式的确定可用作该组织中实际mRNA群体的表达模式的工具。所 以，miRNA水平和/或miRNA突变的检测对于下列目的有用疾病检测、诊断、预后或治疗相 关的决策(即，在启动治疗方案前或后显示反应)或对象特定疾病的表征。如本文所用，术语“蛋白质”指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、 寡肽和肽。蛋白质可由天然存在的氨基酸和肽键或合成的拟肽结构组成。因此，本文所用 的“氨基酸”或“肽残基”既意为天然存在的氨基酸和合成的氨基酸。例如，同型-苯丙氨 酸、瓜氨酸和去甲亮氨酸是本发明目的考虑的氨基酸。“氨基酸”也包括亚氨基酸残基，如脯 氨酸和羟脯氨酸。侧链可以以(R)或( 构型。“探针”或“探针核酸分子”是至少部分单链和与目标序列至少部分互补或至少部 分基本互补的核酸分子。探针可以是RNA、DNA或RNA和DNA的组合。同样在本发明范围内 的是，具有包含核酸的探针核酸分子，其中主链糖不是核糖就是脱氧核糖。探针核酸也可以 是肽核酸。探针可包含抗溶核活性的键或可检测的标记，并可被可操作地连接到其他部分， 例如肽。当单链核酸分子可与其他核酸分子的全部或部分碱基配对(杂交)形成双螺旋 (双链核酸分子)时，单链核酸分子基于鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)碱基配对及腺嘌呤(A)与 胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)碱基配对的能力与另一个单链核酸分子“互补”。例如，核苷酸 序列5，-TATAC-3，与核苷酸序列5，-GTATA-3，互补。如本发明所用的术语“抗体”意为包括多克隆或单克隆抗体的完整分子及其片段， 如能结合表位决定子的Fab和F(ab' )2、Fv和SCA片段。术语“特异性结合”或“特异性相 互作用”在当参考抗体使用时意为抗体和特定表位的相互作用具有这样的解离常数至少约1 X 10_6，一般至少约1 X 10_7，经常至少约1 X 10_8，并且特别至少约1 X 10_9或1 X 10,或 更小。如本文所用，“杂交”指核酸链与互补链通过碱基配对结合的过程。杂交反应可 以是敏感的和具有选择性，以便甚至可以在其以低浓度存在的样本中识别特定的目标序 列。在体外环境下，可通过以下限定适当严格的条件例如，预杂交和杂交溶液中盐或甲酰 胺的浓度或杂交温度，这些条件为本领域熟知。特别是，可通过降低盐浓度、增加甲酰胺浓 度和提高杂交温度增加严格性。例如，高严格性条件下的杂交可发生于约50%甲酰胺，于 约37°C至42°C。杂交可发生于约35%至25%甲酰胺、约30°C至35°C的降低的严格性条件 下。特别是，杂交可在以下高严格性条件下发生42°C、50%甲酰胺、5XSSPE、0. 3% SDS和 200mg/ml已剪切何变性鲑精DNA。杂交可在降低的上述严格性条件下发生，除了在降低的 温度35°C、35%甲酰胺中。可通过计算目标核酸的嘌呤嘧啶比和相应地调节温度进一步缩 窄相应于特定严格性水平的温度范围。上述范围和条件的变化在本领域中众所周知。如本文所用，术语“突变”指相对于标准野生型序列的基因组变化。突变可以是核 酸序列在基因组位点的缺失、插入或重排，或其可以是在基因组位点的单个碱基变化，被称 为“点突变”。突变可以遗传，或其可在个体生命期间于一种或多种细胞中发生。如本文所用，术语“试剂盒”或“研究试剂盒”指这样的产品的集合其用于进行生 物研究反应、手术或合成如，例如，检测、化验、分离、提纯等，其对于最终使用者一般被一起 运输，通常在同一个包装中。如本文所用，术语“改善”或“治疗”意为有关癌或黑素瘤的临床标志和/或症状 由于所实施的动作而减轻。所要监控的标志或症状是特定癌或黑素瘤所特有的，并且对于 专业的临床医师是熟知的，监控该标志和情况的方法同样如此。因此，“治疗方案”指用于治 疗对象的疾病或癌的任何系统计划或疗程。可通过多种本领域熟知的方法分离组织样本。分离样本的侵入性方法包括但不限 于针或手术刀的应用，例如在不同组织的活组织检查过程中。分离样本的非创伤性方法包 括但不限于胶带剥离和刮皮。因此，在一个实施方式中，本发明应用了非创伤性胶带剥离技术，得到可疑损伤的 样本。如此，应用DNA微阵列试验建立黑素瘤的非创伤性诊断和/或从日光性着色斑分辨 黑素瘤。胶带剥离从皮肤表面移取了表层细胞和附件细胞。可扩增从胶带剥离细胞分离的 少量核酸分子，并用于微阵列分析和定量PCR。此外，可将从溶解细胞得到的蛋白质定量，以 用于疾病的诊断。因此，胶带剥离是非创伤性的诊断方法，其没有干扰随后的组织学分析， 从而绕过了当前有关黑素瘤的表达模式研究的主要限制。当胶带剥离主要从表皮取样表层 细胞时，该方法由于以下原因在色素沉着损伤的诊断和预后预测中具有巨大前景首先，与 良性痣相比，在许多黑素瘤中色素沉着细胞转移进入表皮和/或附件。因此，基于胶带剥 离，该特征可有助于从黑素瘤分辨良性色素沉着损伤。其次，邻近黑素瘤的真皮和表皮中具 有变化。覆盖黑素瘤的表皮增生呈现与血管发生和转移潜能均有关；这些变化预期将用胶 带剥离方法取样。最后，一些晚期黑素瘤会到达皮肤表面，并且黑素瘤癌细胞会被胶带剥离 直接取样。此外，如果活组织检查每一个损伤是实际不可行的情况下，胶带剥离可用于具有 多个色素沉着损伤的患者的护理。因此，本发明证明了得自胶带剥离与表皮遗传信息检索 (EGIR)(参见美国专利号6，949，338，在此引入作为参考)的角质层RNA可用于在可疑的色素沉着损伤中从发育不良痣分辨黑素瘤。如述，本文所提供的胶带剥离方法一般包括对对象的皮肤应用胶带，并从对象的 皮肤移除胶带一次或多次。某些实例中，对皮肤应用并从皮肤移除胶带约1至10次。或者， 可对皮肤相继应用并从皮肤移除约10条胶带。然后将这些胶带组合以用于进一步分析。因 此，可对目标位点应用并移除胶带10、9、8、7、6、5、4、3、2或1次，和/或可对目标位点应用 并移除10、9、8、7、6、5、4、3、2或1条胶带。一个示例性实例中，对皮肤应用胶带约1次至8 次之间，另一个实例中1次至5次之间，以及另一个示例性实例中，对皮肤应用和移除胶带 4次。橡胶基粘合剂可以是，例如，合成的橡胶基粘合剂。示例性实例中的橡胶基粘合剂 具有高剥离、高剪切和高粘着性。例如，橡胶基粘合剂可以具有这样的峰值力粘着性大于 丙烯酸基胶带如D-SQUAME 的峰值力粘着性至少25%、50%或100%。已发现D-SQUAME 具 有峰值力2牛顿(Newtons)，其中用于本文所提供方法的橡胶基粘合剂的峰值力可以为4牛 顿或更大。此外，橡胶基粘合剂可具有大于丙烯酸基胶带2倍、5倍或10倍的粘性。例如， 应用质构分析仪已发现D-SQUAME 具有0. 0006牛顿米的粘性，而本文所提供的橡胶基胶带 具有约0. 01牛顿米的粘性。此外，某些示例性实例中，本文所提供的方法所使用的粘合剂 比其他橡胶粘合剂——尤其是用于医疗应用和输送带的橡胶粘合剂——具有更高的剥离、 剪切和粘着性。实际上，通过本发明的方法可分别应用和分析任何胶带大小和/或形状和目标皮 肤位点大小和形状。例如，可将胶带制成直径在10毫米至100毫米之间的圆片，例如直径 在15至25毫米之间。胶带可具有约50mm2至IOOOmm2之间、约IOOmm2至500mm2之间或约 250mm2的表面积。在另一个实施方式中，通过侵入性手术的方法得到样本，如活组织检查。可置换胶 带剥离或在胶带剥离后采取活组织检查，并进行标准组织病理学分析。那么与胶带剥离样 本同时取样的活组织检查样本的分析通过DNA微阵列、基因表达数据与组织病理学的关联 和用于黑素瘤诊断的候选表达分类的产生可与所选损伤RNA样本的一种或多种分析所产 生的数据有关。如本文所用，“活组织检查”指用于分析的细胞或组织的移除。本领域已知多种不 同类型的活组织检查手术。最常见的类型包括(1)切取活组织检查，其中仅移除组织样 本；( 切除活组织检查，其中移除整块或整个可疑区域；以及(3核心活组织检查。当使 用细针时，该手术被称为细针抽吸活组织检查。其他类型的活组织检查手术包括但不限于， 刮取活组织检查、钻取活组织检查、刮除活组织检查和原位活组织检查。在另一个实施方式 中，通过用仪器刮皮得到皮肤样本，以便从皮肤移除一种或多种核酸分子。应用胶带剥离方法得到的皮肤样本包括上皮细胞，该上皮细胞包括含有附件结构 的细胞。在某些示例性实例中，样本主要包括上皮细胞甚至独有上皮细胞。上皮主要由角 质形成细胞(> 90% )组成，该细胞不同于基底层，穿过具有下降水平的细胞组织的不同层 向外运动，成为角质层的角化细胞。上皮的更新每20-30天在未牵涉皮肤中发生。上皮中 存在的其他细胞类型包括黑素细胞、Langerhans细胞和Merkel细胞。如本文的实例中所 述，本发明的胶带剥离方法在分离表皮样本中尤为有效。也可通过溶解由本领域技术人员熟知的多种手段从皮肤样本所收集的细胞和细胞物质分离核酸分子。例如，可应用多种可用于分离多核苷酸的商品，包括但不限于， RNeasy (Qiagen, Valencia, CA)禾口 TriReagent (Molecular Research Center, Inc, Cincinnati, OH)。然后可检测或分析已分离多核苷酸的特定核酸序列，包括编码细胞因子 的多核苷酸。在核酸样本中回收目标核酸分子的方法在本领域中众所周知，并可包括微阵 列分析。可以以本领域已知的多种方式分析核酸分子。例如，可通过应用特异核酸分子的 探针或片段经DNA-DNA或DNA-RNA杂交或扩增检测核酸分子的存在。基于核酸扩增的分析 包括寡核苷酸或基于核酸序列的寡聚体的应用，以检测含有特异DNA或RNA的转化体。在一个实施方式中，核酸分子分析包括遗传分析，确定基因的核苷酸序列。由于从 样本分离的DNA片段与已知序列的DNA片段之间在长度或序列上的差异是因为一个或多个 核苷酸的插入、缺失或置换，核酸序列的确定提供了有关突变的信息，该突变对对象疾病状 态的生理具有绝对的影响。这些突变也可包括转位或倒位，并且难以通过除直接测序外的 其他技术检测。例如，最近已显示C-试剂盒-激活突变——L576P的出现可指示恶性黑素 瘤(参见表1)。因此，本发明的方法可用于检测表1-8和10-12中所列举一种或多种基因 的遗传突变，以用于对象皮肤损伤的诊断和/或表征。本领域已知多种应用对蛋白质表达产物具有特异性的多克隆或单克隆抗体检测 和测量核酸分子表达的方案。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA) 和荧光激活细胞分类(FACS)。这些和其他测定在其他地方有所述及，于Hampton，R.等 (1990 ；Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, Minn.)禾口 Maddox, D.Ε.等(1983 ;J. Exp. Med. 158 :1211-1216)。在另一个实施方式中，特异性结合本发明核酸分子表达产物的抗体可用于表征对 象的皮肤损伤。该抗体可具有或不具有修饰，并通过使其与报道分子共价或非共价结合可 将其标记。本领域技术人员已知多种标记和结合技术，该技术可用于各种核酸和氨基酸测 定。产生用于检测与表1-8、10-12和15中核酸分子有关的序列的被标记杂交或PCR探针 的方法包括寡标记(oligolabeling)、缺口翻译、末端标记或应用标记核苷酸的PCR扩增。 或者，可将核酸分子或其任意片段克隆到载体中，以用于mRNA探针的制备。这种载体在本 领域已知，商业上可购，并且通过添加适当的RNA聚合酶如T7、T3或SP6和标记核苷酸可 用于在体外合成RNA探针。可应用多种市售试剂盒(Pharmacia & Upjohn，(Kalamazoo, Mich. ) ；Promega(Madison Wis.)；禾口 U. S. Biochemical Corp. , Cleveland, Ohio)进行这些 程序。可用于方便检测的适当报道分子或标记包括放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或 显色剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒及类似物。PCR系统通常应用两个扩增引物和另外的与扩增子内的位点特异性结合的扩增子 特异荧光杂交探针。该探针可包括一个或多个荧光标记部分。例如，可用两种荧光染料标 记该探针1) 6-羧基-荧光素(FAM)，被定位在5’末端，其用作报道因子，和2、6-羧基-四 甲基-罗丹明(TAMRA)，被定位在3’末端，其用作猝灭剂。当扩增发生时，Taq DNA聚合酶 的5’ -3’核酸外切酶活性使报道因子在延伸期从探针切割，从而使其从猝灭剂中释放。报 道染料的荧光发射的增加在PCR过程中被监控，并表示所产生的DNA片段量。原位PCR可 用于目标核酸分子的直接定位和观察，并可进一步用于将表达与组织病理学发现关联。
用于制备本发明核酸分子的特异杂交探针的方法包括将核酸序列克隆到载体中， 以用于mRNA探针的制备。这种载体在本领域已知，商业可购，并通过添加适当的RNA聚合 酶和适当的被标记核苷酸的方法可用于体外合成RNA探针。杂交探针可被多种报道基团标 记，例如，放射性核素如32P或35S,或酶标记如通过抗生物毒蛋白/生物素结合系统结合到 探针的碱性磷酸酶及类似物。为了为与本发明核酸分子表达有关的疾病诊断和表征提供依据，建立表达的普通 或标准模式。可通过比较从已知皮肤特征的对象得到的值(例如，来自具有黑素瘤、具有发 育不良痣和/或具有如日光性着色斑的对象)定量标准杂交。可将得自这种样本的标准值 与得自下列样本的值比较来自具有疑为黑素瘤的皮肤损伤的对象的样本。用标准值与对 象值之间的偏差确立疾病的存在。因此，本发明的一方面，为皮肤上皮肤损伤的表征提供非创伤性的取样方法。在一 个实施方式中，建立了色素沉着性皮肤损伤的样本组。各样本由胶带剥离或覆盖损伤的表 层上皮活组织检查样本收集的核酸分子组成。除胶带剥离外，也可随同伴随的组织学和诊 断对相同损伤进行标准活组织检查。通过胶带剥离正常皮肤的表层上皮收集的核酸分子将 用作阴性对照。另一方面，本发明提供了从对象的日光性着色斑和/或发育不良痣和/或正常色 素沉着皮肤分辨黑素瘤的方法。在一个实施方式中，该方法包括分析表1-8、10-12、15的任 一个或其任意组合中所列举的一种或多种基因的核酸分子。分析对象皮肤中疑为黑素瘤的 目标区域的大量基因的表达。分析表达包括检测基因表达的任何定性或定量方法，其中许 多为本领域已知。该方法可包括通过应用定量方法测定标记的表达或通过应用定性方法来 分析特异标记的表达。以下说明分析多核苷酸和多肽的非限制性方法。另一方面，本发明提供了从对象的发育不良痣和/或基底细胞癌和/或正常色素 沉着皮肤分辨日光性着色斑的方法。在一个实施方式中，该方法包括分析表1-8、10-12、15 的任一个或其任意组合中所列举的一种或多种基因的核酸分子。分析对象皮肤中疑为黑素 瘤的目标区域的大量基因的表达。分析表达包括检测基因表达的任何定性或定量方法，其 中许多为本领域已知。该方法可包括通过应用定量方法测定标记的表达或通过应用定性方 法来分析特异标记的表达。以下说明分析多核苷酸和多肽的非限制性方法。分析本发明所述基因的表达的方法可应用微阵列或其他微型高通量技术，以检测 一种或多种基因产物的表达。本领域也已知应用这种微阵列的表达水平定量测量，并且一 般包括用于测量本文所述表达的传统方法的改良版本。例如，可通过测量结合微阵列点的 放射性标记探针的磷光体图像，应用磷光体成像仪和成像软件进行这样的定量。相关方面中，本发明提供了通过鉴定新型诊断标记诊断对象的多种疾病状态，尤 其是分类和诊断黑素瘤的方法。此外，本发明提供了从发育不良痣和/或恶性雀斑样痣和/ 或正常皮肤分辨日光性着色斑的方法。因此，本发明提供了通过鉴定新型诊断标记诊断对 象的多种疾病状态——尤其是分类和诊断黑素瘤的方法。通过鉴定对于给定状态唯一的基 因组，可以以诊断为目的应用这些遗传表达的差异。在一个实施方式中，核酸分子是RNA，包 括从对象的样本分离的信使RNA (mRNA)。可随后组合给定疾病状态的上调和下调基因组。该 组合使本领域技术人员能鉴定对于给定疾病状态唯一的基因组(sets或panels)。这种基 因组具有巨大的诊断价值，因为可将其普遍应用在比微阵列分析简单的测定中(例如“实时”定量PCR)。这种基因组也为新型药物的设计提供对发病机理的深入了解和靶标。包含多种参考设计模式的参考数据库也由具有已知状态——如正常(即，非黑素 瘤)状态和不同的皮肤癌疾病状态和/或色素沉着的非癌状态——的对象皮肤样本被建立 起来。然后将设计模式与包含参考设计模式的参考数据库比较。如果对象的设计模式最 符合数据库中特定疾病状态的模式，那么诊断该对象具有这种疾病状态。可应用不同的计 算机系统和软件实施本发明的分析方法，且对于本领域技术人员是明显的。示例性的软件 禾呈序包括但不限于 Cluster & TreeView(Stanford, URLs :rana. lbl. gov 或 microarray. org)、GeneCluster(MIT/ffhitehead Institute, URL :MPR/GeneCluster/GeneCluster. html)、Array Explorer (SpotFire Inc, URL :spotfire. com/products/scicomp. asp#SAE) 禾口 GeneSpring(Silicon Genetics Inc, URL :sigenetics.com/Products/GeneSpring/ index, html)(对于计算机系统和软件，同样参见美国专利号6，203，987，在此引入作为参 考)。另一方面，本发明的方法包括皮肤损伤的原位分析用于对其表征。对于原位方法， 不需要在分析前从对象分离核酸分子。在一个实施方式中，使可检测标记的探针与对象的 细胞或组织接触，用于表达RNA的视觉检测，以表征皮肤损伤。另一方面，本发明的方法也可用于监控疾病进程和治疗效果。例如，通过比较治疗 前的设计模式与治疗后的模式。在一个实施方式中，该方法基于表1-8中一种或多种核酸 分子的分析将癌表征为黑素瘤转移。在另一个实施方式中，该方法基于表10-12和15中一 种或多种核酸分子的分析表征日光性着色斑。已知多种情况下，对象中黑素瘤诊断确立时 转移已经发生，因为黑素瘤包含由以下表征的多个细胞群体不同的生长速率、核型、细胞 表面性质、抗原性、免疫原性、侵入性、转移性和对细胞毒性药物或生物剂的灵敏度。因此， 本发明可用于表征已从黑素瘤转移的器官癌。在相关方面中，本发明的方法也可用于为患有具体癌或黑素瘤的对象确定适合的 治疗方案。在另一个相关方面中，本发明的方法也可用于为患有日光性着色斑的对象确定 适合的治疗方案。因此，本发明所述的方法可用于为实践个性化治疗提供方法，其中治疗是 基于对象癌症或皮肤损伤的具体特征为对象量身定制的。可实践该方法，例如通过首先确 定皮肤损伤是否为黑素瘤或日光性着色斑，如上所述。可从被治疗的对象得到根据本方法检测的细胞样本，或者该细胞样本可以是与对 象中类型相同的已建立的癌细胞系中的细胞。一方面，已建立的细胞系可以是这种细胞系 组其中之一，其中该组可包括同种疾病类型的不同细胞系和/或与目标基因表达相关的不 同疾病的不同细胞系。这种细胞系组可用于例如，在仅少量细胞可从被治疗的对象得到时 实践本方法，从而提供对象细胞的替代样本；并且也可用于在实践本方法时囊括对照样本。一旦建立了疾病和/或皮肤损伤的表征并启动了治疗方案，可定期重复本发明的 方法，以监控对象中目标基因的表达模式。从连续分析得到的结果可用于显示在数天至数 月范围的一段时间里的治疗效果。因此，本发明的另一方面涉及这样的方法监控治疗患有 皮肤癌的对象的治疗方案。治疗前和治疗中核酸分子的核酸序列的表达模式或突变的比较 可表明治疗的效果。因此，如果需要，本领域技术人员能理解并调整治疗方法。可以通过在治疗开始时对象特定癌症的症状或临床征兆的消失鉴定用于治疗癌 症的治疗方案随时间的效力。在被诊断为患有特定癌症的对象中，可通过测量对象的征兆和症状严重性的减轻或通过疾病替代终点的出现来评价本发明方法的效力。此外，这种方法可有助于鉴定具有疾病发展倾向的个体，或者可提供在实际临床 症状出现前检测疾病的方法。该类型中更确定的诊断使保健专家能更早地应用预防措施或 积极的治疗，从而防止癌症的发展或进一步恶化。当以高通量(或超高通量)形式进行时，可在固相支持体(例如，微量滴定板、硅 片或载玻片)上进行本发明所述的方法，其中将细胞样本和/或目标基因放置成以便每一 个相互描绘(例如，在加样孔中)。可应用这种方法并行检测多个样本或基因(例如，96、 10M、10，000、100，000或更多)，取决于所用的具体支持体。以阵列(即，限定图式)放置 样本时，可通过其位置(例如，利用χ-y轴)定义阵列中的各个样本，从而为各个样本提供 “地址”。应用可寻址阵列方式的优势在于该方法可全部或部分自动化，从而可将细胞样本、 试剂、目标基因及类似物在所需的时间分配至指定位置(或从具体位置移除)，并可监控样 本(或等分试样)，例如，监控表1-8、10-12和15中所列举基因的任意一种的表达产物和/ 或核酸分子的核酸序列中的突变。因此，微阵列可用于同时监控大量基因的表达水平(生成转录物图像)和鉴定遗 传变异、突变和多态性。微阵列中所用的多核苷酸可以是这样的寡核苷酸其对一个或多 个目标基因具有特异性，其中至少序列的片段已知；或对一个或多个未鉴定CDNAs具有特 异性，所述cDNAs对于特定细胞类型、发育或疾病状态是常见的。为了生成已知序列的寡 核苷酸用于微阵列，应用计算机运算法则检测目标基因，该运算法则在核苷酸序列的5'末 端，更优选在3'末端起始。该运算法则鉴定具有限定长度的寡聚体，其对于基因是独特的， 具有适于杂交范围内的GC含量，并且缺少预期的可能妨碍杂交的二级结构。某些情况下， 适合在微阵列上应用寡核苷酸对。除了优选位于序列中心的一个核苷酸外，这些寡核苷酸 “对”一致。对中第二个寡核苷酸(被一个错配)可用作对照。寡核苷酸对的数量可在二至 一百万的范围内。应用光定向化学方法在基底上指定区域处合成寡聚体。基底可以是纸、 尼龙或其他类型的膜、滤器、芯片、载玻片或任何其它适合的固相支持体。根据本发明的另一方面，提供了可用于在细胞或组织中检测癌的试剂盒，例如，应 用本发明所提供的用于表征对象皮肤损伤的方法。在一个实施方式中，本发明的试剂盒包 含皮肤样本收集装置和选择性结合表1-8、10-12和15的任一个中的一种或多种核酸分子 的一种或多种探针或引物。在另一个实施方式中，试剂盒包含除皮肤样本收集装置外或取 而代之的一种或多种涂布器。这种涂布器可用于在对象皮肤上进行基因表达的原位分析。 例如，涂布器可用于施用可检测地标记的探针用于表达RNA的视觉检测，以表征皮肤损伤。在另一个实施方式中，本发明的试剂盒包含结合表1-8、10-12和15的任一个中的 部分核酸分子的探针。在另一个实施方式中，试剂盒进一步包含这样的微阵列其至少含有 表1-8、10-12和15中所列举基因的任意一种的基因或核酸分子或蛋白质产物的片段。在 一些实施方式中，可在本发明的试剂盒中提供多种试剂，仅其中一些应当在特定反应或程 序中被一起应用。例如，可提供多种引物，仅需要其中两种用于特定的应用。在另一个实施方式中，本发明的试剂盒提供了区室化载体，该载体包含含有一对 引物的第一个容器。该引物一般是选择性结合基因一条链上游的正向引物和选择性结合基 因互补链上游的反向引物。任选地，本发明的试剂盒可进一步包含操作说明，例如，公开了 利用样本收集装置的样本收集方法和/或示例性基因表达模式，用于与取自对象的样本的
21表达模式进行比较。提供以下实施例进一步说明本发明的优势和特征，但非意为限制本发明的范围。 在其为可应用方法的典型时，可以可选地应用其它本领域技术人员已知的程序、方法学或 技术。实施例1RNA定量和序型分析(概况分析，profiling)本研究的核心假设是可通过粘合方法收集原位覆盖或覆盖侵入性黑素瘤的上皮 细胞，包括但不限于角质层、透明层和颗粒层，以及此样本中所包含的RNA形式的基因表 达的性质和数量与邻近的表皮样本相比被差异性地表达，即，由于下面的黑素瘤，被取样的 RNA样本可被诊断。在前已经显示具体基因的基因表达变化在这样的表皮增生中是可检测 的其覆盖得自表皮手术样品的人类皮肤黑素瘤样本(McCarty等，2003)。本研究被分成两个独立的阶段，样本收集和表征阶段(阶段1)和RNA序型分析阶 段(阶段2)。在阶段1中，由主要调查人员或主要调查人员委派的实习人员进行胶带剥离 样本和活组织检查样本的收集，以得到不同位点的活组织检查样本。所有活组织检查均经 过标准的组织病理学分析。RNA序型分析阶段(阶段幻包括但不限于RNA纯化和杂交到 DNA微阵列，以用于基因表达序型分析。材料和试剂。胶带以整卷购自Adhesives Research (Glen Rock，PA)。由 Diagnostic Laminations Engineering(Oceanside，CA)将这些胶带卷定制成小圆片，直 径 17 毫米。人脾总 RNA 购自 Ambion(catalogue#7970 ；Austin, TX)。RNeasy RNA 提取 试剂盒购自Qiagen (Valencia，CA)。逆转录酶、PCR引物和探针以及包含用于特定cDNAs 扩增和荧光检测必需的所有缓冲液和酶的iTaqMan Universal Master Mix购自Applied Biosystems (Foster City, CA)。MELT 总核酸分离系统购自 Ambion (Austin, TX)。RNA 分离。利用压力循环技术(PCT ；Garrett, Tao 等· 2002 ；Schumacher, Manak 等.2002)或MELT总核酸系统从胶带上提取RNA。通过用1. 2mls的缓冲液RLT(Qiagen RNeasy 试剂盒中提供)插入 PULSETM 管(Pressure Biosciences, Gaithersburg,MD)成对 提取胶带。将PULSE 管插入PCT-NEP2017压力循环器，并应用下列参数提取样本室温； 5个35Kpsi的压力循环，在每次循环顶端和底端压力持续20秒；压力提取后，去除缓冲液， 并用于处理其余用于剥离该位点的胶带；然后根据较大RNAs( > 200核苷酸)收集的标准 Qiagen RNeasy方案通过施用于较大RNA分子(即mRNAs)结合的纯化柱处理缓冲液，同时 保留柱流通，以用于微小RNA的纯化。根据Qiagen miRNA纯化程序(在万维网的qiagen. com/literature/protocols/pdf/RY20. pdf)处理柱流通——该柱流通包含从mRNA分离的 miRNA,以便纯化微小RNA。混合来自在各对象上所剥离的2个位点的RNA，以产生各对象的 独单个样本。应用MELT总核酸方案的RNA分离。在具有19&ι1 MELT缓冲液和8ml MELT混合 液(cocktail)的anl印pendorf管中提取胶带，并在室温下涡旋10分钟。在> 10，OOOXg 下旋转减慢3分钟后将MELT溶解产物移至分配的结合珠主要混合物，并用300ml洗液1和 2洗涤。在100ml洗脱液中洗脱RNAs。mRNA的定量。实验数据被报告为达到具体cDNA荧光阈所需的PCR循环数，并被表 示为 “Ct” 值(Gibson, Heid 等· 1996 ；Heid, Stevens 等· 1996 ；AppliedBiosystems2001)。如在前所述进行总RNA量的定量(Wong，Tran等.2004)。简要地，通过参考由商购人脾总 RNA 生成的标准曲线(Ct,a。tin vs. log[RNA] ；AppliedBiosystems2001)应用定量 RT-PCR 确 定从胶带收集的RNA质量。参考标准曲线，用6次重复Ct, actin值的平均值计算样本中RNA 的浓度。RNA扩增和阵列杂交。通过多酶组织液化(Multi-Enzymatic Liquefaction of Tissue)法(Ambion, Austin, TX)分离 RNA,并应用 WT-Ovation pico 扩增系统(NuGen, San Carlos，CA)扩增RNA。将扩增RNA与Affymetrix U133+2. 0微阵列杂交，并应用 Bioconductor的R处理和分析数据。样本大小。实施例2中显示了样本大小的计算。该分析预测为了以高预测值(P < 0. 001)找到25-40个基因用于从黑素瘤分辨良性痣，那么需要约30个黑素瘤和30个非 黑素瘤损伤。预处理基因芯片(GeneChip)数据。应用GCOS软件(Affymetrix)将用Affymetrix 系列3000扫描仪扫描Affymetrix基因芯片得到的图像文件转换为“CEL”格式的文件。应 用Bioconductor组的软件(在万维网bioconductor. org上)执行CEL文件标准化的。特 别地，如“gcrma”包中功能“just, gcrma”所实施的具有光学干扰调整和寡核苷酸探针结合 亲和性的强大的多阵列分析(Wu等.，2006 ；和mi等.，2004)将用于将基因芯片数据标准 化。微阵列数据分析的统计学方法。本方案解决了两个遗传统计问题(i)鉴定在不 同种类的损伤(即，黑素瘤与非黑素瘤损伤)中差异表达的基因和(ii)基于基因表达数据 形成(和评价)黑素瘤和非黑素瘤损伤的分类成组的规则。最重要的分组在活组织检查结果的基础上将黑素瘤与非黑素瘤划分开。将用于解 决以上所确定的问题的方法现在在微阵列数据的统计学评价中成为标准(参见Smyth等， 2003 ；和Lee，2004)。已由其他人应用这些方法从Affymetrix阵列收集数据，以研究前列腺 癌中的基因表达(Stuart等，2004)，表征HIV感染后基因表达的变化(Mitchell等，2003)， 以及建立高通量基因型平台(Wolyn等，2004 ；和Borevitz等，200 。为了鉴定差异表达的 基因，优选基于排列的错误发现率评价(参见Efron等，200 。开发R定量程序设计环境的 脚本以实施我们早前成果中的这些方法，但该脚本可能应用或采用本项目中Bioconductor 组的“siggenes”包。分类规则的建立将取决于在我们早前工作中所应用的再采样方法(k 重交叉验证(k-fold cross-validation)、632+引导程序(632 plus bootstrap)和 / 或 MT" naive Bayes 分类禾口最接近缩/J、失巨^ll、分类(nearest shrunken centrid classifier) (Tibshirani 等，2002)的集合(bagging) (Hastie 等，2001))和支持向量机(SVM)，二者在 将前列腺组织分类为恶性或良性中运行良好。可能应用的实施是进行k重交叉验证。在每 次k重培训/测试循环中，进行差异表达基因的培训数据的初始筛选并根据其差异表达的 后概率将基因排序。在1至IOM之间选择足值的r形成具有最高差异表达的后概率、基于 r基因的Naive Bayes和最接近缩小矩心分类，以允许分类错误率的精确插值。对测试组的 错误率应用“one serule" (Brieman等，1984)，以选择将错误率最小化的分类。对于SVM， 向各培训样本应用内部632+引导程序，以选择用于产生分类的基因数量。来自K测试组的 “1 serule”错误率表征分类准确性。除一元和多元统计分析工具的应用外，复杂的生物信息学分析方法将有助于了解发现被差异表达的基因之间——例如黑素瘤与非黑素瘤样本之间——可能的生物 连接。这些方法将集中于遗传网络和途径的分析(Edelman等，2006 ;Kong等，2006 ；和 Pang等，2006)，并且在软件包中实施该方法，如hgenuity (在万维网ingenuity, com)和 MetaCore (在万维网genego. com)。基因表达微阵列分析中出现的基因之间生物连接的鉴 定可有助于将其表达模式的生物意义融入背景，并且有助于基于其生物学减少在诊断组上 呈现的差异表达基因组。该分析的最终结果将被设定为在未来、较大临床检测中验证的候 选表达分类。RNA、扩增的cDNA和微阵列数据的QC标准。遵循通知的协议，应用EG 胶带剥离 可疑的色素沉着损伤，然后根据护理标准进行活组织检查。将从EG^胶带分离得到的RNA 扩增并在AfTymetrix U133+2. 0基因芯片上序型分析。通过GCRMA运算法则将微阵列数 据标准化。为了确保生成高质量的微阵列数据，为RNA、扩增的cDNA和微阵列数据建立QC 标准(metrics)。应用Experion系统(Biorad，Hercule, CA)通过毛细管电泳评价RNA的 性质，并进一步处理具有至少一种可视18S rRNA的RNA，以用于RNA扩增。通过Nanodrop 系统定量扩增的cDNA，并且也通过Experion系统评价扩增cDNA的性质。大于5mg的扩增 cDNAs产量和大于750nt的cDNAs平均分布量接着用于微阵列杂交。应用R的simpleaffy 程序进一步评价阵列数据的性质，并且具有小于5. O的标度因子和大于30%的百分数当前 指示(present call)的阵列数据用于进一步的数据分析。类建模(Class Modeling)-PAM0经过阵列数据QC后，进一步分析14个黑素瘤、40 个发育不良痣和12个正常皮肤的样本。首先，滤出所有样本中小于50的基因表达值，并测 试16716个探针组。应用ANOVA(ρ < 0. 05)、多次测试校正算法(ffestafall and Young排 列)和0. 05的错误发现率(FDR)，使这些16716个探针组经过黑素瘤、发育不良痣和正常皮 肤间差异表达基因的统计学分析。如上所述，原117个基因中发现89个基因的组(表2) 是潜在的黑素瘤分类。进一步的检验鉴定5-基因分类(表幻、包含新鉴定基因的30-基因 分类(表4)、包含新鉴定基因的20-基因分类(表幻和包含新鉴定基因的19-基因分类， 其均可用于从非典型痣分辨黑素瘤。应用Manford University (Stanford, CA)免费提供 的微阵列预测分析(PAM)软件分析基因和各分类组。PAM软件利用了最接近矩心方法的修正，该软件计算培训组中各类的标准化矩心。 其涉及由该基因种类之内的标准偏差划分的各个种类中各基因的平均基因表达。最接近矩 心分类采用新样本的基因表达模式，并将其与这些类矩心中的每一个进行比较。其平方距 离上所最接近的矩心的种类就是该新样本的预测种类。使这些基因全部进行等级聚簇分析，黑素瘤样本分组在一起，并从发育不良痣和 正常皮肤被清楚分辨出来。此外，有三个独特的发育不良痣种类；一类与正常皮肤分组在 一起，第二类在正常皮肤与黑素瘤之间，而第三类与黑素瘤分组在一起。这些数据表明由用 EG^进行胶带剥离得到的角质层RNA可用于在可疑色素沉着损伤中从发育不良痣分辨黑 素瘤。基因分析作为潜在的黑素瘤分类以分辨黑素瘤与发育不良痣，应用t检验(ρ <0.01)、FDR(0.05)和黑素瘤与发育不良痣间的2倍差异进行。在原始117个基因中，发 现89个基因的组(表幻是潜在的黑素瘤分类，并且使该89个基因的功能进行创造力路径 分析(Ingenuity Pathway Analysis, I PA) (Ingenuity, Redwood City, CA) 其中，15个基因与毛发和皮肤的发育和功能有关，18个基因与细胞发育有关，16个基因与细胞生长和增 殖有关，以及M个基因与癌有关。因此，差异表达的基因是与黑素细胞的生物功能有关的 基因，包括黑素的生物合成、黑素细胞增殖、分化和发育。(参见图5和6)。类建模-随机森林(Random Forests)。另外的工作确定了 284个差异表达的基因 (P < 0. 001，错误发现率q < 0. 05)，其中通过基因芯片测定分析了 31个黑素瘤、71个非典 型痣和15个正常皮肤对照。这些基因的等级聚簇分析显示可以从非典型痣和正常皮肤分 辨黑素瘤，并提出不同种类非典型痣的存在(图7)。通过创造力路径分析发现该基因中的 几种在黑素细胞发育和功能以及皮肤发育、细胞增殖和癌中起重要作用。这些发现进一步 证明黑素瘤的存在直接或间接地改变角质层的基因表达模式。使2 个基因进行随机森林 分析，发现该2 个基因其中61个从非典型痣分辨黑素瘤(参见图8)。随机森林分析基于集合预测(Bagging I^redictors)，其是用于生成多个预测版本 并应用这些版本得到聚集预测的方法。当预测数值结果时该聚集在各版本中取平均，当预 测种类时做多数表决。通过重复做出研究项引导程序并将这些用作新的研究项(learning set)形成多个版本。应用分类和回归树对实际数据组和模拟数据组的测定以及线性回归的 子集选择显示集合可准确地给出实质增长。如果干扰研究项可造成已建立的预测的显著 变化，那么集合可提高准确性。类建模-TREE^ET 。鉴定82个另外的基因(表7)。应用TREENET 软件 (Salford Systems, San Diego, CA)鉴定20-基因的组(表8)，其可全部用于从非典型痣分 辨黑素瘤(参见图9)。由黑素瘤与痣之间的7199个差异表达基因鉴定另外的19-基因分 类(表6，也可参见图11和12)。针对独立样本测试该19-基因分类，并显示对黑素瘤检测 100%的灵敏度和88%的特异性。此外，10个黑素瘤和10个痣的结果显示qRT-PCR重现了 应用基因芯片微阵列所得到的数据(图12，并且参见表13和14中的原始数据)。TREENET 是基于推进决策树(boosted decision trees)的数据采集工具。 TREENET 是模型建立和功能逼近系统，其也可用作初始数据探索工具。其可析取数据的 关系和校准结果将如何可预测，并可处理分类和回归的问题。实施例2初始势(preliminary power)和样本大小研究痣与初级黑素瘤以下样本大小和势的计算仅基于Haqq等^00 所提供的大规模cDNA研究数据。 该数据集中于正常皮肤(n = 3样本)、痣(n = 9)、初级黑素瘤(n = 6)和转移性黑素瘤(η =19)。以样本大小计算为目的，重点在于痣与初级黑素瘤的比较。基于由I^age等所述的 引导程序策略计算势和样本大小的评估。利用自Haqq等Ο005)的研究得到的原始数据， 对各探针/基因应用简单的t检验计算痣与初级黑素瘤间的基因表达差异——基于在其 cDNA分析中所用的全部14，772个探针。注意可应用多个探针询问各个基因。此外，也以 三组方差分析(ANOVA)和由该ANOVA计算的痣与初级黑素瘤间的具体对比评估正常皮肤、 痣和初级黑素瘤的基因表达差异。在随后的图中，利用三个主要的参数评估势和样本大小。 表9 (改编自I^age等)显示实际或没有实际差异表达的基因数，并提供描述这些参数的简 单方式，其如下定义(图IA和2A曲线的颜色相应于括号中所提供的各参数，虽然图IB和 2B仅集中于如下所定义的EDR)。
EDR:预期发现率(自表9，D/(B+D))。其反映了在限定阈被声明显著差异表达的 探针/基因的预期比例(在此对于大部分采用P < 0. 05)，该探针/基因实际上在痣与初级 黑素瘤之间被差异表达。PTP:真阳性(True Positives)探针/基因的预期比例(表9，D/(C+D))。该比 例反映了显示表达差异的探针/基因数，其可能是从这样的基因总量中被实际差异表达出 来其表达值导致测试统计值小于阈值(例如，0. 05)。PTN 真阴性(True Negative)结果的概率(表9，A/(A+B))。此概率涉及在假设 阈(例如，0.0 没有显著差异的探针/基因，实际上在皮肤和黑素瘤之间没有差异表达。表9.评估微阵列研究的势的关联参数
基于阵列分析的结果不差异表达实际差异表达不显著基因AB显著基因CD这些栏表示经发现满足给定限制的基因数量；A =经发现在阵列实验中没有被差 异表达并且实际上没有被差异表达的基因；B =被差异表达但在阵列实验中没有发现被差 异表达基因(假阴性)；C=经发现在阵列实验中被差异表达但实际上没有被差异表达的基 因(假阳性)；D=经发现在阵列实验中被差异表达并且实际上被差异表达的基因。痣与初始数据。样本大小分析考虑“发现”或确定这样的探针或基因或探针/基因 组所必需样本数量，其可基于由Haqq等O005)得到的探针/基因表达差异从初级黑素瘤 分辨痣。图Ia提供了作为样本大小的函数的EDR、PTP和PTN图，假设声明痣和初级黑素瘤 之间探针/基因表达差异的显著性的阈ρ < 0. 05。因此，由该图显示为了“发现”鉴定在 呈现探针/基因表达差异的芯片上询问的全部基因的80%产生检验统计ρ值< 0. 05—— 该值事实上反映了实际探针/基因表达差异，需要每个痣和初级黑素瘤组约20的样本大 小。注意如果考虑全部14，772个探针，一个样本可能单独偶然具有14,772X0.05 = 738 个呈？值< 0.05，其中1,727X0.80 = 1,381个可能在该显著性(即，ρ值)水平上反映 出实际基因表达差异。如果一个样本的目的在于鉴定较小的组基因——该组具有较大的可 能性被检测为实际差异表达，可应用更严格的统计显著性阈(例如，0.001)。其会偶然生成 14, 772X0. 001 = 15个具有ρ值< 0.001的基因，其中 45% (即，在该水平上;34Χ0. 45 =7个将可能被实际差异表达；参见图Ib ；注意图Ib中的曲线仅以不同的假设类型I错误 率相应于EDR)。也进行这样的样本大小的分析，该分析考虑在比较正常皮肤、痣和初级黑素瘤的 方差分析(ANOVA)背景中痣与初级黑素瘤的对比结果。其基本原理是正常皮肤无论与痣或 初级黑素瘤之间均比痣与初级黑素瘤之间具有更多的差异(基于Haqq等Ο005)数据的分 析)，并且考虑正常皮肤基因表达变异的分析可有助于减少痣与初级黑素瘤基因表达差异 评估中的干扰。图加和2b显示这些分析的结果，并向图Ia和Ib中所示那些提供类似的 样本大小的指导。由此也考虑专注于后验真概率(PTP)的分析，如述，有这样的多个探针/基因其
26偶然在某个可能性水平上全部呈现痣与初级黑素瘤之间的差异(假设询问了大量探针/基 因)。因此，这些被实际差异表达的探针/基因的可能分数对于评估非常重要。图3A和北 反映出不同的假定显著性水平的结果。因此，可以做出这样的论断每个痣和初级黑素瘤组约20个样本的研究将具有足 够的能力去检测可能在P值水平0. 05下呈现差异表达的全部基因的80 %，因为其该水平上 被实际地差异表达。但是，如果使用了 10，000-30, 000个探针或研究了 5，000-10, 000个基 因，对该差异表达基因的组起作用的基因(或探针)的数量可能数以百计。如果感兴趣的是 鉴定具有较大可能性被差异表达的较小数量的探针或基因( 25-40)，例如在ρ值0. 001 下，那么需要 30个痣和30个初级黑素瘤样本(参见图1、2和3)。实施例3从正常皮肤收集核酸的胶带剥离以下步骤用于从对象的正常皮肤(例如，乳突区或上背区)收集核酸。始终用戴手套的双手处理胶带。定位在相对无污点和健康的特定位点，除非由方 案另外说明。优选的正常皮肤位点是乳突(在颅骨基部耳后的骨突)和肩胛脊柱直上方的 上背。如果有必要，刮擦该位点以去除非毫毛的毛发。用酒精擦拭(70%异丙醇)清洁位 点。在应用胶带前使位点完全空气干燥。建议等待约2分钟以保证位点在应用胶带前完全 干燥。向皮肤位点应用胶带。如果使用一条以上的胶带，就从左侧开始以连续的顺序使 用胶带。应用外科皮肤标记和/或水溶性标记以标记胶带在皮肤上的位置，以便对齐随后 的胶带。通过使用压力(稳定地按压胶带)开始胶带收集步骤。保证皮肤绷紧，以保证胶 带在使用压力时不会移动。然后以一个方向缓慢移除胶带。将胶带边缘置于包装顶部的细 条上，胶带粘性表面朝下，以保护样本。在相同的位点布置第二条胶带；如上稳定地使用压 力。以与紧前应用中所用方向相反的方向缓慢移除胶带。通过在相同位点布置另外的胶带，按照以上提供的步骤继续胶带剥离。可以用总 量至少4条胶带剥离该位点，除非方案中另外说明。将细条放入保存袋并立即将样本置于 干冰上或-20 °C或以下保存，直到分析。实施例4从色素沉着损伤收集核酸的胶带剥离以下步骤用于从对象的色素沉着损伤和/或疑为黑素瘤的皮肤收集核酸。与正常 皮肤相比，损伤皮肤应当具有大于或等于约6mm，但小于胶带片的直径的术前活组织检查直 径。多个损伤必须相隔至少约4mm。应当用不溶性墨水笔在胶带上充裕地标定接触损伤的 胶带区域，从而在实验室中可从周围胶带切除该区域作为RNA提取步骤的一部分。如上，始终用戴手套的双手处理胶带。如果有必要，刮擦位点以去除非毫毛的毛 发。用酒精擦拭(70%异丙醇)清洁位点。在应用胶带前使位点完全空气干燥。建议约2 分钟以保证位点在应用胶带前完全干燥。向皮肤位点应用胶带。如果使用多于一条以上的胶带，就从左侧开始以连续的顺 序应用胶带。应用外科皮肤标记和/或水溶性标记以标记胶带在皮肤上的位置，以便对齐 随后的胶带。向可疑损伤应用胶带，该胶带应当具有大于或等于约6mm的直径。
通过直接在损伤上使用压力并躲避周围正常皮肤(稳定地按压胶带)开始胶带收 集步骤。保证皮肤绷紧，以保证胶带在使用压力时不会移动。用记号笔围绕损伤标定区域， 以使损伤区域被包围在墨水界线内，该界线离损伤边线约1mm。以一个方向缓慢移除胶带。将胶带边缘置于粘性细条上，细胞朝下，以保护样本。 按照上述提供的方向在相同的位点布置第二条胶带。重复，直到已总共至少4次剥离该损 伤，除非方案中另外说明。将细条放入保存袋并立即将样本置于干冰上或-20°C或以下保 存，直到分析。实施例5从非典型痣分辨黑素瘤的基因表达模式本研究的目的是确定用EG^经胶带剥离收集的角质层RNA是否可用于在可疑的 色素沉着损伤中从非典型痣分辨黑素瘤。参见图4A。应用EG^胶带剥离可疑的色素沉着损伤4次，然后根据护理标准进行活组织检 查。胶带剥离正常、未牵涉的皮肤，用作阴性对照。全部活组织检查进行初步和主要的组织 病理学检查。应用MELT (Ambion，Inc.)从胶带分离总RNA，并通过Experion (Bio-fcid，Inc.) 分析来评估性质。RNA的产量为约lng，如通过β-肌动蛋白基因表达样本的定量RT-PCR 所确定。然后应用 WT-Ovation Pico RNA扩增系统(NuGen，he.)扩增总 RNAQ00-500pg)， 并应用U133+2. O基因芯片(Affymetrix，Inc.)分析基因表达模式。然后扩增由EG^胶带分离的所得RNA，并在Affymetrix U133+2. O基因芯片上进 行序型分析。通过GCRMA运算法则使微阵列数据标准化。通过错误发现率为0. 05的ANOVA 分析法(P < 0. 05)和应用Westfall和^ung排列的多个校正检验的进一步分析鉴定约 117个在黑素瘤、发育不良痣和正常皮肤间差异表达的基因(表1)。这些基因的等级聚簇 显示黑素瘤样本集合在一起并被从发育不良痣和正常皮肤中明确分辨出来(图4B)。此 外，进一步鉴定表1所示117个基因中89个为黑素瘤与发育不良痣之间潜在的分辨基因 (discriminator) (ρ < 0. 01，错误发现率q < 0. 05)(表2)。当该89个基因进行创造力路 径分析时，发现许多在黑素瘤、毛发和皮肤发育和功能、细胞发育、细胞生长和增殖以及癌 中起重要作用。这些发现证明，从可疑的色素沉着性皮肤损伤用EG^收集的RNA可用于从 发育不良痣分辨黑素瘤(图4C)。进一步地，这些结果表明角质层的基因表达模式直接或间 接地被黑素瘤的存在改变(图4D)。在随后比较正常和发炎皮肤的研究中，4条小胶带在相同皮肤位点的连续应用收 集到足够的完整RNA，以便进行用于基因表达研究的定量逆转录聚合酶链反应(qPCR)测 定和DNA微阵列分析。后者在IOng总RNA样本的两轮扩增后应用Affymetrix HG-U133A GeneChip进行检测，该扩增生成30-80 U g反义RNA。两个对象结果的对比——各在三个单 独的位点上取样——显示基因测量中12 %的对象内和对象间的变异，是完全在Affymetrix 指定的GeneChip测定变异系数(CV)内的结果。要注意的是观察到Y染色体基因的差异表 达，是准确地分辨2个对象的不同性别的结果。然后对RNA进行基因芯片分析，该RNA由以 下分离而来胶带剥离来自正常、水堵塞和十二烷基硫酸钠刺激研究组的3个对象其中每 一个。已知所示100个其表达在未处理与SLS处理皮肤之间变化最显著改变的基因中的大 多数牵涉组织炎症和损伤作用。因此，通过EG^技术收集的RNA对于微阵列基基因表达序 型分析绰绰有余，并大约反映出皮肤的病理状态。
Benson等Q006)近期的工作证明了可从牛皮癣损伤收集RNA，以及胶带剥离收集 的RNA的总RNA表达模式与从同一患者的损伤得到的活组织检查RNA —致。进一步的工作 (参见美国专利号7，183，057，在此引入作为参考)已经表明可在用Enbrel的治疗过程中 用胶带取样牛皮癣损伤，以及在治疗第1周的基因表达与第4周和第8周的临床反应之间 形成强关联性。该工作进一步建立了胶带剥离以从皮肤表面收集生理相关RNA的证明。实施例6从黑素瘤、非典型痣和/或正常皮肤分辨日光性着色斑的基因表达模式本研究的目的是确定角质层RNA是否可用于在可疑的色素沉着损伤中从黑素瘤、 非典型痣和/或正常皮肤分辨日光性着色斑。如上胶带剥离可疑的色素沉着损伤，然后根据护理标准进行活组织检查。胶带剥 离正常、未牵涉的皮肤，用作阴性对照。全部活组织检查进行初步和主要的组织病理学检 查。如上所述分离总RNA，然后如上所述扩增和序型分析。选择在日光性着色斑和正常皮肤 对照之间被差异表达的1600个基因。进一步的检测鉴定103-基因分类(表10)，其可用于 从正常色素沉着皮肤分辨日光性着色斑(图14至16)。另外的工作——其中应用ANOVA (ρ < 0. 05) ,FDR(ρ < 0. 05)和多个检验校正分析 11个日光性着色斑样本、12个非典型痣样本和8个基底细胞癌(BCC)样本，以鉴定82个差 异表达的基因(表11)。82-基因分类的等级分析表明，其可用于分辨日光性着色斑与非典 型痣和/或基底细胞癌(BCC)(图17)。最终，鉴定32-基因分类(表12)，该分类可用于分 辨日光性着色斑与恶性雀斑样痣(图18)。应用由Manford University (Stanford, CA)免 费提供的微阵列预测分析(PAM)软件分析基因和各自的分类组。由恶性雀斑样痣与日光性着色斑之间M37个差异表达的基因鉴定另外的28-基 因分类，这由TREENET 分析鉴定(表15 ；同样参见图19)。此外，沈个恶性雀斑样痣和34 个日光性着色斑样本的结果表明，qRT-PCR重现了应用基因芯片微阵列所得到的数据(参 见表16-21中的原始数据)。参考文献Jemal A,Murray Τ,Samuels A,Ghafoor A,Ward E,Thun MJ Cancer statistics, 2003. 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1.一种用于表征对象皮肤损伤的方法，包括分析所述皮肤损伤样本中表1-8、10-12 和15中所列举的一种或多种基因的核酸分子，从而表征所述对象的皮肤损伤。
2.权利要求1所述的方法，其中所述核酸分子是RNA。
3.权利要求1所述的方法，其中分析核酸分子包括检测所述核酸分子的核酸序列中的 一个或多个突变。
4.权利要求3所述的方法，其中所述一个或多个突变选自置换、缺失和插入。
5.权利要求1所述的方法，进一步包括在分析前扩增获自所述样本的所述核酸分子。
6.权利要求1所述的方法，其中通过以足以分离粘附于胶带的样本的方式向皮肤的目 标区域应用胶带得到所述样本。
7.权利要求1所述的方法，进一步包括应用所述表征以确定治疗方案。
8.权利要求2所述的方法，其中所述分离的所述核酸分子或其扩增产物被应用于微阵列。
9.权利要求8所述的方法，其中应用微阵列检测表达模式。
10.权利要求1所述的方法，其中所述样本得自在皮肤损伤或周围边缘位点进行的活 组织检查。
11.权利要求6所述的方法，其中所述胶带包括在聚氨酯膜上的橡胶粘合剂。
12.权利要求6所述的方法，其中应用并从皮肤移除约1至10条胶带或1至10次使用 的胶带。
13.权利要求6所述的方法，其中应用并从皮肤移除约1至8条胶带或1至8次使用的 胶带。
14.权利要求6所述的方法，其中应用并从皮肤移除约1至5条胶带或1至5次使用的 胶带。
15.权利要求6所述的方法，其中所述方法进一步包括进行皮肤目标区域的活组织检查。
16.权利要求2所述的方法，其中所述分析在原位进行。
17.一种用于从对象的发育不良痣或正常色素沉着皮肤分辨黑素瘤的方法，包括在所 述对象的样本中分析表8所列举的一种或多种基因的核酸分子，从而从对象的发育不良痣 或正常色素沉着皮肤分辨黑素瘤。
18.权利要求17所述的方法，进一步包括分析表1-7中任一个或其任意组合中所列举 的一种或多种基因的核酸分子。
19.权利要求17所述的方法，其中所述核酸分子是RNA。
20.权利要求17所述的方法，其中分析所述核酸分子包括检测所述核酸分子的核酸序 列中的一个或多个突变。
21.权利要求20所述的方法，其中所述一个或多个突变选自置换、缺失和插入。
22.权利要求17所述的方法，进一步包括在分析前扩增得自所述样本的核酸分子。
23.权利要求17所述的方法，其中通过以足以分离粘附于胶带的样本的方式向皮肤的 目标区域应用胶带得到所述样本，其中所述样本包含核酸分子。
24.权利要求19所述的方法，其中所述分离的所述核酸分子或其扩增产物被应用于微 阵列。
25.权利要求22所述的方法，其中应用微阵列检测表达模式。
26.权利要求17所述的方法，其中所述样本得自在所述对象的皮肤目标区域进行的活 组织检查。
27.权利要求23所述的方法，其中所述胶带包括在聚氨酯膜上的橡胶粘合剂。
28.权利要求23所述的方法，其中应用并从皮肤移除约1至10条胶带或1至10次使 用的胶带。
29.权利要求23所述的方法，其中应用并从皮肤移除约1至8条胶带或1至8次使用 的胶带。
30.权利要求23所述的方法，其中应用并从皮肤移除约1至5条胶带或1至5次使用 的胶带。
31.权利要求23所述的方法，其中所述方法进一步包括进行皮肤目标区域的活组织检查。
32.权利要求19所述的方法，其中所述分析在原位进行。
33.一种用于从对象的黑素瘤或发育不良痣或正常色素沉着皮肤分辨日光性着色斑的 方法，包括在对象的样本中分析表10-12和15中所列举的一种或多种基因的核酸分子，从 而从对象的发育不良痣或正常色素沉着皮肤分辨黑素瘤。
34.权利要求33所述的方法，进一步包括分析表1-8的任一个或其任意组合中所列举 的一种或多种基因的核酸分子。
35.权利要求33所述的方法，其中所述核酸分子是RNA。
36.权利要求33所述的方法，其中分析所述核酸分子包括检测所述核酸分子的核酸序 列中的一个或多个突变。
37.权利要求36所述的方法，其中所述一个或多个突变选自置换、缺失和插入。
38.权利要求33所述的方法，进一步包括在分析前扩增得自所述样本的核酸分子。
39.权利要求33所述的方法，其中通过以足以分离粘附于胶带的样本的方式向皮肤的 目标区域应用胶带得到所述样本，其中所述样本包含核酸分子。
40.权利要求25所述的方法，其中所述分离的所述核酸分子或其扩增产物被应用于微 阵列。
41.权利要求38所述的方法，其中应用微阵列检测表达模式。
42.权利要求33所述的方法，其中所述样本得自在对象的皮肤目标区域进行的活组织检查。
43.权利要求39所述的方法，其中所述胶带包括在聚氨酯膜上的橡胶粘合剂。
44.权利要求39所述的方法，其中应用并从皮肤移除约1至10条胶带或1至10次使 用的胶带。
45.权利要求39所述的方法，其中应用并从皮肤移除约1至8条胶带或1至8次使用 的胶带。
46.权利要求39所述的方法，其中应用并从皮肤移除约1至5条胶带或1至5次使用 的胶带。
47.权利要求39所述的方法，其中所述方法进一步包括进行皮肤目标区域的活组织检查。
48.权利要求35所述的方法，其中所述分析在原位进行。
49.一种用于诊断对象的黑素瘤的方法，包括检测与未患有黑素瘤的对象的相应样本 中目标蛋白质的水平相比所述对象样本中目标蛋白质的改变水平，其中所述蛋白质是表8 所列举基因的表达产物，从而诊断所述对象的黑素瘤。
50.权利要求49所述的方法，进一步包括检测表1-7任一个或其任意组合中所列举基 因的一种或多种表达产物的改变水平。
51.权利要求49所述的方法，其中通过以足以分离粘附于胶带的样本的方式向皮肤的 目标区域应用胶带得到所述样本，其中所述样本包含细胞，并进一步包括将所述细胞溶解 以提取目标蛋白质。
52.权利要求51所述的方法，其中所述胶带包括在聚氨酯膜上的橡胶粘合剂。
53.权利要求51所述的方法，其中应用于皮肤并从皮肤移除1和10条之间的胶带。
54.权利要求51所述的方法，其中应用于并从皮肤移除约1至8条胶带。
55.权利要求51所述的方法，其中应用于并从皮肤移除约1至5条胶带。
56.权利要求51所述的方法，其中所述方法进一步包括进行皮肤目标区域的活组织检查。
57.权利要求56所述的方法，其中从所述活组织检查样本中提取蛋白质，并且分析所 述活组织检查中的蛋白质水平和所述胶带样本中的蛋白质水平。
58.权利要求49所述的方法，其中所述样本得自皮肤目标区域的活组织检查。
59.权利要求49所述的方法，进一步包括从所述对象的未牵涉组织得到样本。
60.权利要求59所述的方法，其中通过进行未牵涉皮肤的活组织检查得到所述未牵涉 组织样本。
61.权利要求59所述的方法，其中所述未牵涉组织样本通过如下得到a)以足以分离粘附于所述胶带的皮肤样本的方式向所述对象的皮肤应用胶带，其中所 述皮肤样本包含所述角质层的细胞，并且其中所述皮肤未受待检测疾病的影响；b)溶解所述细胞以提取蛋白质；以及c)定量所述提取的蛋白质。
62.权利要求59所述的方法，其中所述未牵涉皮肤来自乳突或上背。
63.一种用于诊断对象的日光性着色斑的方法，包括检测与未患有黑素瘤的对象的相 应样本中目标蛋白质的水平相比所述对象样本中目标蛋白质的改变水平，其中所述蛋白质 是表10-12中所列举基因的表达产物，从而诊断所述对象的黑素瘤。
64.权利要求63所述的方法，进一步包括检测表1-8任一个或其任意组合中所列举基 因的一种或多种表达产物的改变水平。
65.权利要求63所述的方法，其中通过以足以分离粘附于胶带的样本的方式向皮肤的 目标区域应用胶带得到所述样本，其中所述样本包含细胞，并且进一步包括将细胞溶解以 提取所述目标蛋白质。
66.权利要求65所述的方法，其中所述胶带包括在聚氨酯膜上的橡胶粘合剂。
67.权利要求65所述的方法，其中应用于所述皮肤并从所述皮肤移除1和10条之间的 胶带。
68.权利要求65所述的方法，其中应用并从皮肤移除约1至8条胶带。
69.权利要求65所述的方法，其中应用并从皮肤移除约1至5条胶带。
70.权利要求65所述的方法，其中所述方法进一步包括进行皮肤目标区域的活组织检查。
71.权利要求70所述的方法，其中从所述活组织检查样本提取蛋白质，并且分析所述 活组织检查中的蛋白质水平和所述胶带样本中的蛋白质水平。
72.权利要求63所述的方法，其中所述样本得自皮肤目标区域的活组织检查。
73.权利要求63所述的方法，进一步包括从对象的未牵涉组织得到样本。
74.权利要求73所述的方法，其中通过进行所述未牵涉皮肤的活组织检查得到所述未 牵涉组织样本。
75.权利要求73所述的方法，其中所述未牵涉组织样本通过如下得到a)以足以分离粘附于所述胶带的皮肤样本的方式向所述对象的皮肤应用胶带，其中所 述皮肤样本包含所述角质层的细胞，并且其中所述皮肤未受待检测疾病影响；b)溶解所述细胞以提取蛋白质；以及c)定量所述提取的蛋白质。
76.权利要求73所述的方法，其中所述未牵涉皮肤来自乳突或上背。
77.—种诊断对象的黑素瘤的方法，包括a)提供对象皮肤上疑为黑素瘤的目标区域的基因表达模式，其中所述皮肤目标区域同 时在蛋白质水平上表达大量为黑素瘤标记的基因；以及b)将对象的基因表达模式与得自相应正常皮肤样本的参考基因表达模式进行比较，其 中所述参考基因表达模式包括选自下列的目标基因的表达值B型内皮素受体、假设蛋白 MGC40222、三角形四肽重复域3、staufen RNA结合蛋白(果蝇(Drosophila))、肌动蛋白 α 4、KIAA1212、糖蛋白M6B、v-kit Hardy-Zuckerman 4猫肉瘤病毒致癌基因同源物(同系 物)、c-Maf-诱导蛋白、连接物相关蛋白复合物2 mu 1亚基、突触融合蛋白5A、趋化因子样 因子超家族4、UDP-Gal β GlcNAc β 1，4-半乳糖基转移酶多肽5、纤维化蛋白1、可能的鼠 邻直向同源物Punc Ε11、肌球蛋白重多肽14、黑素瘤中优先表达的抗原、jumonji域内含物 3、BCL2相关蛋白Al、formin结合蛋白1或其任意组合。
78.权利要求77所述的方法，其中所述参考基因表达模式进一步包括下列的人类mRNA 表达值酪氨酸酶相关蛋白1、LIM同源框2、黑素-A、亚精胺/精胺m-乙酰转移酶、NDRG 家族成员2、糖类(N-乙酰氨基葡糖-6-0)磺基转移酶2、多配体蛋白聚糖结合蛋白(内居蛋 白)、晶体蛋白，α Β、Β型内皮素受体、三角形四肽重复域3、WAP四-二硫化物核心域3、细胞 色素P450(家族1、亚家族B、多肽1)、ρ8蛋白(转移候选1)、干扰素Y-诱导蛋白16、多巴 色素互变异构酶(多巴色素δ -异构酶、酪氨酸相关蛋白2、、溶质载体家族39 (锌转运体)， 成员6、热激70kDa蛋白2、囊泡相关膜蛋白2 (小突触泡蛋白2)、类似AI661453蛋白质和 瞬时受体电位阳离子通道(亚家族M、成员1)、酪氨酸酶(眼皮肤白化病ΙΑ)、B型内皮素受 体、三角形四肽重复域3、多配体蛋白聚糖结合蛋白(内居蛋白)、v-kit Hardy-Zuckerman 4猫肉瘤病毒致癌基因同源物、OTU域、泛素乙醛结合1、蛋白质磷酸酶1调控(抑制因子) 亚基12A、钙调理蛋白2、散乱的dsh同源物3(果蝇)、tribbles同源物2 (果蝇)、粘脂蛋 白3、肌动蛋白α 4、核糖体蛋白S15、⑶C37细胞分裂周期37同源物(酿酒酵母)、jumonji 域内含物3、v-maf肌腱膜成纤维肉瘤致癌基因同源物B(鸟类)、C-Maf-诱导蛋白、肌球蛋白重多肽14、假设蛋白MGC40222或其任意组合。
79.权利要求77所述的方法，其中所述参考基因的表达模式进一步包括表1-7所列举 的任意目标基因的表达值。
80.权利要求77至79中任一项所述的方法，其中所述参考基因的表达模式被包含在数 据库内。
81.权利要求77所述的方法，其中应用计算机运算法则实施所述比较。
82.一种用于诊断对象的日光性着色斑的方法，包括a)提供对象皮肤上疑为黑素瘤的目标区域的基因表达模式，其中所述皮肤目标区域同 时在蛋白质水平上表达大量为黑素瘤标记的基因；以及b)将对象的基因表达模式与得自相应正常皮肤样本的参考基因表达模式比较，其中 所述参考基因表达模式包括选自下列的目标基因的表达值干扰素调节物6、密蛋白23、黑 素-A、石骨症相关跨膜蛋白1、RAS样家族11成员B、肌动蛋白α 4、跨膜蛋白68、富甘氨酸蛋 白(GRP3S)、转录因子4、假设蛋白FLJ20489、躯体细胞色素C、转录因子4、叉头框Ρ1、转导 物ERBB2-2、谷氨酰胺酰基肽环转移酶(谷氨酰胺酰环化酶)、假设蛋白FLJ10770、磷酸硒合 成酶2、胚胎Fyn相关底物、Kruppel样因子8、Discs大同源物5 (果蝇)、G_蛋白信号传导 的调节物10、ADP-核糖基化因子相关蛋白2、TIMP金属肽酶抑制因子2、5_氨基咪唑-4-氨 甲酰核糖核苷酸转甲酰酶/IMP环水解酶、类似RIKEN cDNA 5730421E18基因、G-蛋白信号 传导的调节物10、假设核RNA结合蛋白、酪氨酸酶相关蛋白1、TIMP金属肽酶抑制因子2、密 蛋白1、转录因子4、溶质载体家族16 (单羧酸转运体)成员6 (类似溶质载体家族16成员6 ； 单羧酸酯转运体6)、磷酸硒合成酶2、连接蛋白A5、黑素-A、血小板-白细胞C激酶底物同源 物样结构域，家族A，成员1、断裂点簇区；类似断裂点簇区同种型1、脂肪瘤HMGIC融合伙伴 样3、A激酶(PRKA)锚定蛋白13、他0相关BTB域内含物3、Ras关联(Ral⑶S/AF-6)域家族 8、ADP-核糖基化因子样6互动蛋白2、E74样因子5 (ets域转录因子)、假设蛋白FLJ219M、 锌指、DHHC型内含物11、膜组分、染色体11、表面标记1、FLJ20259蛋白、染色体9开放可读 框3、血清/糖皮质激素调控激酶、胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2 (autotaxin)、具有 多剪接的RNA结合蛋白、载脂蛋白L-2、胰岛素受体底物2、染色体14开放可读框65、假设蛋 白MGC10911、相关的RAS病毒(r_ras)致癌基因同源物2、T细胞免疫调节蛋白/T细胞免 疫调节蛋白、KIAA07M蛋白、染色体14开放可读框1、三重基序内含物63或其任意组合。
83.权利要求82所述的方法，其中所述参考基因表达模式进一步包括表1-8、10、11中 所列举的基因或其任意组合。
84.权利要求82所述的方法，其中所述参考基因表达模式进一步包括表10或11中所 列举任意目标基因的表达值。
85.权利要求82至84中任一项所述的方法，其中所述参考基因表达模式被包含在数据 库内。
86.权利要求82所述的方法，其中应用计算机运算法则实现所述比较。
87.一种用于表征对象的皮肤损伤的试剂盒，包括皮肤样本收集装置和选择性结合表 10-12和15中一种或多种核酸分子或结合表10-12和15中的核酸或核酸分子的蛋白质表 达产物的一种或多种探针或引物。
88.权利要求87所述的试剂盒，进一步包括选择性结合表1-8任一个中的一种或多种核酸分子或结合表1-8任一个中的核酸或核酸分子的蛋白质表达产物的一种或多种探针 或引物。
89.权利要求87所述的试剂盒，其中所述试剂盒提供与表1-8、10-12和15任一个中核 酸分子的部分结合的探针。
90.权利要求87所述的试剂盒，其中所述试剂盒提供一种或多种引物对，所述引物对 包括选择性结合基因一条链上游的正向引物和选择性结合基因互补链上游的反向引物，其 中所述基因被列举在表1-8、10-12和15任一个中。
91.权利要求87所述的试剂盒，其中所述皮肤样本收集装置是活组织检查针。
92.权利要求87所述的试剂盒，其中所述皮肤样本收集装置是胶带。
93.权利要求92所述的试剂盒，其中所述胶带包括在聚氨酯膜上的橡胶粘合剂。
94.权利要求87所述的试剂盒，进一步包括微阵列，至少包含表1-8、10-12、15任一个 或其任意组合中所鉴定基因或核酸或所基因的蛋白质产物的片段。
95.一种用于表征对象的皮肤损伤的试剂盒，包括涂布器和选择性结合表10-12和15 中一种或多种核酸分子或者结合表10-12和15的任一个中的核酸或核酸分子的蛋白质表 达产物的一种或多种探针或引物。
96.权利要求95所述的试剂盒，进一步包括选择性结合表1-8的任一个中的一种或多 种核酸分子或结合表1-8的任一个中的核酸或核酸分子的蛋白质表达产物的一种或多种 探针或引物。
97.权利要求95所述的试剂盒，其中所述探针被可检测地标记。
98.权利要求1、17、33、49、63、77或82中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
99.权利要求1、17、33、49、63、77或82中任一项所述的方法，其中所述样本是表皮样本。
全文摘要
本发明提供了通过分析得自对象的核酸分子诊断对象中黑素瘤和/或日光性着色斑的方法。本发明也提供了从日光性着色斑和/或发育不良痣和/或正常色素沉着皮肤分辨黑素瘤的方法。该方法包括分析具有一种或多种皮肤标记的表皮样本中的表达或突变。该方法可包括应用微阵列分析样本的基因或蛋白质图谱。
文档编号C12Q1/68GK102089444SQ200980127278
公开日2011年6月8日 申请日期2009年5月14日 优先权日2008年5月14日
发明者S·H·常 申请人:德玛泰克国际公司