用于黑素瘤的多抗原载体的制作方法

专利名称：用于黑素瘤的多抗原载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防和/或治疗癌症的多抗原载体。尤其是，本发明涉及用于治疗和/或预防黑素瘤的多抗原载体。
背景技术：
在几种技术如高密度微阵列、SEREX、免疫组织化学(IHC)、RT-PCR、原位杂交(ISH)和激光捕获显微镜检查(laser capturemicroscopy)(Rosenberg，Immunity，1999；Sgroi et al，1999，Schenaet al，1995，Offringa et al，2000)的帮助下，由于基于原发肿瘤和正常细胞的表达谱鉴定分子的巨大进步，最近几年含肿瘤相关抗原(TAAs)的癌症疫苗的发展已有巨大增加。TAAs是由肿瘤细胞表达或过表达的抗原并且对一种或几种肿瘤可以是特异性的，例如CEA抗原在结肠直肠、乳房和肺癌中表达。Sgroi et al(1999)采用激光捕获显微解剖和cDNA微阵列的联合使用鉴定了在侵犯性和转移性癌细胞中差异表达的几个基因。几种递送系统，象DNA或病毒可以用于抗人癌症的治疗性接种(Bonnet et al，2000)并且可以引发免疫反应以及切断针对TAAs的免疫耐受性。通过插入编码T细胞共刺激分子如B7.1或细胞因子例如IFN-γ、IL2或GM-CSF等的转基因，肿瘤细胞可以变得具有更高的免疫原性。TAA和细胞因子或共刺激分子的共表达可以开发有效的治疗疫苗(Hodge et al，95，Bronte et al，1995，Chamberlain etal，1996)。
本领域需要对刺激免疫反应以预防或治疗癌症有用的试剂和方法。本发明提供了克服别人试图治疗癌症中所遭遇的许多困难的这种试剂和方法。
发明概述本发明提供了用于给患者施用以预防和/或治疗癌症的多抗原载体。尤其是，多抗原载体编码一个或多个肿瘤抗原(“TA”)。多抗原载体还可以编码免疫刺激物，如共刺激分子和/或与佐剂一起给予。
附图简述

图1.质粒pALVAC.Tricom(#33)和pT1132的图。
图2.质粒pALVAC.Tricom(#33)的DNA序列。
图3.质粒pT1132的DNA序列。
图4.质粒pT3217的图。
图5.质粒pT3217的DNA序列。
图6.示例的NY-ESO-1、TRP-2、gp100、gp100M、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、B7.1、LFA-3和ICAM-1蛋白的氨基酸序列。
发明详述本发明提供了对治疗和/或预防癌症有用的试剂和方法。本申请中引用的所有参考文献引入作为参考。
在一个实施方案中，本发明涉及抗一个或多个肿瘤抗原(“TA”)的免疫反应的诱导或增强，以预防和/或治疗癌症。在某些实施方案中，一个或多个TAs可以被组合。在优选实施方案中，给予编码肿瘤抗原的核酸载体或例如肽或多肽形式的肿瘤抗原本身后，TA在宿主细胞中的表达引起免疫反应。
在此使用的“抗原”是在已经给予抗原的宿主中产生免疫反应的分子(如多肽)或其一部分。免疫反应可以包括与抗原的至少一个表位结合的抗体的产生和/或针对表达该抗原的表位的细胞的细胞免疫反应的产生。该反应可以是目前免疫反应的增强，通过例如引起抗体产生增加、与抗原亲和力增加的抗体的产生增加或细胞免疫反应增加(即免疫活性T细胞数量或活性增加)。产生免疫反应的抗原可以被认为是具有免疫原性的或免疫原。在描述本发明时，TA可以被称为“免疫原性靶”。本发明提供了在宿主中表达一个或多个免疫原性靶的表达载体。
术语TA包括肿瘤相关抗原(TAAs)和肿瘤特异性抗原(TSAs)，其中癌细胞是抗原的来源。TAA是在肿瘤细胞表面上以高于正常细胞上观察到的量表达的抗原或在胎儿发育过程中在正常细胞上表达的抗原。TSA是对肿瘤细胞独特的和在正常细胞上不表达的抗原。TA进一步包括TAAs或TSAs、其抗原性片段和保持它们的抗原性的修饰形式。
依照TAs的表达模式、功能或遗传来源，它们典型地被分为五类睾丸癌(CT)抗原(即MAGE、NY-ESO-1)；黑素细胞分化抗原(即MelanA/MART-1、酪氨酸酶、gp100)；突变抗原(即MUM-1、p53、CDK-4)；过表达“自身”抗原(即HER-2/neu、p53)；和病毒抗原(即HPV、EBV)。为实施本发明的目的，合适的TA是诱导或增强已经给予TA的宿主中的抗肿瘤免疫反应的任何TA。合适的TAs包括例如各种gp100(Coxet al.，Science，264716-719(1994)；美国专利6,500,919 B1和WO01/30847，第162位残基是Val，也称为“gp100M”；美国专利6,537,560B1，第162位残基是Phe)、MART-1/Melan A(Kawakami etal.，J.Exp.Med.，180347-352(1994)；美国专利5,874,560)、gp75(TRP-1)(Wang et al.，J.Exp.Med.，1861131-1140(1996))、TRP-2(Wang et al.1996 J.Exp.Med.1842207；美国专利5,831,016和6,083,783)、酪氨酸酶(Wolfel et al.，Eur.J Immunol.，24759-764(1994)；WO 200175117；WO 200175016；WO 200175007)、NY-ESO-1(WO 98/14464；WO 99/18206；GenBank登录号P78358；美国专利5,804,381)、黑素瘤蛋白聚糖(Hellstrom et al.，J.Immunol.，1301467-1472(1983))、MAGE家族抗原(即MAGE-1、2、3、4、6、12、51；Van der Bruggen et al.，Science，2541643-1647(1991)；美国专利6,235,525；CN 1319611)、BAGE家族抗原(Boel et al.，Immunity，2167-175(1995))、GAGE家族抗原(即GAGE-1，2；Van den Eynde etal.，J.Exp.Med.，182689-698(1995)；美国专利6,013,765)、RAGE家族抗原(即RAGE-1；Gaugler et at.，Immunogenetics，44323-330(1996)；美国专利5,939,526)、N-乙酰葡糖氨基转移酶-V(Guilloux etat.，J.Exp.Med.，1831173-1183(1996))、p15(Robbins et al.，J.Immunol.1545944-5950(1995))、β-连环蛋白(Robbins et al.，J.Exp.Med.，1831185-1192(1996))、MUM-1(Coulie et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA，927976-7980(1995))、细胞周期蛋白依赖性激酶-4(CDK4)(Wolfel et al.，Science，2691281-1284(1995))、p21-ras(Fossum et at.，Int.J.Cancer，5640-45(1994))、BCR-abl(Bocchia et al.，Blood，852680-2684(1995))、p53(Theobald et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9211993-11997(1995))、p185 HER2/neu(erb-B1；Fisk et al.，J.Exp.Med.，1812109-2117(1995))、表皮生长因子受体(EGFR)(Harris et al.，Breast Cancer Res.Treat，291-2(1994))、癌胚抗原(CEA)(Kwong et al.，J Natl.Cancer Inst.，85982-990(1995)美国专利5,756,103；5,274,087；5,571,710；6,071,716；5,698,530；6,045,802；EP 263933；EP 346710和EP 784483)；癌相关突变粘蛋白(即MUC-1基因产物；Jerome et al.，J.Immunol.，1511654-1662(1993))；EBV的EBNA基因产物(即EBNA-1；Rickinson et al.，Cancer Surveys，1353-80(1992))；人乳头瘤病毒的E7、E6蛋白(Ressing et al.，J.Immunol.1545934-5943(1995))；前列腺特异性抗原(PSA；Xue et al.，The Prostate，3073-78(1997))；前列腺特异性膜抗原(PSMA；israeli etal.，Cancer Res.，541807-1811(1994))；独特型表位或抗原，例如免疫球蛋白独特型或T细胞受体独特型(Chen et al.，J.Immunol.，1534775-4787(1994))；KSA(美国专利5,348,887)、驱动蛋白2(Dietz，et al.Biochem Biophys Res Commun 2000 Sep 7275(3)731-8)、HIP-55、TGFβ-1抗调亡因子(Toomey，et al.Br J Biomed Sci 2001；58(3)177-83)、肿瘤蛋白D52(Bryne J.A.et al.，Genomics，35523-532(1996))、HIFT、NY-BR-1(WO 01/47959)、NY-BR-62、NY-BR-75、NY-BR-85、NY-BR-87、NY-BR-96(Scanlan，M.Serologic andBioinformatic Approaches to the Identification of Human TumorAntigens，in Cancer Vaccines 2000，Cancer Research Institute，NewYork，NY)，包括“野生型”(即由基因组正常编码的、天然存在的)、其修饰和突变形式，以及其它片段和衍生物。任何这些TAs可以单独使用或在共免疫方案中一个与另一个联合使用。
优选的TAs对诱导抗黑素瘤细胞的免疫反应有用。术语“黑素瘤”包括但不限于例如黑素瘤、转移性黑素瘤、由黑素细胞或黑素细胞相关痣细胞衍生的黑素瘤、黑素癌、黑素上皮瘤、黑素肉瘤、原位黑素瘤、浅表蔓延性黑素瘤、结节性黑素瘤、恶性小痣黑素瘤、肢端小痣黑素瘤、侵犯性黑素瘤和家族非典型痣和黑素瘤(FAM-M)综合症。通常，黑素瘤由例如染色体畸形、退形性生长和发育紊乱、促有丝分裂剂、紫外线辐射(UV)、病毒感染、基因的不适当组织表达、基因表达改变或致癌物质引起。
在某些情况下，用TA和其它抗原如血管生成相关抗原(“AA”)共免疫患者可能有益。AA是与涉及在血管诱导和/或再发育中的细胞相关的免疫原性分子(即肽、多肽)。例如，AA可以在内皮细胞(“EC”)上表达，内皮细胞是血管的主要结构成分。在癌症的情况下，优选在提供肿瘤的血管内或附近找到AA。优选患者的抗AA免疫产生抗AA免疫反应，借此预防和/或抑制肿瘤附近或内部发生的血管生成过程。示例的AAs包括例如血管内皮生长因子(即VEGF；Bernardini，et al.J.Urol.，2001，166(4)1275-9；Starnes，et al.J.Thorac.Cardiovasc.Surg.；2001，122(3)518-23；Dias，et al.Blood，2002，992179-2184)、VEGF受体(即VEGF-R、flk-1/KDR；Starnes，et al.J.Thorac.Cardiovasc.Surg，2001，122(3)518-23)、EPH受体(即EPHA2；Gerety，et al.1999，Cell，4403-414)、表皮生长因子受体(即EGFR；Ciardeillo，et al.Clin.Cancer Res.，2001，7(10)2958-70)、碱性成纤维细胞生长因子(即bFGF；Davidson，et al.Clin.Exp.Metastasis2000，18(6)501-7；Poon，et al.Am J.Surg.，2001，182(3)298-304)、血小板衍生细胞生长因子{即PDGF-B)、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF；Hong，et al.J.Mol.Med.，2001，8(2)141-8)、转化生长因子(即，TGF-α；Hong，et al.J.Mol.Med.，2001，8(2)141-8)、endoglin(Balza，et al.Int.J.Cancer，2001，94579-585)、Id蛋白(Benezra，R.Trends Cardiovasc.Med.，2001，11(6)237-41)、蛋白酶如uPA、uPAR和基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9；Djonov，et al.J.Pathol.，2001，195(2)147-55)、一氧化氮合酶(Am.J.Ophthalmol.，2001，132(4)551-6)、氨肽酶(Rouslhati，E.NatureCancer，284-90，2002)、血小板反应蛋白(即TSP-1、TSP-2；Alvarez，et al.Gynecol.Oncol.，2001，82(2)273-8；Seki，et al.Int.J.Oncol.，2001，19(2)305-10)、k-ras(Zhang，et al.Cancer Res.，2001，61(16)6050-4)、Wnt(Zhang，et al.Cancer Res.，2001，61(16)6050-4)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs；Drug Resist.Updat.2000，3(2)83-88)、微管(Timar，et al.2001.Path.Oncol.Res.，7(2)85-94)、热休克蛋白(即HSP90(Timar，上述))、肝素结合因子(即肝素酶；Gohji，et al.Int.J.Cancer，2001，95(5)295-301)、合酶(即ATP合酶、thymidilate合酶)、胶原受体、整联蛋白(即αvβ3、αvβ5、α1β1、α2β1、α5β1)、表面蛋白聚糖NG2、AAC2-1或AAC2-2等，其中包括“野生型”(即由基因组正常编码的、天然存在的)，其修饰、突变形式，以及其它片段和衍生物。在实施本发明中，这些靶中的任何一种可能都合适，单独或彼此联合或与其它试剂联合。
核酸分子可以包含编码一个或多个免疫原性靶的核苷酸序列或其片段或衍生物，或由它们组成，如ATCC保藏物中DNA插入物中含有的序列。术语“核酸序列”或“核酸分子”是指DNA或RNA序列。该术语包括由DNA和RNA的任何已知碱基类似物形成的分子，例如但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮杂环丙烯基-胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基-甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异-戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5-甲氧基羰基-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤等。
分离的核酸分子是(1)当总核酸分离自来源细胞时，与至少大约50％的自然情况下与其一起找到的蛋白、脂类、碳水化合物或其它物质相分离的核酸分子；(2)不与自然情况下该核酸分子所连接的多核苷酸的全部或部分连接的核酸分子；(3)与自然情况下不与之连接的多核苷酸可操作连接的核酸分子；(4)自然情况下不作为更大的多核苷酸序列的一部分存在的核酸分子。优选，本发明的分离的核酸分子基本上不含任何其它污染核酸分子或在其自然环境中发现的将干扰所述核酸分子在多肽制备中的用途或它的治疗、诊断、预防或研究用途的其它污染物。在此使用的术语“天然存在的(naturally occuring)”或“天然的(native)”或“天然发现的”，当与生物材料如核酸分子、多肽、宿主细胞等相关使用时，是指自然情况下发现的和未被人们操作的物质。类似地，在此使用的“非天然存在的”或“非天然的”是指不是自然情况下发现的物质或已被人们进行结构修饰或合成的物质。
两个或更多核酸或氨基酸序列的同一性(identity)通过比较序列来确定。如本领域已知，“同一性”是通过组成该分子的单位(即核苷酸或氨基酸残基)之间的配对确定的核酸或氨基酸序列之间序列相关的程度。同一性测定两个或更多序列的较小序列之间相同配对的百分比，其中缺口比对(如果有的话)是通过特定数学模式或计算机程序(即算法)得到的。核酸序列之间的同一性还可以通过核酸序列彼此杂交的能力来确定。在限定杂交方法中，术语“高度严格条件”和“中等严格条件”是指允许序列互补的核酸链杂交，并排除显著错配核酸的杂交的条件。对于杂交和洗涤的“高度严格条件”的实例是在65-68℃，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或在42℃，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺。(参见例如Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，1989)；Anderson et al.，Nucleic AcidHybridisationA Practical Approach Ch.4(IRL Press Limited))。术语“中等严格条件”是指能够形成比在“高度严格条件”下可能发生的碱基对错配程度更大的DNA双螺旋的条件。示例的中等严格条件是在50-65℃，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或在37-50℃，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和20％甲酰胺。举例来说，在50℃，0.015M钠离子中的中等严格条件将允许大约21％的错配。杂交过程中，为了降低非特异性和/或背景杂交的目的，杂交和洗涤缓冲液中可以包括其它试剂。实例是0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％焦磷酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠、NaDodSO4、(SDS)、ficoll、Denhardt′s溶液、超声处理的鲑精DNA(或另一非互补的DNA)和葡聚糖硫酸酯，尽管还可以使用其它合适的试剂。这些添加剂的浓度和类型可以改变，而基本上不影响杂交条件的严格性。杂交实验通常在pH6.8-7.4进行；然而，在典型的离子强度条件下，杂交速度几乎与pH无关。
在本发明的优选实施方案中，载体用于将编码免疫原性靶的核酸序列转移至细胞。载体是用于将核酸序列转移至宿主细胞的任何分子。在某些情况下，利用表达载体。表达载体是适于宿主细胞的转化并且含有指导和/或控制所转移核酸序列的表达的核酸序列的核酸分子。表达包括但不限于多种过程，如转录、翻译，和剪接，如果存在内含子的话。表达载体典型地包含与编码多肽的异源核酸序列可操作连接的一个或多个侧翼序列。侧翼序列可以是例如同源的(即来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)、异源的(即来自宿主细胞物种或菌株之外的物种)、杂种的(即来自一个以上来源的侧翼序列的组合)，或合成的。
优选侧翼序列能够实现(effect)编码序列的复制、转录和/或翻译并且与编码序列可操作连接。在此使用的术语可操作连接是指多核苷酸元件以功能性关系的连接。例如，启动子或增强子与编码序列可操作连接，如果它影响编码序列的转录的话。然而，侧翼序列无须必然邻近编码序列，只要它正确发挥功能即可。因此，例如，插入的不被翻译但被转录的序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，启动子序列仍然可以被认为与编码序列可操作连接。类似地，增强子序列可以位于编码序列上游或下游并且影响该序列的转录。
在某些实施方案中，优选侧翼序列是驱动靶细胞中高水平基因表达的转录调节区。转录调节区可以包含例如启动子、增强子、沉默子、阻遏物元件(repressor element)或其组合。转录调节区可以是组成型的、组织特异性的、细胞类型特异性的(即与另一种组织或细胞类型相比，该区域驱动在一种组织或细胞类型中的更高水平转录)或可调节的(即对与化合物如四环素的相互作用有反应性)。转录调节区的来源可以是任何原核或真核生物、任何脊椎动物或无脊椎动物或任何植物，条件是该侧翼序列通过引起细胞内核酸转录而在细胞中行使功能。在实施本发明中可以利用各式各样的转录调节区。
合适的转录调节区包括CMV启动子(即CMV立早(immediateearly)启动子)；来自真核基因(即雌激素诱导型鸡卵清蛋白基因、干扰素基因、糖皮质激素诱导型酪氨酸转氨酶基因和胸苷激酶基因)的启动子；和主要早期和晚期腺病毒基因启动子；SV40早期启动子区(Bernoist and Chambon，1981，Nature 290304-10)；鲁斯氏肉瘤病毒(RSV)的3’长末端重复(LTR)中含有的启动子(Yamamoto，et al.，1980，Cell 22787-97)；单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781444-45)；金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster et al.，1982，Nature 29639-42)；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff et al.，1978，Proc.Acad.Sci.U.S.A.753727-31)；或tac启动子(DeBoer et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)。组织和/或细胞类型特异性转录控制区包括例如在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶1基因控制区(Swift et al.，1984，Cell 38639-46；Omitz et al.，1986，Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.50399-409(1986)；MacDonald，1987，Hepatology 7425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature 315115-22)；在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl et al.，1984，Cell 38647-58；Adameset al.，1985，Nature 318533-38；Alexander et al.，1987，Mol.Cell.Biol.，71436-44)；在睾丸、乳腺、淋巴样和肥大细胞中的小鼠乳房瘤病毒控制区(Leder et al.，1986，Cell 45485-95)；肝脏中的白蛋白基因控制区(Pinkert et al.，1987，Genes and Devel.1268-76)；肝脏中的α-feto-protein基因控制区(Krumlauf et al.，1985，Mol.Cell.Biol.，51639-48；Hammer et al.，1987，Science 23553-58)；肝脏中的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey et al.，1987，Genes and Devel.1161-71)；髓样细胞中的β-珠蛋白基因控制区(Mogram et al.，1985，Nature 315338-40；Kollias et al.，1986，Cell 4689-94)；脑中少突神经胶质细胞中的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead et al.，1987，Cell 48703-12)；骨骼肌中的肌球蛋白轻链2基因控制区(Sani，1985，Nature 314283-86)；下丘脑中的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason et al.，1986，Science 2341372-78)，和黑素瘤细胞中的酪氨酸酶启动子(Hart，I.Semin Oncol 1996 Feb；23(1)154-8；Siders，et al.Cancer Gene Ther 1998 Sep-Oct；5(5)281-91)等。还可以使用在某些化合物或条件例如光、热、辐射、四环素或热休克蛋白存在下活化的诱导型启动子(参见例如WO00/10612)。其它合适的启动子是本领域已知的。
如上所述，增强子也可以是合适的侧翼序列。增强子是作用于启动子以增加转录的DNA的顺式作用元件，通常长度大约10-300bp。增强子典型地是方向和位置不依赖性的，已经在受控编码序列的5′和3′都鉴定出了增强子。已知可从哺乳动物基因获得的几个增强子序列(即珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-feto蛋白和胰岛素)。类似地，SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多形瘤增强子和腺病毒增强子对真核生物启动子序列有用。虽然增强子可以在核酸编码序列的5′或3′的位置剪接入载体，但是典型地它位于启动子的5′的位点。其它合适的增强子是本领域已知的，并且将适用于本发明。
当制备本发明的试剂时，细胞可能需要被转染或转化。转染是指细胞对外来或外源性DNA的摄取，当外源性DNA已经被导入细胞膜内侧时，细胞已经被转染。很多转染技术为本领域熟知(即Graham etal.，1973，Virology 52456；Sambrook et al.，Molecular Cloning，ALaboratoty Manual.(Cold Spring Harbor Laboratories，1989)；Daviset al.，Basic Methods in Molecular Biology，(Elsevier，19S6)；和Chuet al.，1981，Gene 13197)。这种技术可用于将一个或多个外源性DNA部分导入合适的宿主细胞。
在某些实施方案中，优选细胞的转染引起那些细胞的转化。当细胞的特征有改变时，细胞被转化，当它已被修饰含有新核酸时，细胞正在被转化(being transformed)。转染后，转染的核酸可以通过物理整合入细胞的染色体而与细胞的核酸重组，可以作为游离型元件短暂维持而不被复制，或可以作为质粒独立复制。当核酸随细胞的分裂而复制时，细胞被稳定转化。
本发明的表达载体还提供免疫原性靶的片段的表达。片段可以包括在氨基末端(有或没有前导序列)和/或羧基末端截断的序列。片段也可以包括变异体(即等位的、剪接)、直向同源物、同源物和与亲本序列相比具有一个或多个氨基酸添加或置换或内部缺失的其它变异体。在优选实施方案中，截短和/或缺失包含大约1-5个氨基酸、5-10个氨基酸、10-20个氨基酸、20-30个氨基酸、30-40个氨基酸、40-50个氨基酸或更多。这种多肽片段可以任选包含氨基末端甲硫氨酸残基。应理解这种片段可以用于例如产生针对免疫原性靶的抗体或细胞免疫反应。
变异体是与主题序列相比具有一个或多个序列置换、缺失和/或添加的序列。变异体可以是天然存在的或人工构建的。可以从相应的核酸分子制备这种变异体。在优选实施方案中，变异体具有1至3，或1至5，或1至10，或1至15，1至20，或1至25，1至30，或1至40，或1至50，或50个以上氨基酸置换、插入、添加和/或缺失。
等位变异体是占据生物或生物种群染色体上给定基因座的序列的几个可能天然存在的替换形式之一。剪接变异体是从由初级转录物剪接产生的几个RNA转录物之一产生的多肽。直向同源物是来自另一个物种的类似核酸序列或多肽序列。例如，小鼠和人的免疫原性靶可以彼此被认为是直向同源物。序列衍生物是由亲本序列获得的具有置换、添加、缺失或化学修饰变异的那些序列。变异体也可以包括融合蛋白，它是指一个或多个第一序列(如肽)在至少一个其它序列(如异源肽)的氨基或羧基末端的融合。
“相似性”是与同一性相关的概念，除了相似性是指相关性的测量，包括相同的配对和保守置换的配对。如果两个多肽序列具有例如10/20相同的氨基酸，并且其余的全部是非保守置换，那么同一性和相似性百分比将都是50％。如果在相同实例中，还有五个位置上有保守置换，那么同一性百分比仍然是50％，但是相似性百分比将是75％(15/20)。因此，在有保守置换的情况下，两个多肽之间的相似性百分比将比那两个多肽之间的同一性百分比高。
置换可以是保守的或非保守的或其任何组合。多肽序列的保守氨基酸修饰(和编码核苷酸的相应修饰)可以产生具有类似于亲本多肽的功能和化学特征的多肽。例如，“保守氨基酸置换”可以包括用非天然残基置换天然氨基酸残基，以致对那个位置的氨基酸残基的大小、极性、电荷、疏水性或亲水性有很少或没有影响，尤其是不引起免疫原性降低。表I示出了合适的保守氨基酸置换。
表I
本领域技术人员将能够使用熟知技术确定免疫原性靶的合适变异体。为了鉴定该分子的可以改变而不破坏生物活性(即MHC结合、免疫原性)的合适区域，本领域技术人员可以靶向那些被认为对那种活性不重要的区域。例如，当已知来自相同物种或来自其它物种的具有类似活性免疫原性靶时，本领域技术人员可以将多肽的氨基酸序列与这种类似多肽进行比较。通过进行这种分析，人们可以鉴定保守的分子的残基和部分。应理解该分子的相对于这种类似免疫原性靶不保守的区域的改变将更小可能地不利地影响多肽的生物活性和/或结构。类似地，结合MHC所需的残基是已知的，并可以被修饰以提高结合。然而，在多数情况下，引起与MHC结合降低的修饰将不适当。本领域技术人员也将知晓，甚至在相对保守的区域，人们也可以用化学上类似的氨基酸置换天然存在的残基，同时保持活性。因此，甚至对于生物活性或对于结构重要的区域也可以经受保守氨基酸置换，而不破坏免疫原性靶的生物活性或不会不利地影响免疫原性靶的结构。
其它优选多肽变异体包括糖基化变异体，其中糖基化部位的数量和/或类型与主题氨基酸序列相比已经被改变。在一个实施方案中，多肽变异体包含比主题氨基酸序列更多或更少数量的N联糖基化部位。N联糖基化部位(N-linked glycosylation site)的特点在于序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中表示为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸残基。产生这个序列的氨基酸残基置换提供了添加N联糖链的潜在新部位。或者，消除这个序列的置换将除去存在的N联糖链。也提供了N联糖链的重排，其中一个或多个N联糖基化部位(典型地是天然存在的部位)被消除和产生一个或多个新的N联部位。为影响多肽的O联糖基化，人们将修饰丝氨酸和/或苏氨酸残基。
另外的优选变异体包括半胱氨酸变异体，其中与主题(subject)氨基酸序列组相比，一个或多个半胱氨酸残基被删除或被另一个氨基酸置换(如丝氨酸)。当肽或多肽必须再折叠为生物学有活性的构象时，如不溶包涵体分离后，半胱氨酸变异体有用。半胱氨酸变异体通常具有比天然蛋白更少的半胱氨酸残基，典型地具有偶数以使不成对半胱氨酸引起的相互作用减至最小。
在其它实施方案中，肽或多肽可以与有助于多肽纯化的一个或多个融合片段连接。可以在主题多肽变异体的氨基末端或羧基末端进行融合。可以没有接头或衔接分子直接融合或可以通过接头或衔接分子融合。接头或衔接分子可以是一个或多个氨基酸残基，典型地大约20个至大约50个氨基酸残基。接头或衔接分子也可以设计有DNA限制性核酸内切酶或蛋白酶的切割位点以允许融合部分的分离。应理解融合多肽一旦被构建，就可以根据在此描述的方法来衍生化。合适的融合片段包括金属结合结构域(如聚组氨酸片段)、免疫球蛋白结合结构域(即A蛋白、G蛋白、T细胞、B细胞、Fc受体或补体蛋白质抗体结合结构域)、糖结合结构域(如麦芽糖结合结构域)和/或“tag”结构域(即α-半乳糖苷酶的至少一部分、链球菌标记肽(a strep tagpeptide)、T7标记肽、FLAG肽或使用结合该结构域的化合物如单克隆抗体可以纯化的其它结构域)等。这个标记(tag)典型地与肽或多肽融合，并且表达后可以用作从宿主细胞亲和纯化感兴趣多肽序列的工具。亲和纯化法可以通过例如使用抗标记抗体作为亲和基质的柱层析完成。任选，随后用各种方法如使用某些肽酶进行切割，从纯化的感兴趣多肽序列中除掉该标记。如下所述，例如也可以在TA和共刺激成分如趋化因子CXC10(IP-10)、CCL7(MCP-3)或CCL5(RANTES)之间进行融合。
融合基序(motif)可以增强免疫原性靶到MHC加工隔室如内质网的运输。被称为转导或转胞吞序列的这些序列包括来源于HIVtat(参见Kim et al.1997 J.Immunol.1591666)、Drosophilaantennapedia(参见Schutze-Redelmeier et al.1996 J.Immunol.157650)或人1期(period-1)蛋白(hPER1；尤其是SRRHHCRSKAKRSRHH)的序列。
此外，多肽或其变异体可以与同源肽或多肽融合形成同源二聚体或与异源肽或多肽融合形成异源二聚体。异源肽和多肽包括但不限于允许检测和/或分离融合多肽的表位；跨膜受体蛋白或其部分如胞外结构域或跨膜和胞内结构域；与跨膜受体蛋白结合的配体或其部分；具有催化活性的酶或其部分；促进寡聚化的多肽或肽如亮氨酸拉链结构域；增加稳定性的多肽或肽如免疫球蛋白恒定区；具有不同于该肽或多肽的治疗活性的肽或多肽；和/或其变异体。
在某些实施方案中，在本发明组合物中，编码免疫原性靶的核酸序列与一个或多个共刺激成分组合可能有益，如细胞表面蛋白、细胞因子或趋化因子。共刺激成分可以例如作为多肽或作为编码该多肽的核酸包括在组合物中。合适的共刺激分子包括例如结合CD28家族成员(即CD28，ICOS；Hutloff，et al.Nature 1999，397263-265；Peach，et al.J Exp Med 1994，1802049-2058)的多肽，如CD28结合多肽B7.1(CD80；Schwarz，1992；Chen et al，1992；Ellis，et al.J.Immunol.，156(8)2700-9)、B7.2(CD86；Ellis，et al.J.Immunol.，156(8)2700-9)和其突变体/变异体(WO 00/66162)；结合整联蛋白家族成员的多肽(即LFA-1(CD 11a/CD18)；Sedwick，et al.J Immunol 1999，1621367-1375；Wulfing，et al.Science 1998，2822266-2269；Lub，et al.Immunol Today 1995，16479-483)，包括ICAM家族成员(即ICAM-1、-2或-3)；结合CD2家族成员的多肽(即CD2，信号淋巴细胞活化分子(CDw150或″SLAM″；Aversa，et al.J Immunol 1997，1584036-4044))如CD58(LFA-3；CD2配体；Davis，et al.ImmunolToday 1996，17177-187)或SLAM配体(Sayos，et al.Nature 1998，395462-469)；结合热稳定抗原的多肽(HSA or CD24；Zhou，et al.Eur J Immunol 1997，272524-2528)；结合TNF受体(TNFR)家族成员的多肽(即4-1BB(CD137；Vinay，et al.Semin Immunol 1998，10481-489)、OX40(CD134；Weinberg，et al.Semin Immunol 1998，10471-480；Higgins，et al.J Immunol 1999，162486-493)，和CD27(Lens，et al.Semin Immunol 1998，10491-499))如4-1BBL(4-1BB配体；Vinay，et al.Semin Immunol 1998，10481-48；DeBenedette，et al.J Immunol 1997，158551-559)、TNFR相关因子-1(TRAF-1；4-1BB配体；Saoulli，et al.J Exp Med 1998，1871849-1862，Arch，et al.Mol Cell Biol 1998，18558-565)、TRAF-2(4-1BB和OX40配体；Saoulli，et al.J Exp Med 1998，1871849-1862；Oshima，et al.Int Immunol 1998，10517-526，Kawamata，et al.J BiolChem 1998，2735808-5814)、TRAF-3(4-1BB和OX40配体；Arch，et al.Mol Cell Biol 1998，18558-565；Jang，et al.Biochem BiophysRes Commun 1998，242613-620；Kawamata S，et al.J Biol Chem1998，2735808-5814)、OX40L(OX40配体；Gramaglia，et al.JImmunol 1998，1616510-6517)、TRAF-5(OX40配体；Arch，et al.Mol CellBiol 1998，18558-565；Kawamata，et al.J Biol Chem 1998，2735808-5814)和CD70(CD27配体；Couderc，et al.Cancer GeneTher.，5(3)163-75)。CD 154(CD40配体或″CD40L″；Gurunathan，et al.J.Immunol.，1998，1614563-4571；Sine，et al.Hum.Gene Ther.，2001，121091-1102)可能也合适。
一种或多种细胞因子也可能是合适的共刺激成分或“佐剂”，作为本发明组合物内含有的多肽或由含有的核酸编码(Parmiani，et al.Immunol Lett 2000 Sep 15；74(1)41-4；Berzofsky，et al.NatureImmunol.1209-219)。合适的细胞因子包括例如白介素-2(IL-2)(Rosenberg，et al.Nature Med.4321-327(1998))、IL-4、IL-7、IL-12(综述，Pardoll，1992；Harries，et al.J.Gene Med.2000 Jul-Aug；2(4)243-9；Rao，et al.J.Immunol.1563357-3365(1996))、IL-15(Xin，et al.Vaccine，17858-866，1999)、IL-16(Cruikshank，et al.J.Leuk Biol.67(6)757-66，2000)、IL-18(J.Cancer Res Clin.Oncol.2001.127(12)718-726)、GM-CSF(CSF(Disis，et al.Blood，88202-210(1996))、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或干扰素如IFN-α或IFN-γ。其它细胞因子也可能适于实施本发明，如本领域已知。
也可以使用趋化因子，以多肽或核酸形式。已经表明与肿瘤自身抗原融合的包含CXCL10(IP-10)和CCL7(MCP-3)的融合蛋白诱导抗肿瘤免疫(Biragyn，et al.Nature Biotech.1999，17253-258)。趋化因子CCL3(MIP-1α)和CCL5(RANTES)(Boyer，et al.Vaccine，1999，17.(Supp.2)S53-S64)在实施本发明中可能也有用。其它合适的趋化因子是本领域已知的。
本领域也已知抑制性或负性调节免疫机制可以被阻断，引起增强的免疫反应。例如，已经表明用抗CTLA-4(Shrikant，et al.Immunity，1996，14145-155；Sutmuller，et al.J.Exp.Med.，2001，194823-832)、抗CD25(Sutmuller，上述)、抗CD4(Matsui，et al.J.Immunol.，1999，163184-193.)、融合蛋白IL13Ra2-Fc(Terabe，et al.NatureImmunol.，2000，1515-520)及其组合(即抗CTLA-4和抗CD25，Sutmuller，上述)治疗上调抗肿瘤免疫反应并将适于实施本发明。尤其是这种治疗也可以与本发明的一个或多个免疫原性靶联合。
这些组分中的任何一种可以单独或与其它试剂联合使用。例如，已经表明CD80、ICAM-1和LFA-3(“TRICOM”)的组合可以增强抗癌免疫反应(Hodge，et al.Cancer Res.595800-5807(1999)。其它有效组合包括例如IL-12+GM-CSF(Ahlers，et al.J.Immunol.，1583947-3958(1997)；Iwasaki，et al.J.Immunol.1584591-4601(1997))、IL-12+GM-CSF+TNF-α(Ahlers，et al.Int.Immunol.13897-908(2001))、CD80+IL-12(Fruend，et al.Int.J.Cancer，85508-517(2000)；Rao，et al.上述)和CD86+GM-CSF+IL-12(Iwasaki，上述)。本领域技术人员将知晓实施本发明有用的另外的组合。此外，本领域技术人员将知晓可以用来调节这种机制的另外的试剂或方法。在实施本发明中可以使用这些试剂和方法，以及本领域技术人员已知的其他试剂和方法。
也可以使用提高基于核酸的免疫的效率的另外策略，包括例如使用自我复制病毒复制子(Caley，et al.1999.Vaccine，173124-2135；Dubensky，et al.2000.Mol.Med.6723-732；Leitner，et al.2000.Cancer Res.6051-55)、密码子优化(Liu，et al.2000.Mol.Ther.，1497-500；Dubensky，上述；Huang，et al.2001.J.Virol.754947-4951)、体内电穿孔(Widera，et al.2000.J.Immunol.1644635-3640)、CpG刺激基序的掺入(Gurunathan，et al.Ann.Rev.Immunol.，2000，18927-974；Leitner，上述；Cho，et al.J.Immunol.168(10)4907-13)、靶向内吞或泛素加工途径的序列(Thomson，et al.1998.J.Virol.722246-2252；Velders，et al.2001.J.Immunol.1665366-5373)、Marek病病毒1型VP22序列(J.Virol.76(6)2676-82，2002)、激发-加强方案(prime-boost regimens)(Gurunathan，上述；Sullivan，et al.2000.Nature，408605-609；Hanke，et al. 1998.Vaccine，16439-445；Amara，et al.2001.Science，29269-74)和使用粘膜递送载体如沙门氏菌(Darji，et al.1997.Cell，91765-775；Woo，et al.2001.Vaccine，192945-2954)。其它方法是本领域已知的，其中一些描述如下。
在使用免疫原性靶治疗和/或预防癌症中也可以利用化疗剂、射线、抗血管生成化合物或其它试剂(Sebti，et al.Oncogene 2000 Dec27；19(56)6566-73)。例如，在治疗转移性黑素瘤中，合适的化疗方案可以包括BELD(博莱霉素，长春地辛，罗氮芥，和deacarbazine；Young，et al.1985.Cancer，551879-81)、BOLD(博莱霉素、长春新碱、环己亚硝脲、氮烯唑胺；Seigler，et al.1980.Cancer，462346-8)、DD(氮烯唑胺、放线菌素；Hochster，et al.Cancer TreatmentReports，6939-42)或POC(普鲁苄肼、长春新碱、环己亚硝脲；Carmo-Pereira，et al.1984.Cancer Treatment Reports，681211-4)等。也可以使用其它合适的化疗方案。
许多抗血管生成试剂是本领域已知的并且将适于与免疫原性靶疫苗和/或化疗方案共同施用(参见例如Timar，et al.2001.PathologyOncol.Res.，7(2)85-94)。这种试剂包括例如生理试剂如生长因子(即ANG-2，NK1，2，4(HGF)，转化生长因于β(TGF-β))、细胞因子(即干扰素如IFN-α、-β、-γ、血小板因子4(PF-4)、PR-39)、蛋白酶(即切割的AT-III、胶原XVIII片段(Endostatin)、HmwKallikrein-d5纤溶酶片段(Angiostatin)、凝血酶原-Fl-2、TSP-1)、蛋白酶抑制剂(即金属蛋白酶的组织抑制剂如TIMP-1、-2或-3；maspin；纤溶酶原激活物抑制剂如PAI-1；色素上皮衍生因子(PEDF))，Tumstatin(通过ILEX，Inc.可获得)、抗体产物(即胶原结合抗体HUIV26、HUI77、XL313；抗VEGF；抗整联蛋白(即Vitaxin，(Lxsys)))和糖苷酶(即肝素酶-I、-III)。已知或被认为具有抗血管生成潜力的“化学试剂”或修饰的生理试剂，包括例如长春碱、紫杉酚、酮康唑、萨力多胺、dolestatin、combrestatin A、雷帕霉素(Guba，et al.2002，Nature Med.，8128-135)、CEP-7055(可从Cephalon，Inc.获得)、黄酮乙酸、Bay 12-9566(Bayer Corp.)、AG3340(Agouron，Inc.)、CGS 27023A(Novartis)、tetracylcine衍生物(即COL-3(Collagenix，Inc.))、Neovastat(Aeterna)、BMS-275291(Bristol-Myers Squibb)、低剂量5-FU、低剂量氨甲喋呤(MTX)、irsofladine、radicicol、cyclosporine、卡托普利、塞来昔布、D45152硫酸化多糖、阳离子蛋白(鱼精蛋白)、阳离子肽VEGF、苏拉明(polysulphonated napthyl urea)、干扰VEGF功能或产量的化合物(即SU5416 或 SU6668(Sugen)、PTK787/ZK22584(Novartis))、远霉素A、Angiozyme(核酶)、isoflavinoids、星形孢菌素衍生物、染料木素、EMD121974(Merck KcgaA)、tyrphostins、isoquinolones、视黄酸、carboxyamidotriazole、TNP-470、善得定、2-甲氧基雌二醇、aminosterols (即squalamine)、谷胱甘肽类似物(即N-乙酰-L-半胱氨酸)、combretastatin A-4(Oxigene)、Eph受体阻滞剂(Nature，414933-938，2001)、Rh-Angiostatin、Rh-Endostatin(WO 01/93897)、环状RGD肽、accutin-disintegrin、苯并二氮杂、人源化抗avb3 Ab、Rh-PAI-2、氨氯吡脒、p-amidobenzamidine、抗uPA ab、抗uPAR Ab、L-phanylalanin-N-methylamides(即Batimistat，Marimastat)、AG3340和米诺环素。许多其它合适的试剂是本领域已知的，并将足以实践本发明。
本发明也可以与治疗癌症的“非传统”方法联合使用。例如，最近已证明给予某些厌氧菌可以有助于减缓肿瘤生长。在一项研究中，诺氏梭菌(Clostridium novyi)被修饰除去噬菌体游离基因(episome)上携带的毒素基因并被给予具有结肠直肠肿瘤的小鼠(Dang，et al.P.N.A.S.USA，98(26)15155-15160，2001)。与化疗联合，表明该治疗在动物中引起肿瘤坏死。本申请中描述的试剂和方法可以与这种治疗方法联合。
编码免疫原性靶的核酸可以通过几种可利用技术中的任何一种给予患者。已经成功用于将核酸引入宿主的各种病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、疱疹病毒和痘病毒等。本领域理解在本领域中许多这种病毒载体可以利用。本发明的载体可以使用本领域技术人员广泛可利用的标准重组技术构建。在普通分子生物学参考文献中可以找到这种技术，如Molecular CloningA LaboratoryManual(Sambrook，et al.，1989，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)、Gene Expression Technology(Methods in Enzymology，Vol.185，edited by D.Goeddel，1991.Academic Press，San Diego，CA)和PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications(Innis，et al.1990.Academic Press，San Diego，CA)。
优选的逆转录病毒载体是慢病毒(lentivirus)衍生物以及鼠和鸟类逆转录病毒的衍生物。合适的逆转录病毒载体实例包括例如Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺瘤病毒(MuMTV)、SIV、BIV、HIV和鲁斯氏肉瘤病毒(RSV)。很多逆转录病毒载体可以合并(incorporate)多个外源核酸序列。由于重组逆转录病毒是有缺陷的，因此为了产生传染性载体颗粒，它们需要辅助。这种辅助可以通过例如编码逆转录病毒结构基因的辅助细胞系来提供。合适的辅助细胞系包括Ψ2、PA317 和 PA12等。然后使用这种细胞系产生的载体病毒粒子可以用来感染组织细胞系，如NIH3T3细胞以产生大量嵌合逆转录病毒粒子。逆转录病毒载体可以通过传统方法(即注射)或通过接近靶细胞群的“生产细胞系”的植入给予(Culver，K.，et al.，1994，Hum.Gene Ther.，5(3)343-79；Culver，K.，et al.，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.，59685-90)；Oldfield，E.，1993，Hum.Gene Ther.，4(1)39-69)。生产细胞系(producer cell line)被改造以产生病毒载体和在靶细胞附近释放病毒颗粒。一部分释放的病毒颗粒接触靶细胞并感染那些细胞，由此将本发明的核酸递送至靶细胞。靶细胞感染后，发生载体核酸的表达。
已证明腺病毒载体对于将基因转移入真核细胞(Rosenfeld，M.，etal.，1991，Science，252(5004)431-4；Crystal，R.，etal.，1994，Nat.Genet.，8(1)42-51)、真核基因表达的研究(Levrero，M.，et al.，1991，Gene，101(2)195-202)、疫苗开发(Graham，F.and Prevec，L.，1992，Biotechnology，20363-90)和动物模型中(Stratford-Perricaudet，L.，et al.，1992，Bone Marrow Transplant.，9(Suppl.1)151-2；Rich，D.，et al.，1993，Hum.Gene Ther.，4(4)461-76)特别有用。将重组Ad给予体内不同组织的实验途径包括气管内滴注(Rosenfeld，M.，et al.，1992，Cell，68(1)143-55)、肌内注射(Quantin，B.，et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89(7)2581-4)、外周静脉内注射(Herz，J.，and Gerard，R.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90(7)2812-6)和趋实体接种(stereotactic inoculation)至脑(LeGal La Salle，G.，et al.，1993，Science，259(5097)988-90)等。
腺病毒相关病毒(AAV)显示出高水平传染性、广泛的宿主范围和整合入宿主细胞基因组的特异性(Hermonat，P.，et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81(20)6466-70)。和单纯疱疹病毒1型(HSV-1)是又一个吸引人的载体系统，尤其是由于其亲神经性能而用于神经系统(Geller，A.，et al.，1991，Trends Neurosci.，14(10)428-32；Glorioso，et al.，1995，Mol. Biotechnol.，4(1)87-99；Glorioso，et al.，1995，Annu.Rev.Microbiol.，49675-710)。
痘病毒是另一种有用的表达载体(Smith，et al.1983，Gene，25(1)21-8；Moss，et al，1992，Biotechnology，20345-62；Moss，et al，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，15825-38；Moss，et al.1991.Science，2521662-1667)。证明有用的痘病毒包括牛痘、NYVAC、禽痘(avipox)、鸟痘(fowlpox)、金丝雀痘(canarypox)、ALVAC和ALVAC(2)等。
NYVAC(vP866)源自于牛痘病毒的哥本哈根疫苗株，通过删除基因组的编码已知或潜在的毒力因子的六个非必需区(参见例如美国专利5,364,773和5,494,807)。缺失基因座也被改造为插入外源基因的接受基因座。缺失区域是胸苷激酶基因(TK；J2R)；出血区(u；B13R+B14R)；A型包涵体区(ATI；A26L)；血细胞凝集素基因(HA；A56R)；宿主范围基因区(C7L-K1L)和大亚基、核糖核苷酸还原酶(I4L)。NYVAC是遗传改造的牛痘病毒株，是通过特异性缺失编码与毒性和宿主范围相关的基因产物的十八个开放阅读框产生的。已经证明NYVAC可用于表达TAs(参见例如美国专利6,265,189)。NYVAC(vP866)、vP994、vCP205、vCP1433、placZH6H4Lreverse、pMPC6H6K3E3和pC3H6FHVB也按照布达佩斯条约的条件保藏在ATCC，保藏号分别为VR-2559、VR-2558、VR-2557、VR-2556、ATCC-97913、ATCC-97912和ATCC-97914。
基于ALVAC的重组病毒(即ALVAC-1和ALVAC-2)也适合用于实施本发明(参见例如美国专利5,756,103)。ALVAC(2)与ALVAC(l)相同，除了ALVAC(2)基因组包含牛痘启动子控制下的牛痘E3L和K3L基因(美国专利6,130,066；Beattie et al.，1995a，1995b，1991；Chang et al.，1992；Davies et al.，1993)。已经证明ALVAC(1)和ALVAC(2)都可用于表达外源DNA序列，如TAs(Tartaglia et al.，1993a，b；美国专利5,833,975)。ALVAC按照布达佩斯条约的条件保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209，美国，ATCC保藏号VR-2547。
另一种有用的痘病毒载体是TROVAC。TROVAC是指减毒的鸟痘，是来源于被许可对1日龄小鸡接种的鸟痘病毒的FP-1疫苗株的噬菌斑克隆分离物。TROVAC同样按照布达佩斯条约的条件保藏在ATCC，保藏号2553。
“非病毒”质粒载体可能也适于实施本发明。优选的质粒载体与细菌、昆虫和/或哺乳动物宿主细胞相容。这种载体包括例如PCR-II、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen，San Diego，CA)、pBSII(Stratagene，La Jolla，CA)、pET15(Novagen，Madison，WI)、pGEX(PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)、pEGFP-N2(Clontech，Palo Alto，CA)、pETL(BlueBacII，Invitrogen)、pDSR-α(PCT
发明者N·伯林斯泰因, J·塔塔格利亚, M·帕林顿, D·帕尼卡利, L·格里茨 申请人:圣诺菲·帕斯图尔有限公司, 特里昂生物学公司