专利名称：黑素瘤中的gna11突变的制作方法
黑素瘤中的GNA11突变相关申请的交叉引用本申请要求于2009年10月30日提交的美国临时申请61/256，885的权益，该申请被通过引用并入本文。关于在联邦政府资助的研究或开发中完成的发明的权利声明本发明的完成得到了在国立卫生研究院授予的ROl CA131524-01A1号基金下的政府支持。政府享有本发明的某些权利。
背景技术：
黑素瘤形成的现有模式是黑素细胞通过关键性黑素瘤基因的累积突变从正常状态发展为恶性状态。參见 Meier, F.，et al. (1998) Frontiers in Bioscience3:D1005-1010o黑素瘤能够自发地发生或发生在已有的疲(nevus)或痦子(mole)内。疲具有已知的黑素瘤基因的突变，因此是发展为黑素瘤的危险因素。參见，例如，Pollock, P.M. , et al, (2003) Nat. Genet. 33 (I) : 19-20; Kumar, R. et al, (2004) J. Invest. Dermatol122(2):342-348;Chin, L. , (2003)Nat. Rev. Cancer 3(8):559-570。已经表明，人黑素瘤和黑素细胞痣的大多数具有BRAF、NRAS, C-KIT或HRAS基因的活化突变。而且，最近的研究已经证明黑素瘤从遗传学角度分为不同的组，这些组在MAP-激酶通路活化频率方面具有显著差异。參见，Curtin，J.A.，et al, (2005) N EnglJ Med. 353(20): 2135-47。ー种类别为葡萄膜黑素瘤，其起源于眼部的脉络膜丛内的黑素细胞，并且在生物学上与特征为细胞遗传改变的皮肤黑素瘤明显不同。參见，Horsman etal. (1993)Cancer 71 (3) :811。另ー类别是皮内黑素细胞增殖，其可以是先天性的或后天性的，并且以从离散的蓝色痦子(蓝痣)到大蓝灰色斑块的不同方式存在，所述斑块影响结膜和眶周皮肤(太田痣(nevus of Ota))、肩部(伊藤痣(nevus of Ito))和下背部(蒙古斑(Mongolain spot))。參见，Zembowicz, et al. (2004) Histopathology 45(5) :433。这些皮内黑素细胞增殖不包含BRAF或NRAS突变，并因此与其他痣和黑素瘤比较时具有独特的病因学。參见，Ariyanayagam-Baksh SM, et al, (2003)Am J Dermatopathol. 25(1) :p. 21-7 葡萄膜黑素瘤是起源于眼部的脉络膜丛、睫状体或虹膜上皮中的黑素细胞的黑素细胞瘤(例如，Singh, et al, Ophthalmol Clin North Aml8:75-84，viii, 2005)。在侵袭性更强的亚型中，有诸如单体3、三体8的进ー步的基因改变以及向肝脏转移的强倾向性(Singh, et al, Ophthalmol Clin North Am 18:75-84,viii, 2005, Horsman&ffhite, Cancer71:811-9, 1993)。葡萄膜黑素瘤侵袭性強，5年疾病特异性生存率约为70%(例如，Chang etal, Cancer 83:1664-78，1998)。葡萄膜黑素瘤的一个危险因子是存在于结膜和眶周皮肤中的蓝灰色色素沉着过度，称为太田疲(Singh et al, Ophthalmology 105:195-8, 1998).(1998)Am J Dermatopathol. 20:109-110)。最近，小鼠中的大規模诱变筛选鉴定了几种黑皮肤(Dsk)突变体。參见VanRaamsdonk CD, et al, (2004) Nat Genet. 36:961-968。这些突变体中的ー些具有黑素细胞表型，具有类似蓝痣的皮内黑素细胞的稀疏的细胞増殖。该突变已被证明是G-蛋白a亚単位突变的結果。、
G蛋白代表在哺乳动物中发现的异源三聚体蛋白的一大家族，其由阿尔法(a)、贝它(￠)和伽玛(Y )亚单位组成。參见，Wettschureck, N. A. 0. S.，(2005) Physiol.Rev. 85(4) :1159-1204。G-a q是多种G-a亚单位中的ー种，其通过结合和水解GTP介导对磷脂酶C3 的刺激。參见，Markby, D.W.，et al, (1993) Science 262 (1541) : 1895-1901。已假设G-a q的活化促进黑素细胞在皮肤中的存活。參见，Van Raamsdonk, C. D. , et al, (2004)。这与在小鼠中的以下观测是一致的G-aq的多度活跃增加成黑素细胞，即不成熟的黑素细胞迁移到皮肤中的数目，而不增加它们的有丝分裂率。參见，Van Raamsdonk, C. D. , etal, (2004)。GNAQ(—种异源三聚体G蛋白a亚单位)的体细胞致癌性突变已经在多种黑素细胞瘤，包括蓝痣和葡萄膜黑素瘤(W0 2008/098208)等中被鉴定。小鼠中GNAll在氨基酸水平与GNAQ有90% —致性，并且在色素沉着方面与GNAQ共享重叠功能。本发明部分基于以下发现，黑素细胞瘤包括葡萄膜黑素瘤中存在GNAll的突变。发明简述本发明提供了检测生物样品中黑素瘤细胞或痣细胞的方法。该方法包括检测生物样品中GNAll基因的活化序列突变，所述生物样品包含来自患者的疑似黑素瘤细胞或痣细胞，或者包含来自患者的已知为黑素瘤细胞或疲细胞的细胞。例如，本发明提供了通过检测GNAll基因或由该基因编码的产物中突变的存在，或者通过检测GNAll的过表达来检测黑素瘤的方法，或者检测痣的方法，所述黑素瘤例如原发性或转移性葡萄膜黑素瘤，所述痣例如诸如恶性蓝痣、细胞型蓝痣、普通型蓝痣的蓝痣、伊藤痣或太田痣。所述方法可以用于诊断和预后指示以及用于鉴定以下黑素瘤患者对靶向GNAll通路的各种处理疗法(诸如G-a拮抗剂)或者靶向下游信号组分的疗法(诸如蛋白激酶C抑制剂)的反应或者可能的反应。本发明还提供了治疗黑素瘤或痣的方法，包括给予患有来源于GNAll基因突变的黑素瘤(例如葡萄膜黑素瘤或恶性蓝痣)，或者痣(例如蓝痣)的患者GNAll抑制剂，例如小分子、抗体、或者诸如siRNA的核酸抑制剂。因此，本发明提供了检测生物样品如皮肤或眼部样品中黒素细胞瘤的方法，所述生物样品包含来自患者，例如患有或疑似患有黑素瘤的患者的黑素瘤细胞，该方法包括检测存在于生物样品中的黑素瘤或痣细胞的GNAll活化突变，其中GNAll活化突变的存在指示黑素细胞瘤的存在。在一些实施方案中，黑素细胞瘤是葡萄膜黑素瘤。在其他实施方案中，GNAll突变指示痣，诸如蓝痣或也称为恶性蓝痣的发生在蓝痣中的黑素瘤。在一些实施方案中，检测步骤包括检测核酸例如mRNA或基因组DNA中是否存在GNAll突变。在典型的实施方案中，这种检测步骤包括特异性扩增GNAll的扩增反应，诸如PCR或者RT-PCR，以及利用能与靶GNAll序列杂交的探针或者通过测序扩增的GNAll对突变进行检測。在其他实施方案中，检测步骤包括检测GNAll蛋白的突变，例如测量GNAll活性和/表达的水平。在典型实施方案中，这种检测步骤包括利用抗体(免疫细胞化学)和/或电泳蛋白分离(例如，蛋白免疫印迹)。在一些实施方案中，GNAll突变是209位的Gln突变为Leu (CJA突变为CIA或CM突变为CIS);而在其他实施方案中，GNAlI突变是209位的Gln突变为Pro(CAA突变为C￡A)。 典型地，检测步骤包括检测GNAll中是否存在活化序列突变。这通常通过分析来自生物样品的核酸样品来实现。核酸可以是DNA或RNA样品。DNA样品可以通过RNA的逆转录获得，或者可以是基因组DNA。通常，检测突变的检测步骤包括扩增反应。是否存在突变可以通过扩增的核酸的序列分析或者通过应用等位基因特异性寡核苷酸或探针的方法来鉴定。在一些实施方案中，本发明的方法可以包括检测来自生物样品的核酸中是否存在GNAQ的活化突变的额外步骤，所述突变例如GNAQ编码Gln 209的密码子的突变。在ー些实施方案中，生物样品来自患葡萄膜黑素瘤或恶性蓝痣的患者。在一些实施方案中，患者患有黑素细胞瘤，其中黑素细胞瘤是蓝疲。在一些实施方案中，生物样品来自患有或疑似患有黑素瘤(例如葡萄膜黑素瘤或恶性蓝痣)或转移瘤的患者。在其他实施方案中，生物样品来自患有或疑似患有痣的患者，所述痣例如诸如普通型蓝痣、细胞型蓝痣的蓝痣、伊藤痣或太田痣。在一些实施方案中，样品来自皮肤、眼部或者来自转移部位。本发明还提供了监测患者黑素瘤进展的方法，所述患者经历了治疗源自GNAll突变的黑素瘤的疗法。该方法包括检测来自患者的生物样品中具有GNAll突变的细胞的数目变化，其中具有突变的细胞的数目变化指示患者对所述疗法的反应。在一些实施方案中，黑素瘤是葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，黑素瘤是恶性蓝痣。在一些实施方案中，样品来自转移部位。在一些实施方案中，监测患者的黑素瘤进展通过检测来自生物样品的核酸中的突变来实施，所述患者中的黑素瘤源自GNAll基因的活化突变。在其他实施方案中，通过评价存在于生物样品中的GNAll蛋白来检测源自GNAll突变的黑素瘤的进展。在本发明的ー些实施方案中，生物样品来自眼部或皮肤。在其他实施方案中，生物样品来自转移部位，例如肝脏、肺脏、血液、淋巴结、肾上腺或骨。典型地，依照本发明监测黑素瘤进展中，与取自暴露于治疗剂前的患者的生物样品中具有GNAll突变的细胞数目相比，取自用治疗剂治疗后的患者的生物样品中具有GNAll突变的细胞出现数目减少指示对上述治疗剂有阳性治疗反应。在本发明的所有检测方法中，生物样品可以来自疑似包含原发性或转移性黑素瘤细胞的机体中的任一来源。因此，生物样品可以来自皮肤，例如眼部，例如葡萄膜、结膜或粘膜。在其他实施方案中，样品可以来自血液、血清、来自淋巴结的组织、或者来自内脏器官诸如肾上腺、肝脏或肺脏的组织或骨组织。在一些实施方案中，例如在监测黑素瘤进展中，样品来自容易获取的组织，诸如血液。在另一方面，本发明提供了确定黑素瘤患者是否是接受治疗的候选者的方法，所述治疗直接抑制Ga亚单位活性，或者通过抑制由Ga活化的蛋白来抑制Ga亚单位活性。该方法包括确定黑素瘤细胞是否具有GNAll的活化突变。在一些实施方案中，用这种抑制剂治疗的患者并不患有具有GNAQ活化突变的黑素瘤或痣。这种測定依照本文描述的检测方法来实施。因此，检测步骤可以包括检测mRNA、DNA或蛋白的突变。在一些实施方案中，检测步骤可以包括检测来自黑素瘤或痣的核酸样品中GNAll突变的存在，而在其他实施方案 中，检测步骤来自黑素细胞瘤的蛋白样品。核酸样品可以是RNA或DNA，例如来自黑素细胞瘤样品的基因组DNA或从来自黑素细胞瘤样品的RNA制备的cDNA。经常地，检测步骤包括扩增反应，诸如PCR或RT-PCR。
在一些实施方案中，黑素瘤是葡萄膜黑素瘤。
在另一方面，本发明提供了抑制源自GNAll体细胞突变的痣或黑素瘤细胞的生长和/或増殖的方法，该方法包括给予GNAll拮抗剂。GNAll拮抗剂可以是例如小分子，诸如依地福新(edelfosine)、蛋白激酶C抑制剂或者星形孢菌素类似物CPG41251 ;抗体；肽；或者核酸。在一些实施方案中，抑制剂是siRNA。在一些实施方案中，siRNA既靶向GNAll又靶向GNAQ核酸序列。典型地，痣或黑素瘤细胞来自例如葡萄膜黑素瘤或蓝痣。在典型实施方案中，经历治疗的患者不患具有GNAQ突变的黑素瘤或痣。本发明还提供了确定由痣发展为黑素瘤的风险的方法，该方法包括检测来自痣的生物样品中是否存在GNAll基因的序列突变，其中突变的存在指示由痣发展为黑素瘤的风险增加。在一些实施方案中，序列突变是GNAll的编码Gln 209的密码子。在一些实施方案中，痣是蓝痣。在一些实施方案中，突变通过评估由基因编码的蛋白来检测。本发明还提供了确定黑素瘤转移风险的方法，该方法包括检测来自患者的生物样品中GNAll基因的序列突变的存在或缺失，其中生物样品包含原发性黑素瘤细胞，并且其中突变的存在指示黑素瘤转移的风险增加。在一些实施方案中，黑素瘤是葡萄膜黑素瘤。在一些实施方案中，序列突变是GNAll的编码Gln 209的密码子。在一些实施方案中，在诸如肢端黑素瘤、肢端雀斑性黑素瘤、慢性日晒诱发的损伤性(CSD)黑素瘤、非慢性日晒诱发的损伤性(NCSD)黑素瘤、恶性小痣黑色素瘤、粘膜黑素瘤、结节性黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、结缔组织增生性黑素瘤、结膜黑素瘤、复发性细胞型蓝痣、先天性痣引起的黑素瘤、恶性蓝痣和转移瘤的黑素细胞瘤中检测GNAll突变，例如密码子209的活化突变。在一些实施方案中，在为痣的黑素细胞瘤中检测GNAll突变。例如，可以在先天性痣、结节性先天性痣、具有结缔组织增生反应的先天性痣、异型性巨大先天性痣、结节性巨大先天性痣、没有确诊的先天性痣、非典型性蓝痣、非典型性细胞型蓝痣、伴有神经嵴性错构瘤(neurocristic hamartoma)的蓝疲、没有确诊的蓝疲和没有确诊的深部穿通性痣中检测GNAll突变。附图
简述图I. GNAll在密码子209处的突变谱。顶图显示了编码谷氨酰胺的密码子209的野生型序列(虚线之间)。最常见的突变是导致亮氨酸取代(GNA11Q2°9り的腺嘌呤到胸腺嘧啶的颠换，随后是导致脯氨酸取代(GNA11_P)的腺嘌呤到胞嘧啶的颠换，以及影响密码子209的第二和第三碱基的突变，这也导致亮氨酸取代。图2.解剖学位置和组织病理学特征以及突变状态。A)GNAlI突变在睫状体脉络膜位置的原发性葡萄膜黑素瘤中更为常见。(p=0. 048，Fisher' s精确检验)。条块上段，GNAll ;中段，GNAQ ;下段，两者都不是。图3. GNAlf在免疫低下小鼠中诱发具有自发转移的肿瘤。永生化小鼠黑素细胞(melan-a细胞)转导了 6熟110皿，并且自双侧注射入勵0/5(10/白介素2受体[IL2r]Y *小鼠(n=3)的侧腹。所有六个注射部位发展为重度黑化(左下方)的肿瘤(右上方)，所有小鼠发生多发性肺脏转移(中下方)，以及ー只小鼠发生肝脏转移(右下方)。图4.突变的GNAlI导致MAP-激酶活化。将Melan-a细胞转导GNAl 1Q209L,GNAQq209l或载体对照，孵育48小时，血清饥饿16小时，用2%血清刺激20分钟，然后裂解。发明详述
引言本发明提供了用于检测黑素瘤和痣细胞的方法、试剂和试剂盒，用于诊断和预后用途，以及用于治疗黑素瘤和痣。本发明部分基于以下发现黑素瘤和痣具有活化体细胞型GNAll突变，即导致G- a亚单位的GTP水解活性丧失或减弱的突变。G-a是ー种异源三聚体GTP-结合蛋白的a亚单位，其在脊椎动物中形成两个亚组广泛表达的包括Gnaq和Gnall的Ga -q家族，以及表现出更为局限的表达的Gnal4和Gnal5家族。G a-q家族介导磷脂酶C P的刺激，从而导致磷脂酰肌醇ニ磷酸(PIP2)水解为三磷酸肌醇(IP3)和甘油ニ酯(DA G)。IP3能够刺激钙从内质网(ER)的细胞内贮存库释放出来，激活下游钙-依赖性信号转导。同吋，DAG能够激活蛋白激酶C(PKC)，然后两条通路都能进入有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联中。參见Corbit，K. C.，et al.，(2000)Mol.Cell Biol. 20:5392-5403;Sato, M. et al. , (2006)Ann. Rev. Pharm. Toxicol. 46 151-187 在本发明的一方面，本发明人已经发现，GNAll的活化突变，例如GNAll的Q209的杂合体细胞型取代突变存在于几种黑素细胞瘤中，包括诸如蓝痣的痣和诸如葡萄膜黑素瘤的黑素瘤。在一些实施方案中，GNAlI活化突变是导致GNAll核酸和多肽序列过表达的突变。因此，除了检测活化突变的方法外，检测GNAll核酸和/或多肽序列水平的方法也能够用于检测痣，例如蓝痣和黑素瘤细胞，诸如本文描述的其中GNAll过表达的原发性或转移性葡萄膜黑素瘤细胞。在本发明的ー个方面，借助检测活化GNAll的体细胞型GNAll突变检测痣和/或黑素瘤细胞的能力对于大量应用中任何一个都是有用的。例如，它可以单独应用或与其他诊断方法联用，以诊断患者的黑素瘤或某ー类型的黑素瘤。它还可以用于鉴定对治疗，诸如靶向G-蛋白或磷脂酶CP或由GNAll调节的通路的其他下游组分的治疗敏感的特定黑素瘤。在一些实施方案中，活化的GNAll突变的检测可以作为侵袭性更强的黑素瘤的预后指示剂，所述侵袭性更强的黑素瘤比没有GNAll突变的黑素瘤更可能引起转移。GNAll的体细胞型活化突变的检测还可以用于监测黑素瘤治疗的功效。例如，可以将抗黑素瘤治疗后的GNAll活性水平(例如Ga活性、或诸如依赖Ga活性的磷脂酶C3的活性)或具有GNAll序列突变的黑素细胞的数目与治疗前的水平比较。治疗后,GNAll活性水平(如磷脂酶CP活性)的降低或具有突变的GNAll的黑素瘤细胞数目的減少指示有效的治疗。GNAlI活性水平和/或具有体细胞型GNAlI突变的细胞数目的变化还可以与特定的抗黑素瘤疗法或与观测到的预后结果在统计学上相关，由此允许开发数据库，基于该数据库，根据具体的水平活性或GNAll突变的诊断存在作出以统计学为基础的预后或选择最有效的治疗。检测具有GNAll活化突变的细胞可以用于监测患者中黒素瘤细胞的数目或定位，例如用于监测癌症随时间的进展。GNAll活化突变的存在还可以指示可能对靶向突变GNAll的治疗剂有反应的黑素瘤。因此，本发明还提供了通过给予Ga拮抗剂来治疗具有GNAll活化突变的黑素细胞瘤(例如葡萄膜黑素瘤或蓝痣)的方法，所述G a拮抗剂例如，抗体、肽、小分子抑制剂诸如L-苏-双氢鞘氨醇(PKC特异性抑制剂)或其他小分子抑制剂、以及GNAl I核酸抑制剂(例如6嫩11或6嫩11/6嫩0 siRNA抑制剂)或磷脂酶CP或GNAll调节的下游通路的抑制剂。利用本文描述的方法，通过分析GNAll活化突变的存在来鉴定这种黑素细胞瘤。痣中GNAll活化突变的存在通常指示痣(例如常规种类的蓝痣和太田痣)具有发展为黑素瘤的风险。因此，来自患者的痣可以用本文描述的方法来评估活化突变的存在。定义 术语“GNA11”或“ Gnal I”指鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G-蛋白)的a亚单位。该术语涵盖了 GNAll的核酸和多肽多态性变体、等位基因、突变体和片段。人GNAll位于染色体区19pl3. 3。GNAll序列为本领域所熟知。编码GNAll的核酸序列的实例提供为SEQ IDNO: I。多肽序列的实例显示在SEQ ID N0:2中。人GNAll基因变体位于染色体区19pl3. 3，并且编码与SEQ ID勵:2有至少97%、98%、或99%或更高ー致性的多肽。本申请上下文中使用的“GNA11-依赖性黑素瘤”指包含黑素瘤细胞的黑素细胞瘤，所述黑素瘤细胞与不具有突变的黑素细胞相比，具有活化GNAll的GNAll缺陷(也称为“突变”)，即具有“活化”突变，并且导致突变的G- a亚单位的GTP水解活性的丧失或减弱。GNAll缺陷能够包括导致蛋白的组成型活性的突变，例如取代突变。“GNA11-依赖性黑素瘤细胞”可以具有ー个或多个这种突变，例如，细胞可以具有涉及Q209的体细胞型取代突变。本发明的“GNAlI-依赖性黑素瘤”可以来源于例如痣(例如蓝痣)或眼部(例如葡萄膜)。“GNA11-依赖性黑素瘤”还可以具有除GNAll之外的基因突变。术语“粘膜黑素瘤”指发生在粘膜上的肿瘤；本文使用的“眼黑素瘤”指来源于眼部的黑素瘤。“眼黑素瘤”包括葡萄膜和结膜黑素瘤。“结膜黑素瘤”指发生在结膜上的黑素瘤，而“葡萄膜黑素瘤”指眼部的色素层的黑素瘤。本文所用的“ CSD黑素瘤”指来源于有慢性日晒诱发的损伤的皮肤的黑素瘤；以及本文所用的“NCSD黑素瘤”指来源于无慢性日晒诱发的损伤的皮肤的黑素瘤。本申请“CSD”和“NCSD”组间的区别基于对黑素瘤周围皮肤的明显的光晒弾性组织变性的存在与否的显微測定。在几乎所有病例中，与慢性日晒诱发的损伤(CSD)有关的黑素瘤发生在面部和四肢末端，诸如前臂、手背部、胫部和腓部。这些黑素瘤通常发生在50多岁的个体，在显微镜下具有表皮内组分，其中黑素细胞作为孤立单位而非成网状排列。此外，这些黑素瘤倾向于具有萎縮的表皮，并伴有表皮突的消失。CSD黑素瘤的子集是恶性小痣黑素瘤。相比之下，与慢性日晒诱发的损伤(NCSD)无关的黑素瘤发生在躯干和诸如大腿和上臂的四肢近端。NCSD黑素瘤通常显示表皮内组分，其中黑素细胞成巢状而不是作为孤立単位排列，并且表现出明显的向上散播(变形性骨炎样扩散)。许多NCSD黑素瘤是浅表扩散性黑素瘤。慢性日晒诱发的损伤定义为具有大于CSD 2的CSD分数。利用以下系统(Landiet al., Science 313:521 - 522，2006)，通过在100_200x放大倍数的黑素瘤周围正常皮月夫的苏木精-伊红染色切片上确定光晒弾性组织变性的程度来获得分数，其中的实例提供在Landi 中CSD 0:无弹性变性纤维；CSD 0+:仅在200x放大倍数下可见的稀有的弾性变性纤维；CSD I:分散的弹性变性纤维，以独立单位而不是成丛(bushel)散布在胶原蛋白束间或“+ “分类符用于指示弹性变性纤维是稀疏地还是密集地散布。CSD 2:密集散布的弹性变性纤维，主要为成丛分布而不是以独立单位分布；“-”分类符用于指示成丛存在，但弹性变性 纤维主要以独立単位分布；当较大的丛聚集体形成，但仍保留独立丛的轮廓而不是形成无定形的沉积吋，使用“+”分类符；CSD 3:蓝灰色物质的无定形沉积，失去纤维纹理仅形成无定形结构病灶；“ + ”弥散嗜碱性物质的非常大的团聚体。如本文所用的，术语“确定黑素瘤来源”的部位，例如葡萄膜、粘膜、结膜、肢体末端皮肤、具有慢性日晒诱发损伤的皮肤、或者没有慢性日晒损伤的皮肤，指鉴定黑素瘤起源的部位。这种确定可以通过目测患者或通过黑素瘤的病理评估来实施。术语动物中的“肿瘤”或“癌症”指具有诸如非典型生长或形态的特征的细胞的存在，所述非典型生长或形态包括不受控制的増殖、永生、转移潜力、迅速生长和增殖率以及某些特征性形态特征。通常，癌症细胞会是肿瘤的形式，但这种细胞可以在动物内独立存在。“肿瘤”包括良性和恶性瘤。术语“瘤的”指良性和恶性非典型生长。如本文所用的，术语“黑素细胞瘤”指相对于周围组织，色素沉着过度的区域。黑素细胞瘤包括痣和原发性黑素瘤以及已经转移到身体任何地方的黑素瘤。因此，本文所用的“黑素细胞瘤”包括良性瘤。类似地，术语“黑素细胞”指瘤性和正常黑素细胞。典型地，黑素细胞瘤发生在皮肤、粘膜和眼部。非限定性黑素细胞瘤包括黑素瘤，例如肢端小痣黑素瘤、CSD黑素瘤、NCSD黑素瘤、恶性小痣黑素瘤、粘膜黑素瘤、结节性黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、结缔组织增生性黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、结膜黑素瘤、复发性细胞型蓝痣、先天性痣引起的黑素瘤、恶性蓝痣和转移瘤。本文描述的黑素细胞瘤还包括痣。例如，黑素细胞瘤的非限定性实例还包括先天性痣、结节性先天性痣、具有结缔组织增生反应的先天性痣、异型性巨大先天性痣、结节性巨大先天性痣、没有确诊的先天性痣、蓝痣、非典型性蓝痣、非典型性细胞型蓝痣、伴有神经嵴性错构瘤的蓝痣、没有确诊的蓝痣和没有确诊的深部穿通性痣。如本文所用的，术语“蓝痣(blue nevus) ”或“蓝痣(blue nevi) ”指皮内，即皮肤真皮层内的黑素细胞增殖，其显示出増加的色素沉着，以致使痣通常为蓝色。蓝痣可以是先天的或是后天性的，其可以以从离散的蓝色痦子(蓝痣)到大蓝灰色斑块的不同方式存在，所述斑块影响结膜和眶周皮肤(太田痣)、肩部(伊藤痣)和下背部(蒙古斑)。在ー些实施方案中，“蓝痣”可以是“恶性蓝痣”，即发生在蓝痣内的黑素瘤，或者其中某些部分在组织病理学上类似蓝痣。本文所用的“生物样品”指获自疑似患有或患有黑素瘤的患者的样品。在ー些实施方案中，样品可以是活检组织，其指任何类型的活检，诸如穿刺活检、细针穿刺活检、手术活检等。样品通常包括组织样品，例如含有黑素细胞瘤的皮肤组织样品或眼部样品，尽管生物样品还可以源自另外的部位，例如黑素瘤可以转移到的部位，或者来自血液。在一些实例中，生物样品还可以来自于黑素细胞瘤邻近的区域。“提供生物样品”意味着获得生物样品用于本发明描述的方法中。最经常地，这通过从患者取出细胞样品而完成，但也可以通过利用以前分离的细胞(例如，其他人在其他时间，和/或出于其他目的分离的)，或者通过体内实施本发明的方法来实现。还可以利用具有治疗或结果历史记录的归档组织。如下所述，两核酸序列或多肽基本上一致的指示为由第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽引发的抗体发生免疫学交叉反应。因此，例如，如果两条多肽的差异仅在于保守性取代，则多肽通常与另ー多肽基本上一致。如下所述，两核酸序列基本上一致的另一指示为两分子或它们的互补物在严紧条件下彼此杂交。两核酸序列基本上一致的另一指示为可以利用相同的引物来扩增序列。术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上纯的”指基本上或实质上不含在其天然状态下所发现的通常伴随其的成分的物质。典型地，利用分析化学技术诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来确定纯度和均质性。存在于制备物中的主要种类的蛋白或核酸是基本上纯化的。特别地，将分离的核酸与ー些开放读码框分开，所述读码框在天然状态下位于该基因的侧翼并编码由该基因编码的蛋白外的蛋白。在一些实施方案中，术语“纯化的”表示核酸或蛋白在电泳凝胶中实质上产生一条帯。优选地，它意味着核酸或蛋白是至少85%纯的，更优选地，至少95%纯的，最优选地至少99%纯的。在其他实施方案中，“纯化(Purify) ”或“纯化(purification) ”指从待纯化的组合物中去除至少ー种污染物。在这一意义上，纯化不需要纯化的化合物是均质的，例如100%纯的。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換使用，指氨基酸残基的聚合体。这些术语适用于这样的氨基酸聚合体，其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人エ化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合体、含修饰的残基的那些氨基酸聚合体以及非天然存在的氨基酸聚合体。术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及功能与天然存在的氨基酸类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及随后修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(例如与氢结合的a碳、羧基、氨基以及R基)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物可以具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指这样的化学化合物，其具有与氨基酸一般化学结构不同的结构，但功能与天然存在的氨基酸相似。本文中氨基酸可以通过它们公知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样，核苷酸可以通过它们公认的单字母代码来提及。“保守性修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于具体的核酸序列，保守性修饰变体指编码一致的或实质上一致的氨基酸序列的那些核酸，或者如果核酸不编码氨基酸序列，指实质上一致的或相关的，例如天然邻近的，序列。因为遗传密码的简并性，大量功能一致的核酸编码大多数蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸被密码子指定的每一位置，密码子可以改变为描述的对应密码子的另ー个，而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，其是保守性修饰变异的ー种。本文编码多肽的每一核酸序列也描述了核酸的沉默变异。本领域技术人员会认识到，在某些环境下，可以修饰核酸中的每ー密码子(AUG除外，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子；以及TGG除外，其通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的经常的沉默变异暗含在相对于表达产物而不是相对于真实的探针序列的描述序列中。关于氨基酸序列，本领域技术人员会认识到，如果改变导致氨基酸被取代为化学上类似的氨基酸，则改变、添加或缺失编码的序列中的单个氨基酸或小比例氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白序列的个别取代、缺失或添加是“保守性修饰的变体”。提供功能上类似的氨基酸的保守性取代表为本领域所熟知。这种保守性修饰的变体补充而不排除本发明的多态、性变体、种间同源体和等位基因。典型的彼此保守性取代为1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G) ;2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E); 3)天冬酰胺(N),谷氨酰胺(Q) ; 4) A精氨酸(R)，赖氨酸(K) ; 5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V) ;6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W) ; 7)丝氨酸(S)，苏氨酸⑴；以及8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(參见，例如，Creighton, Proteins(1984))。本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”或语法等同词意味着共价连接在一起的至少两个核苷酸。寡核苷酸一般从约5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50或更多个核苷酸的长度，直至约100个核苷酸的长度。核酸和多核苷酸是任意长度的聚合体，包括更长的长度，例如 200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10，000 等。本发明的核酸一般包含磷酸ニ酯键，尽管在一些实例中，包括核酸类似物，其可以具有可选的骨架，包括例如氨基磷酸酷、硫代磷酸酷、ニ硫代磷酸酯或0-甲基亚磷酞胺连接(參见，EcKstem, Oligonucleotides ana Analogues:A Practical Approach, Oxford UniversityPress);以及肽核酸骨架和连接。其它类似核酸包括具有阳性骨架、非离子骨架和非核糖骨架的那些，包括在美国专利第5，235，033号和第5，034, 506号，以及ASC Symposium Series580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sangnui&Cook, eds.的弟 6和7章中描述的那些。包含一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的一个定义中。可以出于多种理由进行核糖-磷酸骨架的修饰，例如増加这种分子在生理环境中的稳定性和半衰期，或者作为生物芯片上的探针。可以制备天然存在的核酸和类似物的混合物；可选地，可以制备不同核酸类似物的混合物，以及天然存在的核酸和类似物的混合物。多种參考文献公开了这种核酸类似物，包括例如氨基磷酸酯(Beaucage etal., Tetrahedron 49 (10):1925(1993)以及其中的參考文献；Letsinger, J. Org.Chem. 35:3800(1970);Sprinzl et al. , Eur. J. Biochem. 81:579(1977);Letsinger etal. , Nucl. Acids Res. 14:3487 (1986);Sawai et al,Chem. Lett. 805(1984), Letsingeret al. , J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988);以及 Pauwels et al. , Chemica Scripta26:14191986))、硫代磷酸酷(Mag et al. , Nucleic Acids Res. 19:1437 (1991);和美国专利第 5，644，048 号)、ニ硫代磷酸酯(Briu et al.，J. Am. Chem. Soc. 111:2321 (1989)、0-甲基亚憐酞胺连接(參见 Eckstein, Oligonucleotides and Analogues:A PracticalApproach, Oxford University Press)以及妝核酸骨架和连接(參见 Egholm, J. Am. Chem.Soc. 114:1895(1992);Meier et al. , Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008(1992);Nielsen, Nature, 365:566 (1993) ; Carlsson et al. , Nature 380:207(1996),所有这些都通过引用并入)。其它类似物核酸包括具有阳性骨架(Denpcy et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA92:6097(1995)、非离子骨架(美国专利第 5，386，023 号、第 5，637，684 号、第 5，602，240号、第 5，216, 141 号和第 4, 469, 863 号;Kiedrowshi et al. , Angew. Chem. Intl. Ed. English30:423 (1991);Letsinger et al. , J. A m. Chem.Soc. 110:4470(1988);Letsinger etal. , Nucleoside&Nucleotide 13:1597 (1994);Chapters 2and 3, ASC Symposium Series580, “Carbohydrate Modifications in Antisense Research，，，EcL Y. S. Sanghui andP. Dan Cook;Mesmaeker et al. , Bioorganic&Medicinal Chem. Lett. 4:395(1994);Jeffset al. , J. Biomolecular NMR 34:17 (1994);Tetrahedron Lett. 37:743(1996))和非核糖 骨架的那些类似物，包括在美国专利第5，235，033号和第5，034, 506号以及ASC SymposiumSeries 580, “Carbohydrate Modifications in Antisense Research，，，Ed. Y. S. Sanghuiand P. Dan Cook.第6和7章中描述的那些类似物。包含一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的一个定义中(參见 Jenkins et al. , Chem. Soc. Rev. (1995) pp 169-176)。几种核酸类似物描述在Rawls, C&E News June 2，1997第35页中。所有这些參考文献都由此通过引用明确并入。其他类似物包括为肽核酸类似物的肽核酸(PNA)。与天然存在的核酸带高电荷的磷酸ニ酯键骨架相比，这些骨架在中性条件下基本上是非离子的。这产生了两个优势。首先，PNA骨架展示了改进的杂交动力学。对于错配的碱基对相对于完美匹配的碱基对，PNA的解链温度(Tm)具有较大的变化。对于内部错配，DNA和RNA —般展示出Tm下降2_4° C。有非离子PNA骨架的情况下，下降更接近7-9° C。类似地，由于它们的非离子性质，连接到这些骨架的碱基的杂交对于盐浓度相对不敏感。此外，PNA不被细胞酶降解，因此可以更为稳定。如说明的，核酸可以是单链的或双链的，或含有部分双链或单链序列。如本领域技术人员所认识到的，单链的描述也定义了互补链的序列，由此本文描述的序列还提供了序列的互补物。除外另外指明，特定核酸序列还暗含了其保守性修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补的序列，以及明确指出的序列。核酸可以是DNA (基因组的和cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸可以包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等的碱基的组合。“转录本” 一般指天然存在的RNA，例如，前-mRNA、hnRNA或mRNA。如本文所用的，术语“核苷”包括核苷酸和核苷以及核苷酸类似物，以及修饰的核苷诸如氨基修饰的核苷。此外，“核苷”包括非天然存在的类似物结构。因此，例如，每ー个都含碱基的肽核酸的个体单位在本文被称为核苷。“标记物”或“可检测的部分”是可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理方法进行检测的组分。例如，有用的标记物包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，通常用于ELISA中的)、生物素、地高辛、或半抗原和蛋白或其它可被检测的实体，例如通过将放射性标记物掺入肽或用于检测与肽特异性反应的抗体。标记物可以在任何位置掺入KIT核酸、蛋白和抗体。可以应用用于将抗体与标记物偶联的本领域已知的任何万法，例如利用 Hermanson, BioconiuRate Techniquesl996, Academic Press, Inc. , SanDiego中描述的方法。“标记的核酸探针或寡核苷酸”是这样的，将核酸探针或寡核苷酸以共价键方式通过连接子或化学键结合至标记物或以非共价键方式通过离子、范德华力、静电或氢键结合至标记物，以使探针的存在可通过检测结合至探针的标记物的存在来检测。可选地，利用高亲和カ相互作用的方法可以实现相同结果，其中一对结合伴侶中的一个结合到另ー个，例如生物素、链霉亲和素。如本文使用的，“核酸探针或寡核苷酸”被定义为能够通过一种或多种类型的化学 键、通常通过互补的碱基配对、通常通过氢键形成与互补序列的靶核酸结合的核酸。如本文所用的，探针可以包括天然的(即，A，G，C或T)或修饰的碱基(7-脱氮鸟苷、肌苷等)。此夕卜，探针中的碱基可以通过磷酸ニ酯键之外的连接相连，只要该连接在功能上不干扰杂交就行。因此，例如探针可以是肽核酸，其中组成型碱基通过肽键而不是磷酸ニ酯键相连。本领域技术人员会认识到，依赖杂交条件的严紧性，探针可以与并非与探针序列完全互补的靶序列結合。优选地，探针直接标记同位素、发色团、发光团、色原体，或者用诸如与链霉亲和素复合物可以随后与之结合的生物素非直接标记。通过测定是否存在探针，技术人员可以检测是否存在所选序列或亚序列。诊断或预后可以基于基因组水平，或者基于RNA或蛋白表达的水平。术语“重组的”当用于提及例如细胞或核酸、蛋白或载体时，指细胞、核酸、蛋白或载体已经通过引入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰过，或者指细胞来自如此修饰过的细胞。 因此，例如重组细胞表达不存在于天然(非重组)形式的细胞的基因，或者表达以其它方式异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。本文所用术语“重组核酸”是指通常不是自然界所发现的形式的核酸，其一般通过核酸的操纵，例如利用聚合酶和内切酶最初在体外形成。类似地，“重组蛋白”是利用重组技木，即通过上述的重组核酸的表达制备的蛋白。短语“选择性(或特异性)杂交”指当特定核苷酸序列在混合物(例如，总细胞DNA或RNA或文库DNA或RNA，扩增反应)中存在时，某分子与该序列在严紧杂交条件下的结合、成对或杂交，以使该分子与该特定核苷酸序列的结合决定核苷酸序列在所述混合物中的存在。短语“严紧杂交条件”指探针一般在核酸的复杂混合物中会与它的靶亚序列而不是其它序列杂交的条件。严紧条件是序列依赖的，并且在不同环境下不同。更长的序列在更高温度下特异杂交。核酸杂交的全面指导存在于Tssen, Techniques in Biochemistry andMolecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, uOverview of principlesof hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (生物化学和分子生物学技木-与核酸的杂交，“杂交远离综述和核酸測定策略”)(1993)中。一般地，对于在限定的离子强度和PH下的具体序列，选择的严紧条件应低于热解链点(Tm)约5-10° C。、是在平衡时与靶标互补的探针的50%与靶序列杂交的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)(当靶序列过量存在时，在！下，在平衡吋，50%的探针被占据)。严紧条件是如下的那些其中在PH 7. 0至8. 3下盐浓度低于约I. OM钠离子、一般约0. 01至I. OM钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(例如，10-50个核苷酸)为至少约30° C，以及对于长探针(例如，大于50个核苷酸)为至少约60° C。严紧条件还可以通过去稳定剂诸如甲酰胺的添加来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号为背景的至少两倍，优选为背景杂交的10倍。严紧杂交条件的实例可以如下50%甲酰胺，5x SSC,以及1%SDS，在42° C下孵育；或者5x SSC, 1%SDS,在65° C孵育，以及在65° C下在0. 2x SSC和0. 1%SDS中洗涤。对于PCR，尽管依赖于引物长度，退火温度可以在约32° C至48° C间变化，但对于低严紧扩增，温度一般为约36° C。对于高严紧PCR扩增，尽管依赖于引物长度和特异性，高严紧退火温度能够在约50° C至约65° C间变动，但温度一般为约62° C。高和低严紧扩增的典型循环条件包括90° C-95° C持续30sec-2min的变性阶段、持续30sec. _2min的退火阶段、以及约 72° C 持续 l-2min 的延伸阶段。例如，在 Innis et al. (1990)PCR Protocols, AGuide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N. Y.)中，提供了低和高严紧扩增反应的方案和指南。如果它们编码的多肽是基本上一致的，则在严紧条件下彼此不杂交的核酸仍是基本上一致的。这发生在，例如当利用遗密码容许的最大密码子简并性产生核酸拷贝吋。在这种情况下，核酸通常在适度严紧杂交条件下杂交。示例的“适度严紧杂交条件”包括于37° C在40%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS的缓冲液中杂交，以及于45° C在IX SSC中洗涤。阳性杂交至少为背景的两倍。本领域普通技术人员会容易地认识到，可以利用可选的杂交和洗涤条件以提供相似严紧性的条件。确定杂交參数的其它指南提供在大量參考文献中，例如，Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.中。
在分析背景下，用于测试抑制GNAll蛋白活性的化合物的短语“功能性作用”包括测定间接或直接受GNAlI蛋白或核酸影响的參数，例如功能的、物理的或化学作用，诸如降低肿瘤发生的能力或改变GTP水解酶活性的能力。GNAll的活性或功能性作用可以包括蛋白-蛋白相互作用活性，例如，GNAll与与其相互作用的抗体或其它蛋白结合的能力；GTP水解酶活性，GNAlI与GTP和/或GDP结合的能力；生长的接触抑制和密度限制；细胞增殖；细胞转化；色素沉着变化；生长因子或血清依赖性；肿瘤特异性标志物水平；向基质胶的侵袭性；肿瘤生长和体内转移,包括在模型系统中肿瘤生长的测量和肿瘤“摄取”;细胞中的mRNA和蛋白表达，包括经历转移的那些，以及癌细胞的其它特征。“功能性作用”包括体外、体内和离体活性。如本文所用的，GNAll “抑制剂”或“拮抗剂”(例如，“ GNAll拮抗剂”)指调节性分子或化合物，其例如与GNAll蛋白、磷脂酶CP或者由GNAll调节的下游分子如蛋白激酶C(PKC)结合时，部分或完全阻断这些分子的活性，減少、防止、延迟活化，灭活、脱敏或下调这些分子的活性或表达。抑制剂可以包括siRNA或反义RNA、GNAll蛋白的遗传修饰版本(例如活性改变的版本)，以及天然存在的和合成的GNAll拮抗剂、抗体、小化学分子等。用于本发明的GNAll抑制剂在本领域是已知的。例如，适用于本发明的抑制剂的非限定性实例可以包括PKC抑制剂，例如，相对非特异性PKC抑制剂星形孢菌素、星形孢菌素类似物CPG41251、苔藓虫素-I、KAI-9803.7-羟基星形孢菌素、L-苏-ニ氢鞘氨醇(沙芬戈(safingol))、AHT956 和 AEB071、非选择性 PKC 抑制剂(PKC412)、伊莫福新(ilmofosine)(BM 41 440)、包括PKCii在内的经典PKC亚型更为特异性抑制剂吲哚并咔唑GS6796、PKC-a 反义抑制剂 LY900003 以及 PKC-3 抑制剂 LY333531、LY317615 (Enzastaurin)。适于用耗竭PKC- a mRNA的反义分子的实例是5' -GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA-3'。磷脂酶C 3的非限定性示例抑制剂可以包括依地福新和流感病毒毒素(Huvirusin)B [2]。通过应用测试抑制剂化合物以及然后测定对活性的功能性作用，可以在体外或体内，例如在细胞或细胞膜中进行鉴定其它抑制剂的分析。在一些实施方案中，将用潜在抑制剂处理过的包含GNAll蛋白的样品和分析与没有抑制剂的对照样品比较，以检测对活性的影响。典型地，具有GNAll突变且没有用抑制剂处理的对照样品，例如黑素瘤细胞被指定100%的相对蛋白活性值。当相对于对照活性值变化至少20%，优选50%，更优选75-100%或更多时，实现了对GNAll的抑制。在一些实施方案中，抑制剂会激活特定活性，诸如GTP水解，然而净效应将是例如与具有活化的GNAll的对照相比，GNAllq活性降低。短语“细胞生长变化”指在体外或体内细胞生长和增殖特征的任何变化，诸如病灶的形成、锚定非依赖性、半固体或软琼脂生长、生长的接触抑制和密度限制变化、生长因子或血清需求的丧失、细胞形态学变化、获得或丧失永生性、获得或丧失肿瘤特异性标志物、当注射入合适的动物宿主时形成或抑制肿瘤的能力、和/或细胞的永生化。參见，例如，Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique pp. 231-241 (3rded. 1994)。
如本文所用的，“抗体”包括提及的与特定抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子，以及包括多克隆和单克隆抗体。该术语还包括基因工程形式，诸如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)以及异源偶联抗体(例如，双特异性抗体)。术语“抗体“还包括抗体的抗原结合形式，包括具有抗原结合能力的片段(例如，Fab'、F(ab' ) 2、Fab、Fv和rlgG。还參见,Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co.，Rockford, IL)。还參见,例如，Kuby, J. , Immunology, 3rd Ed. , ff. H. Freeman&Co. , New York(1998)。该术语还指重组的单链Fv片段(scFv)。术语抗体还包括双价或双特异性分子、双链抗体、三链抗体和四链抗体。双价和双特异性分子描述在例如Kostelny et al. . (1992) J TmmunoI 148:1547, Packand Pluckthun(1992)Biochemistry 31:1579, Hollinger et al. , 1993,同上，Gruberet al. (1994)J Immunol:5368, Zhu et al. (1997)Protein Sci 6:781, Hu et al. (1996)Cancer Res. 56:3055, Adams et al. (1993)Cancer Res. 53:4026，以及 McCartney, etal. (1995)Protein Eng. 8:301 中。通过重组方法，诸如噬菌体或相似载体中的重组抗体库的选择(參见，例如，Huseet al. , Science 246:1275-1281(1989) ;ffard et al. , Nature341:544-546 (1989);以及Vaughan et al. , Nature Biotech. 14:309-314(1996)),或者通过用抗原或用编码该抗原的DNA免疫动物，可以产生与特定抗原发生免疫反应的抗体。典型地，免疫球蛋白具有重链和轻链。每一重链和轻链都包含恒定区和可变区(这些区域也称为“结构域”)。轻链和重链可变区包含四个框架区，这四个框架区由三个也称为互补决定区(CDR)的高变区间隔开。提及的“ VH”或“ VH”指抗体免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv或Fab的重链。提及的或“VL”指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链。“嵌合抗体”是免疫球蛋白分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替代或交换从而使得抗原结合部位(可变区)与不同的或改变的类别、效应器功能和/或种类的恒定区连接，或者与赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子如酶、毒素、激素、生长因子、药物等连接；或者(b)可变区或其一部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替代或交换。“人源化抗体”是免疫球蛋白分子，其包含来源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和カ和容量的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR残基所取代。在一些情形下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人类残基所取代。人源化抗体还可以包含既不在受体抗体也不在输入的CDR或框架序列中存在的残基。一般来说，人源化抗体会包含至少ー个、通常两个可变结构域的几乎全部，其中CDR区的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的CDR区，以及框架(FR)区的全部或基本上全部是人免疫球蛋白共有序列的框架区。最适宜地，人源化抗体还会包含免疫球蛋白恒定区(Fe)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的恒定区(Fe)的至少一部分(Jones et al.，Nature321:522-525(1986) ; Riechmann et al. , Nature 332:323-329(1988);以及 Presta, Curr. Op. Struct.Biol. 2:593-596 (1992))。实质上，可以按照 Winter 和同事的方法(Jones et al. , Nature321:522-525 (1986);Riechmann et al. , Nature 332:323-327 (1988);Verhoeyen etal.，Science 239:1534-1536 (1988))，通过用啮齿类CDRs或CDR序列取代人抗体的对应序列进行人源化。因此，这种人源化抗体是嵌合抗体(美国专利第4，816，567号)，其中基本上不到ー个完整的人可变结构域已被来自非人物种的对应序列所取代。术语“纯人类抗体”指除人类框架和恒定区之外还包含人类高变区的免疫球蛋白。这种抗体可以利用本领域已知的多种技术来制备。例如体外方法包括利用噬菌体(例如，McCafferty et al. , 1990, Nature348:552-554;Hoogenboom&ffinter, J.Mol. Biol. 227:381 (1991);以及 Marks et al.，J. Mol. Biol. 222:581 (1991))、酵母细胞(Boder and ffittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553-557)、或核糖体(Hanes andPluckthun, 1997, Proc Natl Acad Sci U S A 94:4937-4942)展示的人抗体片段的重 组文库。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，例如导入其中内源性免疫球蛋白基因已经部分或全部被灭活的小鼠来制备人抗体。激发时，观测到人抗体产生，其在所有方面都很类似在人类中发现的抗体，包括基因重排、装配以及抗体库。这种方法描述于，例如美国专利第6, 150, 584号、第5，545, 807号、第5，545, 806号、第
5,569, 825号、第5，625, 126号、第5, 633, 425号、第5, 661, 016号以及以下的科学出版物中(例如，Jakobavits, Adv Drug Deliv Rev. 31:33-42 (1998), Marks et al. , Bio/Technology 10:779-783(1992);Lonberg et al. , Nature 368:856-859(1994);Morrison, Nature 368:812-13 (1994);Fishwild et al. , Nature Biotechnology 14:845-51(1996);Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996);Lonberg&Huszar, Intern.Rev.Immunol. 13:65-93(1995)。一般重组方法本发明部分依赖于重组遗传学领域的常规技术，例如用于检测GNAll的方法的技术或者用于制备GNAll多肽和核酸的技木。公开了用于本发明的一般方法的基础教科书包括 Sambrook&Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rdEd, 2001) ;Kriegler, Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual (1990);以及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.，1994-1999)。鉴定来自患者的样品中的GNAlI序列在本发明的ー个方面，在疑似包含诸如蓝痣和/或黑素瘤(例如葡萄膜黑素瘤和恶性蓝痣)的痣细胞的生物样品中确定GNAll多核苷酸(例如mRNA或基因组DNA)中活化突变的存在，确定GNAll蛋白活性的増加和/或GNAll蛋白中序列突变的存在。在一些实施方案中，确定GNAll核酸中的活化突变。如提到的，人GNAll序列是公知的。因此，突变的存在可以容易地确定。本申请中使用的“序列突变”指导致蛋白活性变化的多核苷酸序列的变化。突变可以是核苷酸取代如单核苷酸取代、插入或缺失。本发明的黑素细胞瘤的GNAll突变通常是导致GNAll活性组成性活化的活化突变。在本发明的上下文中被“突变的”GNAll基因包括过表达以使GNAll通路活性上调并导致痣或黑素瘤细胞异常生长的GNAll基因。根据本发明检测的活化突变一般是序列突变。突变可以位于GNAll基因的任何部位，其中该突变导致GNAll的活化。通常的序列突变位点存在于Q209。GNAll在Q209的突变包括图I中显示的那些。如本领域 所理解的，特定的突变通常通过由核酸序列突变引起的氨基酸序列的改变被提及。在本发明中，检测改变水平的GNAll活性和/或GNAll中的序列突变用于黑素细胞瘤的诊断(或用于预后指示)，例如用于诊断诸如葡萄膜黑素瘤的黑素瘤亚型和诸如蓝痣的痣亚型。因此，可以分析获自患或疑似患有黑素细胞瘤患者的生物样品中的GNAllmRNA或蛋白序列的突变。突变的存在可以方便地利用RNA、DNA或蛋白样品来分析。在一些实施方案中，本发明的方法还包括评估来自患者的生物样品是否存在GNAQ的活化突变，例如在来自生物样品的核酸中GNAQ的编码Gln209的密码子突变。在一些实施方案中，生物样品来自患有葡萄膜黑素瘤或恶性蓝痣的患者。在一些实施方案中，患者患有黑素细胞瘤，其中所述黑素细胞瘤是蓝痣。检测GNAQ的活化突变的方法是已知的(参见WO 2008/098208)。GNAll的序列突变的检测在一个实施方案中，GNAll序列突变的诊断性和预后检测通过确定生物样品中具有GNAll序列突变的细胞的存在来实施。评估特定基因序列的方法对本领域技术人员而言是熟知的，包括杂交和扩增分析等。可以利用与突变序列选择性杂交的探针来确定本发明中的GNAll序列突变。在一些实施方案中，利用DNA测序(诸如焦磷酸测序)或其它已知的测序技术可以方便地确定突变的GNAll等位基因的存在。其它检测方法包括单链构象多态性或限制性片段长度多态性检测方法以及变性梯度凝胶电泳分析。在一些实施方案中，通过样品DNA或RNA与探针的杂交来确定生物样品中的GNAl I序列突变，所述探针能与GNAll序列特异性杂交。用于这种应用中的探针能与GNAll序列的含有突变的区域特异性杂交。优选的探针足够长，例如从约10、15或20个核苷酸至约50个或更多个核苷酸，以便在严紧条件下与靶核酸特异性杂交。在一些实施方案中，探针可以用于与GNAll的编码GNAll的209位的区域杂交。在一些实施方案中，用于检测突变的探针可以与具有突变CAG>CTG、CAG>CCG、CAG>CTA或CAG>CTT的突变密码子209选择性杂交。大量基于杂交的分析的任一种都可以用于检测生物样品细胞中的GNAll序列突变。例如，斑点印迹、阵列分析等可以用于确定GNAll序列突变。在一些实施方案中，基于扩增的分析用于检测GNAll序列突变或用于测量GNAll转录本的水平。在这种分析中，在扩增反应(例如聚合酶链式反应或PCR)中特异性扩增靶GNAll核酸序列。基于扩增的分析的实例可以包括本领域技术人员熟知的RT-PCR方法(参见，例如Ausubel et al.，同上)。用于DNA和RNA的PCR的详细方法，包括定量扩增方法是已知的(参见，例如 Innis et al. (1990)PCR Protocols, A Guide to Methods andApplications, Academic Press, Inc. N. Y.;以及 Ausubel and Russell&Sambrook,两者都同上)。已知的GNAll核酸序列(参见，例如SEQ ID NO: I)足以使得本领域技术人员常规选择能够特异性扩增该基因的任一部分的引物，从而靶向GNA11。用于扩增特定序列的合适引物可以利用本领域公知的原则来设计(参见，例如Dieffenfach&Dveksler, PCR Primer:ALaboratory Manual (1995))。其它合适的扩增方法包括但不限于连接酶链式反应(LCR)(参见，Wu andWallace (1989)Genomics 4:560,Landegren et al. (1988)Science241:1077,以及Barringer et al. (1990) Gene 89:117)、转录扩增(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 86:1173)、自主序列复制(Guatelli et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA87:1874)、斑点PCR和连接子适配子PCR等。
还可以利用已知的技术诸如等位基因特异性寡核苷酸杂交来确定GNA11DNA或RNA突变的存在，所述等位基因特异性寡核苷酸杂交依赖于利用与突变或正常的核酸序列特异性杂交的寡核苷酸将突变体与正常核酸序列区分开。这种方法一般应用被设计成与正常或突变等位基因区别杂交的短寡核苷酸，例如15-20个核苷酸长度。设计这种探针的指南在本领域是可以得到的。通过测量与样品杂交的等位基因特异性寡核苷酸的量来确定定突变等位基因的存在。在其它实施方案中，正常或突变GNAll核酸的存在(或量)可以利用等位基因特异性扩增或引物延伸方法来检测。这些反应一般包括利用被设计为通过引物3,端的错配而特异性靶向正常或突变等位基因的引物。当聚合物缺乏错误校正活性时，错配的存在影响聚合酶延伸引物的能力。扩增的产物的量可以利用探针或通过直接测量存在于反应中的DNA的量来确定。还可以利用定量分析诸如5'-核酸酶活性(也称为“TaqMan ’’分析),例如在美国专利第5,210,015号、第5，487，972号和第5，804，375号以及Holland etal.，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280 中描述的那样，实施 GNAll 核酸水平(如正常和/或突变GNAl I多核苷酸水平)的检测或者GNAll突变的存在。在这种分析中，在扩增反应期间，添加在扩增区域内杂交的标记的检测探针。在一些实施方案中，杂交探针可以是能够区别正常或突变等位基因的等位基因特异性探针。可选地，该方法可以利用等位基因特异性引物和与扩增产物结合的标记探针来实施。在其它实施方案中，探针可以不区分突变等位基因和正常等位基因。如上所示，在一些实施方案中，检测GNA11RNA的水平。利用核酸杂交技术检测和/或定量GNAll基因转录本(mRNA或从其制备的cDNA)水平的方法是本领域技术人员熟知的。例如，还可以通过诸如RT-PCR的技术例如利用利用等位基因特异性引物或探针的实时RT-PCR、斑点印迹、原位杂交、RNase保护、探测DNA微芯片阵列等来分析GNAll表达水平。可以例如利用本领域已知的定量序列，诸如上文描述的那些来检测GNAll (突变的序列或正常核酸和/或多肽序列)的过表达。参考对照，例如正常组织或正常黑素细胞来确定过表达。GNAll多肽序列检测改变的GNAll表达和/或活性还可以通过检测GNAll蛋白或活性来检测。例如，GNAll蛋白活性的检测或具有突变的GNAll蛋白存在可以用于诊断目的或用于筛选分析。在一些实施方案中，利用免疫学分析方便地确定样品中GNAll的水平或者正常或突变GNAll多肽的存在。在其它实施方案中，GNAlI活性可以用于确定生物样品中GNAll活化突变的存在。下章节讨论了 GNAll的免疫学检测。该章节还涉及可以用于例如治疗应用的抗体的产生和工程化。GNAll的免疫学检测抗体可以用于检测GNAll或者可以在本发明的方法中被评价抑制GNAll的能力。GNAll的检测和/或定量可以利用多种公认免疫学结合分析的任何一种来完成。可适用的技术的一般总览可以在 Harlow&Lane, Antibodies:A Laboratory Manual (1988)和 Harlow&Lane, Using Antibodies (1999)中找到。其它资源包括还参见 Methods inCell Biology: Antibodies in Cell Biology,volume 37 (Asai, ed. 1993);Basic andClinical Immunology(Stites&Terr, eds. , 7th ed. 1991,以及 Current Protocols inImmunology (Coligan, et al. Eds, John C. Wiley, 1999-present)。免疫学结合分析可以使用多克隆或单克隆抗体。在一些实施方案中，可以应用特异性检测突变GNAll分子的抗体。常用的分析包括非竞争性分析(例如，三明治分析)和竞争性分析。在竞争性分析中，通过测量被存在于样品中的未知GNAll从抗GNAll抗体上置换下来的已知、添加的(外源性的)GNAll的量来间接测量样品中存在的GNAll的量。常用的分析模式包括免疫印迹，其用于检测和定量样品中蛋白的存在。其它分析模式包括脂质体免疫分析(LIA)，其利用被设计为结合特异性分子(例如，抗体)并释放封装的试剂或标志物的脂质体，所述试剂或标志物然后根据标准技术来检测(参见，Monroe et al. , Amer. Clin. Prod.Rev.5:34-41(1986))。GNAll的抗体可以商购。在一些实施方案中，可以利用特异性结合突变形式的抗体来检测GNAll突变，由此免疫分析还可以用于检测突变的GNAll蛋白。利用本领域已知的技术(参见，例如Coligan;Harlow&Lane,两者都同上)，GNAll或其片段，例如通常含有序列突变的肽部分可以用于产生与GNAll特异性反应的抗体。这种技术包括通过从噬菌体或类似载体的重组抗体库中选择抗体来制备抗体，以及通过免疫兔或小鼠制备多克隆和单克隆抗体(参见，例如Huse et al.，Science246:1275-1281(1989) ;ffard et al. , Nature 341:544-546(1989))。这种抗体可以用于诊断或预后应用，例如在检测黑素瘤方面或者用于显示了 GNAll的表达或活性增加的其它癌症。典型地，选择滴度为IO4或更高的多克隆抗血清并利用竞争性结合免疫分析测试所述抗血清抗非GNAll蛋白或来自其它生物体的其它相关蛋白的交叉反应。特异性多克隆抗血清和单克隆抗体通常结合的Kd为至少约O. ImM,更通常为至少约I μ Μ，任选地为至少约O. I μ M或更好，以及任选地O. 01 μ M或更好。 在一些实施方案中，GNAl I抗体可以用于治疗应用。例如，在一些实施方案中,这种抗体可以用于降低或消除GNAll的生物功能，如下所述。也就是说，将抗GNAll抗体(或者多克隆的，或者优选单克隆的)添加至黑素细胞瘤(或者含癌细胞的细胞群)可以降低或消除所述瘤。一般地，活性、生长、尺寸等降低至少25%是优选的，特别优选降低至少约50%，以及尤其优选降低约95-100%。通常,用于治疗应用的GNAll蛋白抗体是人源化抗体(例如，Xenerex Biosciences, Mederex, Inc. , Abgenix, Inc. , Protein Design Labs, Inc)。人抗体还可以利用包括曬菌体展不文库(Hoogenboom&ffinter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991) ;Marks et al. , J.Mol.Biol. 222:581 (1991))在内的本领域已知的多种技术来制备。还可以利用Cole等和Boerner等的技术来制备人单克隆抗体(Cole et al. , Monoclonal Antibodies和Cancer Therapy,p.77 (1985)和 Boerner et al.，J. Immunol. 147 (I):86-95 (1991))。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，例如导入其中内源性免疫球、蛋白基因已经部分或全部灭活的小鼠来制备人抗体。激发时，观测到人抗体产生，其在所有方面都很类似在人类中发现的抗体，包括基因重排、装配以及抗体库。这种方法描述于，例如美国专利第5，545, 807号、第5，545, 806号、第5，569, 825号、第5,625, 126号、第5，633，425号、第5，661，016号以及以下的科学出版物中Marks et al. , Bio/Technology 10:779-783 (1992);Lonberg et al. , Nature 368:856-859 (1994);Morrison, Nature368:812-13(1994);Fishwild et al. , Nature Biotechnology 14:845-51(1996);Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996);Lonberg&Huszar, Intern. Rev.Tmmunol. 13:65-93(1995)。活性检测 如本领域技术人员所理解的，可以检测GNAll活性以评估表达水平或用于鉴定活性抑制剂。所述活性可以利用多种体外和体内分析来评价，包括GTP和GDP结合活性、GTP-水解酶活性或磷脂酶Cβ活性测量。在一些实施方案中，GNAll活性可以利用另外的指标诸如与转化或色素沉着有关的那些指标来评估。在实施例和详述鉴定其它GNAll抑制剂的方法的章节中更详细地描述了这种分析。典型地，GNAll的活性通过测量结合与GNAlI相互作用的蛋白，例如，抗体、配体、或其它蛋白诸如信号分子的能力来确定。疾病诊断/预后GNAll核酸和多肽序列可以用于对患者的黑素细胞瘤(例如蓝痣、葡萄膜黑素瘤或恶性蓝痣)进行诊断或预后。例如，如上所述，可以确定来自患者的黑素细胞瘤样品中的GNAll的序列、水平或活性，其中改变例如GNAll的表达水平或活性或GNAll中的活化序列突变的增加指示黑素细胞瘤的存在或可能性。本发明的方法可以用于确定癌症患者治疗的最佳疗程。例如，GNAll活化突变，例如活化序列突变的存在可以指示某些疗法，诸如靶向GNA11、磷脂酶Ci3、或者GNAll调节的下游通路的那些疗法对那些患者是有益处的。此外，可以在具有GNAll突变的黑素细胞瘤细胞数目与一种或另一种抗黑素瘤药剂的相对功效之间很容易地建立相关性。例如，可以回顾性地进行这种分析，即通过分析之前从患者获取的样品中的活化突变，以及将具有突变的黑素细胞瘤细胞的数目与治疗的已知功效关联，所述患者已经随后经历了一种或多种类型的抗癌治疗，例如靶向G-蛋白或磷脂酶Ci3或者由GNAll调节的其它下游通路的治疗。通常，这种方法将与另外的诊断方法，例如检测其它黑素瘤指示物，例如细胞形态学等联用。在其它实施方案中，会分析例如来自肿瘤的已知含黑素瘤细胞的组织样品的GNAll活化突变以确定关于癌症的信息，例如某些治疗的功效，诸如靶向GNAll或由GNAll调节的下游通路疗法的功效。在一些实施方案中，分析黑素瘤细胞的GNAll活化突变的存在可以用于确定黑素瘤患者如葡萄膜黑素瘤或恶性蓝痣患者的预后，或用于确定疾病的进展。“诊断性存在”可以是GNAllmRNA或蛋白和/或活性水平的增加，和/或GNAllmRNA活化序列突变的存在。可以评估任何疑似含有黑素瘤细胞的生物样品来确定进展。例如，可以分析来自内脏器官诸如肝脏或肺脏、血液、淋巴结、骨等组织的GNAll序列突变的存在和/或GNAll活性水平的增加。GNAll的抑制剂或调节剂
在另一方面，本发明包括治疗过表达和/或具有GNAll突变的黑素瘤的方法，其中该方法包括给予抑制剂或GNAll拮抗剂。抑制剂和GNAll拮抗剂是已知的。例如，适用于本发明的非限定性抑制剂可以包括PKC和各种PKC亚型(包括PKC μ和PKCe)的特异性和非特异性的抑制剂。适用于本发明的非限定性抑制剂还包括星形孢菌素、星形孢菌素类似物CPG41251、苔藓虫素-I、ΚΑΙ-9803.7-羟基星形孢菌素、L-苏-二氢鞘氨醇(沙芬戈)、非选择性PKC抑制剂(PKC412)、伊莫福新(BM 41 440)、更特异性地抑制经典PKC亚型(包括PKC μ)的吲哚并咔唑(Β6796、PKC-α反义抑制剂LY900003以及PKC-β抑制剂LY33353ULY317615 (Enzastaurin)。磷脂酶CP的非限定性抑制剂可以包括依地福新和流感病毒毒素B [2]，其也适用于本发明。其它抑制剂包括诸如抗体、肽、核酸(例如SiRNA等)的抑制剂。如本文所用的，GNAll抑制剂可以是调节GNAll核酸表达和/或GNAll蛋白活性的分子，或者在一些实施方案中，是调节由GNAll调节的下游通路的分子。在一些实施方案中，GNAlI抑制剂是靶向GNAl I核酸序列的抑制性RNA分子。在一些实施方案中，靶向GNAl I核酸序列的抑制性RNA分子还可以靶向GNAQ核酸序列。鉴定靶向GNAll的合适siRNA的方法是本领域公知的。抑制GNAll的能力可以利用合适的分析来评估，例如通过分析GNAll活性如GTP结合或GTP水解酶活性，以及将活性量与没有用抑制剂处理的对照相比较。在另一实施方案中，可以测量mRNA和/或蛋白表达水平以评价测试化合物对GNAll表达水平的影响。将表达GNAll的宿主细胞与测试化合物接触足够的时间以产生任何相互作用，然后测量mRNA或蛋白的水平。产生这种相互作用的时间量可以通过经验来确定，诸如通过运行一个时程，并将表达水平测量为时间的函数。可以通过利用本领域技术人员已知的任何合适的方法来测量表达量。然后将表达量与在没有测试化合物情况下的表达量相比。基本上一致的细胞可以衍生自制备重组细胞的相同细胞，但这些细胞没有通过导入异源DNA被修饰。表达量的差异表明测试化合物已经以某种方式改变了 GNAll水平。在一些鉴定GNAll抑制剂的分析中，将用潜在抑制剂处理的样品与对照样品比较以确定调节的程度。没有突变并且没用候选抑制剂处理的对照样品被指定为100的相对活性值。当活性值是对照的约80%、任选50%、或任选25-0%时实现了 GNAll的抑制。GNAll抑制剂可以是任一小化学化合物，或者生物实体，例如诸如蛋白、糖、核酸或脂质的大分子。在一些实施方案中，GNAlI抑制剂是分子量低于1，500道尔顿的小分子，在一些情形下，分子量低于1，000、800、600、500或400道尔顿。尺寸相对较小的试剂可能是理想的，因为与具有较高分子量的试剂相比，较小的分子更有可能具有与良好药物动力学特征相容的物理化学特性，包括口服吸收。例如，基于渗透性和溶解性，较不可能成为药物的试剂被Lipinski等描述如下具有大于5个氢键供体(表示为OH和NH的总数)；具有超过500的分子量；具有超过5的LogP (或MLogP超过4. 15);和/或具有大于10个氢键受体(表示为 N 和 O 的总数)。参见，例如，Lipinski et al. Adv Drug Delivery Res 23:3-25(1997)。为生物转运体底物的化合物类别通常是这一规则的例外。表达抑制
如上提及的，核酸抑制剂也可以用于降低GNAll的表达。因此，在转录或翻译水平特异性干扰GNAll表达的核苷酸序列可以用于治疗黑素瘤或痣。在一些实施方案中，这种核酸抑制剂还可以靶向与GNAQ核酸序列充分一致的GNAll核苷酸序列从而干扰GNAQ的表达。可以利用抑制性核酸方法，例如siRNA和/或反义寡核苷酸，通过用siRNA诱导mRNA的降解，或者通过用反义核酸掩饰mRNA,来阻断GNAllmRNA的转录或翻译。“siRNA”或“RNAi”指形成双链RNA的核酸，当siRNA与基因或靶基因在相同细胞中表达时，该双链RNA具有降低或抑制基因或靶基因表达的能力。因此，“siRNA”指通过互补链形成的双链RNA。杂交形成双链分子的siRNA的互补部分通常具有基本或完全的一致性。在一个实施方案中，siRNA指与靶基因具有基本或完全的一致性并形成双链siRNA的核酸。siRNA的序列可以对应于全长靶基因或其亚序列。典型地，siRNA为至少约15-50个核苷酸长度(例如，双链siRNA的每一互补序列为15-50个核苷酸长度，以及双链siRNA为约15-50个碱基对长度，优选约20-30个碱基核苷酸，优选为约20-25个核苷酸长度，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 个核苷酸长度。“沉默”或“下调”指与在没有干扰RNA或其它核酸序列存在情况下检测到的正常水平相比，靶序列，即siRNA靶向的序列的转录和/或翻译有可检测的下降，或者靶序列或蛋白的量或活性下降。可检测的下降可以低至5%或10%，或高至80%、90%或100%。更典型地，可检测的下降为20%、30%、40%、50%、60%或70%。转录dsRNA或siRNA (例如，作为发夹双螺旋)的DNA分子也提供RNAi。例如，与GNAll核酸序列诸如SEQ ID NO: I特异性杂交的dsRNA寡核苷酸可以用于本发明的方法中。与GNAll核酸序列特异性杂交的反义寡核苷酸也可以用于沉默GNAll的转录和/或翻译，并由此治疗黑素瘤，例如葡萄膜黑素瘤，或者痣诸如蓝痣。设计反义核酸(DNA或RNA分子)的方法是本领域熟知的。反义核酸可以包含天然存在的核苷酸或修饰的核苷酸诸如，例如硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、和-异头糖磷酸骨架修饰的核苷酸。可以利用已知的方法来评估抑制剂调节GNAll表达的能力。这类方法一般包括进行基于细胞的分析，其中将测试化合物与表达GNAll的一个或多个细胞接触，然后检测表达(转录或翻译产物)的下降。黑素瘤治疗和药物组合物的给药可以给予患者GNAll的抑制剂用于治疗具有GNAll序列突变的黑素细胞瘤。如下详述的，以任一合适的方式给予抑制剂，任选与药学上可接受的载体一起。在一些实施方案中，给予PKC或磷脂酶Ci3的抑制剂。用于抑制剂给药的方案是已知的，并且能够基于药理学领域已知的原则进一步优化用于黑素瘤患者(参见，例如，ReminRtoniTheScience and Practice of Pharmacy, 21st Edition,Philadelphia, PA. LippincottWilliams&Wilkins, 2005)。抑制剂可以以治疗有效剂量给予患者以预防、治疗或控制黑素细胞瘤。以足以引发患者有效保护或治疗反应的量给予患者化合物。有效的治疗反应是至少部分阻止或减缓疾病的症状或并发症的反应。足以实现该反应的量被定义为“治疗有效剂量”。通过应用的特定GNAll抑制剂的功效和个体的状况以及体重或待治疗区域的表面积来确定剂量。还会 通过特定个体中伴随特定化合物给药的任何副作用的存在、性质和程度来确定剂量规格。这种化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物方案来确定，例如通过确定LD5tl (50%群体致死的剂量)和ED5tl (在50%群体中治疗有效的剂量)来确定。毒性和治疗效应间的剂量比值是治疗指数，并且可以表示为比值LD5(i/ED5(i。显示高治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用显示毒性副作用的化合物，但是应该给予关注来设计将这种化合物靶向患病组织部位的递送系统以使对正常细胞的潜在损伤最小化，并由此减少副作用。
获自细胞培养分析和动物研究的数据可以用于制定用于人类的剂量范围。这种化合物的剂量优选位于几乎没有或没有毒性的循环浓度(包括ED5tl)范围内。取决于应用的剂量形式和给药途径，剂量可以这一范围内变动。对于用于本发明方法的任一化合物，治疗有效剂量可以最初从细胞培养分析中估算。可以在动物模型中制定剂量以实现包括在细胞培养中确定的IC5tl(测试化合物实现症状半数最大抑制的浓度)的循环血浆浓度范围。这种信息可以用于更为精确地确定人类的有用剂量。可以测量血浆中的水平，例如通过高效液相色谱法(HPLC)。一般来说,对于典型个体,调节剂的剂量当量为约lng/kg至10mg/kg。可以利用本领域已知的任何方式，包括通过siRNA的注射、吸入或口服将siRNA递送至个体。另一合适的siRNA递送系统是胶体分散体系，诸如例如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠、以及基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。本发明优选的胶体体系是脂质体。脂质体是用作体外和体内的递送载体的人工膜泡。包括RNA和DNA的核酸位于脂质体内，并被以生物活性形式递送至细胞(Fraley, et al.，Trends Biochem.Sci. ,6:77, 1981)。利用本领域已知的任何方式，可以将脂质体靶向特异的细胞类型或组织。GNAll特异的反义多核苷酸的递送可以利用本领域已知的任何方式来实现，包括例如多核苷酸的直接注射、吸入或摄取。此外，可以利用重组表达载体(例如，基于腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒或逆转录病毒的病毒载体)或胶体分散体系(例如脂质体)来递送反义核苷酸。靶向GNAll的治疗可以与其它黑素瘤疗法一起施予，即与用另一黑素瘤治疗剂的治疗同时、或在其之前或之后施予。利用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂，通过标准技术可以配制用于本发明的药物组合物。可以配制化合物和它们生理学上可接受的盐和溶剂用于通过任何合适的途径给药，包括通过吸入、经局部、经鼻、经口、经胃肠外(例如，经静脉、经腹腔、经膀胱或经鞘内)或者经直肠给药。对于口服给药，药物组合物可以采用例如片剂或胶囊的形式，该片剂或胶囊通过常规方式与以下一起制备药学上可接受的赋形剂包括粘合剂，例如预糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、或羟丙甲基纤维素；填充剂，例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙；润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石或硅土 ；崩解剂，例如马铃薯淀粉或羧基乙酸淀粉钠；或湿润剂例如月桂醇硫酸钠。片剂可以通过本领域公知的方法包被。用于口服给药的液体制剂可以采用例如溶液、糖浆剂或悬浮液的形式，或者它们可以呈现为干燥产品，在使用前用水或其它合适的介质构造。这种液体制剂可以通过常规的方法与以下药学上可接受的添加剂一起制备例如悬浮剂如山梨糖醇、纤维素衍生物或氢化食用脂；乳化剂，例如卵磷脂或阿拉伯胶；非水性介质，例如杏仁油、油酯、乙醇或分馏的植物油；以及防腐剂，例如甲基或丙基-对羟苯甲酸或山梨酸。制剂还可以适当地包含缓冲盐、调味剂、着色剂和/或甜味剂。如果需要，可以适当配制用于口服给药的制剂，以产生控释的活性化合物。对于吸入给药，化合物可以方便地以如下形式被递送使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体，从加压包或喷雾器提供气溶胶喷雾。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀以递送计量的量来确定。例如，用于吸入器或吹药器的明胶胶囊和明胶药筒可以配制为包含化合物和合适的粉基如乳糖或淀粉的粉末混合物。
化合物可以配制为用于通过注射，例如通过弹丸注射或连续输注的胃肠外给药。用于注射的制剂可以与添加的防腐剂呈现为单位剂量形式，例如在安瓶或在多剂量容器中。组合物可以采用诸如在油性或水性介质中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，并且可以包含配方剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，活性成分可以为粉末形式，用于在使用前用合适的介质如灭菌无热源水构造。化合物还可以配制在直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂(例如含有常规栓剂基质如可可油或其它甘油酯)中。此外，化合物可以配制为储存性制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如，皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射给药。因此，例如化合物可以与合适的聚合物质或疏水物质(例如，作为可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂一起配制，或者作为微溶衍生物，例如作为微溶盐。如果需要的话，组合物可以提供在可以含一种或多种单位剂量形式的包装或分配装置中，所述单位剂量形式含活性成分。例如，包装可以包括金属或塑料箔，例如罩板包装。包装或分配装置可以附有给药说明书。用于诊断和/或预后应用的试剂盒本发明还提供用于诊断或治疗应用的试剂盒。对于诊断/预后应用，这种试剂盒可以包括下述的任一种或全部分析试剂、缓冲液、GNAll探针、引物、抗体等。在一些实施方案中，包含GNAll诊断试剂的试剂盒还可以包含GNAQ诊断试剂。例如，这种试剂盒可以包含特异性扩增GNAll的引物组和特异性扩增GNAQ的引物组。此外，试剂盒可以包含检测突变(诸如在GNAll和/或GNAQ的编码209位的密码子处的突变)的探针。在一些实施方案中，试剂盒可以包含GNAll特异性探针和GNAQ特异性探针，以及区分突变和野生型等位基因的探针。任选地，试剂盒还可以包含GNAll和GNAQ的扩增引物。此外，试剂盒可以包括指导性材料，所述指导性材料包含用于实践本发明方法的用法说明书(即实验方案)。尽管指导性材料一般包含书面的或打印的材料，但并不限于此。任何能够储存这种指导并将其传播至终端用户的媒介都在本发明的范围内。这种媒介包括但不限于电子储存媒介(例如，磁盘、磁带、磁盒、芯片)、光学媒介(例如CD ROM)等。这种媒介可以包括能提供这种指导性材料的因特网站的网址。
实施例对黑素瘤和痣样品是否存在GNAll序列突变的检测为了确定GNAll在人黑素细胞瘤中是否起作用，对葡萄膜黑素瘤和蓝痣中的GNAll编码区进行了测序。还对来自所选活检的周围正常组织中的GNAll编码区进行了测序。
方法学组织从旧金山加利福尼亚大学的眼科系以及皮肤病学和病理学系的皮肤病理科、加拿大的不列颠哥伦比亚大学的病理系、纪念斯隆一凯特琳癌症中心(Memorial SloanKettering Cancer Center)的病理系、以及奥地利的格拉茨大学的档案室得到归档的、石蜡包埋的活检组织。对于每一样品，从5-20 μ m厚的切片中提取DNA，从这些切片中，荷瘤组织已经被人工微切割。测序利用PCR扩增样品DNA。反应条件为0. 25mM的每种dNTPs、0. 4X BSA (NewEngland Biolabs)、IU Hotstar Taq(Qiagen)、IX Hotstar Taq 缓冲液(Qiagen)以及 O. 5μΜ 的用于检测 GNAll Q209 的每种引物5’ _cgctgtgtcctttcaggatg_3’ 和5’ -ccacctcgttgtccgact-3’。PCR组成为94° C 15分钟的预变性后，35次循环的95° C(30秒)、58° C(1分钟)和72° C(I分钟)。PCR反应物利用柱纯化，然后用作利用Big Dye(ABI)进行测序反应的模板。在两个方向进行测序。在两个测序方向鉴定有突变的样品重复至少两次。对于具有突变的样品，对来自邻近的正常组织的DNA进行测序，以确定突变是否是体细胞获得的。质粒从UMR cDNA资源中心获得具有含Q209L变体的完整GNAll编码区的质粒。通过密码子209的位点特异性诱变产生野生型对应物。两种构建体的编码区用N-末端Myc-标签进行了表位标记，并被克隆入Wzl逆转录病毒表达载体。用于蛋白质免疫印迹的GNAQ和GNAll构建体获自Missouri S&T cDNA资源中心。它们内部是Glu-Glu标记的，在第171-176位具有从AYLPTQ (Ga q)或GYLPTQ(Ga 11)至EYMPTE6的残基改变，将它们克隆入Wzl逆转录病毒载体。所有构建体都测序确认。转导病毒上清液是利用合适的包装细胞系产生的，并用10 μ g质粒和脂质体2000进行转染。转染16小时后更换培养基，40-56小时后收获病毒。转导Melan-a细胞，并用杀稻瘟菌素进行阳性选择。蛋白免疫印迹分析细胞用冰冷PBS洗涤两次，并在添加有蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和EDTA(Pierce Biotechnologies)的 50mM Tris-HCl ρΗ7· 8、1%NP_40、10% 甘油、150mMNaCl、l%脱氧胆酸钠、1%十二烷基硫酸钠中裂解。裂解液的蛋白含量通过BCA蛋白分析试剂(Pierce Biotechnologies)来确定。15 μ g的蛋白通过SDS-PAGE分离，并转移到Immobilon-P 膜(Millipore)。一抗是 pERK (E-4, Santa Cruz Biotechnology)和 β _ 肌动蛋白(Sigma)。二抗用辣根过氧化物酶标记。细胞培养将Melan-a细胞培养在添加了 10%FCS和200nM TPA的含谷氨酰胺的RPMI培养基中。致肿瘤性评价Melan-a细胞用GNAll表达构建体或β-半乳糖苷酶对照载体转导，并在两周内用、5μ g/ml杀稻瘟菌素进行选择。然后培养这些细胞、将其用胰酶消化、在PBS中洗涤，然后以每毫升一千万个细胞重悬在DMEM中。在四月龄的雌性NOD/SCID/白介素2受体[IL2r] Y$小鼠两侧腹中皮下注射一百万个细胞。对于肿瘤发展，每周触诊小鼠一次，并且利用测径器确定肿瘤大小。我们获得来自713个病例(表I)的GNAl I和GNAQ的外显子5的测序数据。突变被鉴定为在GNAll外显子5中，均在 209位谷氨酰胺，这在大多数病例(97. 3%)中导致亮氨酸取代(GNA1 f)，以及2. 7%的病例具有导致脯氨酸取代(GNAIIq2ci9p)的突变。影响GNAl I密码子 209 的突变是 CAG>CTG(94. 5%)、CAG>CCG(2. 7%)、CAG>CTA(1. 4%)以及 CAG>CTT(1. 4%)。在所有病例中，具有GNAll突变的那些样品没有GNAQ突变。GNAll的突变频率从蓝痣(7%)到原发性葡萄膜黑素瘤(32%)到葡萄膜黑素瘤转移瘤(57%)呈渐进性增加，这与最常见于蓝痣、最少见于转移瘤(p=〈0.001)的GNAQ突变分布的模式相反。GNAll突变局限于瘤组织，没有在从周围非病损组织提取的DNA中发现，这表明突变是体细胞性的。因为节段性黑素细胞增多症、伊藤痣和太田痣的细胞是稀疏的，所以在一些样品中未找到突变是可能的。对于在其中可能确定原发性肿瘤位置的118例葡萄膜黑素瘤，出现在睫状体脉络膜区的病损具有更高频率的GNAll突变(表2)。与仅由梭形细胞组成的样品相比，发现在具有上皮样细胞或上皮样细胞和梭形细胞混合物的原发性肿瘤中GNAQ和GNAll突变更常见，但这在统计学上并不是显著的。利用比较基因组杂交术(CGH)，我们尝试确定预后相关的染色体畸变(例如，White et al. , Cancer 83:354-359, 1998)是否存在于36例原发性葡萄膜黑素瘤中，并且观察到它们的存在与GNAQ和GNAll突变状态间没有关联。然而，这一分析非常有限，因为35个样品中没有一个缺乏用于比较的突变。对于我们已经得到了必需数据的81个病例的总生存期和无病生存期的检测没有揭示在具有携带GNAQ突变的肿瘤的病例与具有携带GNAll突变的肿瘤的病例之间有显著性差异。然而，观察到与携带GNAQ突变的那些肿瘤、或没有GNAQ或GNAll突变的那些肿瘤相比，在携带GNAll突变的那些肿瘤中有更长生存期的倾向。GNAll的功能验证为了验证GNAlf在体内为致癌基因，将永生化的小鼠黑素细胞(melan-a细胞)转导了 GNAlf，并与转导了 β_半乳糖苷酶的类似黑素细胞(作为阴性对照)相比，监测它们在免疫低下小鼠中形成肿瘤的能力。注射GNAlf黑素细胞的6个部位的每个都发生了快速生长的肿瘤。在对照黑素细胞的注射部位没有观察到肿瘤(η=6)。与用GNAQq2ci9L转导的黑素细胞(Van Raamsdonk et al. , Nature 457:599-602, 2009)实施的类似的致肿瘤性试验相比，注射了 GNAlf转导的melan-a细胞的所有三只小鼠都发生转移瘤，三只在肺脏，一只在肝脏。GNAlf转导的黑素细胞的蛋白质免疫印迹分析显示了 MAP-激酶活化，如通过增加的磷酸化ERK水平所测量的。在以前的研究(例如，Van Raamsdonk et al. , Nature457:599-602, 2009)中，GNAQq2ci9l突变细胞系对于MEK抑制剂是高度敏感的。在我们实验室可以得到的13种葡萄膜黑素瘤细胞系中，没有一种携带GNAll突变，因此我们未能检测GNAl 1Θ2°9 突变细胞对MEK抑制剂是否同样敏感。然而，Ga ^和Ga ^间的密切功能联系以及我们本文描述的数据表明，葡萄膜黑素瘤细胞中的MAP-激酶活化是通过GNAIIq2ci9突变产生的，并且可以用MEK抑制剂来对抗。这13种细胞系中的5种携带GNAQ_突变，提示GNAll突变比GNAQq2ci9突变在更大程度上危害培养中的生长。讨论这些数据鉴定了 GNAll为在葡萄膜黑素瘤中经常突变的致癌基因。在我们的样品组中，约83%的葡萄膜黑素瘤具有GNAQ或GNAll突变，这提示G a q/11通路的活化是葡萄膜黑素瘤发生的主要途径。GNAQ和GNAll在黑素细胞中共享重叠功能(Van Raamsdonk, etal.，Nat Genet36:961-8, 2004)，并且两者组成性活化时，都激活MAP激酶通路。尽管Gaq和Ga 11具有90%同源的氨基酸序列，但看起来它们 在黑素细胞瘤形成中的作用是不同的。GNAll突变可能比GNAQ突变对黑素细胞有更大的影响。在本实施例描述的研究中，GNAl I突变在为良性瘤的蓝痣中少见。在葡萄膜黑素瘤转移瘤中，存在比GNAQq2ci9突变显著增多的GNAl 1Q2°9突变。而且，GNAl I突变在局部晚期原发性肿瘤和源自睫状体脉络膜区的非原发性肿瘤(imprimaries,其为预后不良特征)中更常见(Abramson et al. , In Kufe etal.，eds，Cancer Medicine, Neoplasms of the Eye,Adult Ophtalmic Oncology:OcurlarDiseases:BC Decker, 2003)。最后，小鼠GnallDsk7突变在营救由Kit、Pax3和内皮素B中的杂合突变损害的黑素细胞增殖/生存方面比Gnaqllskl更有效(Van Raamsdonk et al.，NatGenet 2004; 36:961-968，2004)。然而，因为小鼠中发现的突变发生在GNAlI和GNAQ的不同残基(分别为I63V和V179M)，可能该差异是突变本身的功能性结果，而不是GNAlI和GNAQ之间的功能差异。尽管在本实施例所描述的研究中，GNAQ和GNAll-突变病例间的患者生存期没有显著差异，但可能在分析时获得的患者数目过小以致不能检测出这种差异。此外，本文的分析使用摘除术样本，这可能会引入偏差；用于突变分析的组织不是从没有经历摘除术手术的样品常规获得的。我们在本实施例中分析的样品还一般来自较大的肿瘤，这可能在本实施例分析中掩盖了 GNAQ或GNAll突变与预后之间的关联。在最近关于922例各种组织病理学的人肿瘤的GNAQ和GNAll研究中，发现的唯一突变位于蓝痣中的GNAQ (Lamba et al.，PLoS One 4: e6833，2009)。然而没有包括葡萄膜黑素瘤。尽管不是详尽的，本研究中的这些结果和数据表明GNAQ和GNAll突变富集在黑素细胞谱系中。另一项研究显示，GNAQ突变存在于37%的中枢神经系统黑素细胞瘤中(Kusters-Vandevelde, et al. Acta Neuropathol 2009)。GNAll 突变也被预期在这一类的黑素细胞肿瘤中存在。不受理论约束，在皮肤、葡萄膜和CNS的黑素细胞瘤中突变的独特关联可以表明不同来源的细胞。发展的路径已被描述(Adameyko, et al. , Cell 139:366-79，2009),其中黑素细胞子集来源自与Schwann细胞共享的前体。可能G a q/11信号转导在通过该发展机制出现的黑素细胞中具有重要作用。如果这样的话，突变出现的时机能够确定瘤的位置和程度。局限于CNS的病损由迁移开始前的前体细胞中的Ga q/11突变引起，诸如太田痣的节段性病损会由迁移早期的前体细胞中的突变引起，而沿着迁移路径后来出现的突变会导致涉及皮肤或脉络膜的孤立病损。总之，本实施例中呈现的结果表明，大多数的葡萄膜黑素瘤和蓝痣含有GNAQ或GNAl突变。由此G a ,和G a n间的功能类似性形成了开发基于机制治疗具有这些特异性突变的黑素瘤疗法的基础。这种干预会使多达83%的转移性葡萄膜黑素瘤病例受益，所述转移性葡萄膜黑素瘤是特别具破坏性的黑素瘤形式，对于它目前没有有效的治疗。本说明书中引用的所有出版物、专利、登录号和专利申请都通过引用并入，如同每一单独的出版物或专利申请被特别地和单独地指出通过引用并入一样尽管出于清楚理解的目的，通过示例和实施例相当详细地描述了上述发明，但对本领域普通技术人员显而易见的是，结合本发明的教导，可以对其作出一些变化和修饰，而不背离所附权利要求书的精神或范围。表I.黑素细胞瘤中GNAQ和GNAll的外显子5中的Q209的突变频率。CSD，位于慢性日晒损伤皮肤上的黑素瘤；NonCSD，没有慢性日晒诱发损伤的显微迹象的皮肤上的黑素瘤。
权利要求
1.检测来自患者的生物样品中的黑素细胞瘤细胞的方法，其中所述样品包含黑素细胞，所述方法包括 检测所述生物样品中是否存在GNAll基因的活化突变，由此如果存在所述活化突变，检测所述生物样品中存在黑素细胞瘤细胞。
2.如权利要求I所述的方法，其中所述黑素细胞瘤细胞是葡萄膜黑素瘤细胞。
3.如权利要求I所述的方法，其中所述黑素细胞瘤细胞是蓝痣细胞。
4.如权利要求I至3中任一项所述的方法，其中序列突变位于GNAll的编码Gln209的密码子处。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述突变是Q209L或Q209P取代。
6.如权利要求I至4中任一项所述的方法，其中所述检测步骤包括检测来自所述生物样品的核酸样品中是否存在所述突变。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述检测步骤包括扩增反应。
8.如权利要求6或权利要求7所述的方法，其包括确定所述GNAll基因的突变区的序列。
9.如权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述检测步骤包括使所述核酸样品与探针接触，以及检测杂交的探针的存在，由此检测所述序列突变，所述探针能与所述GNAll基因选择性杂交。
10.如权利要求I至4中任一项所述的方法，其中所述检测步骤包括检测由所述基因编码的蛋白的突变。
11.如权利要求I至10中任一项所述的方法，其中所述生物样品是眼部样品或皮肤样品。
12.如利要求I至10中任一项所述的方法，其中所述生物样品来自淋巴结、肺脏、肝脏、肾上腺、软组织或骨。
13.如利要求I至12中任一项所述的方法，其中所述生物样品来自己经被诊断为黑素瘤的患者。
14.如利要求13述的方法，其中所述黑素瘤起源干葡萄膜。
15.如利要求13述的方法，其中所述黑素瘤起源于蓝痣。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括检测GNAQ基因中是否存在活化突变。
17.监测经历治疗的患者中黒素瘤进展的方法，所述方法包括检测来自所述患者的生物样品中具有GNAll基因活化突变的黑素瘤细胞的数目变化，其中具有GNAll突变的细胞的数目变化指示患者对所述治疗的反应。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述生物样品来自眼部或皮肤。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述生物样品来自血液、淋巴结、肝脏、肺脏、肾上腺或骨。
20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述黑素瘤是葡萄膜黑素瘤。
21.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述黑素瘤是恶性蓝痣。
22.抑制具有GNAlI活化突变的黑素瘤细胞増殖的方法，所述方法包括使GNAl I拮抗剂与具有GNAll活化突变的黑素瘤细胞接触。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述GNAll拮抗剂是小分子。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述GNAll拮抗剂是蛋白激酶C抑制剂。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述GNAll拮抗剂是磷脂酶C^的抑制剂。
26.如权利要求22所述的方法，其中所述GNAll拮抗剂是抗体。
27.如权利要求22所述的方法，其中所述GNAll拮抗剂是siRNA。
28.如权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述黑素瘤细胞来自葡萄膜黑素瘤。
29.如权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述黑素瘤细胞起源于蓝痣。
30.如权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述活化突变位于GNAll的编码Gln 209的密码子处。
31.鉴定黑素瘤患者是否是GNAll抑制剂治疗的候选者的方法，所述方法包括检测来自存在于所述患者的黑素瘤的生物样品中是否存在GNAll基因的活化突变， 其中所述突变的存在指示黑素瘤患者是GNAll抑制剂治疗的候选者。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述突变位于GNAll的编码Gln209的密码子处。
33.如权利要求31或32所述的方法，其中所述黑素瘤是葡萄膜黑素瘤。
34.如权利要求31或32所述的方法，其中所述黑素瘤是恶性蓝痣。
35.如权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述检测步骤包括检测由所述基因编码的蛋白的突变。
36.如权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述检测步骤包括检测GNAll核酸的突变。
37.如权利要求31至36中任一项所述的方法，其还包括给予所述患者GNAll抑制剂。
38.确定由痣发展为黑素瘤的风险的方法，所述方法包括检测来自所述痣的生物样品中是否存在GNAll基因的活化突变， 其中所述突变的存在指示由所述痣发展为黑素瘤的风险增加。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述突变是GNAll的编码Gln209的密码子。
40.如权利要求38或39所述的方法，其中所述痣是蓝痣。
41.如权利要求38或39所述的方法，其中所述痣是太田痣。
42.如权利要求38至41中任一项所述的方法，其中所述检测步骤包括检测由所述基因编码的蛋白的突变。
43.如权利要求38至41中任一项所述的方法，其中所述检测步骤包括检测GNAll核酸的突变。
44.确定黑素瘤转移风险的方法，所述方法包括检测来自黑素瘤患者的生物样品中是否存在GNAll基因的活化突变， 其中所述突变的存在指示所述黑素瘤转移的风险增加。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述黑素瘤是葡萄膜黑素瘤。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述黑素瘤是恶性蓝痣。
47.如权利要求44至46中任一项所述的方法，其中所述突变位于GNAll的编码Gln.209的密码子处。
全文摘要
本发明提供了在黑素细胞瘤中检测GNA11基因的突变的方法，用于诊断和预后目的。本发明还提供了通过调节突变的GNA11基因的活性治疗这种黑素细胞瘤的方法。
文档编号C12Q1/68GK102648293SQ201080054030
公开日2012年8月22日 申请日期2010年10月29日 优先权日2009年10月30日
发明者凯瑟琳·D·万拉姆斯东科, 格雷戈里·S·巴什, 鲍里斯·C·巴斯蒂安 申请人:不列颠哥伦比亚大学, 加利福尼亚大学董事会, 莱兰斯坦福初级大学评议会