专利名称：：6-氨基己酸的生物化学合成的制作方法6-氨基己酸的生物化学合成本发明是基于发明专利申请No.200580002757.3的分案申请。本发明涉及对6-氨基己酸(6-aminocaproicacid)进行生物化学合成的新方法。6-氨基己酸在下文中也被称为6-ACA。化合物6-氨基己酸(IUPAC名称6_氨基-己酸，6-amino-hexanoicacid)是生产ε-己内酰胺(下文中简称为己内酰胺)的可能的中间产物，这是生产尼龙-6的基础。另一方面，6-氨基己酸还可通过己内酰胺的水解形成。己内酰胺是散装化学物质，其在世界范围内以非常大的规模被制造。用于对己内酰胺进行工业制造的基础化学物质通常是散装化学物质，例如，苯、环己烷、环己酮等，从它们可以制得环己酮肟，然后其再通过所谓的Beckmarm重排转化为己内酰胺。但是，在回收尼龙-6地毯废料时，例如，6-氨基己酸(以及在对尼龙-6的去聚合化步骤中形成的一些其它产物)可被用于通过环化反应合成己内酰胺。在对尼龙-6的工业回收中，生产己内酰胺通常是最后的合成步骤。6-氨基己酸(6-ACA)因此适合用于合成己内酰胺，以及随后的对尼龙-6的生产。但是，6-ACA还可直接用作为生产尼龙-6的原材料。对于6-ACA和/或其酯类的环化而言，多种方法都是技术人员已知的。例如，可以参考US-A-6，194，572中描述的方法，其中，在反应区域中，在不存在催化剂的情况下，用温度在270至400°C范围内压力在0.5至2MPa范围内的超热蒸汽去处理6-ACA和/或其酯类。这些方法可连续操作，形成的己内酰胺可通过在反应混和物离开反应区域之后立即在100至170°C范围内的温度下进行部分冷凝来分离。将6-ACA直接转化为尼龙-6例如可以按照JP4050232-A来进行。在本专利申请中，术语“生物化学合成”(在本专利申请上下文中，该术语可被替换为“生物转化”)的含义不仅指除大量纯粹的化学反应步骤之外还包含一种或多种生物催化反应的方法，该术语还包括使用合适的生产菌株的整个细胞来进行的纯粹的生物化学过程。此类纯粹的生物化学过程在从合适的碳源开始的生物化学合成的情况下指发酵，在从已具有碳骨架(从其可获得待合成的目标分子)的中间产物开始的生物合成的情况下指前体发酵。这些方法可以在有氧或厌氧条件下进行。生物化学合成可以在体内或体外进行。通常，体内方法是用活细胞(术语“活细胞”还包括所谓的静止细胞)进行的方法；另一方面，体外方法通常使用细胞裂解物或(部分)纯化的酶来进行的。然而，在本文中提及的生物化学合成还可用渗透性(permeabilized)细胞来进行；但是，对于用渗透性细胞进行的方法来说，体内和体外的区别没有太多意义。本发明还涉及获得用于合成6-氨基己酸的生物转化过程的经过遗传工程改造的合适的宿主细胞的方法，还特别涉及迄今未知的用于从能得到6-氨基己酸的中间产物(即，6-氨基己-2-烯酸)，或从能转化为其的化合物(即6-氨基-2-羟基己酸)对6-氨基己酸进行前体发酵的方法。在本申请的上下文中，所述化合物6-氨基己-2-烯酸和6-氨基-2-羟基己酸(下文中将有解释)将被分别称为6-AHEA和6-AHHA。在对6-氨基己酸的前体发酵中，如下所述，可针对前体发酵将合适的中间产物制备为如下可获得的形式它们3以非限制性和非抑制性的浓度存在，例如，通过将其补料到其中进行生物化学合成(即，转化)的反应容器中来进行。本发明还特别涉及新颖的宿主细胞，它们具有针对6-氨基己-2-烯酸，即针对6-AHEA，的烯酸酯(enoate)还原酶活性。特别地，其还涉及具有针对6-AHEA的在空气中稳定的烯酸酯还原酶活性的新颖的宿主细胞。本文中使用的术语“空气中稳定的(aerostable)，，表示耐氧的。最后，如下文中所解释的一样，本发明涉及通过生物化学方法生产的新颖的化合物6-AHEA和6-ACA，以及从此类6-ACA生产的己内酰胺，涉及尼龙_6和其它衍生物，它们是从此类通过生物化学方法生产的化合物或此类己内酰胺生产的。通常，直到今天，已知的到6-ACA的途径都是艰苦且麻烦的。通常，如果6-ACA不是从废的尼龙_6材料生产的话，这些已知的途径都需要相对昂贵的起始原料和反应试剂(例如，丁二烯和氢气)，以及相对严格的在多步骤和多反应器方案中的温度和压力反应条件，以及需要用到昂贵的催化体系。因此，人们需要替代性的到6-ACA的途径，优选地，从便宜很多的原材料起始的。本领域公知，来自农业生产的天然生长的并且因此可更新的材料是可用于发酵或前体发酵的碳源(例如葡萄糖)(或其它合适的碳源或其混合物)的基础。此类可更新的材料相对便宜而且可以大量获得。通常，如果可更新的材料可用作为针对所有类型的化学材料的起始原料，会被认为是非常有利的。本发明的目的之一是使得能够通过生物化学合成(即，通过生物转化)来生产6-ACA，这在目前是未知的。本发明的发明人出人意料地发现了一种新颖的方法，用于对6-氨基己酸进行生物化学合成，其中，结构式[1]的6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)H2N-CH2-CH2-CH2-CH=CH-COOH[1]或6-氨基-2-羟基己酸(6-AHHA)(这是一种能被转化为6_氨基己_2_烯酸的化合物)被具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶处理，所述的酶活性针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子，具体而言，被具有针对6-氨基己-2-烯酸的α，烯酸酯还原酶活性的酶处理。本文中，针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯还原酶活性应被理解为，能将与羧酸(-C00H)或羧酸根(_C00_)或酯(_C00R，R表示至多6个C原子的低级烷基)相邻的α，β-位置上的α，碳-碳双键转化为还含有伯氨基(即，不形成酰胺基团一部分的-NH2基团)的分子中的碳-碳单键。单取代或二取代的氨基不被包含在本文所使用的伯氨基的定义内。术语α，β-烯酸酯还原酶活性包括可测量到的活性的所有可能水平上的此类活性，包括可通过技术人员已知的方法获得的增加的活性水平，例如，通过过量表达、诱导或者对相关基因加以调控、增加相关基因的拷贝数、增加相关基因的内源活性等方法来实现，或者通过优化试验条件来实现。除6-ΑΗΕΑ之夕卜，能通过脱水作用转化为6-ΑΗΕΑ的、相应的饱和α-轻基-取代的化合物6-ΑΗΗΑ也可用于本发明的方法。在本专利申请的上下文中，该化合物被认为与α-未取代的α，β-烯酸酯6-ΑΗΕΑ等同。应当注意，由本发明发明人发现的生物化学反应，关于含α，烯酸酯基团和伯氨基的分子的转化方面，在本领域中并未有描述和教导，尽管具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶(大多数情况下，通常特别用于含有不与氢等同的α-取代基的α，β-烯酸酯)是技术人员已知用于针对大范围底物的其它类型的反应的。通常，此类使用具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶的已知的反应是用于对应异构体特异性酶的合成的。例如，见H.Simonetal.的Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，Vol13(1974)，p.608-609、B.Rambecketal.的如上文中第609页、I.Thanosetal.的J.Biotechnol.9，13-29(1987)、H.Simonetal.的Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，Vol.24(1985)，p.539-553和US-A-4,464，235。在H.Simon的Chem.Biochem.Flavoenzymes(1991),Chapterl1,pages317-328(出版者CRC,BocaRaton)中可以找到关于具有α，β_烯酸酯还原酶活性的酶的综述。这些文献中的后者表明，所述α，β-烯酸酯还原酶活性涉及从被还原的酶到烯酸酯化合物的氢化物转移。I.Thanosetal.(上文中引用的)关注使用来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460的烯酸酯还原酶针对α-取代的烯酸酯进行的电酶还原方面。在W0-03/066863中显示了具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶的其它例子，这些例子涉及对立体化学上纯净的α-取代的羰基化合物的合成。该文献没有显示针对所用的烯酸酯还原酶的任何含有伯氨基的底物。因此，完全没有教导表明，具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶适合用于对羧酸基团邻近的α-位置上未被取代且还含有伯氨基的化合物，例如6-ACA进行生物化学合成。事实上，技术人员考虑到上述可能的氢化物转移机制，将更可能预期到那些要被具有α，烯酸酯还原酶活性的酶转化的分子中伯氨基的存在，会对此类转化反应造成负面影响。预期中带正电的氨基看起来将是被转移的氢化物的优选受体，因此会对烯酸酯还原酶活性造成负面干扰。还应注意到，SteirAacheretal.(见STN数据库编号2003:101473)进行的评述指出烯酸酯还原酶具有宽广的底物特异性，这与来自其它文献(例如，上文引用的H.Simonetal.)的数据一致，其中显示了针对菌株ClostridiumtyrobutyricumDSM1460(与上文引用的I.Thanosetal.的工作中使用的同样的菌株)中烯酸酯还原酶反应的宽广范围的底物的使用，这并未改变所述的观点。此外，在文献中，对来自不同梭状芽胞杆菌的烯酸酯还原酶的克隆、测序和表达已有描述(见，F.Rohdich，etal.的J.Biol.Chem.276(6)，5779-5787(2001))。特别地，ClostridiumtyrobutyricumDSM1460禾口ClostridiumthermoaceticumDSM1974(该菌株近来与许多其它Clostridium种的菌柱一起被重新命名，因此现在也被称为Moorellathermoacetica)的烯酸酯还原酶(enr)基因被克隆和测序。然而，此类克隆目前还没有在来自例如，Bacillus、Corynel3acterium或Pichia属的任何种中开展。但是，具体而言，关于在E.coli中克隆来自Moorellathermoacetica和来自Clostridiumtyrobutyricum的enr基因已被F.Rohdich描述过。关于这些克隆，应当注意到，后者(来自C.tyrobutyricum)并未被Rohdichetal.在厌氧条件下(即在厌氧条件下生长)试验过，并且在有氧条件下的实验导致烯酸酯还原酶的失活形式；而前者(来自M.thermoacetica)在有氧条件下表达时给出了同样的结果，仅在厌氧条件下才能产生烯酸酯还原酶的活性形式。此外，在W0-03/066863中，已描述了在E.coli中对从BurWiolderia种获得的烯酸酯还原酶进行克隆，这些酶已被测序。因此，引用的参考文献中没有一篇教导了形成本发明基础的6-ACA形成反应。如发明人所发现的，具有α，烯酸酯还原酶活性的酶(用于本发明的方法中的)可以是来自一大组的微生物属(厌氧的以及需氧的那些)的任何合适的酶(即，如果可被确认为具有针对含α，β_烯酸酯基团和伯氨基的分子，尤其是针对6-氨基己-2-烯酸的α，β-烯酸酯还原酶活性，该酶就是合适的)，例如，来自Acetobacterium、AchromobacterλAcremonium、Agrobacterium、Alcaligenes、Bacillus、Bradyrhizobium、Burkholderia、CaloramatorΛCephalosporium、Clostridium、Escherichia、Eubacterium、FilifactorλFusobacterium、Kluyveromyces、Mesorhizobium、Moorella、Ochrobactrum、Oxalophagus、OxobacterΛPaenibacillus、PseudomonasΛRalstonia、Rhizobium、Rhodotorula、Salmonella、Shigella、Sinorhizobium、Sporohalobacter、Syntrophospora、ThermoanaerobacterλThermoanaerobacterium、Tilachlidium、Vibrio、Xanthobacter或Yersinia的属。优选地，在本发明的方法中，具有α，烯酸酯还原酶活性的酶是来自Acetobacterimsp.、Acremoniumsp.、Agrobacteriumsp.、Burkholderiasp.、Cephalosporiumsp.、Clostridiumsp.、Escherichiasp.、Moorellasp.、Ochrobactrumsp.、Pseudomonassp.、Salmonellasp.、Shigellasp.、Tilachlidiumsp.、Yersiniasp.和Vibriosp.种的组的微生物的酶。更优选地，具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶是来自Acremoniumsp.、Clostridiumsp·、Moorellasp.、或Ochrobactrumsp.的酶。最优选地，具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶是来自AcremoniumstrictumCBSl14157(保藏日2003年12月19日；按照布达佩斯条约保藏)、ClostridiumtyrobutyricumDSM1460(可从DeutscheSammlungMikroorganismenundZellkulturen获得)、MoorellathermoaceticaDSM1974(可从DeutscheSammlungMikroorganismenundZellkulturen获得)(该酶还被称为DSM1974，直到1980年1月1日，被命名为Clostridiumthermoaceticum)>OchrobactrumanthropiNCIMB41200(1H%2003^Ξ12月16日；按照布达佩斯条约保藏)或ClostridiumkluyveriDSM555(可从DeutscheSammlungMikroorganismenundZellkulturen获得)的酶。在上下文中，应当注意至丨」，大量的Clostridium种近来被重命名。上文中给出的名字因此指出了可由其获得具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶的菌株(细胞)和品种。使用来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460或来自MoorellathermoaceticaDSM1974的具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶时，发明人已获得了根据本发明的向6-ACA的生物化学转化的好结果。优选地，针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的具有α，β_烯酸酯还原酶活性的酶具有在空气中稳定的α，烯酸酯还原酶活性。这意味着，该酶将能在游离氧存在的条件下催化想要的生物转化，而没有任何明显的钝化，即，在生物转化过程中钝化不会超过酶活的标准偏差。此类具有空气中稳定活性的酶可被称为耐氧酶。因此，在本发明的一种优选的实施方式中，具有α，烯酸酯还原酶活性的酶具有在空气中稳定的α，β-烯酸酯还原酶活性，并且是来自Agrobacteriumsp.、Burkholderiasp.^Escherichiasp.>Pseudomonassp.>Salmonellasp.>Shigellasp.、Yersiniasp.和Vibriosp.种的组的微生物的酶。更优选地，具有空气中稳定的α，β-烯酸酯还原酶活性的酶是来自Escherichiacoli种的，最优选地，是来自EscherichiacoliK12的酶。本发明的方法非常适合在3至9范围内的pH下通过将6-氨基己_2_烯酸转化为6-氨基己酸来进行，优选地，4至8范围内的pH，更优选地，5至8，最优选地，在厌氧条件下5.5至7pH，在有氧条件下，6.5至8pH。可通过以如下方式提供6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)化合物，或者提供能代谢为该化合物的产品(但与纯粹的碳源例如葡萄糖不同)，使得起始材料6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)可为根据本发明的生物化学转化所用，所述方式使得该化合物在所用的反应器中以非限制性和非抑制性的浓度存在，例如通过向其中进行生物化学过程的反应容器(例如，发酵罐)中补料来进行。其中6-AHEA(或其可被代谢的前体)以上述方式用于反应容器中的根据本发明的方法被称为“前体发酵”。当然，还可通过发生于含α，β-烯酸酯还原酶活性的微生物中的任何合适的生物化学方法，使得6-ΑΗΕΑ(或任何能被代谢为其但与纯粹的碳源不同的产品)可以被根据本发明的转化所利用。例如，人们已知，赖氨酸可通过在Corynebacteriumglutamicum细胞中的生物转化来产生(例如，见PfefferleW.的Adv.Biochem.Eng.(2003)，Vol.79，p59-l12)。Corynebacteriumglutamicum完整基因组序列的已知对于赖氨酸的生物技术生产的改进产生了重大的影响。假设微生物中的赖氨酸随后可被转化为6-AHEA，这是迄今为止未被公开或提出的方法，它将可能是制备可用于本发明转化的6-AHEA的合适方法。通过技术人员容易获得的化学方法，可将通过生物化学合成(生物转化)产生的赖氨酸转化为6-AHEA。例如，按照Houben-Weyl，MethodsofOrganicChemistry(4thedition),VolE22a,Thieme,Stuttgart,2002page166-191所述，通过首先用赖氨酸-铜(II)复合物方法保护氨基来进行。可选的保护基团是乙酰基、苯甲酰基、苯乙酰基、苄氧羰基或邻苯二甲酰亚胺基(phthaloylimide)。随后在硫醇或硒醇存在的情况下对α-氨基进行的亚硝化反应导致了相应的α-硫或α-硒醚的形成。该亚硝化可以在具有NaNO2/H2S04的水性介质中进行，或者在使用例如，亚硝酸异戊酯(iso-amylnitrite)的无水条件下进行。硫醇的合适例子是(被取代的)苯硫酚和苯甲基硫醇；该反应中苯硒醇是作为硒醇优选的。随后用H2O2对α-硫醚或α-硒醚氧化以及随后进行原位消去反应将获得ε-保护的6-ΑΗΕΑ。该过程的例子由S.Bory,M.Gaudry,A.Marquet；NouveauJournaldeChimie(1986)，10，709-713所描述。通过酸或碱催化的对ε-保护基团的水解，获得6-ΑΗΕΑ。当6-ΑΗΕΑ是在细胞中通过生物化学方法产生(或来自通过生物转化制造的赖氨酸)的情况下，得到的6-ACA(以及在从细胞中排出和通过任何已知方法进行的环化之后从其获得的己内酰胺)与从化石给料(fossilefeedstock)的化学途径获得的6-ACA(和/或由此获得的己内酰胺，分别从其获得的产品，例如，从此类己内酰胺获得的尼龙-6)可以很容易地区分开。在后一种情况中，分子中不存在14C是显而易见的。或者，可以用12C比13C比14C同位素的比例(可通过StableIsotopeRatioMassSpectrometry(SIRMS)方法，或通过所谓的经由NuclearMagneticResonance的Site-SpecificNaturalIsotopeFractionation(SNIF-NMR，它们可用于对生物物质的鉴定)作为6-ACA(和/或己内酰胺)来源的指纹，因为，12C比13C比14C同位素的比例将与环境二氧化碳中存在的值大致相同。起始材料，6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)还可通过纯粹的化学方法获得，例如，与P.Hughesetal.关于苏_3_羟基赖氨酸合成的J.Org.Chem.vol.59(1994)，pages5799-5802中所述的方法中流程2的步骤a和i类似的方法。这被展示在本申请的实验部分中。根据本发明的方法优选在选自由Aspergillus、Bacillus、Corynebacterium、hcherichia和Pichia属组成的组的宿主生物中进行。属于Corynekicteriumsp.的组，例如C.glutamicum的宿主生物是特别优选的，因为这些微生物已知适合用于对赖氨酸的生物合成生产。在本发明的特别优选的实施方式中，适于对6-氨基己酸进行生物化学合成的宿主菌株以及由此的宿主细胞选自Escherichiacoli、Bacillus、Corynebacteriumglutamicum、Aspergillusniger或Pichiapastoris宿主细胞的组，其中，编码具有针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的α，烯酸酯还原酶活性的α，β_烯酸酯还原酶基因被克隆和表达。可以代替任何上述α，β-烯酸酯还原酶基因，编码具有α，β-烯酸酯还原酶活性并且能将6-ΑΗΕΑ以足够程度转化为6-ACA的任何其它基因可以使用，其被认为是落在了要求保护的范围之内。在本申请提到的细胞中，现有技术中仅描述了用来自MoorellathermoaceticaDSM1974或来自Clostridiumtyrobutyricum的α,β-烯酸酯还原酶基因克隆的hcherichiacoli细胞；上面提到的其它细胞都是新颖的细胞。此外，如本发明所发现的，编码具有空气中稳定的、针对含α，烯酸酯基团和伯氨基的分子的α，烯酸酯还原酶活性的酶的基因可被用于本发明的方法。例如，发明人发现，已知具有N-乙基马来酰亚胺还原酶活性的基因，EscherichiacoliK12(菌株W3110)的nemA基因(编号D86931)也具有针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯还原酶活性。nemA基因的这种α，β_烯酸酯还原酶活性以前是未知的。基于与来自E.coli的nemA基因的序列同源性，编码具有在空气中稳定的、针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯还原酶活性的酶的其它基因将可从来自例如Agrobacterium、Escherichia、Pseudomonas、Salmonella、Shigella、Yersinia禾口Vibrio的菌株中获得。就本专利申请的目的而言，编码具有在空气中稳定的、针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的α，烯酸酯还原酶活性的酶的所有此类其它基因都被认为是与nemA等同的。因此，本发明还特别涉及如下新颖的细胞-Escherichiacoli宿主细胞，其中，来自OchrobactrumanthropiNCIMB41200或来自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达；-Bacillus宿主细胞，其中，来自MoorellathermoaceticaDSM1974,或来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460,^jfegOchrobactrumanthropiNCIMB41200,自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达；-Corynebacteriumglutamicum宿主细胞，其中，来自MoorellathermoaceticaDSM1974，或来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或来自OchrobactrumanthropiNCIMB41200，或来自AcremoniumstrictumCBS114157的α,β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达；-Aspergillusniger,gMoorellathermoaceticaDSM1974,^；JfegClostridiumtyrobutyricumDSM1460,^jftgOchrobactrumanthropiNCIMB41200,或来自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达；-Pichiapastoris宿主细胞，其中，来自MoorellathermoaceticaDSM1974，或来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460,^jftgOchrobactrumanthropiNCIMB41200,^；来自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达；以及-选自Aspergillus、Bacillus、Corynebacterium和Pichia宿主细胞的组的宿主细胞，其中，来自E.coliK12的在空气中稳定的α，β-烯酸酯还原酶基因nemA被克隆和表达。通常，具有在空气中稳定的α，烯酸酯还原酶活性的酶在本发明的上下文中是明确优选的。这是因为在有氧条件下培养和/或使用的微生物中它们能被表达和使用。可以通过技术人员已知的任何合适的克隆策略，例如通过实验部分中描述的Tj法，来获得下述Escherichiacoli、或Bacillus、或Corynebacteriumglutamicum、或Aspergillusniger或Pichiapastoris宿主细胞，所述宿主细胞中，来自MoorellathermoaceticaDSM1974,g*自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460,g*自OchrobactrumanthropiNCIMB41200,SAcremoniumstrictumCBSl14157白勺α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达(或者，与它们同源、并且编码具有α，β-烯酸酯还原酶活性且能以足够程度将6-ΑΗΕΑ转化为6-ACA的酶的任何此类基因)。还可参考公知的手册，SambrookJ.,Fritsch,Ε.F.,andManiatis,Τ.MolecularClonning:ALaboratoryManual.2nded.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY，1989。类似地，此类克隆策略还可被用于构建上面提到的nemA克隆(或与其等同的克隆)。此外，特别是当从真菌中获得的基因被克隆到细菌菌种中的情况下，技术人员将使用合适的手段，不仅用于改造转录和翻译控制序列，此外还使用经过分离的或通过合成获得的cDNA序列，以获得将被制造的酶的功能性表达。此外，本发明还涉及对6-氨基己酸(6-ACA)进行前体发酵的方法，其中，从6_氨基己-2-烯酸(6-AHEA)或从6-氨基-2-羟基己酸(6-AHHA)开始，应用至少一个酶步骤，其中使用具有针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的α，烯酸酯还原酶活性的酶，特别是使用具有针对6-氨基己-2-烯酸的α，烯酸酯还原酶活性的酶。在最优选的实施方式中，此类前体发酵在能体内形成6-氨基己-2-烯酸(6-ΑΗΕΑ)的微生物中进行。事实上，在这种情况下，根据本发明的6-ACA的形成是起始自任何合适碳源的向6-ACA的生物转化。适合用于本发明方法的此类特殊实施方式的碳源是寡糖和二糖，例如，麦芽糖，β-半乳糖苷，蜜二糖，表蜜二糖(印imelibiose)，肌醇半乳糖苷，蜜二醇(melibitol)，半乳糖苷甘油和海藻糖(trehalose)，己糖，例如，D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨糖和D-半乳糖，含有葡萄糖的溶液或浆体，淀粉，含有碳源的溶液或浆体，氨基糖，例如，N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖胺，甲基戊糖，例如，L-海藻糖(fucose)和L-鼠李糖，戊糖和丙糖，例如，L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、木糖醇、D-来苏糖、D-核糖、2-脱氧-2-D-核糖和二羟基丙酮，核苷和去氧核苷中的戊糖，例如，胞嘧啶核苷、去氧胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、去氧腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、黄嘌呤核苷、胸腺嘧啶脱氧核苷(去氧尿嘧啶核苷)，嘌呤(腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤核糖核苷)，heXur0nides，heXur0nates和己糖酸酯，例如D-葡9萄糖酸酯和D-半乳糖醛酸酯(D-galactonate)，磷酸化的糖和羧酸酯，例如己糖磷酸酯以及sn-甘油3-磷酸酯，二羧酸酯，例如琥珀酸酯、富马酸酯和L-苹果酸酯，三羧酸，多羟基化合物，例如，D-甘露糖醇、D-葡萄糖醇、D-山梨糖醇、半乳糖醇、卫矛醇、D-阿拉伯醇、核糖醇和木糖醇、甘油，二碳化合物，例如乙醇和乙酸酯，脂肪酸，.羟乙酸酯(glycolate)和乙醛酸酯(glyoxylate)以及甲醇，可食用油或任意上述化合物的混合物。最优选地，6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)是在体内从含有合适碳源的溶液或浆体形成的。此类合适的碳源可以选自葡萄糖、含有葡萄糖的溶液或浆体、(甲)乙醇、葡萄糖酸酯、戊糖、己糖、淀粉和脂肪酸的组。特别地，使用的碳源是葡萄糖。如上所述，因为对游离氧耐受的(并且因此可被描述为在空气中稳定的)、具有针对6-AHEA的烯酸酯还原酶活性的酶是本发明范围内优选的(即，在有氧条件下培养和/或使用的微生物中可被表达和使用的酶)，因此优选使用在有氧条件下可用的微生物。有氧条件下的生长效率(即，也是生物物质产量)以及相关(多种)酶和/或将被生产的物质产生的效率，通常比厌氧条件下的生长要高得多。例如，能获得好得多的关于葡萄糖(或其它碳源)的产量。此类优点在，例如，通用手册H.khlegel，Thieme,Germany(1981)的"AllgemeineMikrobiologie"中有所描述。此外，本发明涉及新颖的、通过生物化学方法生产的如本文所公开的物质，涉及由此获得的、且12C比13C比14C同位素比例与环境二氧化碳中存在的值大致相同的产品，即，涉及通过生物化学方法生产的、具有与环境二氧化碳中存在的值大致相同的1V比"c比14C同位素比例的6-氨基己-2-烯酸；具有与环境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的6-氨基-己酸；具有与环境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的、从通过生物化学方法生产的6-羧基-6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸产生的ε-己内酰胺；涉及具有与环境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的尼龙-6或其衍生物，所述尼龙-6是从通过生物化学方法生产的6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸，或从ε-己内酰胺产生的，所述ε-己内酰胺是从通过生物化学方法生产的6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸生产的。通过本文描述的方法，可以容易地鉴定出这些新颖的化合物，例如，通过MableIsotopeRatioMassSpectrometry(SIRMS)方法或通过由NMR进行的Site-SpecificNaturalIsotopeFractionation.这些新颖的化合物与从化石碳源通过化学合成获得的、在现有技术文献中有所描述的相应的化学结构和结构式明显不同(即，它们的12C比13C比14C同位素比例方面)。下述实验结果将对本发明加以详述，但是，本发明并不被该实验部分的方法或原理所限制。此外，应当清楚，通过类推，本发明将可用于从ω-氨基2-烯烃羧酸对更高级的α，ω-氨基羧酸进行生物合成(以及随后对来自其的聚酰胺的生产)。例如，11-氨基-2-十一烯酸可以作为合成聚酰胺-11的起始化合物。用于通过处理其相应的α，β-不饱和羧酸来生产此类高级α，ω-氨基羧酸的实施方式被认落为在本发明权利要求的范围内。I从4-氨基丁醛二乙缩醛来制备6-氨基己-2-烯酸出-AHEA)在R.Hamiltonetal.,Tet.Letters1993(34)，ρ·2847—2850，在P.Hughesetal.,J.Org.Chem.1994(59),p.5799-5802,以及在C.Stammeretal.,J.Org.Chem.1969(34)，p.2306-2311中分别描述了相关的反应步骤。在Dean-Stark条件下，4-氨基丁醛二乙缩醛(技术级，90%；202.4g,1130mmol)和邻苯二甲酸酐(186g，1256mmol)在含有大约IOwt.%三乙胺(TEA;166g，1640mmol)的甲苯(1700ml)中进行4小时的反应。冷却至室温(RT)后，真空蒸发掉溶剂和多余的TEA。将残余物溶解，在2MHCl水溶液QOOOml)和丙酮Q800ml)的混合物中回流20分钟。冷却至室温后，真空移除丙酮，用CH2Cl2(h200ml)萃取残余物。用2MHCl水溶液(3x200ml)和饱和NaHCO3水溶液(h200ml)来洗有机相。在Na2SO4上干燥溶液之后，通过真空蒸发掉CH2Cl2来分离4-邻苯二甲酰亚氨基正丁醛G-phtalimidobutanal)。在真空下除湿器中于P2O5上干燥之后，获得了MO.5g的4-邻苯二甲酰亚氨基正丁醛(产率98%)。再将4-邻苯二甲酰亚氨基正丁醛(120.9g，556mmOl)溶于600ml的CH2Cl2，用600mlCH2Cl2中的(三苯基正膦基亚基)乙酸甲酯(methyl(triphenylphosphoranylidene)acetate)(186g,556mmol)对其进行处理。1小时后，在真空下对混合物进行浓缩，分七等分进行色谱(MerckKieselgel60；7x14cm柱；用己烷中30%的乙酸乙酯进行洗脱)，得到了145.6g(96%)的甲基-6-邻苯二甲酰亚氨基己-2-烯酸酯^-phtalimidohex-2_enoate)，其为白色固体。甲基-6-邻苯二甲酰亚氨基己-2-烯酸酯(145.6g；533mmol)被溶于甲醇(900ml)，与1700ml蒸馏水中的71.6gNa0H(1790mmol)在室温下搅拌8小时。用木炭处理溶液并过滤。用沈咖丨37%的HCl水溶液对滤出物进行酸化，然后回流3小时。冷却至室温后，将小量沉淀物过滤掉，将溶液在真空下浓缩至开始结晶。沉淀物被滤走，在真空下将溶液蒸发至干。用2-丙醇和乙酸乙酯的71(体积/体积)混合物(hSOOml)煮沸残余物，以提取产物。过滤之后，真空下蒸发溶剂，残余物从2-丙醇(385ml)中重结晶出来，得到了36.7g(42%)的6-氨基-己-2-烯酸HCl盐。用250MHz匪R在CD3OD中进行测量得到的关于6-AHEA的匪R数据如下所示权利要求1.通过生物化学方法生产的6-氨基己-2-烯酸，具有与环境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例。2.通过生物化学方法生产的6-氨基-己酸，具有与环境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例。3.e-己内酰胺，其具有与环境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例，是从通过生物化学方法生产的6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸制造的。4.从如权利要求1或2所述通过生物化学方法生产的任何产品或从如权利要求3所述的e-己内酰胺制造的尼龙-6和其它衍生物，其具有与环境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例。全文摘要本发明涉及6-氨基己酸的生物化学合成。本发明涉及从6-氨基己-2-烯酸化合物或从6-氨基-2-羟基己酸来进行6-氨基己酸生物化学合成的方法，这是通过用具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶去处理含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子来实现的。本发明还涉及获得用于此类生物转化过程的经过遗传工程改造的合适的细胞的方法，以及涉及从能得到6-氨基己酸的中间产物进行的对6-氨基己酸的前体发酵。最后，本发明涉及一些新颖的通过生物化学方法生产的化合物，即，6-氨基己-2-烯酸、6-氨基己酸，以及涉及由此生产的己内酰胺，以及尼龙-6和来自此类生物化学方法生产的化合物或己内酰胺的其它衍生物。文档编号C12P7/42GK102285893SQ201010151079公开日2011年12月21日申请日期2005年1月17日优先权日2004年1月19日发明者保罗·玛丽亚·布朗特斯,彼得吕斯·马蒂纳斯·马特乌斯·诺斯恩,斯蒂法恩·马莉亚·安德勒·德威尔德曼,桑德拉·尔恩斯特,比托纳拉·凯萨琳娜·拉伊马克斯-弗兰肯,韦南德·彼得·赫勒纳·派特斯,马丁·舒尔曼,马塞尔·格哈杜斯·乌博尔特斯申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司