6－氨基己酸的生物化学合成的制作方法

专利名称：：6－氨基己酸的生物化学合成的制作方法
技术领域：
：本发明涉及对6-氨基己酸(6-aminocaproicacid)进行生物化学合成的新方法。6-氨基己酸在下文中也被称为6-ACA。化合物6-氨基己酸(IUPAC名称6-氨基-己酸，6-amino-hexanoicacid)是生产ε-己内酰胺(下文中简称为己内酰胺)的可能的中间产物，这是生产尼龙-6的基础。另一方面，6-氨基己酸还可通过己内酰胺的水解形成。己内酰胺是散装化学物质，其在世界范围内以非常大的规模被制造。用于对己内酰胺进行工业制造的基础化学物质通常是散装化学物质，例如，苯、环己烷、环己酮等，从它们可以制得环己酮肟，然后其再通过所谓的Beckmann重排转化为己内酰胺。但是，在回收尼龙-6地毯废料时，例如，6-氨基己酸(以及在对尼龙-6的去聚合化步骤中形成的一些其它产物)可被用于通过环化反应合成己内酰胺。在对尼龙-6的工业回收中，生产己内酰胺通常是最后的合成步骤。6-氨基己酸(6-ACA)因此适合用于合成己内酰胺，以及随后的对尼龙-6的生产。但是，6-ACA还可直接用作为生产尼龙-6的原材料。对于6-ACA和/或其酯类的环化而言，多种方法都是技术人员已知的。例如，可以参考US-A-6,194,572中描述的方法，其中，在反应区域中，在不存在催化剂的情况下，用温度在270至400℃范围内压力在0.5至2MPa范围内的超热蒸汽去处理6-ACA和/或其酯类。这些方法可连续操作，形成的己内酰胺可通过在反应混和物离开反应区域之后立即在100至170℃范围内的温度下进行部分冷凝来分离。将6-ACA直接转化为尼龙-6例如可以按照JP4050232-A来进行。在本专利申请中，术语“生物化学合成”(在本专利申请上下文中，该术语可被替换为“生物转化”)的含义不仅指除大量纯粹的化学反应步骤之外还包含一种或多种生物催化反应的方法，该术语还包括使用合适的生产菌株的整个细胞来进行的纯粹的生物化学过程。此类纯粹的生物化学过程在从合适的碳源开始的生物化学合成的情况下指发酵，在从已具有碳骨架(从其可获得待合成的目标分子)的中间产物开始的生物合成的情况下指前体发酵。这些方法可以在有氧或厌氧条件下进行。生物化学合成可以在体内或体外进行。通常，体内方法是用活细胞(术语“活细胞”还包括所谓的静止细胞)进行的方法；另一方面，体外方法通常使用细胞裂解物或(部分)纯化的酶来进行的。然而，在本文中提及的生物化学合成还可用渗透性(permeabilized)细胞来进行；但是，对于用渗透性细胞进行的方法来说，体内和体外的区别没有太多意义。本发明还涉及获得用于合成6-氨基己酸的生物转化过程的经过遗传工程改造的合适的宿主细胞的方法，还特别涉及迄今未知的用于从能得到6-氨基己酸的中间产物(即，6-氨基己-2-烯酸)，或从能转化为其的化合物(即6-氨基-2-羟基己酸)对6-氨基己酸进行前体发酵的方法。在本申请的上下文中，所述化合物6-氨基己-2-烯酸和6-氨基-2-羟基己酸(下文中将有解释)将被分别称为6-AHEA和6-AHHA。在对6-氨基己酸的前体发酵中，如下所述，可针对前体发酵将合适的中间产物制备为如下可获得的形式它们以非限制性和非抑制性的浓度存在，例如，通过将其补料到其中进行生物化学合成(即，转化)的反应容器中来进行。本发明还特别涉及新颖的宿主细胞，它们具有针对6-氨基己-2-烯酸，即针对6-AHEA，的烯酸酯(enoate)还原酶活性。特别地，其还涉及具有针对6-AHEA的在空气中稳定的烯酸酯还原酶活性的新颖的宿主细胞。本文中使用的术语“空气中稳定的(aerostable)”表示耐氧的。最后，如下文中所解释的一样，本发明涉及通过生物化学方法生产的新颖的化合物6-AHEA和6-ACA，以及从此类6-ACA生产的己内酰胺，涉及尼龙-6和其它衍生物，它们是从此类通过生物化学方法生产的化合物或此类己内酰胺生产的。通常，直到今天，已知的到6-ACA的途径都是艰苦且麻烦的。通常，如果6-ACA不是从废的尼龙-6材料生产的话，这些已知的途径都需要相对昂贵的起始原料和反应试剂(例如，丁二烯和氢气)，以及相对严格的在多步骤和多反应器方案中的温度和压力反应条件，以及需要用到昂贵的催化体系。因此，人们需要替代性的到6-ACA的途径，优选地，从便宜很多的原材料起始的。本领域公知，来自农业生产的天然生长的并且因此可更新的材料是可用于发酵或前体发酵的碳源(例如葡萄糖)(或其它合适的碳源或其混合物)的基础。此类可更新的材料相对便宜而且可以大量获得。通常，如果可更新的材料可用作为针对所有类型的化学材料的起始原料，会被认为是非常有利的。本发明的目的之一是使得能够通过生物化学合成(即，通过生物转化)来生产6-ACA，这在目前是未知的。本发明的发明人出人意料地发现了一种新颖的方法，用于对6-氨基己酸进行生物化学合成，其中，结构式[1]的6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)H2N-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-COOH[1]或6-氨基-2-羟基己酸(6-AHHA)(这是一种能被转化为6-氨基己-2-烯酸的化合物)被具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶处理，所述的酶活性针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子，具体而言，被具有针对6-氨基己-2-烯酸的α，β-烯酸酯还原酶活性的酶处理。本文中，针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯还原酶活性应被理解为，能将与羧酸(-COOH)或羧酸根(-COO-)或酯(-COOR，R表示至多6个C原子的低级烷基)相邻的α，β-位置上的α，β-碳-碳双键转化为还含有伯氨基(即，不形成酰胺基团一部分的-NH2基团)的分子中的碳-碳单键。单取代或二取代的氨基不被包含在本文所使用的伯氨基的定义内。术语α，β-烯酸酯还原酶活性包括可测量到的活性的所有可能水平上的此类活性，包括可通过技术人员已知的方法获得的增加的活性水平，例如，通过过量表达、诱导或者对相关基因加以调控、增加相关基因的拷贝数、增加相关基因的内源活性等方法来实现，或者通过优化试验条件来实现。除6-AHEA之外，能通过脱水作用转化为6-AHEA的、相应的饱和α-羟基-取代的化合物6-AHHA也可用于本发明的方法。在本专利申请的上下文中，该化合物被认为与α-未取代的α，β-烯酸酯6-AHEA等同。应当注意，由本发明发明人发现的生物化学反应，关于含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的转化方面，在本领域中并未有描述和教导，尽管具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶(大多数情况下，通常特别用于含有不与氢等同的α-取代基的α，β-烯酸酯)是技术人员已知用于针对大范围底物的其它类型的反应的。通常，此类使用具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶的已知的反应是用于对应异构体特异性酶的合成的。例如，见H.Simonetal.的Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，Vol13(1974)，p.608-609、B.Rambecketal.的如上文中第609页、I.Thanosetal.的J.Biotechnol.9，13-29(1987)、H.Simonetal.的Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，Vol.24(1985)，p.539-553和US-A-4,464,235。在H.Simon的Chem.Biochem.Flavoenzymes(1991)，Chapter11，pages317-328(出版者CRC，BocaRaton)中可以找到关于具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶的综述。这些文献中的后者表明，所述α，β-烯酸酯还原酶活性涉及从被还原的酶到烯酸酯化合物的氢化物转移。I.Thanosetal.(上文中引用的)关注使用来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460的烯酸酯还原酶针对α-取代的烯酸酯进行的电酶还原方面。在WO-03/066863中显示了具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶的其它例子，这些例子涉及对立体化学上纯净的α-取代的羰基化合物的合成。该文献没有显示针对所用的烯酸酯还原酶的任何含有伯氨基的底物。因此，完全没有教导表明，具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶适合用于对羧酸基团邻近的α-位置上未被取代且还含有伯氨基的化合物，例如6-ACA进行生物化学合成。事实上，技术人员考虑到上述可能的氢化物转移机制，将更可能预期到那些要被具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶转化的分子中伯氨基的存在，会对此类转化反应造成负面影响。预期中带正电的氨基看起来将是被转移的氢化物的优选受体，因此会对烯酸酯还原酶活性造成负面干扰。还应注意到，Steinbacheretal.(见STN数据库编号2003101473)进行的评述指出烯酸酯还原酶具有宽广的底物特异性，这与来自其它文献(例如，上文引用的H.Simonetal.)的数据一致，其中显示了针对菌株ClostridiumtyrobutyricumDSM1460(与上文引用的I.Thanosetal.的工作中使用的同样的菌株)中烯酸酯还原酶反应的宽广范围的底物的使用，这并未改变所述的观点。此外，在文献中，对来自不同梭状芽胞杆菌的烯酸酯还原酶的克隆、测序和表达已有描述(见，F.Rohdich，etal.的J.Biol.Chem.276(6)，5779-5787(2001))。特别地，ClostridiumtyrobutyricumDSM1460和ClostridiumthermoaceticumDSM1974(该菌株近来与许多其它Clostridium种的菌柱一起被重新命名，因此现在也被称为Moorellathermoacetica)的烯酸酯还原酶(enr)基因被克隆和测序。然而，此类克隆目前还没有在来自例如，Bacillus、Corynebacterium或Pichia属的任何种中开展。但是，具体而言，关于在E.coli中克隆来自Moorellathermoacetica和来自Clostridiumtyrobutyricum的enr基因已被F.Rohdich描述过。关于这些克隆，应当注意到，后者(来自C.tyrobutyricum)并未被Rohdichetal.在厌氧条件下(即在厌氧条件下生长)试验过，并且在有氧条件下的实验导致烯酸酯还原酶的失活形式；而前者(来自M.thermoacetica)在有氧条件下表达时给出了同样的结果，仅在厌氧条件下才能产生烯酸酯还原酶的活性形式。此外，在WO-03/066863中，已描述了在E.coli中对从Burkholderia种获得的烯酸酯还原酶进行克隆，这些酶已被测序。因此，引用的参考文献中没有一篇教导了形成本发明基础的6-ACA形成反应。如发明人所发现的，具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶(用于本发明的方法中的)可以是来自一大组的微生物属(厌氧的以及需氧的那些)的任何合适的酶(即，如果可被确认为具有针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子，尤其是针对6-氨基己-2-烯酸的α，β-烯酸酯还原酶活性，该酶就是合适的)，例如，来自Acetobacterium、Achromobacter、Acremonium、Agrobacterium、Alcaligenes、Bacillus、Bradyrhizobium、Burkholderia、Caloramator、Cephalosporium、Clostridium、Escherichia、Eubacterium、Filifactor、Fusobacterium、Kluyveromyces、Mesorhizobium、Moorella、Ochrobactrum、Oxalophagus、Oxobacter、Paenibacillus、Pseudomonas、Ralstonia、Rhizobium、Rhodotorula、Salmonella、Shigella、Sinorhizobium、Sporohalobacter、Syntrophospora、Thermoanaerobacter、Thermoanaerobacterium、Tilachlidium、Vibrio、Xanthobacter或Yersinia的属。优选地，在本发明的方法中，具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶是来自Acetobacterimsp.、Acremoniumsp.、Agrobacteriumsp.、Burkholderiasp.、Cephalosporiumsp.、Clostridiumsp.、Escherichiasp.、Moorellasp.、Ochrobactrumsp.、Pseudomonassp.、Salmonellasp.、Shigellasp.、Tilachlidiumsp.、Yersiniasp.和Vibriosp.种的组的微生物的酶。更优选地，具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶是来自Acremoniumsp.、Clostridiumsp.、Moorellasp.、或Ochrobactrumsp.的酶。最优选地，具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶是来自AcremoniumstrictumCBS114157(保藏日2003年12月19日；按照布达佩斯条约保藏)、ClostridiumtyrobutyricumDSM1460(可从DeutscheSammlungMikroorganismenundZellkulturen获得)、MoorellathermoaceticaDSM1974(可从DeutscheSammlungMikroorganismenundZellkulturen获得)(该酶还被称为DSM1974，直到1980年1月1日，被命名为Clostridiumthermoaceticum)、OchrobactrumanthropiNCIMB41200(保藏日为2003年12月16日；按照布达佩斯条约保藏)或ClostridiumkluyveriDSM555(可从DeutscheSammlungMikroorganismenundZellkulturen获得)的酶。在上下文中，应当注意到，大量的Clostridium种近来被重命名。上文中给出的名字因此指出了可由其获得具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶的菌株(细胞)和品种。使用来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460或来自MoorellathermoaceticaDSM1974的具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶时，发明人已获得了根据本发明的向6-ACA的生物化学转化的好结果。优选地，针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶具有在空气中稳定的α，β-烯酸酯还原酶活性。这意味着，该酶将能在游离氧存在的条件下催化想要的生物转化，而没有任何明显的钝化，即，在生物转化过程中钝化不会超过酶活的标准偏差。此类具有空气中稳定活性的酶可被称为耐氧酶。因此，在本发明的一种优选的实施方式中，具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶具有在空气中稳定的α，β-烯酸酯还原酶活性，并且是来自Agrobacteriumsp.、Burkholderiasp.、Escherichiasp.、Pseudomonassp.、Salmonellasp.、Shigellasp.、Yersiniasp.和Vibriosp.种的组的微生物的酶。更优选地，具有空气中稳定的α，β-烯酸酯还原酶活性的酶是来自Escherichiacoli种的，最优选地，是来自EscherichiacoliK12的酶。本发明的方法非常适合在3至9范围内的pH下通过将6-氨基己-2-烯酸转化为6-氨基己酸来进行，优选地，4至8范围内的pH，更优选地，5至8，最优选地，在厌氧条件下5.5至7pH，在有氧条件下，6.5至8pH。可通过以如下方式提供6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)化合物，或者提供能代谢为该化合物的产品(但与纯粹的碳源例如葡萄糖不同)，使得起始材料6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)可为根据本发明的生物化学转化所用，所述方式使得该化合物在所用的反应器中以非限制性和非抑制性的浓度存在，例如通过向其中进行生物化学过程的反应容器(例如，发酵罐)中补料来进行。其中6-AHEA(或其可被代谢的前体)以上述方式用于反应容器中的根据本发明的方法被称为“前体发酵”。当然，还可通过发生于含α，β-烯酸酯还原酶活性的微生物中的任何合适的生物化学方法，使得6-AHEA(或任何能被代谢为其但与纯粹的碳源不同的产品)可以被根据本发明的转化所利用。例如，人们已知，赖氨酸可通过在Corynebacteriumglutamicum细胞中的生物转化来产生(例如，见PfefferleW.的Adv.Biochem.Eng.(2003)，Vol.79，p59-112)。Corynebacteriumglutamicum完整基因组序列的已知对于赖氨酸的生物技术生产的改进产生了重大的影响。假设微生物中的赖氨酸随后可被转化为6-AHEA，这是迄今为止未被公开或提出的方法，它将可能是制备可用于本发明转化的6-AHEA的合适方法。通过技术人员容易获得的化学方法，可将通过生物化学合成(生物转化)产生的赖氨酸转化为6-AHEA。例如，按照Houben-Weyl，MethodsofOrganicChemistry(4thedition)，VolE22a，Thieme，Stuttgart，2002page166-191所述，通过首先用赖氨酸-铜(II)复合物方法保护ε-氨基来进行。可选的保护基团是乙酰基、苯甲酰基、苯乙酰基、苄氧羰基或邻苯二甲酰亚胺基(phthaloylimide)。随后在硫醇或硒醇存在的情况下对α-氨基进行的亚硝化反应导致了相应的α-硫或α-硒醚的形成。该亚硝化可以在具有NaNO2/H2SO4的水性介质中进行，或者在使用例如，亚硝酸异戊酯(iso-amylnitrite)的无水条件下进行。硫醇的合适例子是(被取代的)苯硫酚和苯甲基硫醇；该反应中苯硒醇是作为硒醇优选的。随后用H2O2对α-硫醚或α-硒醚氧化以及随后进行原位消去反应将获得ε-保护的6-AHEA。该过程的例子由S.Bory，M.Gaudry，A.Marquet；NouveauJournaldeChimie(1986)，10，709-713所描述。通过酸或碱催化的对ε-保护基团的水解，获得6-AHEA。当6-AHEA是在细胞中通过生物化学方法产生(或来自通过生物转化制造的赖氨酸)的情况下，得到的6-ACA(以及在从细胞中排出和通过任何已知方法进行的环化之后从其获得的己内酰胺)与从化石给料(fossilefeedstock)的化学途径获得的6-ACA(和/或由此获得的己内酰胺，分别从其获得的产品，例如，从此类己内酰胺获得的尼龙-6)可以很容易地区分开。在后一种情况中，分子中不存在14C是显而易见的。或者，可以用12C比13C比14C同位素的比例(可通过StableIsotopeRatioMassSpectrometry(SIRMS)方法，或通过所谓的经由NuclearMagneticResonance的Site-SpecificNaturalIsotopeFractionation(SNIF-NMR，它们可用于对生物物质的鉴定)作为6-ACA(和/或己内酰胺)来源的指纹，因为，12C比13C比14C同位素的比例将与环境二氧化碳中存在的值大致相同。起始材料，6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)还可通过纯粹的化学方法获得，例如，与P.Hughesetal.关于苏-3-羟基赖氨酸合成的J.Org.Chem.vol.59(1994)，pages5799-5802中所述的方法中流程2的步骤a和i类似的方法。这被展示在本申请的实验部分中。根据本发明的方法优选在选自由Aspergillus、Bacillus、Corynebacterium、Escherichia和Pichia属组成的组的宿主生物中进行。属于Corynebacteriumsp.的组，例如C.glutamicum的宿主生物是特别优选的，因为这些微生物已知适合用于对赖氨酸的生物合成生产。在本发明的特别优选的实施方式中，适于对6-氨基己酸进行生物化学合成的宿主菌株以及由此的宿主细胞选自Escherichiacoli、Bacillus、Corynebacteriumglutamicum、Aspergillusniger或Pichiapastoris宿主细胞的组，其中，编码具有针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯还原酶活性的α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达。可以代替任何上述α，β-烯酸酯还原酶基因，编码具有α，β-烯酸酯还原酶活性并且能将6-AHEA以足够程度转化为6-ACA的任何其它基因可以使用，其被认为是落在了要求保护的范围之内。在本申请提到的细胞中，现有技术中仅描述了用来自MoorellathermoaceticaDSM1974或来自Clostridiumtyrobutyricum的α，β-烯酸酯还原酶基因克隆的Escherichiacoli细胞；上面提到的其它细胞都是新颖的细胞。此外，如本发明所发现的，编码具有空气中稳定的、针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯还原酶活性的酶的基因可被用于本发明的方法。例如，发明人发现，已知具有N-乙基马来酰亚胺还原酶活性的基因，EscherichiacoliK12(菌株W3110)的nemA基因(编号D86931)也具有针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯还原酶活性。nemA基因的这种α，β-烯酸酯还原酶活性以前是未知的。基于与来自E.coli的nemA基因的序列同源性，编码具有在空气中稳定的、针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯还原酶活性的酶的其它基因将可从来自例如Agrobacterium、Escherichia、Pseudomonas、Salmonella、Shigella、Yersinia和Vibrio的菌株中获得。就本专利申请的目的而言，编码具有在空气中稳定的、针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯还原酶活性的酶的所有此类其它基因都被认为是与nemA等同的。因此，本发明还特别涉及如下新颖的细胞-Escherichiacoli宿主细胞，其中，来自OchrobactrumanthropiNCIMB41200或来自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达；-Bacillus宿主细胞，其中，来自MoorellathermoaceticaDSM1974，或来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或来自OchrobactrumanthropiNCIMB41200，或来自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达；-Corynebacteriumglutamicum宿主细胞，其中，来自MoorellathermoaceticaDSM1974，或来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或来自OchrobactrumanthropiNCIMB41200，或来自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达；-Aspergillusniger宿主细胞，其中，来自MoorellathermoaceticaDSM1974，或来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或来自OchrobactrumanthropiNCIMB41200，或来自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达；-Pichiapastoris宿主细胞，其中，来自MoorellathermoaceticaDSM1974，或来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或来自OchrobactrumanthropiNCIMB41200，或来自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达；以及-选自Aspergillus、Bacillus、Corynebacterium和Pichia宿主细胞的组的宿主细胞，其中，来自E.coliK12的在空气中稳定的α，β-烯酸酯还原酶基因nemA被克隆和表达。通常，具有在空气中稳定的α，β-烯酸酯还原酶活性的酶在本发明的上下文中是明确优选的。这是因为在有氧条件下培养和/或使用的微生物中它们能被表达和使用。可以通过技术人员已知的任何合适的克隆策略，例如通过实验部分中描述的方法，来获得下述Escherichiacoli、或Bacillus、或Corynebacteriumglutamicum、或Aspergillusniger或Pichiapastoris宿主细胞，所述宿主细胞中，来自MoorellathermoaceticaDSM1974，或来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或来自OchrobactrumanthropiNCIMB41200，或分别来自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达(或者，与它们同源、并且编码具有α，β-烯酸酯还原酶活性且能以足够程度将6-AHEA转化为6-ACA的酶的任何此类基因)。还可参考公知的手册，SambrookJ.，Fritsch，E.F.，andManiatis，T.MolecularClonningALaboratoryManual.2nded.，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989。类似地，此类克隆策略还可被用于构建上面提到的nemA克隆(或与其等同的克隆)。此外，特别是当从真菌中获得的基因被克隆到细菌菌种中的情况下，技术人员将使用合适的手段，不仅用于改造转录和翻译控制序列，此外还使用经过分离的或通过合成获得的cDNA序列，以获得将被制造的酶的功能性表达。此外，本发明还涉及对6-氨基己酸(6-ACA)进行前体发酵的方法，其中，从6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)或从6-氨基-2-羟基己酸(6-AHHA)开始，应用至少一个酶步骤，其中使用具有针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯还原酶活性的酶，特别是使用具有针对6-氨基己-2-烯酸的α，β-烯酸酯还原酶活性的酶。在最优选的实施方式中，此类前体发酵在能体内形成6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)的微生物中进行。事实上，在这种情况下，根据本发明的6-ACA的形成是起始自任何合适碳源的向6-ACA的生物转化。适合用于本发明方法的此类特殊实施方式的碳源是寡糖和二糖，例如，麦芽糖，β-半乳糖苷，蜜二糖，表蜜二糖(epimelibiose)，肌醇半乳糖苷，蜜二醇(melibitol)，半乳糖苷甘油和海藻糖(trehalose)，己糖，例如，D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨糖和D-半乳糖，含有葡萄糖的溶液或浆体，淀粉，含有碳源的溶液或浆体，氨基糖，例如，N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖胺，甲基戊糖，例如，L-海藻糖(fucose)和L-鼠李糖，戊糖和丙糖，例如，L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、木糖醇、D-来苏糖、D-核糖、2-脱氧-2-D-核糖和二羟基丙酮，核苷和去氧核苷中的戊糖，例如，胞嘧啶核苷、去氧胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、去氧腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、黄嘌呤核苷、胸腺嘧啶脱氧核苷(去氧尿嘧啶核苷)，嘌呤(腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤核糖核苷)，hexuronides，hexuronates和己糖酸酯，例如D-葡萄糖酸酯和D-半乳糖醛酸酯(D-galactonate)，磷酸化的糖和羧酸酯，例如己糖磷酸酯以及sn-甘油3-磷酸酯，二羧酸酯，例如琥珀酸酯、富马酸酯和L-苹果酸酯，三羧酸，多羟基化合物，例如，D-甘露糖醇、D-葡萄糖醇、D-山梨糖醇、半乳糖醇、卫矛醇、D-阿拉伯醇、核糖醇和木糖醇、甘油，二碳化合物，例如乙醇和乙酸酯，脂肪酸，羟乙酸酯(glycolate)和乙醛酸酯(glyoxylate)以及甲醇，可食用油或任意上述化合物的混合物。最优选地，6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)是在体内从含有合适碳源的溶液或浆体形成的。此类合适的碳源可以选自葡萄糖、含有葡萄糖的溶液或浆体、(甲)乙醇、葡萄糖酸酯、戊糖、己糖、淀粉和脂肪酸的组。特别地，使用的碳源是葡萄糖。如上所述，因为对游离氧耐受的(并且因此可被描述为在空气中稳定的)、具有针对6-AHEA的烯酸酯还原酶活性的酶是本发明范围内优选的(即，在有氧条件下培养和/或使用的微生物中可被表达和使用的酶)，因此优选使用在有氧条件下可用的微生物。有氧条件下的生长效率(即，也是生物物质产量)以及相关(多种)酶和/或将被生产的物质产生的效率，通常比厌氧条件下的生长要高得多。例如，能获得好得多的关于葡萄糖(或其它碳源)的产量。此类优点在，例如，通用手册H.Schlegel，Thieme，Germany(1981)的“AllgemeineMikrobiologie”中有所描述。此外，本发明涉及新颖的、通过生物化学方法生产的如本文所公开的物质，涉及由此获得的、且12C比13C比14C同位素比例与环境二氧化碳中存在的值大致相同的产品，即，涉及通过生物化学方法生产的、具有与环境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的6-氨基己-2-烯酸；具有与环境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的6-氨基-己酸；具有与环境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的、从通过生物化学方法生产的6-羧基-6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸产生的ε-己内酰胺；涉及具有与环境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的尼龙-6或其衍生物，所述尼龙-6是从通过生物化学方法生产的6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸，或从ε-己内酰胺产生的，所述ε-己内酰胺是从通过生物化学方法生产的6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸生产的。通过本文描述的方法，可以容易地鉴定出这些新颖的化合物，例如，通过StableIsotopeRatioMassSpectrometry(SIRMS)方法或通过由NMR进行的Site-SpecificNaturalIsotopeFractionation。这些新颖的化合物与从化石碳源通过化学合成获得的、在现有技术文献中有所描述的相应的化学结构和结构式明显不同(即，它们的12C比13C比14C同位素比例方面)。下述实验结果将对本发明加以详述，但是，本发明并不被该实验部分的方法或原理所限制。此外，应当清楚，通过类推，本发明将可用于从ω-氨基2-烯烃羧酸对更高级的α，ω-氨基羧酸进行生物合成(以及随后对来自其的聚酰胺的生产)。例如，11-氨基-2-十一烯酸可以作为合成聚酰胺-11的起始化合物。用于通过处理其相应的α，β-不饱和羧酸来生产此类高级α，ω-氨基羧酸的实施方式被认落为在本发明权利要求的范围内。I从4-氨基丁醛二乙缩醛来制备6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)在R.Hamiltonetal.，Tet.Letters1993(34)，p.2847-2850，在P.Hughesetal.，J.Org.Chem.1994(59)，p.5799-5802，以及在C.Stammeretal.，J.Org.Chem.1969(34)，p.2306-2311中分别描述了相关的反应步骤。在Dean-Stark条件下，4-氨基丁醛二乙缩醛(技术级，90％；202.4g，1130mmol)和邻苯二甲酸酐(186g，1256mmol)在含有大约10wt.％三乙胺(TEA；166g，1640mmol)的甲苯(1700ml)中进行4小时的反应。冷却至室温(RT)后，真空蒸发掉溶剂和多余的TEA。将残余物溶解，在2MHCl水溶液(2000ml)和丙酮(2800ml)的混合物中回流20分钟。冷却至室温后，真空移除丙酮，用CH2Cl2(5×200ml)萃取残余物。用2MHCl水溶液(3×200ml)和饱和NaHCO3水溶液(2×200ml)来洗有机相。在Na2SO4上干燥溶液之后，通过真空蒸发掉CH2Cl2来分离4-邻苯二甲酰亚氨基正丁醛(4-phtalimidobutanal)。在真空下除湿器中于P2O5上干燥之后，获得了240.5g的4-邻苯二甲酰亚氨基正丁醛(产率98％)。再将4-邻苯二甲酰亚氨基正丁醛(120.9g，556mmol)溶于600ml的CH2Cl2，用600mlCH2Cl2中的(三苯基正膦基亚基)乙酸甲酯(methyl(triphenylphosphoranylidene)acetate)(186g，556mmol)对其进行处理。1小时后，在真空下对混合物进行浓缩，分七等分进行色谱(MerckKieselgel60；7×14cm柱；用己烷中30％的乙酸乙酯进行洗脱)，得到了145.6g(96％)的甲基-6-邻苯二甲酰亚氨基己-2-烯酸酯(6-phtalimidohex-2-enoate)，其为白色固体。甲基-6-邻苯二甲酰亚氨基己-2-烯酸酯(145.6g；533mmol)被溶于甲醇(900ml)，与1700ml蒸馏水中的71.6gNaOH(1790mmol)在室温下搅拌8小时。用木炭处理溶液并过滤。用260ml37％的HCl水溶液对滤出物进行酸化，然后回流3小时。冷却至室温后，将小量沉淀物过滤掉，将溶液在真空下浓缩至开始结晶。沉淀物被滤走，在真空下将溶液蒸发至干。用2-丙醇和乙酸乙酯的7∶1(体积/体积)混合物(2×800ml)煮沸残余物，以提取产物。过滤之后，真空下蒸发溶剂，残余物从2-丙醇(385ml)中重结晶出来，得到了36.7g(42％)的6-氨基-己-2-烯酸HCl盐。用250MHzNMR在CD3OD中进行测量得到的关于6-AHEA的NMR数据如下所示质子a、b、c、d和e分别位于α、β、γ、δ和ε碳原子处。II培养基及其制备II.1PYG培养基(非选择性)向1l去离子水中加入1.25g蛋白胨、1.25g酵母提取物和3g葡萄糖；将pH调至pH5.8。分装到青霉素瓶中(100ml瓶中50ml培养基)，加热(通过放置在沸水浴中进行，但瓶中样品不沸腾)以除去O2，然后用N2冲(经过培养基，在N2较之培养基压力稍稍高出的情况下进行)。在121℃下灭菌15分钟。可选地，最后的痕量O2可通过加入0.05％的灭菌巯基乙酸钠来去除。II.选择性培养基(丁烯酸酯培养基；(按照F.Rohdichetal.，J.Biol.Chem.276(6)，5779-5787(2001)和Bader，J.etal.，Hoppe-Seyler’sZ.Physiol.Chem.，Bd.359，pages19-27，(1978)))向1l去离子水中加入6g丁烯酸、0.3gNaOH、150mg(NH4)2HPO4、100mgK2HPO4、33mgMgCl2·6H2O、50mgNH4Cl、1g酵母提取物、1g胰蛋白酪蛋白(trypticcaseine)、40mgCaCl2·2H2O、0.4mgMnSO4·2H2O、0.4mgFeSO4·2H2O、10mg(NH4)6MO7O24·4H2O、0.04mg生物素、0.8mgp-氨基苯酸、0.5mg刃天青、8mg50％K2CO3和0.05％的巯基乙酸钠。所有成分(除维生素-、K2CO3-和巯基乙酸钠溶液之外)被混合起来，并被分配到一些青霉素瓶中(100ml瓶中50ml)。之后，用N2气流冲刷瓶子，并进行灭菌(121℃，15分钟)。随后，加入其它化合物的灭菌且不含氧的混合物。检查pH，如果需要的话，加入额外的灭菌K2CO3溶液，将pH调节至大约pH6.4。对于更大规模(500ml培养物)而言，遵循同样的过程，除了加入丁烯酸酯和FeSO4的程序有变。按照Arch.Microbiol，127，279-287(Bader，J.etal.(1980))，如果遵循最优的培养过程，即，从35mM丁烯酸酯代替70mM，以及1.8×10-5MFeSO4开始，那么烯酸酯还原酶的量将增加。当培养物变得稳定时，加入35mM丁烯酸酯和2×10-5MFeSO4。收获细胞的最好时机是稳定生长阶段之后12小时。II.3用于E.coliTOP10克隆的培养基在N2气氛下，将一种丰富的培养基，LuriaBertani培养基(LB培养基，也被称为Luria培养基或Lenox培养基，每l含有10g细菌胰蛋白胨、5g酵母提取物和5gNaCl)用于培养E.coliTOP10/pBAD-Ctyr(1)-enr-DEST、E.coliTOP10/pBAD-Mther(1)-enr-DEST和E.coliTOP10/pBAD-nemA_Eco。每份培养基都含有适当的抗生素，如部分III中所示。II.4培养条件C.tyrobutyricumDSM1460被培养于厌氧条件下(N2气氛)，选择性培养基(见上文)上。MthermoaceticaDSM1974被培养于厌氧条件下(N2气氛)，非选择性(PYG)培养基(见上文)上。C.tyrobutyricumDSM1460被培养于37℃，MoorellathermoaceticaDSM1974被培养于55-60℃。E.coliTOP10/pBAD-Ctyr(1)-enr-DEST和E.coliTOP10/pBAD-Mther(1)-enr-DEST被培养于厌氧条件下(N2气氛)，28℃。E.coliTOP10/pBAD-nemA_Eco被培养于有氧条件下，28℃。III构建载体和质粒III.1通用程序按照在SambrookJ.，Fritsch，E.F.，andManiatis，T.MolecularClonningALaboratoryManual.2nded.，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989或厂商说明书的描述，来进行标准的分子克隆技术，例如质粒DNA分离、凝胶电泳、对核酸进行酶限制性修饰、E.coli转化等。如无特别指明，标准的分子克隆酶，例如，限制性内切酶、T4DNA连接酶等从Invitrogen(Breda，荷兰)获得。合成的寡核苷酸从Sigma-Genosys(Cambridge，UK)和Invitrogen(Paisley，Scotland，UK)获得。利用BaseClear(Leiden，荷兰)，使用有染料标记的双脱氧终止物进行链终止反应来进行DNA序列分析。III.2构建GatewayTM目的载体pBAD/Myc-His-DEST用于在E.coli中表达来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460和MoorellathermoaceticaDSM1974的烯酸酯还原酶基因，以及用于在E.coliTOP10中表达来自EscherichiacoliK12的N-乙基马来酰亚胺还原酶基因(nemA)的目的载体pBAD/Myc-His-DEST是通过将cat/ccdB盒引入到商业可获得的E.coli表达载体pBAD/Myc-HisC中制备的。cat/ccdB盒是通过PCR扩增得到的，其中使用5’-AAGAAGACCGGATCCTACTTTCTCCATACCCGTTTTTTGGGCTAACACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAAC-3’[SEQIDNo.1]作为正向引物(具有双下划线标出的启动子序列、下划线标出的BpiI识别切割位点、斜体标出的attR序列)以及5’-TTGTTCTACGTAACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAAC-3’[SEQID.No.2]作为反向引物(具有下划线标出的SnaBI切割位点和斜体表示的attR序列)，用载体pDEST15(Invitrogen)作为模板。按照厂商说明书，用ExpandHighFidelity聚合酶(RocheAppliedScience，Mannheim，德国)产生了单一片段。通过凝胶电泳验证了扩增片段具有正确的大小(1792bp)。用QIAquickGelExtractionKit(QIAGENGmbH，Hilden，德国)从预备的琼脂糖凝胶中对扩增片段进行纯化之后，用BpiI(MBIFermentas，St.Leon-Rot，德国)(导致与BamHI互补的上悬挂)和SnaBI(NewEnglandBiolabs，Frankfurt，德国)去消化片段，用T4DNA连接酶将其连接到用BamHI和SnaBI消化过的E.coli表达载体pBAD/Myc-HisC(Invitrogen)中。连接混合物随后被用于转化化学感受态E.coliDB3.1细胞(Invitrogen)。通过将整个转化混合物涂布到含有35μg/ml氯霉素的2*TY平板上接着在37℃培养过夜来选择重组细胞。从三个单个菌落分离出重组质粒之后，对插入物进行测序。这些克隆之一被证实含有想要的插入，其被命名为pBAD/Myc-His-DEST。虽然在对照序列(Invitrogen-pDEST15的核苷酸序列)与质粒pBAD/Myc-His-DEST测序部分的核苷酸序列之间有7处不符，但是pBAD/Myc-His-DEST所有重要的特征(氯霉素抗性、ccdB选择和attR重组)都是具有完全功能的。III.3构建质粒pBAD-Ctyr(1)-enr-DEST用PCR和用于克隆的GatewayTM技术(InvitrogenCorp.，Carlsbad，California，USA)，将C.tyrobutyricum烯酸酯还原酶基因克隆进E.coli表达载体pBAD/Myc-His-DEST。使用5’AGGAGGAATTAACCATGAAAAACAAATCTTTATTTGAACC-3’[SEQIDNo.3]作为正向引物(具有下划线表示的Shine-Delgarno位点、斜体表示的ATG起始密码子和双下划线的attB1位点)，使用5’CTAACAGTTAAGTCCAATTTCATTTCC-3’[SEQIDNo.4]作为反向引物(具有斜体表示的终止密码子和双下划线表示的attB2位点)，基因组DNA作为模板，对烯酸酯还原酶开放阅读框进行第一次PCR扩增。起始密码子被改变(GTG到ATG)。使用Promega产品，按照通常用的方案来分离基因组DNA。为进行分离，用C.tyrobutyricum去接种50ml选择性丁烯酸酯培养基，随后在28℃培养过夜。在该培养过程的最后半小时，加入羧苄青霉素(终浓度200μg/ml)，以削弱细胞壁。通过离心收获所有细胞，将收到的沉淀重新悬浮于pH8.0的2.5ml的50mMTris-HCl(含有50mMEDTA)中。加入50μl溶菌酶(100mg/ml)和12.5μl蛋白酶K(20mg/ml)之后，在37℃对悬浮液进行30分钟的培养。加入3mlNucleiLysisSolution(PromegaCorporation，Madison，USA)之后在80℃培养15分钟，获得完全裂解。在37℃孵育30分钟的RNase(终浓度为4μg/ml)处理之后，加入1mlProteinPrecipitationSolution(PromegaCorporation，Madison，USA)，溶液被震荡20秒，在冰上孵育15分钟。离心(4000xg，4℃，15分钟)之后，将上清液转移到0.1倍体积NaAc(3M，pH5)与2倍体积纯乙醇的混合物中。通过离心(14000xg，4℃，15分钟)收集沉淀的DNA。最后，将沉淀溶解于1ml的10mMTris-HCl(pH8)中。按照厂商说明书，用PCRSupermixHighFidelity(Invitrogen)进行的PCR产生了单条片段。通过琼脂糖凝胶电泳来验证了扩增片段的正确大小(2076bp)。用QIAGENGmbH的PCR纯化试剂盒对扩增片段进行纯化之后，片段被用作为所谓BP体外重组反应的底物，该反应按照厂商(Invitrogen)的GatewayTM说明书来进行。attB-PCR片段和pDONR201供体载体之间的重组和随后将所获得的混合物转化进E.coliTOP10感受态细胞(Invitrogen)的过程获得了ENTRY克隆pDONR-Ctyr(1)enr。通过将整个转化混合物涂布到含有50μg/ml卡纳霉素的LB平板上，接着在20℃培养过周末，来选出重组细胞。从LB琼脂平板上收集所有菌落，用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENGmbH)来分离质粒DNA。随后，使用pDONR-Ctyr(1)enr克隆和pBAD/Myc-His-DEST的混合物，通过所谓的LR体外重组反应，将含有烯酸酯还原酶的PCR片段引入目的载体pBAD/Myc-His-DEST(见下文)。该反应也按照厂商的流程来进行。将重组混合物用于转化OneShotTM化学感受态E.coliTOP10细胞(Invitrogen)。通过将整个转化混合物涂布到含有100μg/ml羧苄青霉素的LB琼脂平板以及随后在28℃培养过夜，来选出重组细胞。16个菌落在含有100μg/ml羧苄青霉素的LB培养基中培养过夜后，用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENGmbH)来分离质粒DNA。用AccI和RsrII限制性酶分别进行消化，证明，被检验的16个菌落中的11个含有想要的重组质粒pBADCtyr(1)enr-DEST。将菌株E.coliTOP10/pBAD-Ctyr(1)enr-DEST的单菌落在N2气氛下接种5mlLB培养基，其中补充有50mM磷酸钾和100μg/ml羧苄青霉素。过夜培养之后，用2.5ml该预培养物在N2气氛下去接种500ml相同的培养基。当在28℃培养几小时，达到0.4的OD620nm之后，加入0.005％的阿拉伯糖，开始诱导。在28℃培养过夜之后，通过离心(4000xg，4℃，10分钟)收获细胞。用大约一倍重量体积缓冲液将细胞沉淀重新悬浮于不含氧的磷酸钾缓冲液(100mM，pH7.0)之后，将细胞沉淀贮藏于-20℃，直到用于生物转化反应。III.4构建质粒pBAD-Mther(1)-enr-DEST使用PCR和GatewayTM技术(Invitrogen)，将Moorellathermoacetica烯酸酯还原酶基因亚克隆进E.coli表达载体pBAD/Myc-His-DEST。通过使用5’AGGAGGAATTAACCATGGTAGCCTATACCAGACTTTTTG-3’[SEQIDNo.5]作为正向引物(具有下划线表示的Shine-Delgarno位点、斜体表示的ATG起始密码子和双下划线表示的attB1位点)和5’CTAAATCCCTCGCCCTACCTC-3’[SEQIDNo.6]作为反向引物(具有斜体表示的终止密码子和双下划线表示的attB2位点)，基因组DNA作为摸板，对烯酸酯还原酶开放阅读框进行第一次PCR扩增。起始密码子被改变(GTG到ATG)。使用Promega产品，按照通常用的方案来分离基因组DNA。为进行分离，从在PYG培养基上培养之后获得的甘油贮液中分离Moorellathermoacetica。通过离心收获所有细胞，将收到的沉淀重新悬浮于pH8.0的0.25ml50mMTris-HCl(含有50mMEDTA)中。加入0.5μl溶菌酶(100mg/ml)和1.25μl蛋白酶K(20mg/ml)之后，在37℃对悬浮液进行30分钟的培养。加入0.3mlNucleiLysisSolution(PromegaCorporation，Madison，USA)之后在80℃培养15分钟，获得完全裂解。RNase(终浓度为4μg/ml)处理和在37℃孵育30分钟之后，加入1mlProteinPrecipitationSolution(PromegaCorporation，Madison，USA)，溶液被震荡20秒，在冰上孵育15分钟。离心(4000xg，4℃，15分钟)之后，将上清液转移到0.1倍体积NaAc(3M，pH5)与2倍体积纯乙醇的混合物中。通过离心(14000xg，4℃，15分钟)收集沉淀的DNA。最后，将沉淀溶解于0.05ml10mMTris-HCl(pH8)中。按照厂商说明书，用PCRSupermixHighFidelity(Invitrogen)进行的PCR没有产生足够的片段。但是，第二次PCR之后，获得了足够的PCR片段。此外，通过琼脂糖凝胶电泳来验证了扩增片段的正确大小(2045bp)。用QIAGENGmbH的PCR纯化试剂盒对扩增片段进行纯化之后，片段被用作为所谓BP体外重组反应的底物，该反应按照厂商(Invitrogen)的GatewayTM说明书来进行。attB-PCR片段和pDONR201供体载体之间的重组和随后将所获得的混合物转化进E.coliTOP10感受态细胞(Invitrogen)的过程获得了ENTRY克隆pDONR-Mther(1)enr。通过将整个转化混合物涂布到含有50μg/ml卡纳霉素的LB平板上，接着在20℃培养过周末，来选出重组细胞。从LB琼脂平板上收集所有菌落，用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENGmbH)来分离质粒DNA。随后，使用pDONR-Mther(1)enr克隆和pBAD/Myc-His-DEST的混合物，通过所谓的LR体外重组反应，将含有烯酸酯还原酶的PCR片段引入目的载体pBAD/Myc-His-DEST(见下文)。该反应也按照厂商的流程来进行。将重组混合物用于转化OneShotTM化学感受态E.coliTOP10细胞(Invitrogen)。通过将整个转化混合物涂布到含有100μg/ml羧苄青霉素的LB琼脂平板以及随后在28℃培养过夜，来选出重组细胞。16个菌落在含有100μg/ml羧苄青霉素的LB培养基中培养过夜后，用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENGmbH)来分离质粒DNA。用XmaI和BamHI限制性酶分别进行消化，证明，被检验的16个菌落中的4个含有想要的重组质粒pBAD-Mther(1)enr-DEST。将菌株E.coliTOP10/pBAD-Mther(1)enr-DEST的单菌落在N2气氛下接种5mlLB培养基，其中补充有50mM磷酸钾和100μg/ml羧苄青霉素。过夜培养之后，用2.5ml该预培养物在N2气氛下去接种500ml相同的培养基。当在28℃培养几小时，达到0.4的OD620nm之后，加入0.005％的阿拉伯糖，开始诱导。在28℃培养过夜之后，通过离心(4000xg，4℃，10分钟)收获细胞。用大约一倍重量体积缓冲液将细胞沉淀重新悬浮于不含氧的磷酸钾缓冲液(100mM，pH7.0)之后，将细胞沉淀贮藏于-20℃，直到用于生物转化反应。III.5构建质粒pBAD-nemA_Eco使用PCR和GatewayTM技术(Invitrogen)，将EsherichiacoliK12(菌株W3110)的nemA基因(编码D86931，用于N-乙基马来酰亚胺还原酶)克隆进E.coli表达载体pBAD/Myc-His-DEST。通过使用5’AGGAGGAATTAACCATGTCATCTGAAAAACTGTATTCCCC-3’[SEQIDNo.7]作为正向引物(具有下划线表示的Shine-Delgarno位点、斜体表示的ATG起始密码子和双下划线表示的attB1位点)和5’TTACAACGTCGGGTAATCGGTATAGC-3’[SEQIDNo.8]作为反向引物(具有斜体表示的终止密码子和双下划线表示的attB2位点)，EscherichiacoliK12(菌株W3110)基因组DNA作为摸板，对nemA开放阅读框进行第一次PCR扩增。按照厂商说明书，用AccuPrimePfxDNA聚合酶(Invitrogen)进行的PCR产生了单条产物片段。此外，通过琼脂糖凝胶电泳来验证了扩增片段的正确大小(1169bp)。用QIAGENGmbH的PCR纯化试剂盒对扩增片段进行纯化之后，片段被用作为所谓BP体外重组反应的底物，该反应按照厂商(Invitrogen)的GatewayTM说明书来进行。attB-PCR片段和pDONR201供体载体之间的重组和随后将所获得的混合物转化进E.coliDH5α感受态细胞(Invitrogen)的过程获得了ENTRY克隆pENTR-nemA_Eco。通过将整个转化混合物涂布到含有50μg/ml卡纳霉素的LB平板上，接着在20℃培养过周末，来选出重组细胞。从LB琼脂平板上收集所有菌落，用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENGmbH)来分离质粒DNA。随后，使用pENTR-nemA_Eco克隆和pBAD/Myc-His-DEST的混合物，通过所谓的LR体外重组反应，将含有nemA的PCR片段引入目的载体pBAD/Myc-His-DEST(见下文)。该反应也按照厂商的流程来进行。将重组混合物用于转化OneShotTM化学感受态E.coliTOP10细胞(Invitrogen)。通过将整个转化混合物涂布到含有100μg/ml羧苄青霉素的LB琼脂平板以及随后在28℃培养过夜，来选出重组细胞。3个菌落在含有100μg/ml羧苄青霉素的LB培养基中培养过夜后，用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENGmbH)来分离质粒DNA。用EcoRV和FspI限制性酶分别进行消化，证明，所有被检验的菌落中都含有想要的重组质粒pBAD-nemA_Eco。此外，将菌株E.coliTOP10/pBAD-nemA_Eco的这些菌落在N2气氛下接种500ml灭菌Erlenmeyer瓶中的50mlLB培养基，其中补充有100μg/ml羧苄青霉素，至细胞密度为OD620等于0.05。在每分钟180转(rpm)的回旋振荡器上于28℃对这些50ml的培养物进行培养。在OD620nm为0.6时，加入0.02％的阿拉伯糖，开始诱导。在28℃培养过夜之后，通过离心(4000xg，4℃，10分钟)收获细胞。将细胞沉淀重新悬浮于2ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH7.0)之后，以1ml的份将细胞沉淀贮藏于-20℃，以备将来使用。随后通过超声来破碎细胞(使用带小喷嘴的MSESoniprep150；10秒的5-10微米高度的超声，接着是10秒的破碎。整个循环持续5分钟。在该过程中，用丙酮-冰浴保持溶液冰凉)。破碎的细胞被离心(16000xg，1小时)，不含细胞的提取物被贮藏于4℃，直到进行还原6-ACA的试验。IV分析方法取决于待分析的成分，使用一些不同的HPLC(高效液相色谱)方法和LC-MS(液相色谱—质谱联用)，使用多级MS技术如MS2-SRM(选择性反应监测)和/或MS32-CRM(连续反应监测)，条件如下所示。IV.a用于测量6-AHEA和6-ACA的HPLC分析柱来自Alltech的PrevailC18(250mm×4.6mmI.D.，5μ)柱温度环境(±22℃)流速1.0ml/分钟注射体积20或100μl(较高敏感度的方法使用100μl)运行时间20至40分钟(取决于基体背景，即，存在更多副峰的情况下使用更长的运行时间)洗脱液100mM高氯酸水溶液，pH1.0(16.3g70％高氯酸/升水)样品溶液洗脱液探测柱后反应/荧光(同时在λex338nm/λem＞420nm)(用邻苯二甲醛/巯基乙醇(OPA/MCE)在环境温度，1.0ml/分钟下进行柱后反应)驻留时间对6-ACA而言，14.2分钟；对6-AHEA而言，11.7分钟。IV.b1.LC-MS2-分析按照下述LC-和MS-条件分别进行设备LCQ离子阱质谱，来自ThermoFinniganLC柱250×4.6mmPrevailC18(Alltech)洗脱液0.025％(v/v)甲酸水溶液(pH3.2)流速1ml/分钟。在进入MS之前按1∶5分流注射体积100μlMS以阳离子模式进行电喷雾在LC-MS2-SRM(高选择性及敏感性分析)模式下进行，MS条件如下离子化阳离子电喷雾源条件夹套气60辅助/吹扫气25喷雾电压5KV毛细管温度300℃毛细管电压5V管透镜偏移(tubelensoffsett)25V扫描事件原始质量(parentmass)132.0分离宽度1.1amu标准碰撞(norm.collision)能量28％激活Q0.250激活能量30msec.SRM范围114，宽度1.2(113.4-114.6amu)IV.b2.LC-MS3-分析按照下述LC-和MS-条件分别进行(在其它分析中，如下所示)，不同于IV.b1中提到的那些条件设备HP1100LC系统(AgilentTechnologies)，偶联到LCQDecaXP离子阱质谱(来自ThermoFinnigan)LC柱50×4.6mmNucleosil120-5C18(Machery&Nagel)，与150×4mmAtlantisdC18串联，5μm(Waters)柱温度环境温度(+/-22℃)洗脱液0.025％(v/v)甲酸+1％乙腈水溶液(pH3.2)流速1ml/分钟，在进入MS之前按1∶5分流注射体积2μlMSCRM(连续反应监测)模式(高选择性及敏感性分析模式)被用于选择性地探测6-ACA，MS条件如下离子化阳离子电喷雾源条件夹套气60辅助/吹扫气10喷雾电压4KV毛细管温度330℃毛细管电压5V管透镜偏移15V扫描模式CRMMS1原始质量132.0分离宽度1.0amu标准碰撞能量26％MS2原始质量114.0分离宽度1.0amu标准碰撞能量26％CRM范围78.5-79.5和95.5-96.5amu在IV.b1所述的色谱条件下，6-ACA在3.5分钟时被洗脱出。然后用IV.b.2所述的色谱条件，结合IV.b.1所述的质谱SRM条件，来定量测量6-ACA。通过进行CRMMS3实验，以及检查离子m/z79和96的存在及强度比例，来确认在来自SRM分析的阳性样品中6-ACA的存在。IV.c在大多数分析中，分别在下述的GC-、MS-条件下，使用HP6890气相色谱进行GC-MS分析GC条件GC类型HP6890GC+AtaFocus自动上样仪柱类型CPSIL8CB，LowBleed/MS柱尺寸30m×0.25mmi.d.x1.0μl炉温60℃(1分钟)→20℃/分钟→280℃(0分钟)柱流速1.2ml/分钟，氦，恒定流速注射类型无分流(无分流时间1分钟)衬里(liner)Altech(art.4928)，装有减活化玻璃丝塞子注射温度300℃注射体积0.5μlMS条件MS类型HP5973MSDMS源温度230℃MS四级(quad)温度150℃Aux温度250℃扫描模式SIM，m/z113V生物转化V.(a)用C.tyrobutyricum将6-AHEA通过生物转化为6-ACA；通过HPLC进行分析在手套箱中，氮气流下，将不含O2的缓冲液(100mM磷酸钾，pH6.0)转移到青霉素瓶中。用丁基橡胶塞封住瓶子。之后，经过塞子注射底物6-AHEA(100mM贮液；调至pH6)和/或细胞(贮藏于-20℃的C.tyrobutyricum细胞的沉淀，重新悬浮于pH7的100mM磷酸钾中)来开始反应。最后，加入NADH(110μl5mM贮液)。反应混合物(总体积2.3ml)由磷酸钾缓冲液(100mM，pH6.0)、5mM6-氨基-己-2-烯酸和0.23mMNADH组成。此外，制备空白细胞混合物(无底物)和化学物质空白混合物(无细胞)。所有反应瓶都被孵育于37℃。以不同时间间隔取0.5ml样品，随后通过离心(Eppendorf5415C离心机，10分钟，最大转速，4℃)从中去除细胞，将样品贮存于-20℃，直到用于分析。在HPLC分析之前，用洗脱液(100mM高氯酸水溶液，pH1.0)将样品稀释5至10倍。结果概括于表1中。表1通过由Clostridiumtyrobutyricum细胞对6-AHEA进行生物还原形成6-ACA表1显示，Clostridiumtyrobutyricum可对6-AHEA进行生物还原，形成6-ACA。6-ACA的浓度随时间增加。在空白细胞混合物或化学物质空白混合物中观察不到6-ACA。用选择性反应监测，在IV.b描述的源条件和扫描模式下，用LC-MS-MS证实了产物6-ACA。V.(b)通过E.colipBAD-Ctyr(1)-enr-DEST和E.colipBAD-Mther(1)-enr-DEST将6-AHEA生物转化为6-ACA；通过HPLC和LC-MS-MSSRM进行分析在手套箱中，氮气流下，将不含O2的6-AHEA溶液(20mM，处于100mM磷酸钾缓冲液中，pH6.0)转移到青霉素瓶中。用丁基橡胶塞封住瓶子。之后，经过塞子注射底物细胞(贮藏于-20℃的细胞的沉淀，重新悬浮于pH7.0的100mM磷酸钾中)和NADH溶液来开始反应。反应混合物(总体积大约3ml)含有磷酸钾缓冲液(100mM，pH6.0)、20mM6-AHEA和0.23mMNADH。此外，制备空白细胞混合物(无底物)和化学物质空白混合物(无细胞)。44小时孵育之后，取0.5ml样品，随后通过离心(Eppendorf5415R离心机，14000rpm，10分钟，4℃)从中去除细胞，将样品贮存于-20℃，直到用于分析。在即将HPLC分析之前，用洗脱液(100mM高氯酸水溶液，pH1.0)将样品稀释5至10倍，在即将LC-MS-MS分析之前，用MS洗脱液(0.025％(v/v)甲酸水溶液(pH3.2))将样品稀释5至10倍。结果概括于表2中。表2由烯酸酯还原酶克隆E.colipBAD-Ctyr(1)-enr-DEST和E.colipBAD-Mther(1)-enr-DEST通过对6-AHEA进行生物还原形成的6-ACA表2显示，E.colipBAD-Ctyr(1)-enr-DEST和E.colipBAD-Mther(1)-enr-DEST两者均能进行从6-AHEA到6-ACA的生物还原。在空白细胞混合物或化学物质空白混合物中观察不到6-ACA。V.(c)通过E.coliTOP10/pBAD-nemA_Eco来进行6-AHEA到6-ACA的生物转化；通过LC-MS3CRM来进行分析；制备由100mMTris-缓冲液(pH7.5)构成的反应混合物，其中包括20mM葡萄糖、5mM6-AHEA、7.0mMNAPDH、7.0mMNADH以及10U/ml葡萄糖氧化酶。为开始从6-AHEA到6-ACA的生物转化，加入400μl不含细胞的E.coliTOP10/pBAD-nemA_Eco提取液(总反应体积为1ml)。23小时和48小时之后，取250-300μl样品用于LC-MS2SRM分析。此外，在同样的条件下孵育化学物质空白混合物(没有不含细胞的提取液)，在同样的孵育时间之后取样。结果被概括于表3中。表3通过E.coliTOP10/pBAD-nemA_Eco的不含细胞的提取液来对6-AHEA进行生物还原形成6-ACA表3显示，E.coliTOP10/pBAD-nemA_Eco的不含细胞的提取液能进行从6-AHEA到6-ACA的生物还原。在化学物质空白混合物中观察不到6-ACA。对这些样品中6-ACA的验证是通过如下方法来进行的测定CRM分析中测得m/z为96和79的MS3片段离子的存在和强度比例，将该比例与同一方式处理得到的校正标准6-ACA加以比较。表4中概括了结果。表4来自CRM分析的m/z为96和79的片段离子的强度比例VI从6-AHEA到6-ACA的生物转化环化6-ACA在手套箱中，氮气流下，将不含O2的6-AHEA溶液(20mM，处于100mM磷酸钾缓冲液中，pH6.0)转移到青霉素瓶中。用丁基橡胶塞封住瓶子。之后，经过塞子注射烯酸酯还原酶克隆E.colipBAD-Ctyr(1)-enr-DEST(贮藏于-20℃的细胞沉淀，重新悬浮于pH7.0的100mM磷酸钾中)和NADH溶液来起始生物转化。反应混合物具有大约3ml的总体积，其含有磷酸钾缓冲液(100mM，pH6.0)、20mM6-AHEA和0.23mMNADH。44小时孵育之后，取0.5ml样品，通过离心(Eppendorf5415R离心机，10分钟，最大转速，4℃)从中去除细胞，将样品贮存于-20℃，直到通过将样品注射到偶联有质谱仪的气相色谱(上文所述的GC-MS)上来开始从被形成的6-ACA到己内酰胺的环化。通过将结果与将化学物质空白溶液注射到同样的气相色谱上获得的结果相比较，可对生物转化中形成的6-ACA的环化加以验证，所述空白溶液由磷酸钾缓冲液(100mM，pH6.0)、20mM6-AHEA和0.23mMNADH构成。由此获得的己内酰胺的量被计算为大约2.7ppm。序列表<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司<120>6-氨基己酸的生物化学合成<130>21726WO<160>8<170>PatentInversion3.1<210>1<211>100<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1aagaagaccggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccataccc60gttttttgggctaacacaagtttgtacaaaaaagctgaac100<210>2<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2ttgttctacgtaaccactttgtacaagaaagctgaac37<210>3<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3gggacaagtttgtacaaaaaagcaggctaggaggaattaaccatgaaaaacaaatcttta60tttgaacc68<210>4<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctaacagttaagtccaatttcatttcc56<210>5<211>67<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5gggacaagtttgtacaaaaaagcaggctaggaggaattaaccatggtagcctataccaga60ctttttg67<210>6<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctaaatccctcgccctacctc50<210>7<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctaggaggaattaaccatgtcatctgaaaaact60gtattcccc69<210>8<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttacaacgtcgggtaatcggtatagc5权利要求1.用于对6-氨基己酸进行生物化学合成的方法，其中，结构式[1]的6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)H2N-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-COOH[1]或能被转化为6-氨基己-2-烯酸的化合物，6-氨基-2-羟基己酸(6-AHHA)被具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶处理，所述的酶活性针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子，具体而言，被具有针对6-氨基己-2-烯酸的α，β-烯酸酯还原酶活性的酶处理。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶是来自一种微生物的酶，所述微生物来自Acetobacterimsp.、Acremoniumsp.、Agrobacteriumsp.、Burkholderiasp.、Cephalosporiumsp.、Clostridiumsp.、Escherichiasp.、Moorellasp.、Ochrobactrumsp.、Pseudomonassp.、Salmonellasp.、Shigellasp.、Tilachlidiumsp.、Yersiniasp.和Vibriosp.种组成的组。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶是来自Acremoniumsp.、Clostridiumsp.、Moorellasp.、或Ochrobactrumsp.的酶。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶是来自AcremoniumstrictumCBS114157、ClostridiumtyrobutyricumDSM1460、MoorellathermoaceticaDSM1974、OchrobactrumanthropiNCIMB41200或ClostridiumkluyveriDSM555的酶。5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶具有在空气中稳定的α，β-烯酸酯还原酶活性，并且是来自Agrobacteriumsp.、Burkholderiasp.、Escherichiasp.、Pseudomonassp.、Salmonellasp.、Shigellasp..、Yersiniasp.和Vibriosp..种组成的组的微生物的酶。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶是来自Escherichiacoli种的酶。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶是来自EscherichiacoliK12的酶。8.如权利要求1-7中任意一项所述的方法，其特征在于，在3至9范围内的pH下将6-氨基己-2-烯酸转化为6-氨基己酸。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pH在4至8的范围内。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述pH在5至8的范围内。11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在厌氧条件下，所述pH在5.5至7的范围内，在有氧条件下，所述pH在6.5至8的范围内。12.如权利要求1-11中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法在选自由Aspergillus、Bacillus、Corynebacterium、Escherichia和Pichia属组成的组的宿主生物中进行。13.用于对6-氨基己酸进行生物化学合成的宿主细胞，选自Escherichiacoli、Bacillus、Corynebacteriumglutamicum、Aspergillusniger或Pichiapastoris宿主细胞的组，其中，编码具有α，β-烯酸酯还原酶活性的酶的基因被克隆和表达，所述酶活性针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子。14.如权利要求13所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是Escherichiacoli宿主细胞，其中，来自OchrobactrumanthropiNCIMB41200或来自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达。15.如权利要求13所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是Bacillus宿主细胞，其中，来自MoorellathermoaceticaDSM1974，或来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或来自OchrobactrumanthropiNCIMB41200，或来自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达。16.如权利要求13所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是Corynebacteriumglutamicum宿主细胞，其中，来自MoorellathermoaceticaDSM1974，或来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或来自OchrobactrumanthropiNCIMB41200，或来自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达。17.如权利要求13所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是Aspergillusniger宿主细胞，其中，来自MoorellathermoaceticaDSM1974，或来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或来自OchrobactrumanthropiNCIMB41200，或来自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达。18.如权利要求13所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是Pichiapastoris宿主细胞，其中，来自MoorellathermoaceticaDSM1974，或来自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或来自OchrobactrumanthropiNCIMB41200，或来自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯还原酶基因被克隆和表达。19.如权利要求13所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自Aspergillus、Bacillus、Corynebacterium和Pichia宿主细胞的组，其中，来自E.coliK12的在空气中稳定的α，β-烯酸酯还原酶基因nemA被克隆和表达。20.对6-氨基己酸进行前体发酵的方法，其中，从6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)或从6-氨基-2-羟基己酸(6-AHHA)开始，应用至少一个酶步骤，其中使用具有针对含α，β-烯酸酯基团和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯还原酶活性的酶，特别是使用具有针对6-氨基己-2-烯酸的α，β-烯酸酯还原酶活性的酶。21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法在能体内形成6-氨基己-2-烯酸的微生物中进行。22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，6-氨基己-2-烯酸是在体内从含有合适碳源的溶液或浆体形成的。23.通过生物化学方法生产的6-氨基己-2-烯酸，具有与环境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例。24.通过生物化学方法生产的6-氨基-己酸，具有与环境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例。25.ε-己内酰胺，其具有与环境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例，是从通过生物化学方法生产的6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸制造的。26.从如权利要求23或24所述通过生物化学方法生产的任何产品或从如权利要求25所述的ε-己内酰胺制造的尼龙-6和其它衍生物，其具有与环境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例。全文摘要本发明涉及从6－氨基己－2－烯酸化合物或从6－氨基－2－羟基己酸来进行6－氨基己酸生物化学合成的方法，这是通过用具有α，β－烯酸酯还原酶活性的酶去处理含α，β－烯酸酯基团和伯氨基的分子来实现的。本发明还涉及获得用于此类生物转化过程的经过遗传工程改造的合适的细胞的方法，以及涉及从能得到6－氨基己酸的中间产物进行的对6－氨基己酸的前体发酵。最后，本发明涉及一些新颖的通过生物化学方法生产的化合物，即，6－氨基己－2－烯酸、6－氨基己酸，以及涉及由此生产的己内酰胺，以及尼龙－6和来自此类生物化学方法生产的化合物或己内酰胺的其它衍生物。文档编号C07C229/30GK1926240SQ200580002757公开日2007年3月7日申请日期2005年1月17日优先权日2004年1月19日发明者比托纳拉·凯萨琳娜·拉伊马克斯-弗兰肯,彼得吕斯·马蒂纳斯·马特乌斯·诺斯恩,保罗·玛丽亚·布朗特斯,马塞尔·格哈杜斯·乌博尔特斯,韦南德·彼得·赫勒纳·派特斯,桑德拉·尔恩斯特,斯蒂法恩·马莉亚·安德勒·德威尔德曼,马丁·舒尔曼申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司