专利名称：一种发酵法生产夫西地酸的培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵工程领域，具体说涉及一种发酵法生产夫西地酸的培养基。
背景技术：
夫西地酸(Fusidic acid, FA)又名梭链孢酸，是一种典型的高效抗生素。1962 年，丹麦Leo制药公司首次报道从梭链孢属真菌(Fusidium coccineum)的发酵液中发现 并提取出夫西地酸。它是由梭链孢属产生的一种窄谱抗生素，主要对革兰阳性菌特别是 葡萄球菌有很前强的抗菌活性，包括对金葡菌、凝固酶阴性菌、表葡菌、梭状芽孢杆菌属、 棒状杆菌等都有很高的敏感性[Collignon P, Turndge J. International journal of antimicrobialagents, 1999，12 :45_58]。夫西地酸在国外被广泛使用了四十多年，但是仍 然对绝大多数葡萄球菌菌株保持较高的抗菌活性和很低的耐药率，已经越来越受到人们的 关注，成为抗多重耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株的新选择。根据多种调查显示，自上世纪80年代末和90年代初以来，葡萄球菌感染较以前明 显增多。目前葡萄球菌在常见致病菌治病率占第四位，且耐药性日益增高，甲氧西林(或苯 唑西林)耐药葡萄球菌比例呈增高趋势，国外报道葡萄球菌自上世纪80年代的5% 60% 或更高，而国内上海地区则自80年代的24%增至近期的50% 70%。在重症医院内感染 中，葡萄球菌占重要地位[张晴.河北化工，2008，31 (8) :23-24]。国内应用夫西地酸作为 抗葡萄球菌感染必会成为一种趋势。尽管夫西地酸在国外被广泛多年，但是在国内临床应用较少。在国内，生产夫西地 酸的报道比较少，发酵法生产夫西地酸的研究报道更少。2008年，杜天飞等在中国抗生素杂 志第33卷第3期上发表了题名为“夫西地酸产生菌SIIA06-05-201的鉴定及其次级代谢产 物FA-3的结构分析”的论文。在该论文中，对产生菌进行鉴定并分析了次级代谢产物，证实 产物为夫西地酸。而且在该论文中，尽管提及了发酵生产夫西地酸的方法，但是并没有给出 直接数据证实该方法是最优培养方法。因此，研究出发酵法产夫西地酸的最优培养基是很 有必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能用于发酵法生产夫西地酸的培养基。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种发酵法生产夫西地酸的培养基，其中种子培养基包含如下浓度的组分葡萄糖10 30g/L，黄豆粉2 5g/L， (NH4)2SO4I 4g/L，KH2PO4 0. 1 0. 6g/L, NaCl 0. 1 0. 3g/L，溶剂为水，pH 6. 0 7. 0 ； 种子培养基优选包含如下浓度的组分葡萄糖15 20g/L，黄豆粉4 5g/L，(NH4)2SO4 3 4g/L,KH2PO4O. 4 0. 5g/L，NaCl 0. 1 0. 3g/L，溶剂为水，pH 6. 5 7. 0 ；种子培养基最优 选包含如下浓度的组分葡萄糖20g/L，黄豆粉5g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 0. 4g/L, NaCl0. lg/L，溶剂为水，pH 7.0。发酵培养基包含如下浓度的组分蔗糖20 40g/L，甘油5 7g/L，棉籽饼粉 10 30g/L，黄豆粉 1 2. 5g/L, (NH4)2SO4 1 4g/L, KH2PO4 0. 1 0. 3g/L, MgSO4 · 7H20 0. 01 0. 05g/L, FeCl3 · 6H20 0. 01 0. 05g/L,溶剂为水，pH6. 0 8. 0。发酵培养基优 选包含如下浓度的组分蔗糖20 25g/L，甘油5 6g/L，棉籽饼粉15 20g/L，黄豆粉 1 1. 5g/L, (NH4)2SO4 1 2g/L, KH2PO4 0. 15 0. 2g/L, MgSO4 · 7H20 0. 01 0. 02g/L, FeCl3 ·6Η200. 01 0. 02g/L，溶剂为水，pH 7. 0 8. 0。发酵培养基最优选包含如下浓度的 组分蔗糖 20g/L，甘油 5g/L，棉籽饼粉 20g/L，黄豆粉 lg/L，(NH4)2SO4 lg/L, KH2PO4 0. 2g/ L, MgSO4 · 7H20 0. Olg/L, FeCl3 · 6H20 0. 01g/L，溶剂为水，pH 7. 8。采用本发明所述的培养基发酵制备夫西地酸的工艺，具体如下将在PDA制成的斜面培养基中培养的梭链孢属真菌Fusidium coccineum，从斜面 制成孢子悬浮液，接种量106/mL，转接到种子瓶中(内含种子培养基)，上摇床，25 28°C， 48hr，摇床转速200r/min ；待到种子瓶中生长旺盛时，以5% (ν/ν)的接种量接到50L —级 种子罐(内装35L种子培养基)，25 28°C，0. 4 0. 5vvm搅拌通风，培养60hr，后转到500L 二级种子罐(内装350L种子培养基)，0.4 0. 5vvm搅拌通风，培养48hr，25 28°C ；然 后转到5吨发酵罐(内含3吨发酵培养基)，25 28°C搅拌通风，培养5 8天。种子罐和 发酵罐发酵期间，每隔4hr取样检验，测定糖度、pH值，并用显微镜观察菌体生长情况，发酵 液PH保持在7. 5左右。当发酵液残糖降到5g/L左右时，放罐、获取菌体并提取夫西地酸。有益效果本发明的优点在于1、本发明涉及的用于发酵法制备夫西地酸的培养基，结合本发明所述的发酵工 艺，可以稳定地进行夫西地酸的发酵，使得产品的转化率得到提高。同时，本发明涉及的培 养基放弃了昂贵的材料，降低了培养基成本。2、本发明所述的培养基中含有精细有机氮源——棉籽饼粉。微生物利用效果好、 价格低廉，它作为一种性价比高的有机氮源，可以代替玉米浆、蛋白胨、酵母膏等多种有机 氮源，在发酵行业有广泛的应用。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 由梭链孢属真菌Fusidium coccineum(ATCC 14700)斜面制得孢子悬浮液，接种量106/mL，接入装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，26°C振荡培养48小时即为摇瓶种子。 摇瓶种子培养基组成如下(g/L)葡萄糖25，黄豆粉 3，(NH4)2SO4 3，KH2PO4 0. 6，NaCl 0. 3，pH 6. 0 ；取IOmL摇瓶种子接入装有IOOmL发酵培养基的500mL摇瓶中。发酵培养基组成 如下(g/L)蔗糖30，甘油 6. 5，棉籽饼粉 25，黄豆粉 2，(NH4)2SO4 2. 5, KH2PO4 0. 25,MgSO4 ·7Η20 0. 025，FeCl3 · 6Η20 0. 025，pH 6. 8。
将发酵摇瓶26°C振荡培养96小时后，夫西地酸转化率达到41. 9%。实施例2 由梭链孢属真菌Fusidium coccineum(ATCC 14700)斜面制得孢子悬浮液，接种量 106/mL，接入装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，26°C振荡培养48小时即为摇瓶种子。 摇瓶种子培养基组成如下(g/L)葡萄糖15，黄豆粉 4. 5，(NH4)2SO4 3. 5，KH2PO4 0. 5，NaCl 0. 2，pH 6. 0 ；取IOmL摇瓶种子接入装有IOOmL发酵培养基的500mL摇瓶中。发酵培养基组成 如下(g/L)蔗糖25，甘油 6，棉籽饼粉 15，黄豆粉 1. 5，(NH4)2SO4 2，KH2PO4 0. 15， MgSO4 · 7Η200· 02，FeCl3 · 6Η20 0. 02，pH 7· 2。将发酵摇瓶26°C振荡培养96小时后，夫西地酸转化率达到44. 1 %。实施例3 由梭链孢属真菌Fusidium coccineum(ATCC 14700)斜面制得孢子悬浮液，接种量 106/mL，接入装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，26°C振荡培养48小时即为摇瓶种子。 摇瓶种子培养基组成如下(g/L)葡萄糖20，黄豆粉 5，(NH4) 2S043, KH2PO4 0. 4，NaCl 0. 1，pH 7. 0 ；取IOmL摇瓶种子接入装有IOOmL发酵培养基的500mL摇瓶中。发酵培养基组成 如下(g/L)蔗糖20，甘油 5，棉籽饼粉 20，黄豆粉 1，(NH4)2SO4 1，KH2PO4 0. 2,MgSO4 ·7Η200· 01， FeCl3 · 6Η20 0. 01，pH 7. 8。将发酵摇瓶26°C振荡培养96小时后，夫西地酸转化率达到47. 3%。实施例4 取实施例3所述摇瓶种子3L，接入50L发酵罐中(装30L发酵培养基，其组成同实 施例3)，控制罐压0. 03 0. 05Mpa，通风搅拌，26 28°C培养120小时，夫西地酸转化率达 到 49. 3%。实施例5 将例3所述摇瓶种子以5% (ν/ν)的接种量接入装有200L二级种子培养液的300L 种子罐中。二级种子培养基组成如下(g/L)葡萄糖20g/L，黄豆粉 5g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 0. 4g/L，NaCl 0. lg/L，pH 7. 0 ； 接种后维持罐压0. 03 0. 05Mpa，0. 4 0. 5vvm通风搅拌，26 28°C培养36小时，残糖 4g/L，经检查无杂菌合格后即接入5吨发酵罐中，此罐装有3吨经灭菌的发酵培养基，组成 成分如下(g/L)蔗糖20g/L，甘油 5g/L，棉籽饼粉 20g/L，黄豆粉 lg/L，(NH4) 2S04 lg/L，KH2PO4O. 2g/ L, MgSO4 · 7H20 0. Olg/L, FeCl3 · 6H20 0. Olg/L, pH 7. 8。0. 4 0. 5vvm通风搅拌，26 28°C培养144小时，夫西地酸转化率52. 7%。对比例1 由梭链孢属真菌Fusidium coccineum(ATCC 14700)斜面制得孢子悬浮液，接种量 106/mL，接入装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，26°C振荡培养48小时即为摇瓶种子。 摇瓶种子培养基组成如下(g/L)
葡萄糖20，黄豆粉 3.8，蛋白胨 5，(NH4)2SO4 2，KH2PO4 0.5，NaCl 2. 5，酵母膏 LpH 6. 8 ；取IOmL摇瓶种子接入装有IOOmL发酵培养基的500mL摇瓶中。发酵培养基组成 如下(g/L)乳糖6，葡萄糖3. 5，黄豆粉2，肽素粉3. 5，硫酸铵2，KH2PO4 0. 12，FeSO4 0. 004， MgSO4 · 7H20 0. 06，ρΗ 7. 2。将发酵摇瓶26°C振荡培养96小时后，夫西地酸转化率达到33. 2%。对比例中的种子培养基和发酵培养基配方参考杜天飞等.夫西地酸产生菌SIIA06-05-201的鉴定及其次级代谢产物FA-3的结构分析.中国抗生素杂志.2008年3月 第33卷第3期145 147。
权利要求
一种发酵法生产夫西地酸的培养基，其特征在于种子培养基包含如下浓度的组分葡萄糖10～30g/L，黄豆粉2～5g/L，(NH4)2SO41～4g/L，KH2PO4 0.1～0.6g/L，NaCl 0.1～0.3g/L，溶剂为水，pH 6.0～7.0；发酵培养基包含如下浓度的组分蔗糖20～40g/L，甘油5～7g/L，棉籽饼粉10～30g/L，黄豆粉1～2.5g/L，(NH4)2SO4 1～4g/L，KH2PO4 0.1～0.3g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，FeCl3·6H2O 0.01～0.05g/L，溶剂为水，pH6.0～8.0。
2.根据权利要求1所述的发酵法生产夫西地酸的培养基，其特征在于种子培养基包含如下浓度的组分葡萄糖15 20g/L，黄豆粉4 5g/L，(NH4)2SO4 3 4g/L, KH2PO4 0. 4 0. 5g/L, NaCl 0. 1 0. 3g/L，溶剂为水，pH 6. 5 7. 0 ；发酵培养基包含如下浓度的组分蔗糖20 25g/L，甘油5 6g/L，棉籽饼粉15 20g/L，黄豆粉 1 1. 5g/L, (NH4)2SO4 1 2g/L，KH2PO4 0. 15 0. 2g/L,MgSO4 ·7Η20 0. 01 0. 02g/L, FeCl3 · 6H20 0. 01 0. 02g/L，溶剂为水，pH 7. 0 8. 0。
3.根据权利要求2所述的发酵法生产夫西地酸的培养基，其特征在于种子培养基包含如下浓度的组分葡萄糖20g/L，黄豆粉5g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 0. 4g/L，NaCl 0. lg/L，溶剂为水，pH 7. 0 ；发酵培养基包含如下浓度的组分蔗糖20g/L，甘油5g/L，棉籽饼粉20g/L，黄豆粉Ig/ L, (NH4)2SO4 lg/L, KH2PO4 0. 2g/L, MgSO4 · 7H20 0. 01g/L, FeCl3 · 6H20 0. 01g/L，溶剂为水， pH 7. 8。
全文摘要
本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种发酵法生产夫西地酸的培养基，本发明所述的培养基包括种子培养基和发酵培养基。在由梭链孢霉利用廉价的棉籽饼粉和黄豆粉为有机氮源发酵时，可以稳定的进行产夫西地酸发酵，产率得到了提高，最终产品的转化率达到50％左右，而且培养基成本得到控制。
文档编号C12P33/00GK101818186SQ20101015083
公开日2010年9月1日 申请日期2010年4月20日 优先权日2010年4月20日
发明者从蕾蕾, 李军, 纪晓俊, 胡燚, 苏永明 申请人:江苏九阳生物科技有限公司