专利名称：一种利用玉米皮渣为原料发酵生产微生物油脂的方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，特别涉及一种利用玉米淀粉工业副产物的玉米皮渣为 原料，深黄被孢霉(Mortierella isabellina)为菌株，发酵生产微生物油脂的方法。
背景技术：
由于石化资源的不可再生性和人们的环境意识的不断加强，各种可再生资源越来 越受到重视，其中生物质资源是可以转化成能源产品和各种化工产品的重要的可再生资 源。玉米作为生物质资源，产量丰富，尤新等在文献《粮食加工，2009，34 (4) :12-16》的“玉 米深加工发展主要成就、存在问题及今后发展方针”，报道了全世界每年的玉米产量达到 7. 7亿吨以上，中国每年的玉米产量也在1. 50亿吨以上，而玉米淀粉作为化工和食品原料 的应用极广，中国2007年玉米淀粉的生产量达到1350万吨。而姜岷，姚嘉文，吴昊等在文 献《食品与发酵工业，2007，33 (10) :6-9》的“稀酸水解玉米皮制备丁二酸发酵糖液的研究”， 报道了玉米在湿磨法加工淀粉过程中会产生10-15%左右的玉米皮渣。玉米皮渣主要含有 剩余淀粉、半纤维素、纤维素、蛋白质及灰分等。目前，玉米淀粉加工企业主要将玉米皮渣作 为饲料出售，玉米皮渣的利用没有科学的深化，从玉米综合利用的延伸及发展的角度看，这 是对生物质资源的浪费。微生物油脂又称单细胞油脂，是由藻类、真菌类等微生物，利用碳水化合物、碳氢 化合物和普通油脂为碳源，在菌体内转化为油脂储存。Ratledge C.在《Biochimie，2004， 86 807-815)) ^"Fatty acidbiosynthesis in microorgaisms being used for singnal cell oil production”报道微生物油脂一般占菌体干重的20%以上，微生物油脂的脂肪酸 组成与植物油相似，可作为制备生物柴油原料。目前以动植物油脂生产生物柴油面临成本高、原料总量缺口大、供给季节性强等 不利于规模化生产的难题。而且，持续扩大传统油料作物种植以扩大获取生物柴油生产原 料，将存在着与人争粮、与粮争地等问题。开拓新的微生物油脂资源是降低生物柴油价格和 保障生物柴油产业持续发展的关键。
发明内容
针对微生物油脂的现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种利用玉米皮渣为 原料发酵生产微生物油脂的方法。本发明以玉米皮渣为原料，两步水解法制备水解液，水解液处理并浓缩，添加氮 源，通过生物转化获取微生物油脂。本方法使用玉米皮渣价格低廉，可降低微生物油脂生产成本，实现玉米淀粉工业 副产物资源高值化利用。同时，减少淀粉行业排放的高浓度废弃物对环境的污染，开辟玉米 皮渣利用的新途径，所得微生物油脂，可作为生物柴油生产的油脂原料，具有良好的工业化 应用前景。本发明提供的一种利用玉米皮渣为原料发酵生产微生物油脂的方法，其步骤和条
7件如下(1)玉米皮渣两步水解①玉米皮渣酶水解 在反应釜中加入碎粉至40-200目玉米干皮渣，按照干燥的玉米皮渣的质量g与水 的体积mL的配比为1 4-8加入水，加入玉米皮渣干重0.5-2%的α-淀粉酶，淀粉酶的活 性为36000IU/mL，再加入玉米皮渣干重0. 1-0. 2%的CaCl2,于40_50°C恒温20_50min，升温 至80-85°C恒温60-120min，再煮沸lOmin，降温至50_60°C加入玉米皮渣干重0. 1-0. 5%的 糖化酶，糖化酶的活性为100000IU/mL，于60°C保温30min，采用过滤或离心的方法得到玉 米皮渣酶解液的上清液；②玉米皮渣酸水解在反应釜中加入步骤①玉米皮渣水解后的滤渣，按该滤渣酶解前玉米皮渣干重g 与水的体积HiL的配比为1 4-8加入水，再加入该溶液总体积比的0. 2-0. 6%盐酸水解 2_4h，水解温度80-100°C，水解后采用过滤或离心的方法得到玉米皮渣酸解液的上清液； 所述盐酸质量浓度为37% ；(2)玉米皮渣水解液的中和将步骤(1)的①和②得到的上清液混合，再将其浓缩至所含的还原糖质量浓度为 60-80g/L，加入混合上清液体积的1. 5-2. 0%玉米浆，用Ca(OH)2调pH值为6. 0-7. 0，70°C 恒温20-30min，离心除去沉淀，得到玉米皮渣水解液；(3)油脂微生物发酵培养①种子培养在无菌条件下将已长满深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)分生 孢子的试管斜面加入2-3ml无菌水，轻轻振荡使之悬浮于无菌水中，吸取孢子悬浮液加入 已灭菌的马铃薯葡萄糖培养基中，摇瓶培养温度28-30°C，摇瓶转速80-100r/min，培养时 间20-24h，得到发酵种子液；所述的马铃薯葡萄糖培养基的组成为质量/体积浓度为20%的土豆汁1000ml， 葡萄糖 20g, KH2P043g, MgSO4 · 7H20 1. 5g, pH 6. 0 ；所述的所述的马铃薯葡萄糖培养基在121°C条件下灭菌15min ；②发酵培养在步骤(2)得到的玉米皮渣水解液中，添加玉米皮渣水解液体积的 0. 1-0. 2%硫酸铵，在玉米皮渣发酵培养液中接入步骤(3)的①得到种子液，接入的种子液 是添加硫酸铵后的玉米皮渣水解液体积的5-10%，在全自动发酵装置中进行培养，发酵温 度28-30°C，通气量0. 4-0. 8vvm,搅拌转速120-200r/min，发酵周期4_6d，过滤或离心获得 油脂微生物菌体；所述的玉米皮渣发酵培养液在121°C条件下灭菌15min ；(4)微生物油脂制备将步骤(3)的②得到的油脂微生物菌体干燥，再用有机溶剂提取法，对干燥的油 脂微生物菌体细胞内油脂进行提取把干燥的油脂微生物菌体研磨后用滤纸包装，放入索 氏提取器中，按照干燥的油脂微生物菌体的质量g与石油醚的体积HiL的配比为1 15加 入石油醚，提取温度90-100°C，提取时间5-8h，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，得到微生 物油脂。本发明所得微生物油脂的组成和含量如表1和
图1所示。表1为微生物油脂的组 成和含量，从表1可以看出，微生物油脂的组成主要为16碳系和18碳系脂肪酸，其中棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸含量较多，其组成与含量与植物油类似，可作为油脂资源
用于生物柴油的制备。 表1微生物油脂组成和含量
权利要求
一种利用玉米皮渣为原料发酵生产微生物油脂的方法，其特征在于，步骤和条件如下(1)玉米皮渣两步水解①玉米皮渣酶水解在反应釜中加入碎粉至40 200目玉米干皮渣，按照干燥的玉米皮渣的质量g与水的体积mL的配比为1∶4 8加入水，加入玉米皮渣干重0.5 2％的α 淀粉酶，淀粉酶的活性为36000IU/mL，再加入玉米皮渣干重0.1 0.2％的CaCl2，于40 50℃恒温20 50min，升温至80 85℃恒温60 120min，再煮沸10min，降温至50 60℃加入玉米皮渣干重0.1 0.5％的糖化酶，糖化酶的活性为100000IU/mL，于60℃保温30min，采用过滤或离心的方法得到玉米皮渣酶解液的上清液；②玉米皮渣酸水解在反应釜中加入步骤①玉米皮渣水解后的滤渣，按该滤渣酶解前玉米皮渣干重g与水的体积mL的配比为1∶4 8加入水，再加入该溶液总体积比的0.2 0.6％盐酸水解2 4h，水解温度80 100℃，水解后采用过滤或离心的方法得到玉米皮渣酸解液的上清液；所述盐酸质量浓度为37％；(2)玉米皮渣水解液的中和将步骤(1)的①和②得到的上清液混合，再将其浓缩至所含的还原糖质量浓度为60 80g/L，加入混合上清液体积的1.5 2.0％玉米浆，用Ca(OH)2调pH值为6.0 7.0，70℃恒温20 30min，离心除去沉淀，得到玉米皮渣水解液；(3)油脂微生物发酵培养①种子培养在无菌条件下将已长满深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)分生孢子的试管斜面加入2 3ml无菌水，轻轻振荡使之悬浮于无菌水中，吸取孢子悬浮液加入已灭菌的马铃薯葡萄糖培养基中，摇瓶培养温度28 30℃，摇瓶转速80 100r/min，培养时间20 24h，得到发酵种子液；所述的马铃薯葡萄糖培养基的组成为质量/体积浓度为20％的土豆汁1000ml，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 1.5g，pH 6.0；所述的所述的马铃薯葡萄糖培养基在121℃条件下灭菌15min；②发酵培养在步骤(2)得到的玉米皮渣水解液中，添加玉米皮渣水解液体积的0.1 0.2％硫酸铵，在玉米皮渣发酵培养液中接入步骤(3)的①得到种子液，接入的种子液是添加硫酸铵后的玉米皮渣水解液体积的5 10％，在全自动发酵装置中进行培养，发酵温度28 30℃，通气量0.4 0.8vvm，搅拌转速120 200r/min，发酵周期4 6d，过滤或离心获得油脂微生物菌体；所述的玉米皮渣发酵培养液在121℃条件下灭菌15min；(4)微生物油脂制备将步骤(3)的②得到的油脂微生物菌体干燥，再用有机溶剂提取法，对干燥的油脂微生物菌体细胞内油脂进行提取把干燥的油脂微生物菌体研磨后用滤纸包装，放入索氏提取器中，按照干燥的油脂微生物菌体的质量g与石油醚的体积mL的配比为1∶15加入石油醚，提取温度90 100℃，提取时间5 8h，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，得到微生物油脂。
2.如权利要求1所述的一种利用玉米皮渣为原料发酵生产微生物油脂的方法，其特征在于，步骤和条件如下(1)玉米皮渣两步水解①玉米皮渣酶水解在反应釜中加入粉碎至40目的干燥的玉米皮渣，按照干燥的玉米皮渣与水的质量g与 体积mL比为1 4加入水，加入玉米皮渣干重0. 5% α -淀粉酶，淀粉酶的活性36000IU/ mL，再加入玉米皮渣干重0. 1 % CaCl2,40°C恒温50min后，升温至85°C后恒温60min，再煮沸 IOmin,降温至60°C加入玉米皮渣干重0. 5%的糖化酶，糖化酶的活性100000IU/mL，60°C保 温30min，采用过滤或离心的方法得到玉米皮渣酶解液的上清液；②玉米皮渣酸水解在小型玻璃反应釜中加入步骤(1)的①玉米皮渣水解后的滤渣，按该滤渣酶解前玉米 皮渣干重g与水的体积mL的配比为1 6加入水，再加入该溶液总体积比的0.5%的盐酸， 100°C水解2h，采用过滤或离心的方法得到玉米皮渣酸解液的上清液；所述盐酸质量浓度 为 37% ；(2)玉米皮渣水解液的中和将步骤(1)的①和②得到的上清液混合，再将其浓缩至所含的还原糖质量浓度为60g/ L，加入混合上清液体积的1. 5%玉米浆，用Ca(OH)JfpH值为7. 0，70°C恒温20min，离心除 去沉淀，得到玉米皮渣水解液；(3)油脂微生物发酵培养①种子培养种子斜面加入2ml无菌水，轻轻振荡使之悬浮于无菌水中，吸取孢子悬浮液加入已灭 菌的马铃薯葡萄糖培养基中，摇瓶培养温度28°C，摇瓶转速lOOr/min，培养时间24h，得到 发酵种子液；所述的马铃薯葡萄糖培养基的组成为质量/体积浓度为20%的土豆汁1000ml，葡萄 糖 20g, KH2P043g, MgSO4 · 7H20 1. 5g, pH 6. 0 ；所述的所述的马铃薯葡萄糖培养基在121°C条件下灭菌15min ；②发酵培养在步骤(2)得到的玉米皮渣水解液中，添加玉米皮渣水解液体积的0.2%硫酸铵，在 玉米皮渣发酵培养液中接入步骤(3)的①得到种子液，接入的种子液是添加硫酸铵后的玉 米皮渣水解液体积的10%，在全自动发酵装置中进行培养，通气量0. 4vvm、搅拌转速120r/ min, 28°C，发酵培养4天，离心或抽滤得到油脂微生物菌体；所述的玉米皮渣发酵培养液在121°C条件下灭菌15min ；(4)微生物油脂制备将步骤(3)的②得到的油脂微生物菌体干燥，再用有机溶剂提取法，对干燥的油脂微 生物菌体细胞内油脂进行提取把干燥的油脂微生物菌体研磨后用滤纸包装，放入索氏提 取器中，按照干燥的油脂微生物菌体的质量g与石油醚的体积mL的配比为1 15加入石 油醚，提取温度10(TC，提取时间8h，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，得到微生物油脂。
3.如权利要求2所述的一种利用玉米皮渣为原料发酵生产微生物油脂的方法，其特征 在于，所述的(1)玉米皮渣两步水解①玉米皮渣酶水解在反应釜中加入粉碎至40目的干燥的玉米皮渣，按照干燥的玉米皮渣与水的质量g与 体积mL比为1 6加入水，加入玉米皮渣干重1.0%的α-淀粉酶，再加入玉米皮渣干重 0. 10%的CaCl2,40°C恒温20min后，升温至80°C后恒温60min，降温至60°C加入玉米皮渣 干重0.2%的糖化酶；②玉米皮渣酸水解在反应釜中加入步骤①玉米皮渣水解后的滤渣，按该滤渣酶解前玉米皮渣干重g与水 的体积mL的配比为1 4加入水，再加入该溶液总体积比的0. 2%盐酸水解3h，水解温度 80 0C ；(2)玉米皮渣水解液的中和将步骤(1)的①和②得到的上清液混合，再将其浓缩至所含的还原糖质量浓度为60g/ L，加入混合上清液体积的2. 0%玉米浆，用Ca(OH)2调pH值为6. 0，70°C恒温20min ；(3)油脂微生物发酵培养①种子培养种子斜面加入2ml无菌水，摇瓶培养温度30°C，摇瓶转速80r/min，培养时间20h ；②发酵培养添加玉米皮渣水解液体积的0.2%硫酸铵，接入的种子液是添加硫酸铵 后的玉米皮渣水解液体积的6%，发酵温度28°C，通气量0. 8vvm，搅拌转速140r/min，发酵 周期6d ；(4)微生物油脂制备提取温度90°C，提取时间8h ；其他所有的条件同权利要求2。
4.如权利要求2所述的一种利用玉米皮渣为原料发酵生产微生物油脂的方法，其特征 在于，所述的(1)玉米皮渣两步水解①玉米皮渣酶水解在反应釜中加入粉碎至80目的干燥的玉米皮渣，按照干燥的玉米皮渣与水的质量g与 体积mL比为1 8加入水，加入玉米皮渣干重1.5%的α-淀粉酶，再加入玉米皮渣干重 0. 15%的CaCl2,45°C恒温30min后，升温至85°C后恒温70min，降温至50°C加入玉米皮渣 干重0.4%的糖化酶；②玉米皮渣酸水解按该滤渣酶解前玉米皮渣干重g与水的体积mL的配比为1 6加入水，再加入该溶液 总体积比的0. 4%盐酸水解4h，水解温度85 °C ；(2)玉米皮渣水解液的中和所含的还原糖质量浓度为65g/L，加入混合上清液体积的2. 0%玉米浆，用Ca(OH)2调 PH值为6. 5，恒温30min ；(3)油脂微生物发酵培养①种子培养种子斜面加入3ml无菌水，摇瓶培养温度28°C，摇瓶转速90r/min，培养时间22h ；②发酵培养添加玉米皮渣水解液体积的0.硫酸铵，接入的种子液是添加硫酸铵后的玉米皮渣水解液体积的8%，发酵温度29°C，通气量0. 7vvm，搅拌转速160r/min，发酵 周期5d ；(4)微生物油脂制备提取温度95 °C，提取时间7h ；其他所有的条件同权利要求2。
5.如权利要求2所述的一种利用玉米皮渣为原料发酵生产微生物油脂的方法，其特征 在于，所述的(1)玉米皮渣两步水解①玉米皮渣酶水解在反应釜中加入粉碎至160目的干燥的玉米皮渣，按照干燥的玉米皮渣与水的质量g 与体积mL比为1 6加入水，加入玉米皮渣干重2.0%的α-淀粉酶，再加入玉米皮渣干 重0. 10%的CaCl2, 50°C恒温40min后，升温至80°C后恒温80min，降温至55°C加入玉米皮 渣干重0. 3%的糖化酶；②玉米皮渣酸水解按该滤渣酶解前玉米皮渣干重g与水的体积mL的配比为1 8加入水，再加入该溶液 总体积比的0. 5%盐酸水解2h，水解温度95 °C ；(2)玉米皮渣水解液的中和所含的还原糖质量浓度为70g/L，加入混合上清液体积的1. 5%玉米浆，用Ca(OH)2调 PH值为7. 0，恒温25min ；(3)油脂微生物发酵培养①种子培养种子斜面加入3ml无菌水，摇瓶培养温度29°C，摇瓶转速95r/min，培养时间22h ；②发酵培养添加玉米皮渣水解液体积的0.2%硫酸铵，接入的种子液是添加硫酸铵 后的玉米皮渣水解液体积的10%，发酵温度30°C，通气量0. 5vvm,搅拌转速180r/min，发酵 周期6d ；(4)微生物油脂制备提取温度95 °C，提取时间6h ；其他所有的条件同权利要求2。
6.如权利要求2所述的一种利用玉米皮渣为原料发酵生产微生物油脂的方法，其特征 在于，所述的(1)玉米皮渣两步水解①玉米皮渣酶水解在反应釜中加入粉碎至200目的干燥的玉米皮渣，按照干燥的玉米皮渣与水的质量g 与体积mL比为1 4加入水，加入玉米皮渣干重0.5%的α-淀粉酶，再加入玉米皮渣干 重0. 20%的CaCl2,45°C恒温50min后，升温至85°C后恒温90min，降温至60°C加入玉米皮 渣干重0. 的糖化酶；②玉米皮渣酸水解按该滤渣酶解前玉米皮渣干重g与水的体积mL的配比为1 4加入水，再加入该溶液 总体积比的0. 6%盐酸水解4h，水解温度90°C ；(2)玉米皮渣水解液的中和所含的还原糖质量浓度为80g/L，加入混合上清液体积的1. 5%玉米浆，用Ca(OH)2调 PH值为7. 0，恒温30min ；(3)油脂微生物发酵培养①种子培养种子斜面加入2ml无菌水，摇瓶培养温度30°C，摇瓶转速85r/min，培养时间24h ；②发酵培养添加玉米皮渣水解液体积的0.硫酸铵，接入的种子液是添加硫酸铵 后的玉米皮渣水解液体积的10%，发酵温度30°C，通气量0. 6vvm,搅拌转速200r/min，发酵 周期4d ；(4)微生物油脂制备提取温度10°C，提取时间5h ； 其他所有的条件同权利要求2。
全文摘要
本发明提供一种利用玉米皮渣为原料发酵生产微生物油脂的方法，使用价格低廉的玉米皮渣，减少了淀粉行业排放的高浓度废弃物对环境的污染。所得微生物油脂，可作为生物柴油生产的油脂原料。本发明的方法得到玉米皮渣转化率49.34-53.23％、菌体生物量16.82-19.17g/L、油脂含量41.69-50.26％和油脂产量7.012-9.635g/L。处理后的玉米皮渣，除生产较高含量及产量的微生物油脂外，其剩余组分及提油后菌体仍可满足作为饲料的需要。而且，水解后获得的可发酵糖可作为微生物发酵的培养液用于生产各种生物发酵产品，实现了对玉米综合利用的延伸及发展，符合循环经济的科学发展趋势。
文档编号C12R1/645GK101948883SQ20101027245
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月6日 优先权日2010年9月6日
发明者安龙潘, 薛冬桦 申请人:长春工业大学